WO2006008401A2 - Composition comprenant un milieu de culture de microorganisme marin et/ou d'eau douce photosynthetique. - Google Patents

Composition comprenant un milieu de culture de microorganisme marin et/ou d'eau douce photosynthetique. Download PDF

Info

Publication number
WO2006008401A2
WO2006008401A2 PCT/FR2005/001831 FR2005001831W WO2006008401A2 WO 2006008401 A2 WO2006008401 A2 WO 2006008401A2 FR 2005001831 W FR2005001831 W FR 2005001831W WO 2006008401 A2 WO2006008401 A2 WO 2006008401A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
culture medium
clarified
water
culture
marine
Prior art date
Application number
PCT/FR2005/001831
Other languages
English (en)
Other versions
WO2006008401A3 (fr
Inventor
Patrice Andre
Anne Humeau
Marc Bermudes
Original Assignee
Source Marine De L'ile Grande
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Source Marine De L'ile Grande filed Critical Source Marine De L'ile Grande
Publication of WO2006008401A2 publication Critical patent/WO2006008401A2/fr
Publication of WO2006008401A3 publication Critical patent/WO2006008401A3/fr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/99—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from microorganisms other than algae or fungi, e.g. protozoa or bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G33/00—Cultivation of seaweed or algae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/20—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids
    • A61K31/202—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids having three or more double bonds, e.g. linolenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/748—Cyanobacteria, i.e. blue-green bacteria or blue-green algae, e.g. spirulina
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/02—Algae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/02—Algae
    • A61K36/05—Chlorophycota or chlorophyta (green algae), e.g. Chlorella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A61K8/9706—Algae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/40—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
    • A61K2800/52—Stabilizers
    • A61K2800/522—Antioxidants; Radical scavengers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q1/00—Make-up preparations; Body powders; Preparations for removing make-up
    • A61Q1/02—Preparations containing skin colorants, e.g. pigments
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q17/00—Barrier preparations; Preparations brought into direct contact with the skin for affording protection against external influences, e.g. sunlight, X-rays or other harmful rays, corrosive materials, bacteria or insect stings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/007—Preparations for dry skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/02—Preparations for care of the skin for chemically bleaching or whitening the skin

Definitions

  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising, as active principle, a clarified culture medium of marine microorganism and / or fresh photosynthetic water.
  • the use of microorganisms in the field of cosmetics or pharmacy is known from the prior art.
  • the document EP 0 876 813 describes a cosmetic or pharmaceutical composition comprising, as active principle, an effective amount of culture medium of at least one non-photosynthetic filamentous bacterium, said medium being clarified and stabilized.
  • the clarified and stabilized culture medium has properties similar to those of biomass.
  • the search for biologically active ingredients is a field in full development because it is a way to increase the performance of products having to present a biological activity which is necessary for the development of cosmetic, dermatological, pharmaceutical and food products.
  • the biological activity is measured through biological models that will allow to compare several ingredients in order to retain only one or the best on the model considered.
  • the search for biologically active ingredients relies on screening of many ingredients on biological models judiciously chosen by those skilled in the art.
  • the ingredients come from plants that have been previously selected by various methods. Ethnobotany is the most used approach. It consists in studying preferentially plants whose use is already existing in traditional uses or by ancient medicines. The selected plant is tested on appropriate biological models. For each plant many tests are to be performed on different organs of the plant and different modes of extraction.
  • traditional use directs the researcher towards the biological model (s) to be implemented.
  • the ethnobotanical approach is very effective for the selection of terrestrial plants, which is however not the case for marine plants that are little or not at all known for traditional uses.
  • the present invention relates to the discovery, development and use of a new family of assets particularly interesting.
  • This new family comes from the marine world and / or fresh water and more specifically marine and / or freshwater containing microorganisms.
  • the present invention more particularly relates to a cosmetic, dermatological, pharmaceutical or food composition, preferably a cosmetic composition, characterized in that it comprises a culture medium of at least one marine microorganism and / or fresh photosynthetic water, said middle being clarified.
  • microorganisms are grown under standardized conditions to provide a biomass that is usually obtained by centrifugation. This biomass can then undergo the same extraction techniques as those used for terrestrial plants, and can therefore result in molecules and biologically active extracts.
  • “Clarified culture medium” means a culture medium whose biomass has been removed, that is to say elimination of all the microorganisms and cell debris present in the culture medium. This removal can be carried out by techniques well known to those skilled in the art such as filtration or centrifugation.
  • the Applicant has discovered that the properties of the clarified culture medium are different from those of the biomass. So when the middle clarified culture of the present invention has cosmetic, dermatological, pharmaceutical and food properties particularly interesting this is not necessarily the case of the biomass used to obtain said clarified culture medium.
  • the clarified culture medium used in the composition of the invention refers to the culture medium obtained after amplification of the microorganism (s) cultured, and after separation of all the microorganisms and cell debris from the culture medium.
  • the clarified culture medium then contains only the secreted substances resulting from the culture of the microorganism or microorganisms, also called active substances.
  • the active substances denote in particular the primary and secondary metabolites synthesized and released by the cells of said marine microorganism (s) and / or fresh water, said metabolites being able to be excreted during cell activity or else released after lysis. cells.
  • These active substances can designate molecules of various nature: enzymes, peptides, amino acids, vitamins, polysaccharides, etc., and have different biological properties capable of playing a role in the cosmetics, pharmacy or cosmetic sector. nutrition.
  • the Applicant has shown that, depending on the nature of the culture medium, the choice of the microorganism (s) grown and the cultivation protocol developed, new and very interesting active substances could be produced for cosmetic, dermatological, pharmaceutical and food applications.
  • the composition of the invention is remarkable in that it has particularly advantageous cosmetic properties, especially depigmenting and antioxidant properties, thanks to the active substances present in the clarified medium.
  • the marine microorganism and / or photosynthetic freshwater is a cyanobacterium and / or a microalga resulting from aquatic environments such as sea, ocean, brackish water, saline water or water soft.
  • Saline water refers to water with varying degrees of salinity ranging from 35 g / L to 90 g / L.
  • the photosynthetic marine microorganism is a cyanobacterium and / or a microalgae is derived from marine environments.
  • the marine microorganism and / or photosynthetic freshwater is a cyanobacterium and / or a microalga belonging to the division of chlorophytes chosen from the group consisting of cyanophytes, chlorophytes , chrysophytes, chlorarachniophytes, dinophytes, cryptophytes, euglenophytes or rhodophytes.
  • the cyanobacterium and / or microalgae is selected from the group consisting of the class of cyanophyceae, chlorophyceae, prasinophyceae, pedinophyceae, prymnesiophyceae, eustigmatophyceae, raphidophyceae, chrysophyceae, diatomophyceae, tribophyceae, chlorarachniophyceae , dinophyceae, cryptophyceae, euglenophyceae and rhodophyceae.
  • the marine and / or freshwater microorganism is a microalgae.
  • the microalgae that may be used, there may be mentioned, for example:
  • Dunaliella primolecta Dunaliella tertiolecta, Dunaliella bardawil, Neochloris oleobundans, Clamydomonas reinhardtii, Botryococcus braunii, Chlorococcum oleofaciens, Dysmorphococcus globosus, Hormotilopsis gelatinosa, Ulothrix acuminata and Ourococcus sp, class chlorophyceae;
  • Tetraselmis suecica class prasinophyceae
  • Nannochloropsis oculata of the class of eustigmatophyceae
  • composition of the invention is also characterized in that the amount of clarified culture medium is from 0.01% to 100% by weight relative to the total weight of the composition, preferably from 0.1 to 75% and the
  • the set of microorganisms obtained at the end of step c) of amplification constitutes the biomass.
  • the clarified culture medium, obtained at the end of step d) of elimination can undergo certain modifications before its use.
  • it may for example be subjected to an additional desalting step in order to reduce its concentration of sodium chloride and facilitate its use in certain formulations.
  • This desalting step can be carried out by techniques well known to those skilled in the art such as in particular electrodialysis or nanofiltration.
  • the clarified culture medium, obtained at the end of step d) of elimination can also be subjected to an additional concentration step, by removal of a portion of the water constituting it, or on the contrary to a further dilution step. It may also undergo an additional drying step, such as by spraying or lyophilization, to be in a concentrated and solid form more suitable for use in certain applications.
  • microorganisms When at least two microorganisms are selected in step a) described above, these two microorganisms may be different.
  • Two different microorganisms denote two microorganisms, and in particular two microalgae, belonging to a species different from each other. In addition, they may belong to a different class and / or genre or order.
  • .5 is introduced at least one microorganism) is selected from the group consisting of Marine Source Water of the Big Island, sea water, ocean water, brackish water, saline water , fresh water, a clarified culture medium of at least one microorganism or mixtures thereof.
  • said culture medium comprises Marine Source Water from the Grande Ile.
  • the culture medium of step b) (in which at least one microorganism is introduced) is a clarified culture medium of at least one marine microorganism and / or photosynthetic fresh water as defined above or as obtained at the end of the process as described above.
  • the culture medium of step b) can be enriched in nutritive elements selected from the group consisting of minerals, trace elements and vitamins.
  • the culture (step c) amplification) can be carried out at the appropriate temperature appropriate to the species of the microorganism (s) cultivated (s), including the micro or micro (s) cultivated (s). Generally, this temperature is between 15 and 25 ° C depending on the nature of the crop species.
  • the pH of the culture medium is between 2 and 12, and preferably between 7 and 8 depending on the nature of the cultivated species.
  • This amplification step is carried out until a desired concentration of microalgae and / or cyanobacteria is obtained.
  • this amplification step is carried out until an optical density of between 0.1 and 3.0, preferably between 0.2 and 2, is obtained.
  • Step d) elimination of all the microorganisms obtained at the end of step c) amplification can be obtained by any conventional technique, such as centrifugation or filtration, and preferably centrifugation .
  • This step d) makes it possible to separate the biomass from the culture medium and to obtain the clarified culture medium.
  • the clarified culture medium can be obtained at different physiological stages of the culture, depending on the active substances that are sought (beginning or end of exponential growth phase, stationary phase).
  • the clarified culture medium, obtained at the end of the process as described above comprises for example:
  • the Grande Ile Marine Source Water may be mixed with sea water, fresh water or brackish water, or replaced by these.
  • the Marine Source Water of the Big Island can also be replaced by the clarified culture medium of another microalga, see by its own clarified culture medium.
  • a microalgae can therefore be cultured in its own clarified culture medium or else in the clarified culture medium of another microalgae, with or without the addition of a nutrient medium (concept of Clarificulture ", term invented by the Applicant).
  • a nutrient medium incept of Clarificulture ", term invented by the Applicant.
  • two or more microalgae, identical or different, can be grown in the same culture medium (concept of co-cultivation).
  • each nutrient medium (including minerals, trace elements, vitamins 8) is specific to each microalga and its growth, and can vary from one microalga to another.
  • the type and concentration of active substances synthesized by the microalgual cells are functions of the cultivated microalgae species, the physiological phase of growth and the environmental conditions.
  • Each microalgae culture, necessary for obtaining clarified culture media, is carried out in photobioreactors or basins.
  • a small volume of a concentrated microalgae solution serves as an inoculum to start the culture.
  • composition according to the invention is further characterized in that it contains at least one other active ingredient.
  • This ingredient can be any asset useful to the properties of the composition.
  • the active ingredient that can supplement the compositions of the invention may also come from the biomass as obtained at the end of the elimination step d) as defined above.
  • the clarified culture medium used as an active agent in the compositions of the invention is vectorized in liposomes or other vectors in order to promote their pharmaceutical, cosmetic, dermatological or food activity.
  • the present invention also relates to a method for preparing a clarified culture medium of at least one marine microorganism and / or photosynthetic freshwater, characterized in that it comprises the following steps:
  • the preparation process of the invention is characterized in that a further step of screening the clarified culture medium as defined above, or such as obtained according to the process as defined above, in order to evaluate the pharmaceutical, cosmetic, dermatological or food properties of said clarified culture medium.
  • the present invention also relates to the use of a clarified culture medium as defined previously as a cosmetic active ingredient with lightening and / or depigmenting activity, preferably skin.
  • the clarified culture medium used as a lightening and / or depigmenting cosmetic active ingredient is a culture medium of a microalga of the class of prasinophyceae, preferably a microalga of the genus Tetraselmis, and particularly preferably Tetraselmis suecica.
  • the invention also relates to the use of a clarified culture medium as defined above cosmetic active ingredient with protective activity against free radicals, in order to fight against aging, preferably against aging of the skin.
  • the clarified culture medium used as the active anti-free radical cosmetic ingredient is a culture medium of a microalgae of the class of cyanophyceae and / or chlorophyceae, preferably a microalgae of the genus Nostoc and / or Scenedesmus, and of particularly preferred Nostoc and / or Scenedesmus acutus.
  • the invention also relates to the use of a clarified culture medium as defined above for the preparation of a pharmaceutical composition for combating cutaneous sensitivity and inflammatory reactions.
  • the clarified culture medium is a culture medium of a microalgae of the chlorophycea class, preferably a microalgae of the genus
  • Dunaliella and particularly preferably Dunaliella primolecta.
  • the invention also relates to the use of a clarified culture medium as defined above as a cosmetic active ingredient for combating cutaneous sensitivity and inflammatory reactions.
  • the clarified culture medium used as an anti-inflammatory cosmetic active ingredient is a microalgae culture medium of the class of chlorophyceae, preferably a microalgae of the genus Dunaliella, and particularly preferably Dunaliella primolecta.
  • the invention also relates to the use of a clarified culture medium as defined above as a cosmetic active ingredient with pigmenting activity on the skin and the hair.
  • the invention also relates to the use of a clarified culture medium as defined above as a cosmetic active ingredient with slimming activity.
  • the invention also relates to the use of a clarified culture medium as defined above as a cosmetic active ingredient with bronzing activity.
  • the invention also relates to the use of a clarified culture medium as defined above as a cosmetic active ingredient promoting the growth and regrowth of the hair.
  • the invention also relates to the use of a clarified culture medium as defined above as a cosmetic active ingredient with firming, toning, stimulating, balancing activity.
  • the invention finally relates to the use of a clarified culture medium as defined above as an anti-stress cosmetic active ingredient, in particular to improve the repair of DNA.
  • the clarified culture medium used as an anti-stress cosmetic active ingredient is a culture medium of a microalgae of the class of diatomophycea, preferably of the genus Skeletonema, and particularly preferably Skeletonema costantum.
  • the present invention also relates to a cosmetic treatment method comprising the application to a subject of an effective amount, preferably on the skin, of a clarified medium as described above.
  • the cosmetic treatment method according to the invention is intended for cosmetic uses as described above.
  • Figure 1 illustrates the reaction to Dopa-Oxidase on separate epidermis.
  • the top left square represents the DOPA control
  • the upper right square represents kojic acid
  • the bottom left represents the clarified culture medium of Phaeodactylum tricornutum
  • the bottom right square represents the culture medium.
  • clarified Tetraselmis suecica The top left square represents the DOPA control
  • the upper right square represents kojic acid
  • the bottom left represents the clarified culture medium of Phaeodactylum tricornutum
  • the bottom right square represents the culture medium.
  • clarified Tetraselmis suecica clarified Tetraselmis suecica.
  • Example 1 Preparation of a clarified culture medium from a culture of Tetraselmis suecica, and its cosmetic use as a depigmenting agent.
  • a sterile nutrient medium (CONWAY medium) is added to the Marine Source Water of Ile Grande.
  • composition of the nutrient medium is as follows
  • Vitamin B 1 2.10 "4 g / L
  • Vitamin B 12 1.10 "5 g / L
  • the pond is inoculated with 2500L of a concentrated culture of the microalga Tetraselmis suecica.
  • Tetraselmis suecica is cultivated at a pH of 7 thanks to an automatic regulation in CO2 and a temperature of 2O 0 C.
  • the measured parameters are: pH, T °, O 2 , DO.
  • the culture is carried out at a pH of between 7 and 8, and at a temperature between 20 and 23 ° C.
  • the culture is conducted to obtain a cell concentration corresponding to an optical density of 0.300 at the wavelength of 435 nm.
  • the culture After ten days, the culture is centrifuged (16500 revolutions / min) and the clarified culture medium obtained is conditioned and stored in a cold room.
  • Example 2 Obtaining a clarified culture medium from a culture of Scenedesmus acutus, and its cosmetic use as an antioxidant.
  • PA 5 is filled with 300 Liters of fresh water.
  • a sterile nutrient medium (MLA medium) is added to the fresh water.
  • the composition of the nutrient medium is as follows
  • Vitamin B 1 1. 10 "4 g / L
  • Vitamin B 12 5. 10 "8 g / L
  • Vitamin H 5. 10 "8 g / L
  • the photobioreactor is inoculated with 10 Liters of a sterile and concentrated culture of Scenedesmus acutus. Bubbling in air and CO 2 ensures the culture a permanent mixing of the cells and a maintenance of the pH around the neutrality.
  • the culture of Scenedesmus is carried out at a temperature of 20 ° C.
  • the parameters measured are as follows: pH, ⁇ °, O 2 , DO.
  • the culture is carried out at a pH between 6.5 and 8, and at a temperature between 17 and 21 ° C.
  • the culture is conducted to obtain a cell concentration corresponding to an optical density of 1.4 at the wavelength of 679 nm.
  • the culture is centrifuged (16500 rev / min) and the clarified product is conditioned and stored in a cold room.
  • the clarified culture medium is then concentrated by thermal evaporation to be incorporated in cosmetic compositions with antioxidant activity.
  • CONWAY medium A sterile nutrient medium (CONWAY medium) is added to Seawater.
  • composition of the nutrient medium is as follows
  • the photobioreactor is inoculated with 10 liters of a sterile and concentrated Porphyridium cruentum culture. Bubbling in air and CO 2 ensures the culture a permanent mixing of the cells and a maintenance of the pH around the neutrality.
  • the culture of Porphyridium cruentum is carried out at a temperature of 20 ° C.
  • the measured parameters are: pH, T °, O 2 , DO.
  • the culture is carried out at a pH of between 7.5 and 8 and at a temperature between 19 and 23 ° C.
  • the culture is conducted to obtain a cell concentration corresponding to an optical density of 0.112 at the wavelength of 440 nm.
  • the culture is centrifuged (16500 revolutions / min) and the clarified culture medium obtained is filtered on l ⁇ m in order to eliminate the residual cells.
  • a new photobioreactor disinfected with Deptil PA 5 is filled with the 300 liters of the clarified filtered Porphyridium Cruent obtained previously.
  • Phaeodactylum tricornutum 1 10 Liters of a sterile culture and concentrated Phaeodactylum tricornutum 1 serve as inoculum for culture. Bubbling in air and CO 2 ensures the culture a permanent mixing of the cells and a maintenance of the pH around the neutrality.
  • the culture of Phaeodactylum tricornutum is carried out at a temperature of 20 ° C.
  • the measured parameters are: pH, T °, O 2 , DO.
  • the culture is carried out at a pH between 6.5 and 8, and at a temperature between 19 and 23 ° C.
  • the culture is conducted until the stationary phase is obtained.
  • the culture is centrifuged (16500 rev / min) and the clarified culture medium obtained is conditioned and stored in a cold room.
  • a photobioreactor after Deptil PA 5 disinfection, is filled with 300 Liters of Marine Water from Grande Ile.
  • a sterile nutrient medium (CONWAY medium) is added to Seawater.
  • composition of the nutrient medium is as follows
  • Vitamin B 12 1.10 "5 g / L
  • the photobioreactor is inoculated with 10 liters of a sterile and concentrated Phaeodactylum tricornutum culture and then with 10 liters of a sterile and concentrated Skeletonema costatum culture. Bubbling in air and CO 2 ensures the culture a permanent mixing of the cells and a maintenance of the pH around the neutrality.
  • the co-culture of Phaeodactylum tricornutum and Skeletonema costatum is carried out at a temperature of 20 ° C.
  • the culture is carried out at a pH of between 7 and 8, and at a temperature of between 21 and 23 ° C.
  • the culture is conducted until a cell concentration corresponding to an optical density of 0.250 to the length is obtained. wave of 440 nm.
  • the co-culture is centrifuged (16500 rev / min) and the clarified product obtained is conditioned and stored in a cold room.
  • Example 5 Preparation of a clarified culture medium from a culture of Skeletonema costatum.
  • a sterile nutrient medium (CONWAY medium) is added to the Marine Source Water of Ile Grande.
  • composition of the nutrient medium is as follows
  • the pool is inoculated with 2500L of a concentrated culture of the microalga Skeletonema costatum.
  • the bubbling provided by 2 bubbler ramps located on each side of the basin, brings to the culture of air and CO2, and thus allows a permanent mixing of the cells.
  • Skeletonema costatum is cultivated at a pH of 7 thanks to an automatic regulation in CO2 and a temperature of 2O 0 C.
  • the culture is carried out at a pH of between 7 and 8, and at a temperature between 20 and 23 ° C.
  • the culture is conducted until a cell concentration corresponding to an optical density of about
  • the culture After ten days, the culture is centrifuged (16500 revolutions / min) and the clarified culture medium obtained is conditioned and stored in a cold room. The clarified culture medium is then concentrated and desalted by nanofiltration + diafiltration
  • An outdoor pool is filled with water from an underground aquifer.
  • the pool is inoculated with a concentrated culture of the microalga Skeletonema costatum.
  • the culture is conducted until a cell concentration corresponding to an optical density of at least 0.600 at the wavelength of 440 nm is obtained.
  • the culture is centrifuged (16500 rpm) and the clarified culture medium obtained is conditioned and stored in a cold room.
  • the method consists in visualizing on human melanocytes the depigmenting potential of a composition tested by inhibition of L-DOPA oxidase (one of the enzymes responsible for the synthesis of melanins).
  • the reaction is carried out by mixing the depigmenting composition and L-DOPA.
  • the reaction is visualized by the intensity of melanocyte staining on separate epidermis.
  • the 100% activity control (maximum staining) is carried out in the presence of L-DOPA (substrate of L-DOPA oxidase).
  • the positive control (minimum staining) is carried out in the presence of L-DOPA supplemented with 0.015% kojic acid.
  • Kojic acid is known for its depigmenting activity.
  • the clarified culture media tested are respectively:
  • the epidermals used are those from a frozen mammoplasty.
  • the epidermis are separated by incubation in 2N NaBr (45 ° C.) at 37 ° C.
  • the epidermides are fixed in a buffered formaldehyde fixative, are rinsed and brought into contact with the volume / volume mixture: solutions of L-DOPA (substrate) / clarified culture medium (50 ⁇ g of freeze-dried extract / ml of assay medium) .
  • the epidermis are rinsed, mounted between slide and coverslip with Montage Medium mounting liquid (aqueous mixture containing glycerol and allowing perfect preservation of the sample).
  • Montage Medium mounting liquid aqueous mixture containing glycerol and allowing perfect preservation of the sample.
  • the observation is performed by optical microscopy (objective x 10).
  • KHN primocultures are obtained from isolated cells of cutaneous samples from plastic surgery. KHNs are seeded at the density of 20,000 cells per well (KSFM specific culture medium, Life Technologies) in a 96-well microplate. The cells are incubated in a humid incubator at 37 ° C. under 5% CO 2 for 24 hours. The cells are then treated for the next 24 hours with the different clarified culture media to be tested at the same time as they are stimulated with IL-1 at 1 ng / ml.
  • KSFM specific culture medium Life Technologies
  • Cells are left untreated and others are treated only by IL-1 ⁇ .
  • Culture supernatants containing IL-8 are stored at -20 ° C. until the assay.
  • Human IL-8 is quantified using the Quantikine ELISA Microplate Assay (Quantikine Human Kit IL-8 D8050, R & D Systems). The test uses the enzyme immunoassay method of the sandwich. A monoclonal antibody specific for IL-8 was precoated on a microplate.
  • IL-8 is present, it is trapped between the immobilized antibody and the conjugated polyclonal antibody. After washing eliminating any non-adhered substances, a Substrate solution (hydrogen peroxide and tetramethylbenzidine) is added to the wells. Staining develops in proportion to the amount of IL-8 trapped. The color reaction is stopped and the staining intensity (OD) measured at 450 nm.
  • a Substrate solution hydrogen peroxide and tetramethylbenzidine
  • a protein assay for each well of the microplate is performed.
  • the method used is that of bicinchoninic acid (or BCA).
  • BCA bicinchoninic acid
  • the supernatants are frozen and the wells rinsed with PBS without Ca ++ nor Mg ++ (Gibco).
  • the cell layer is dissolved with 0.1M NaOH solution.
  • a mixture of bicinchoninic acid and copper sulfate (50V / IV) is added.
  • the plate is placed at 37 ° C under 5% CO 2 in the dark. After 30 minutes, the absorbance at 570 nm is measured.
  • a standard range is made from a stock solution of BSA (Bovine serum albumin) 1 mg / ml (P0914, SIGMA) making it possible to convert the ODs into quantities ( ⁇ g of proteins).
  • the final result is expressed in ⁇ g / ml of IL-8 / ⁇ g of proteins (obtained by the BCA assay).
  • Interleukin 8 release reflects an inflammatory terrain; therefore, by inhibiting the release of IL-8, an inflammatory condition of the skin is combated.
  • Dunalliela primolecta therefore has in vitro anti-inflammatory properties.
  • Example 8 Anti-Radical Protocol -Test3D (DNA Damaqed Detection); Quantitative analysis of the protective effects of a clarified culture medium of the invention.
  • the clarified culture media tested are Scenedesmus dimorphus and Nostoc commune.
  • the measurement of the anti-free radical power is carried out using a dosing kit (IDN No. 003) marketed by SFRI Laboratoire (F-Saint Jean d'Illac) for the purpose of highlighting the protection DNA with potentially anti-free radical extracts against hydroxyl radical damage (represented by "OH"), radicals generated by the Fenton reaction below:
  • washing solution phosphate buffer, pH 7
  • ultra-pure water containing no traces of metals are then added and the water is then removed by suction. . We repeat the operation once.
  • the clarified culture media to be tested are distributed: 50 ⁇ l of each diluted sample is distributed per well (the clarified culture media being tested in a concentration zone ranging from pure to a dilution of 1/100 ).
  • the mixture is incubated for 30 minutes at 30 ° C. with gentle stirring.
  • the wells are washed 3 times.
  • the DNA lesions are repaired by an enzymatic repair system (mixture supplied in the dosing kit and patented by the supplier) at the rate of 50 ⁇ l. by well of repair in each well.
  • the plate is covered with an adhesive film and incubated for 3 hours at 30 ° C. without stirring.
  • the wells are washed 3 times. 50 ⁇ l of the revealing solution I (avidin-labeled nucleotide peroxidase) are dispensed into all the wells.
  • the plate is covered with an adhesive film and incubated for 15 minutes at 30 ° C. with gentle stirring.
  • the wells are washed 5 times.
  • 50 ⁇ l of the revealing solution II chemiluminescent substrate of avidin peroxidase
  • the plate is read with a luminometer.
  • Table 1 below represents the values obtained for the clarified culture medium of Scenedesmus dimorphus.
  • the clarified culture medium of Scenedesmus dimorphus has an IC50 (concentration allowing to obtain 50% inhibition of the effect of free radicals) close to 0.01 mg / ml.
  • the cells During external stress such as prolonged exposure to ultraviolet radiation or pollution etc ..., the cells express a high level of free radicals, resulting in deleterious effects on the cell (degradation of proteins, lipids, DNA damage, cell death).
  • An extract with an anti-radical property such as Scenedesmus dimorphus extract will allow the cell to better defend itself.
  • Table 2 below represents the values obtained for the clarified Nostoc culture medium.
  • Nostoc commune has an IC50 (concentration to obtain 50% inhibition of the effect of free radicals) close to 1 mg / ml.
  • An extract with an anti-radical property like the common Nostoc extract will allow the cell to better defend itself.
  • Example 9 Test3D (DNA Damaged Detection): Demonstration of the repairing effects of a clarified culture medium of the invention on DNA.
  • the clarified culture medium tested is Skeletonema costatum.
  • the measurement of the repairing power of the DNA is carried out using a kit of assay (ref IDN 003) marketed by the company SFRI Laboratoire (F-Saint Jean d'Illac) aiming at the highlighting of activation of DNA repair by extracts to repair lesions caused by hydroxyl radicals (represented by "OH 0 "), radicals generated by the Fenton reaction below:
  • washing solution phosphate buffer, pH 7
  • ultra-pure water containing no traces of metals are then added and the water is then removed by suction. . We repeat the operation once.
  • the mixture is incubated for 30 minutes at 30 ° C. with gentle stirring.
  • the wells are washed 3 times.
  • the DNA lesions are repaired by an enzymatic repair system (mixture supplied in the assay kit and patented by the supplier) at a rate of 50 ⁇ l per well of repair in each well.
  • the plate is covered with an adhesive film and incubated for 3 hours at 30 ° C. without stirring.
  • the wells are washed 3 times. 50 ⁇ l of the revealing solution I (avidin-labeled nucleotide peroxidase) are dispensed into all the wells.
  • the plate is covered with an adhesive film and incubated for 15 minutes at 30 ° C. with gentle stirring.
  • the wells are washed 5 times.
  • 50 ⁇ l of the revealing solution II chemiluminescent substrate of avidin peroxidase
  • the mixture is incubated for 5 minutes at 30 ° C. with gentle stirring in the dark.
  • the plate is read with a luminometer.
  • the cells During external stress, the cells express a high level of free radicals, resulting in deleterious effects on the cell, including lesions on the DNA.
  • An extract showing the ability to increase the speed of repair of the damaged DNA such as Skeletonema costatum extract, will allow the cell to recover its DNA capital more quickly.
  • Example 10 Cosmetic depigmenting emulsion of a clarified culture medium of Tetraselmis suecica.
  • composition of a depigmenting cosmetic emulsion of the invention is for example:
  • Example 11 Anti-dry skin protective powder for bathing clarified culture medium of Scenedesmus acutus.
  • the clarified culture medium of Scenedesmus acutus is obtained according to Example 2, then is concentrated by thermal evaporation and lyophylized until a homogenize powder before packaging in 20 g bags for use in the bath.
  • the clarified culture medium of Dunalliela primolecta is obtained according to the protocol described below.
  • a photobioreactor after disinfection with Deptil PA 5, is filled with 300 Liters of fresh water.
  • a sterile nutrient medium (CONWAY medium) is added to the fresh water.
  • composition of the nutrient medium is as follows:
  • Na 2 EDTA 0.045 g / L
  • Na 2 NO 3 0.1 g / L
  • Vitamin B 1 2.10 "4 g / L
  • Vitamin B 12 1.10 " 5 g / L
  • the photobioreactor is inoculated with 10 liters of a sterile and concentrated Dunaliella primolecta culture. Bubbling in air and CO 2 ensures the culture a brewing cells and maintaining pH around neutrality.
  • the Dunaliella culture is carried out at a temperature around 20 ° C.
  • the culture is carried out at a pH between 6.5 and 8, and at a temperature between 19 and 27 ° C.
  • the culture is conducted to obtain a cell concentration corresponding to an optical density of 0.6 at the wavelength of 438 nm.
  • the culture is centrifuged (16500 rpm).
  • the invention is for example:
  • the clarified culture medium of Scenedesmus dimorphus is prepared according to the following protocol:
  • a photobioreactor after disinfection with Deptil PA 5, is filled with 300 Liters of fresh water.
  • a sterile nutrient medium (MLA medium) is added to the fresh water.
  • composition of the nutrient medium is as follows:
  • Vitamin B 1 1. 10 "4 g / L
  • Vitamin B 12 5. 10 ⁇ 8 g / L
  • Vitamin H 5. 10 "8 g / L
  • the photobioreactor is inoculated with 10 Liters of a sterile and concentrated culture of Scenedesmus dimorphus. Bubbling in air and CO 2 ensures the culture a permanent mixing of the cells and a maintenance of the pH around the neutrality.
  • the culture of Scenedesmus is carried out at a temperature of 20 ° C.
  • the measured parameters are: pH, T °, O 2 , DO.
  • the culture is carried out at a pH between 6.5 and 8, and at a temperature between 17 and 23 ° C.
  • the culture is conducted until a cell concentration corresponding to an optical density of 1.8 at the wavelength of 677 nm is obtained.
  • the culture is centrifuged (16500 rev / min) and the clarified product is conditioned and stored in a cold room.
  • the clarified culture medium is then concentrated by thermal evaporation
  • composition of a bioprotective foundation of the invention is for example:
  • Example 14 Tablet for oral absorption.
  • composition of a tablet for oral absorption is for example:
  • clarified culture medium obtained from a co-culture of Phaeodactylum tricornutum and Skeletonema costatum as described in Example 4 and then freeze-dried

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Abstract

La présente invention a pour objet une composition cosmétique, dermatologique, pharmaceutique ou alimentaire, caractérisée en ce qu'elle comprend un milieu de culture d'au moins un microorganisme marin et/ou d'eau douce photosynthétique, ledit milieu étant clarifié.

Description

COMPOSITION COMPRENANT UN MILIEU DE CULTURE DE MICROORGANISME MARIN ET/OU D'EAU DOUCE PHOTOSYNTHÉTIQUE.
La présente invention concerne une composition comprenant, à titre de principe actif, un milieu de culture clarifié de microorganisme marin et/ou d'eau douce photosynthétigue.
L'utilisation de microorganismes dans le domaine de la cosmétique ou de la pharmacie est connue de l'art antérieur. Le document EP 0 876 813 décrit une composition cosmétique ou pharmaceutique comprenant, à titre de principe actif, une quantité efficace de milieu de culture d'au moins une bactérie filamenteuse non photosynthétique, ledit milieu étant clarifié et stabilisé. Il a notamment été découvert dans le document EP 0 876 813 que le milieu de culture clarifié et stabilisé présentait des propriétés similaires de celles de la biomasse.
La recherche d'ingrédients biologiquement actifs est un domaine en plein développement car c'est un moyen pour augmenter la performance de produits devant présenter une activité biologique qui est nécessaire au développement de produits cosmétiques, dermatologiques, pharmaceutiques et alimentaires. L'activité biologique est mesurée grâce à des modèles biologiques qui vont permettre de comparer entre eux plusieurs ingrédients afin de ne retenir que le ou les meilleurs sur le modèle considéré.
Par exemple, les biologistes ont développé de nombreux modèles qui permettent de sélectionner des extraits et molécules actives sur des mécanismes biologiques importants pour réguler le métabolisme cutané. Les actifs, sélectionnés grâce à ces modèles, peuvent ainsi être incorporés dans des produits cosmétiques et/ou dermatologiques qui seront bénéfiques sur des paramètres cutanés qui auront été préalablement ciblés. La même approche est valable pour le développement de produits pharmaceutiques, diététiques et alimentaires qui s'appuient également sur l'activité biologique démontrée sur des modèles.
La recherche d'ingrédients biologiquement actifs s'appuie sur des criblages de nombreux ingrédients sur des modèles biologiques judicieusement choisis par l'homme de l'art. Généralement, les ingrédients proviennent de plantes qui ont été préalablement sélectionnées par diverses méthodes. L'ethnobotanique est l'approche la plus utilisée. Elle consiste à étudier préférentiellement des plantes dont l'utilisation est déjà existante dans des usages traditionnels ou par les médecines anciennes. La plante sélectionnée est testée sur des modèles biologiques appropriés. Pour chaque plante de nombreux tests sont à réaliser sur différents organes de la plante et sur différents modes d'extractions. Dans le cas de plantes sélectionnées par l'approche ethnobotanique, l'usage traditionnel oriente le chercheur vers le ou les modèles biologiques à mettre en œuvre. L'approche ethnobotanique est très efficace pour la sélection de végétaux terrestres, ce qui n'est cependant pas le cas des végétaux marins qui sont peu, voir pas du tout connus pour des usages traditionnels.
La présente invention concerne la découverte, la mise au point et l'utilisation d'une nouvelle famille d'actifs particulièrement intéressante. Cette nouvelle famille est issue du monde marin et/ou d'eau douce et plus précisément de milieux marins et/ou d'eau douce contenant des microorganismes. Ces microorganismes appartiennent aux différentes familles des microalgues et bactéries marines (=les cyanobactéries) , largement répandues dans les mers, océans, lacs, rivières et étangs, communément appelées phytoplanctons.
La présente invention a plus particulièrement pour objet une composition cosmétique, dermatologique, pharmaceutique ou alimentaire, de préférence cosmétique, caractérisée en ce qu'elle comprend un milieu de culture d'au moins un microorganisme marin et/ou d'eau douce photosynthétique, ledit milieu étant clarifié.
Généralement, les microorganismes sont cultivés dans des conditions standardisées afin de fournir une biomasse qui est habituellement obtenue par centrifugation. Cette biomasse peut alors subir les mêmes techniques d'extraction que celles utilisées pour les végétaux terrestres, et peut donc en conséquence aboutir a des molécules et extraits biologiquement actifs.
Cependant, dans le cas de la présente invention, ce n'est pas la biomasse qui est utilisée comme source de nouvelles substances actives mais c'est le milieu débarrassé de la biomasse.
Par « milieu de culture clarifié », on entend un milieu de culture dont la biomasse a été éliminée, c'est-à- dire élimination de l'ensemble des microorganismes et débris cellulaires présents dans le milieu de culture. Cette élimination peut être effectuée par des techniques bien connues de l'homme du métier telles que la filtration ou la centrifugation.
De façon surprenante, la Demanderesse a découvert que les propriétés du milieu de culture clarifié étaient différentes de celles de la biomasse. Ainsi lorsque le milieu de culture clarifié de la présente invention présente des propriétés cosmétiques, dermatologiques, pharmaceutiques et alimentaires particulièrement intéressantes ceci n'est pas forcément le cas de la biomasse ayant servi à obtenir ledit milieu de culture clarifié.
Le milieu de culture clarifié entrant dans la composition de l'invention désigne le milieu de culture obtenu après amplification du ou des microorganismes mis en culture, et après séparation de l'ensemble des microorganismes et débris cellulaire du milieu de culture. Le milieu de culture clarifié ne contient alors plus que les substances sécrétées résultantes de la culture du ou des microorganismes, encore dénommées substances actives.
Les substances actives désignent notamment les métabolites primaires et secondaires synthétisés et relargués par les cellules dudit ou desdits microorganisme(s) marin(s) et/ou d'eau douce, lesdits métabolites pouvant être excrétés durant l'activité cellulaire ou bien libérés après lyse des cellules. Ces substances actives peuvent désigner des molécules de nature diverses : enzymes, peptides, acides aminés, vitamines, polysaccharides, etc ..., et possèdent différentes propriétés biologiques à même de jouer un rôle dans le secteur de la cosmétique, de la pharmacie ou de la nutrition.
La Demanderesse a montré que, suivant la nature du milieu de culture, le choix du ou des microorganismes cultivés et du protocole de culture développé, de nouvelles substances actives très intéressantes pouvaient être produites pour des applications cosmétiques, dermatologiques, pharmaceutiques et alimentaires. La composition de l'invention est remarquable en ce qu'elle présente des propriétés cosmétiques particulièrement avantageuses, notamment dépigmentantes et anti-oxydantes, grâce aux substances actives présentes dans le milieu clarifié.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le microorganisme marin et/ou d'eau douce photosynthétique est une cyanobactérie et/ou une microalgue issue(s) de milieux aquatiques tels que mer, océan, eau saumâtre, eau saline ou eau douce. L'eau saline désigne une eau présentant divers degrés de salinité allant de 35 g/L à 90 g/L.
De préférence, le microorganisme marin photosynthétique est une cyanobactérie et/ou une microalgue est issue de milieux marins.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le microorganisme marin et/ou d'eau douce photosynthétique est une cyanobactérie et/ou une microalgue appartenant à la division des chlorophytes choisie(s) dans le groupe constitué par les cyanophytes, les chlorophytes, les chrysophytes, les chlorarachniophytes, les dinophytes, les cryptophytes, les euglenophytes ou les rhodophytes.
Plus particulièrement, la cyanobactérie et/ou microalgue est choisie dans le groupe constitué par la classe des cyanophycées, des chlorophycées, des prasinophycées, des pedinophycées, des prymnesiophycées, des eustigmatophycées, des raphidophycées, des chrysophycées, des diatomophycées, des tribophycées, des chlorarachniophycées, des dinophycëes, des cryptophycées, des euglenophycées et des rhodophycées.
De préférence, le microorganisme marin et/ou d'eau douce est une microalgue. Parmi les microalgues utilisables, on peut citer par exemple :
Nostoc commune, Synechococcus sp. et Synechocystis sp, de la classe des cyanophycées ;
- Scenedesmus dimorphus, Scenedesmus acutus,
Dunaliella primolecta, Dunaliella tertiolecta, Dunaliella bardawil, Neochloris oleobundans, Clamydomonas reinhardtii, Botryococcus braunii, Chlorococcum oleofaciens, Dysmorphococcus globosus, Hormotilopsîs gelatinosa, Ulothrix acuminata et Ourococcus sp, de la classe des chlorophycées ;
Tetraselmis suecica, de la classe des prasinophycées ;
- Pavlova lutheri et Isochrysis galbana, de la classe des prymnésiophycées ;
- Nannochloropsis oculata, de la classe des eustigmatophycées ;
- Phaeodactylum tricornutum, Skeletonema costatum, Chaetoceros calcitrans, Cyclotella sp, Thaïassiosira pseudonana et Navicula pelliculosa, de la classe des diatomophycées ;
- Porphyridium cruentum et Rhodosorus marinus, de la classe des rhodophycées.
La composition de l'invention est également caractérisée en ce que la quantité du milieu de culture clarifié représente de 0,01% à 100% en poids par rapport au poids total de la composition, de préférence de 0,1 à 75% et l'
de manière particulièrement préférée de 1 à 50% en poids par rapport au poids total de la composition.
La composition de l'invention est encore caractérisée en ce que ledit milieu de culture clarifié est obtenu par un procédé comprenant les étapes suivantes de:
a) sélection d'au moins un microorganisme marin et/ou d'eau douce photosynthétique tel que défini ci-dessus,
b) introduction, dans un milieu de culture, du ou des microorganisme(s) sélectionné(s) lors de l'étape a) précédente,
c) amplification dudit ou desdits microorganismes dans ledit milieu de culture,
d) élimination de l'ensemble des microorganismes obtenus à l'issue de l'étape c) d'amplification, afin d'obtenir un milieu de culture clarifié dudit ou desdits microorganismes marins et/ou d'eau douce photosynthétiques.
L'ensemble des microorganismes obtenus à l'issue de l'étape c) d'amplification constitue la biomasse.
Le milieu de culture clarifié, obtenu à l'issue de l'étape d) d'élimination, peut subir certaines modifications avant son utilisation. Ainsi, il peut par exemple être soumis à une étape supplémentaire de dessalage afin de diminuer sa concentration en chlorure de sodium et faciliter son utilisation dans certaines formulations. Cette étape de dessalage peut être effectuée par des techniques bien connues de l'homme du métier telles que notamment électrodialyse ou la nanofiltration. Le milieu de culture clarifié, obtenu à l'issue de l'étape d) d'élimination, peut également être soumis à une étape supplémentaire de concentration, par élimination d'une partie de l'eau le constituant, ou au contraire à une étape supplémentaire de dilution. Il peut également subir une étape supplémentaire de séchage, notamment par atomisation ou lyophilisation, afin de se 5 présenter sous une forme concentrée et solide plus appropriée pour une utilisation dans certaines applications.
Lorsqu'on sélectionne, dans l'étape a) ci-dessus décrite, au moins deux microorganismes, ces deux microorganismes peuvent être différents. Deux microorganismes .0 différents désignent deux microorganismes, et notamment deux microalgues, appartenant à une espèce différente l'une de l'autre. En outre, ils peuvent appartenir à une classe différente et/ou à un genre ou à un ordre différent.
Le milieu de culture de l'étape b) (dans lequel
.5 est introduit au moins un microorganisme) est choisi dans le groupe constitué par l'Eau de Source Marine de l'Ile Grande, l'eau de mer, l'eau d'océan, l'eau saumâtre, l'eau saline, l'eau douce, un milieu de culture clarifié d'au moins un microorganisme ou leurs mélanges. Avantageusement, ledit !0 milieu de culture comprend de l'Eau de Source Marine de l'Ile Grande.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le milieu de culture de l'étape b) (dans lequel est introduit au moins un microorganisme) est un milieu de 15 culture clarifié d'au moins un microorganisme marin et/ou d'eau douce photosynthétique tel que défini ci-dessus ou tel qu'obtenu à l'issue du procédé tel que décrit ci-dessus.
Selon un mode de réalisation avantageux, le milieu de culture de l'étape b) peut être enrichi en éléments 30 nutritifs choisis dans le groupe constitué par les minéraux, les oligo-éléments et les vitamines. La culture (étape c) d'amplification) peut être effectuée à la température appropriée convenant à l'espèce du ou des microorganisme(s) cultivé(s), et notamment de la ou des microalgue(s) cultivëe(s). Généralement, cette température est comprise entre 15 et 25°C suivant la nature de l'espèce cultivée.
Le pH du milieu de culture est compris entre 2 et 12, et de préférence entre 7 et 8 suivant la nature de l'espèce cultivée.
Chaque jour différents paramètres sont mesurés
(densité optique, concentration cellulaire, température, oxymétrie etc.) afin de suivre l'évolution de la croissance cellulaire dans le milieu de culture.
Cette étape d'amplification est effectuée jusqu'à obtenir une concentration souhaitée en microalgue et/ou en cyanobactérie. À titre d'exemple, cette étape d'amplification est effectuée jusqu'à obtenir une densité optique comprise entre 0,1 et 3,0, de préférence comprise entre 0,2 et 2.
L'étape d) d'élimination de l'ensemble des microorganismes obtenus à l'issue de l'étape c) d'amplification peut être obtenue par toute technique classique, comme par exemple la centrifugation ou la filtration, et de préférence la centrifugation. Cette étape d) permet de séparer la biomasse du milieu de culture et d'obtenir le milieu de culture clarifié.
Le milieu de culture clarifié peut être obtenu à différents stades physiologiques de la culture, en fonction des substances actives que l'on recherche (début ou fin de phase exponentielle de croissance, phase stationnaire) . Selon un mode de réalisation de l'invention, le milieu de culture clarifié, obtenu à l'issue du procédé tel que décrit ci-dessus, comprend par exemple :
- de l'Eau de Source marine de l'Ile Grande (Bretagne, France), éventuellement enrichie en éléments nutritifs. Les inventeurs ont mis en évidence que cette eau, riche en sels minéraux et en oligo-éléments (zinc, manganèse, silice, calcium, potassium, magnésium) et qui présente une pureté importante permet non seulement une croissance améliorée des cultures de microalgues et de cyanobactéries, mais permet aussi d'obtenir un milieu de culture clarifié dont les propriétés, notamment à des fins cosmétiques, sont nettement améliorées par rapport à des milieux de culture standards.
- des métabolites primaires et secondaires synthétisés et relargués par les cellules microalguales elles-mêmes (substances actives) .
Cependant, selon les microalgues cultivées, l'Eau de Source Marine de 1 ' Ile Grande peut être mélangée avec de l'eau de mer, de l'eau douce ou de l'eau saumâtre, voir remplacée par ces dernières. L'Eau de Source Marine de l'Ile Grande peut aussi être remplacée par le milieu de culture clarifié d'une autre microalgue, voir par son propre milieu de culture clarifié.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, une microalgue peut donc être cultivée dans son propre milieu de culture clarifié ou alors dans le milieu de culture clarifié d'une autre microalgue, avec ou sans ajout de milieu nutritif (concept de la "Clarificulture", terme inventé par la Demanderesse). De même, ainsi que cela a déjà été mentionné, deux microalgues ou plus, identiques ou différentes, peuvent être cultivées dans le même milieu de culture (concept de la co-culture).
De même, chaque milieu nutritif (comprenant des minéraux, des oligo-éléments, des vitamines ...) est spécifique de chaque microalgue et de sa croissance, et peut varier d'une microalgue à l'autre.
Le type et la concentration en substances actives synthétisées par les cellules microalguales sont fonctions de l'espèce de microalgue cultivée, de la phase physiologique de croissance et des conditions environnementales.
Chaque culture de microalgues, nécessaire à l'obtention de milieux de culture clarifiés, est réalisée dans des photobioréacteurs ou des bassins. Un petit volume d'une solution concentrée en microalgues sert d'inoculum pour démarrer la culture.
La composition selon l'invention est encore caractérisée en ce qu'elle contient au moins un autre ingrédient actif. Cet ingrédient peut être tout actif utile aux propriétés de la composition.
L'ingrédient actif pouvant supplémenter les compositions de l'invention peut également provenir de la biomasse telle qu'obtenue à l'issue de l'étape d) d'élimination telle que définie ci-dessus.
Selon un mode de réalisation avantageux, le milieu de culture clarifié, utilisé comme agent actif dans les compositions de l'invention, est vectorisé dans des liposomes ou autres vecteurs afin de favoriser leur activité pharmaceutique, cosmétique, dermatologique ou alimentaire. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un milieu de culture clarifié d'au moins un microorganisme marin et/ou d'eau douce photosynthétique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
a) la sélection d'au moins un microorganisme marin et/ou d'eau douce photosynthétique tel que défini ci-dessus,
b) l'introduction, dans un milieu de culture, du ou des microorganisme(s) sélectionné(s) lors de l'étape a) précédente,
c) l'amplification dudit ou desdits microorganismes dans ledit milieu de culture,
d) l'élimination de l'ensemble des microorganismes obtenus à l'issue de l'étape c) d'amplification, afin d'obtenir un milieu de culture clarifié dudit ou desdits microorganismes marins et/ou d'eau douce photosynthétiques.
Les étapes du procédé selon l'invention sont effectuées telles que décrites précédemment.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé de préparation de l'invention est caractérisé en ce que l'on procède en outre à une étape de criblage du milieu de culture clarifié tel que défini ci-dessus, ou tel qu'obtenu selon le procédé tel que défini ci-dessus, afin d'évaluer les propriétés pharmaceutiques, cosmétiques, dermatologiques ou alimentaires dudit milieu de culture clarifié.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un milieu de culture clarifié tel que défini précédemment comme principe actif cosmétique à activité éclaircissante et/ou dépigmentante, de préférence de la peau.
Avantageusement, le milieu de culture clarifié utilisé comme principe actif cosmétique éclaircissement et/ou dépigmentant est un milieu de culture d'une microalgue de la classe des prasinophycées, de préférence une microalgue du genre Tetraselmis, et de manière particulièrement préférée Tetraselmis suecica.
L'invention concerne encore l'utilisation d'un milieu de culture clarifié tel que défini précédemment principe actif cosmétique à activité protectrice contre les radicaux libres, afin de lutter contre le vieillissement, de préférence contre le vieillissement de la peau.
Avantageusement, le milieu de culture clarifié utilisé comme principe actif cosmétique anti-radicaux libres est un milieu de culture d'une microalgue de la classe des cyanophycées et/ou des chlorophycées, de préférence une microalgue du genre Nostoc et/ou Scenedesmus, et de manière particulièrement préférée Nostoc commune et/ou Scenedesmus acutus.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un milieu de culture clarifié tel que défini précédemment pour la préparation d'une composition pharmaceutique permettant de lutter contre la sensibilité cutanée et les réactions inflammatoires.
Avantageusement, le milieu de culture clarifié est un milieu de culture d'une microalgue de la classe des chlorophycées, de préférence une microalgue du genre
Dunaliella, et de manière particulièrement préférée Dunaliella primolecta. L'invention concerne également l'utilisation d'un milieu de culture clarifié tel que défini précédemment comme principe actif cosmétique permettant de lutter contre la sensibilité cutanée et les réactions inflammatoires.
Avantageusement, le milieu de culture clarifié utilisé comme principe actif cosmétique anti-inflammatoire est un milieu de culture d'une microalgue de la classe des chlorophycées, de préférence une microalgue du genre Dunaliella, et de manière particulièrement préférée Dunaliella primolecta.
L'invention concerne encore l'utilisation d'un milieu de culture clarifié tel que défini précédemment comme principe actif cosmétique à activité pigmentante sur la peau et le cheveu.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un milieu de culture clarifié tel que défini précédemment comme principe actif cosmétique à activité amincissante.
L'invention concerne encore l'utilisation d'un milieu de culture clarifié tel que défini précédemment comme principe actif cosmétique à activité bronzante.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un milieu de culture clarifié tel que défini précédemment comme principe actif cosmétique favorisant la pousse et la repousse du cheveu.
L'invention concerne encore l'utilisation d'un milieu de culture clarifié tel que défini précédemment comme principe actif cosmétique à activité raffermissante, tonifiante, stimulante, équilibrante. L'invention concerne enfin l'utilisation d'un milieu de culture clarifié tel que défini précédemment comme principe actif cosmétique anti-stress, notamment pour améliorer la réparation de l'ADN.
Avantageusement, le milieu de culture clarifié utilisé comme principe actif cosmétique anti-stress est un milieu de culture d'une microalgue de la classe des diatomophycées, de préférence du genre Skeletonema, et de manière particulièrement préférée Skeletonema costantum.
La présente invention a également pour objet un procédé de traitement cosmétique comprenant l'application à un sujet d'une quantité efficace, de préférence sur la peau, d'un milieu clarifié tel que décrit précédemment.
Avantageusement, le procédé de traitement cosmétique selon l'invention est destiné aux utilisations cosmétiques telles que décrites précédemment.
La figure 1 illustre la réaction à la Dopa-Oxydase sur épiderme séparé. Le carré en haut à gauche représente le témoin DOPA, le carré en haut à droite représente l'acide kojique, le carré en bas à gauche représente le milieu de culture clarifié de Phaeodactylum tricornutum et le carré en bas à droite représente le milieu de culture clarifié de Tetraselmis suecica.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent. Ces exemples illustrent l'invention sans la limiter aucunement. Exemple 1 : préparation d'un milieu de culture clarifié issu d'une culture de Tetraselmis suecica, et son utilisation cosmétique en tant que dépigmentant.
Un bassin situé sous une serre, après désinfection au Deptil PA 5, est rempli avec 20 m3 d'Eau de Source Marine de l'Ile Grande.
Un milieu nutritif stérile (milieu CONWAY) est ajouté à l'Eau de Source Marine de l'Ile Grande.
La composition du milieu nutritif est la suivante
Na2 EDTA : 0,045 g/L
Na2 NO3 : 0,1 g/L
H3BO3 : 0 , 0336 g/L NaH2PO4 , 2H2O : 0 , 026 g/L
MnCl2 , 4H2O : 3 , 6 . 10"4 g/L
FeCl3 : 6H2O : 1 , 3 . 10"3 g/L
ZnCl2 : 2 , 1. 10's g/L
CoCl2, 6H2O : 2.10"5 g/L (NH4J6Mo7O24, 4H2O : 9.10"6 g/L
CuSO4, 5H2O : 2.10"5 g/L
Vitamine B1 : 2.10"4 g/L
Vitamine B12 : 1.10"5 g/L
On inocule le bassin avec 2500L d'une culture concentrée de la microalgue Tetraselmis suecica.
Le bullage, assuré par 2 rampes de bulleurs situés de chaque côté du bassin, apporte à la culture de l'air et du C02, et permet ainsi un brassage permanent des cellules. Tetraselmis suecica est cultivée à un pH de 7 grâce à une régulation automatique en CO2 et à une température de 2O0C.
Un suivi hebdomadaire de la culture est effectué afin d'évaluer la croissance cellulaire. Les paramètres mesurés sont les suivants : pH, T°, O2, DO.
La culture est effectuée à un pH compris entre 7 et 8, et a une température comprise entre 20 et 23°C. La culture est menée jusqu'à l'obtention d'une concentration cellulaire correspondant à une densité optique de 0,300 à la longueur d'onde de 435 nm.
Après une dizaine de jours, la culture est centrifugée (16500 tours/min) et le milieu de culture clarifié obtenu est conditionné et stocké en chambre froide.
Le milieu de culture clarifié est ensuite concentré et dessalé par nanofiltration + diafiltration (seuil de coupure de la membrane = 1000 daltons) afin d'atteindre l'isotonie et pouvoir être incorporé dans des compositions cosmétiques à activité dépigmentante.
Exemple 2 ; Obtention d'un milieu de culture clarifié issu d'une culture de Scenedesmus acutus, et son utilisation cosmétique en tant qu'anti-oxydant.
Un photobioréacteur, après désinfection au Deptil
PA 5, est rempli avec 300 Litres d'eau douce.
Un milieu nutritif stérile (milieu MLA) est ajouté à l'eau douce. La composition du milieu nutritif est la suivante
Na2 EDTA : 4,36.10"3g/L
FeCl3 : 6H2O : 1,58.10"3 g/L NaHCO3 : 0,6.1(T3 g/L
MnCl2, 4H2O : 0,36.10"3 g/L
CuSO4, 5H2O : 1.10-5 g/L
ZnSO4, 7H2O : 2,2.10~s g/L
CoCl2, 6H2O : 1.10"5 g/L MgSO4 : 4,95. 10"2 g/L
NaN03 : 0,17 g/L
H3BO3 : 2,47. 10"3 g/L
NaHCO3 : 4,23. 10"3 g/L
K2HPO4 : 3,475. 10"2 g/L CaCl2 : 2,94. 10"2 g/L
Vitamine B1 : 1. 10"4 g/L
Vitamine B12 : 5. 10"8 g/L
Vitamine H : 5. 10"8 g/L
Le photobioréacteur est inoculé avec 10 Litres d'une culture stérile et concentrée de Scenedesmus acutus. Un bullage en air et en CO2 assure à la culture un brassage permanent des cellules et un maintien du pH aux alentours de la neutralité. La culture de Scenedesmus est réalisée à une température de 200C.
24 heures après l'inoculation, des rampes de néons sont allumées autour de la culture afin d'apporter la lumière essentielle à la photosynthèse.
Un suivi hebdomadaire de la culture est effectué afin d'évaluer la croissance cellulaire. Les paramètres mesurés sont les suivants : pH, τ°, O2, DO. La culture est effectuée à un pH compris entre 6,5 et 8, et à une température comprise entre 17 et 21°C. La culture est menée jusqu'à l'obtention d'une concentration cellulaire correspondant à une densité optique de 1,4 à la longueur d'onde de 679 nm.
Après 15 jours, la culture est centrifugée (16500 tours/min) et le clarifié obtenu est conditionné et stocké en chambre froide.
Le milieu de culture clarifié est ensuite concentré par évaporation thermique afin d'être incorporé dans des compositions cosmétiques à activité anti-oxydante.
Exemple 3 : Culture de Phaeodactylum tricornutum dans le milieu de culture clarifié de Porphyridium cruentum.
Au préalable une culture de Porphyridium cruentum est réalisée de la façon suivante :
Un photobioréacteur, après désinfection au Deptil PA 5, est rempli avec 300 Litres d'Eau de Source Marine de l'Ile Grande.
Un milieu nutritif stérile (milieu CONWAY) est ajouté à l'Eau de mer.
La composition du milieu nutritif est la suivante
Na2 EDTA : 0 , 1 345 g/L
Na2 NO3 : 0 , 1 g/L
H3BO 3 : 0 , 0336 g/L
NaH2 PO4 , 2H2O : 0 , 026 g/L MnCl2, 4H2O : 3,6.10"4 g/L FeCl3 : 6H2O : l,3.10~3 g/L ZnCl2 : 2,1.10"5 g/L CoCl2, 6H2O : 2.10"5 g/L (NH4)6Mθ7024, 4H2O : 9.10'6 g/L CuSO4, 5H2O : 2.10~5 g/L Vitamine B1 : 2.10"4 g/L Vitamine B12 : 1.10"5 g/L
Le photobioréacteur est inoculé avec 10 Litres d'une culture stérile et concentrée de Porphyridium cruentum. Un bullage en air et en CO2 assure à la culture un brassage permanent des cellules et un maintien du pH aux alentours de la neutralité. La culture de Porphyridium cruentum est réalisée à une température de 200C.
24 heures après l'inoculation, des rampes de néons sont allumées autour de la culture afin d'apporter la lumière essentielle à la photosynthèse.
Un suivi hebdomadaire de la culture est effectué afin d'évaluer la croissance cellulaire. Les paramètres mesurés sont les suivants : pH, T°, O2, DO.
La culture est effectuée à un pH compris entre 7,5 et 8, et à une température comprise entre 19 et 23°C. La culture est menée jusqu'à l'obtention d'une concentration cellulaire correspondant à une densité optique de 0,112 à la longueur d'onde de 440 nm.
Après 15 jours, la culture est centrifugée (16500 tours/min) et le milieu de culture clarifié obtenu est filtré sur lμm afin d'éliminer les cellules résiduelles. Un nouveau photobioréacteur désinfecté au Deptil PA 5, est rempli avec les 300 Litres du clarifié filtré de Porphyridium cruenté obtenu précédemment.
10 Litres d'une culture stérile et concentrée de Phaeodactylum tricornutum servent d1 inoculât pour la culture. Un bullage en air et en CO2 assure à la culture un brassage permanent des cellules et un maintien du pH aux alentours de la neutralité. La culture de Phaeodactylum tricornutum est réalisée à une température de 2O0C.
24 heures après l'inoculation, des rampes de néons sont allumées autour de la culture afin d'apporter la lumière essentielle à la photosynthèse.
Un suivi hebdomadaire de la culture est effectué afin d'évaluer la croissance cellulaire. Les paramètres mesurés sont les suivants : pH, T°, O2, DO.
La culture est effectuée à un pH compris entre 6,5 et 8, et à une température comprise entre 19 et 23°C. La culture est menée jusqu'à l'obtention de la phase stationnaire.
Après 10 jours, la culture est centrifugée (16500 tours/min) et le milieu de culture clarifié obtenu est conditionné et stocké en chambre froide.
Exemple 4 : Co-culture de Phaeodactylum tricornutum et de Skeletonema costatum dans un même milieu.
Un photobioréacteur, après désinfection au Deptil PA 5, est rempli avec 300 Litres d'Eau de Source Marine de l'Ile Grande. Un milieu nutritif stérile (milieu CONWAY) est ajouté à l'Eau de mer.
La composition du milieu nutritif est la suivante
Na2 EDTA : 0,045 g/L
Na2 NO3 : 0,1 g/L
H3BO3 : 0 , 0336 g/L
NaH2PO4 , 2H2O : 0 , 026 g/L
MnCl2 , 4H2O : 3 , 6 . 10"4 g/L FeCl3 : 6H2O : 1 , 3 . 10"3 g/L
ZnCl2 : 2 , 1 . 10"5 g/L
CoCl2, 6H2O : 2 . 10"5 g/L
(NH4 ) 6Mo7024, 4H2O : 9 . 1O-6 g/L
CuSO4, 5H2O : 2.10"5 g/L Vitamine B1 : 2.10"4 g/L
Vitamine B12 : 1.10"5 g/L
Silice : 0,04 g/L
Le photobioréacteur est inoculé avec 10 Litres d'une culture stérile et concentrée de Phaeodactylum tricornutum puis avec 10 litres d'une culture stérile et concentrée de Skeletonema costatum. Un bullage en air et en CO2 assure à la culture un brassage permanent des cellules et un maintien du pH aux alentours de la neutralité. La co- culture de Phaeodactylum tricornutum et Skeletonema costatum est réalisée à une température de 20°C.
24 heures après l'inoculation, des rampes de néons sont allumées autour de la co-culture afin d'apporter la lumière essentielle à la photosynthèse. Un suivi hebdomadaire de la co-culture est effectué afin d'évaluer la croissance cellulaire. Les paramètres mesurés sont les suivants : pH, T°, O2, DO.
La culture est effectuée à un pH compris entre 7 et 8, et à une température comprise entre 21 et 230C. La culture est menée jusqu'à l'obtention d'une concentration cellulaire correspondant à une densité optique de 0,250 à la longueur d'onde de 440 nm.
Après 10 jours, la co-culture est centrifugée (16500 tours/min) et le clarifié obtenu est conditionné et stocké en chambre froide.
Exemple 5 : préparation d'un milieu de culture clarifié issu d'une culture de Skeletonema costatum.
1) Culture de Skeletonema costatum dans de l'Eau de Source Marine de l'Ile Grande.
Un bassin situé sous une serre, après désinfection au Deptil PA 5, est rempli avec 20 m3 d'Eau de Source Marine de l'Ile Grande.
Un milieu nutritif stérile (milieu CONWAY) est ajouté à l'Eau de Source Marine de l'Ile Grande.
La composition du milieu nutritif est la suivante
Na2 EDTA : 0,045 g/L
Na2 NO3 : 0,1 g/L H3BO3 : 0,0336 g/L NaH2PO4, 2H2O : 0,026 g/L MnCl2, 4H2O : 3,6.10"4 g/L FeCl3 : 6H2O : 1,3.10"3 g/L ZnCl2 : 2,1.10'5 g/L CoCl2, 6H2O : 2.10"5 g/L (NH4J6Mo7O24, 4H2O : 9.10'6 g/L
CuSO4, 5H2O : 2.10"5 g/L Vitamine B1 : 2.10"4 g/L Vitamine B12 : 1.10"5 g/L Silice : 0,04 g/L
On inocule le bassin avec 2500L d'une culture concentrée de la microalgue Skeletonema costatum.
Le bullage, assuré par 2 rampes de bulleurs situés de chaque côté du bassin, apporte à la culture de l'air et du CO2, et permet ainsi un brassage permanent des cellules.
Skeletonema costatum est cultivée à un pH de 7 grâce à une régulation automatique en C02 et à une température de 2O0C.
Un suivi hebdomadaire de la culture est effectué afin d'évaluer la croissance cellulaire. Les paramètres mesurés sont les suivants : pH, T0, O2, DO.
La culture est effectuée à un pH compris entre 7 et 8, et à une température comprise entre 20 et 23°C. La culture est menée jusqu'à l'obtention d'une concentration cellulaire correspondant à une densité optique d'environ
0,760 à la longueur d'onde de 440 nm.
Après une dizaine de jours, la culture est centrifugée (16500 tours/min) et le milieu de culture clarifié obtenu est conditionné et stocké en chambre froide. Le milieu de culture clarifié est ensuite concentré et dessalé par nanofiltration + diafiltration
(seuil de coupure de la membrane = 1000 daltons) afin d'atteindre l'isotonie et pouvoir être incorporé dans des compositions cosmétiques.
2) Culture de Skeletonema costatum dans de l'eau provenant d'une nappe souterraine.
Un bassin extérieur est rempli avec de l'eau provenant d'une nappe souterraine.
On inocule le bassin avec une culture concentrée de la microalgue Skeletonema costatum.
L'agitation de la culture, permettant un brassage permanent des cellules, est assurée par des rampes de bulleurs situés au fond du bassin.
La culture est menée jusqu'à l'obtention d'une concentration cellulaire correspondant à une densité optique d'au moins 0,600 à la longueur d'onde de 440 nm.
Lorsque la concentration cellulaire désirée est atteinte, la culture est centrifugée (16500 tours/min) et le milieu de culture clarifié obtenu est conditionné et stocké en chambre froide.
Le milieu de culture clarifié est ensuite concentré et dessalé par nanofiltration + diafiltration afin d'atteindre l'isotonie et pouvoir être incorporé dans des compositions cosmétiques. Exemple 6 : Méthode de criblage de milieux de culture clarifiés dépigmentants par la réaction à la Dopa- Oxydase sur épiderme séparé (Laboratoire BIO-EC)
La méthode consiste à visualiser sur des mélanocytes humains le potentiel dépigmentant d'une composition testée par inhibition de la L-DOPA oxydase (une des enzymes responsables de la synthèse des mélanines).
La réaction se fait par mélange de la composition dépigmentante et de la L-DOPA. La réaction est visualisée par l'intensité de la coloration des mélanocytes sur épiderme séparé.
Le témoin 100% d'activité (maximum de coloration) est effectué en présence de L-DOPA (substrat de la L-DOPA oxydase) .
Le témoin positif (minimum de coloration) est effectué en présence de L-DOPA additionné d'acide kojique à 0.015%. L'acide kojique est connu pour son activité dépigmentante.
Les milieux de culture clarifiés testés sont respectivement :
- le milieu de culture clarifié de Tetraselmis suecica tel qu'obtenu dans l'exemple 1,
- le milieu de culture clarifié de Phaeodactylum tricornutum tel qu'obtenu dans l'exemple 3.
Les épidermes utilisés sont ceux provenant d'une plastie mammaire congelée. Les épidermes sont séparés par incubation dans du NaBr 2N (Ih45) à 370C. Les épidermes sont fixés dans un fixateur formolé tamponné, sont rincés et mis en contact avec le mélange volume/volume : solutions de L-DOPA (substrat)/milieu de culture clarifié (50 μg d'extrait lyophilisé/ml de milieu de dosage) .
Après incubation, les épidermes sont rincés, montés entre lame et lamelle avec du liquide de montage Mounting Médium (mélange aqueux contenant du glycérol et permettant une conservation parfaite de l'échantillon). L'observation est réalisée en microscopie optique (objectif x 10).
Les résultats de la réaction à la Dopa-Oxydase sur épiderme séparé sont illustrés à la figure 1. Conclusion : le milieu de culture clarifié de Tetraselmis suecica présente une activité dépigmentante semblable à celle obtenue avec de l'acide kojique sur le modèle d'épiderme séparé, tandis que le milieu de culture clarifié de Phaedactylum tricornatum ne présente pas d'activité dépigmentante.
Exemple 7 : Effets de milieux de culture clarifiés sur la production d'IL-8 par des KHN stimulés avec de l'IL-lβ (Laboratoire SEPhRA)
Principe du test :
Des kératinocytes humains normaux sont mis en culture dans une microplaque jusqu'à obtention d'une confluence à 80%.
Les primocultures de KHN sont obtenues à partir de cellules isolées de prélèvements cutanés issus de chirurgie plastique. Les KHN sont ensemencés à la densité de 20000 cellules par puits (milieu de culture spécifique KSFM, Life Technologies) dans une microplaque 96 puits. Les cellules sont mises à incuber dans une étuve humide à 37°C sous 5% de CO2 pendant 24H. Les cellules sont ensuite traitées pendant les 24H suivantes avec les différents milieux de culture clarifiés à tester en même temps qu'elles sont stimulées par de l'IL-1 à 1 ng/ml.
4 puits sont traités par dilutions (n = 4), les dilutions étant réalisées dans le milieu de culture. Des cellules sont laissées sans traitement et d'autres ne sont traitées que par l'IL-lβ. Des surnageants de culture contenant l'IL-8 sont conservés à -200C jusqu'au dosage.
L'IL-8 humaine est quantifiée au moyen du test en microplaque ELISA Quantikine (Kit Quantikine human IL-8 D8050, R&D Systems). Le test utilise la méthode immunoenzymatique du sandwich. Un anticorps monoclonal spécifique de l'IL-8 a été pré-coaté sur une microplaque.
Sont déposés dans les puits de la microplaque de titration :
- les standards (IL-8 humaine recombinante) (n =
2) à des concentrations allant de 0 à 1000 pg/ml,
- les surnageants de culture à doser contenant l'IL 8 libérée par les cellules traitées par le milieu de culture clarifié ( = 4),
- l'anticorps polyclonal anti-IL-8 conjugué à l'enzyme Horse Radisch Peroxydase.
Si de l'IL-8 est présente, elle est piégée entre l'anticorps immobilisé et l'anticorps polyclonal conjugué. Après lavage éliminant toutes substances non adhérées, une solution substrat (peroxyde d'hydrogène et tetraméthylbenzidine) est ajoutée aux puits. La coloration se développe proportionnellement à la quantité d'IL-8 piégée. La réaction colorée est stoppée et l'intensité de coloration (DO) mesurée à 450 nm.
Le résumé rapide du protocole est le suivant :
1. Ajouter 100 μl/puits de tampon de dosage (fourni par le kit),
2. Ajouter 50 μl/puits de standard (concentrations connues d'ILδ) ou d'échantillons à doser (surnageants de culture contenant l'IL8 libérée par les cellules traitées par le milieu de culture clarifié). Agiter la plaque pour mélanger les réactifs dans chaque puits.
3. Ajouter 100 μl/puits d'IL-8 conjugué
4. Laisser incuber l'ensemble 2h30 à température ambiante.
5. Vider les puits puis rincer par 5 ou 6 lavages.
6. Ajouter 200μl/puits de solution substrat (peroxyde d'hydrogène et tetraméthylbenzidine) et incuber 30 minutes à l'abri de la lumière.
7. Ajouter 50 μl de solution stop (solution d'acide) .
8. Lire l'absorbance à 450 nm dans les 30 minutes et calculer les résultats de la concentration en pg/ml d'IL- 8.
En parallèle, un dosage protéique pour chaque puits de la microplaque est effectué. La méthode utilisée est celle de l'acide bicinchoninique (ou BCA). Après 24H de traitement, les surnageants sont congelés et les puits rincés avec du PBS sans Ca++ ni Mg++ (Gibco). Le tapis cellulaire est dissous à l'aide d'une solution de NaOH 0,1 M. Un mélange d'acide bicinchoninigue et de sulfate de cuivre (50V/IV) est ajouté. La plaque est placée à 37°C sous 5% de CO2 dans l'obscurité. Après 30 minutes, l'absorbance à 570 nm est mesurée. En parallèle, une gamme étalon est réalisée à partir d'une solution mère de BSA (Bovin sérum albumin) 1 mg/ml (P0914, SIGMA) permettant de convertir les DO en quantités (μg de protéines).
Le résultat final est exprimé en pg/ml d'IL-8/μg de protéines (obtenues par le dosage au BCA).
On observe 20 % d'inhibition de la libération d'IL8 par les kératinocytes après traitement par le milieu de culture clarifié à 25 μg/ml pour le milieu de culture clarifié de Dunalliela primolecta.
Conclusion : une libération d'interleukine 8 traduit un terrain inflammatoire ; par conséquent en inhibant la libération d'IL-8, on lutte contre un état inflammatoire de la peau.
Dunalliela primolecta présente donc in vitro des propriétés anti-inflammatoires.
Exemple 8 : Protocole anti-radicalaire -Test3D (DNA Damaqed Détection) ; Analyse quantitative des effets protecteurs d'un milieu de culture clarifié de l'invention.
Les milieux de culture clarifiés testés sont Scenedesmus dimorphus et Nostoc commune. La mesure du pouvoir anti-radicalaire est effectuée à l'aide d'un kit de dosage (réf. IDN 003) commercialisé par la société SFRI Laboratoire (F- Saint Jean d'Illac) ayant pour but la mise en évidence de la protection de l'ADN par des extraits potentiellement anti-radicalaires contre des lésions causées par les radicaux hydroxyles (représentés par « OH° »), radicaux générés par la réaction de Fenton ci-dessous :
Fe2+ + H2O2 >- OH° + OH" + Fe3+
Le protocole détaillé est le suivant :
Les puits sont prélavés : on ajoute 300 μl de solution de lavage (tampon phosphate, pH 7), diluée au l/10eme avec de l'eau ultra pure ne contenant pas de traces de métaux, puis on élimine l'eau par aspiration. On répète l'opération une fois.
On distribue 50 μl d'ADN préalablement lésé ou non lésé dans le puits. On recouvre la microplaque de titration d'un film adhésif et on incube 30 minutes à 300C sous agitation douce. On lave les puits 2 fois.
On distribue les milieux de culture clarifiés à tester : 50 μl de chaque échantillon dilué est distribué par puits (les milieux de culture clarifiés étant testés dans une zone de concentration allant de pure à une dilution au l/100ême).
On incube 30 minutes à 300C sous agitation douce. On lave les puits 3 fois. On répare les lésions de l'ADN par un système enzymatique de réparation (mélange fourni dans le kit de dosage et breveté par le fournisseur) a raison de 50 μl par puits de réparation dans chaque puits. On recouvre la plaque d'un film adhésif et on incube 3 heures à 300C sans agiter. On lave les puits 3 fois. On distribue 50 μl de la solution de révélation I (nucléotide marqué par l'avidine peroxydase) dans tous les puits.
On recouvre la plaque d'un film adhésif et on incube 15 minutes à 3O0C sous agitation douce. On lave les puits 5 fois. On distribue 50 μl de la solution de révélation II (substrat chimiluminescent de l'avidine peroxydase) dans chaque puits. On incube 5 minutes à 300C sous agitation douce à l'obscurité. On lit la plaque à l'aide d'un luminomètre.
Les résultats sont exprimés en unité arbitraire de chimiluminescence (RLU) .
• pourcentage d'inhibition non spécifique :
(RLU ADN lésé) - (RLU ADN lésé + échantillon) /
(RLU ADN lésé) x 100 ;
• pourcentage d'inhibition en présence de radicaux libres :
(RLU H2O2) - (RLU H2O2 + échantillon) / (RLU H2O2) x 100 ;
• pourcentage de protection spécifique =
(% d'inhibition en présence ROS) — (% d'inhibition non spécifique ) ;
(ROS= reactives oxygen species)
Le tableau 1 ci-dessous représente les valeurs obtenues pour le milieu de culture clarifié de Scenedesmus dimorphus. Tableau 1 :
Figure imgf000034_0001
Conclusion : le milieu de culture clarifié de Scenedesmus dimorphus présente une IC50 (concentration permettant d'obtenir 50% d'inhibition de l'effet des radicaux libres) voisine de 0.01 mg/ml.
Lors d'un stress externe comme une exposition prolongée aux radiations ultra-violettes ou à la pollution etc ... , les cellules expriment un taux élevé de radicaux libres, ayant pour conséquence des effets délétères sur la cellule (dégradation de protéines, lipides, endommagement de l'ADN, mort cellulaire). Un extrait présentant une propriété anti-radicalaire comme l'extrait de Scenedesmus dimorphus permettra donc à la cellule de mieux se défendre.
Le tableau 2 ci-dessous représente les valeurs obtenues pour le milieu de culture clarifié de Nostoc commune.
Tableau 2 :
Figure imgf000034_0002
Conclusion : le milieu de culture clarifié de
Nostoc commune présente une IC50 (concentration permettant d'obtenir 50% d'inhibition de l'effet des radicaux libres) voisine de 1 mg/ml. Un extrait présentant une propriété anti- radicalaire comme l'extrait de Nostoc commun permettra à la cellule de mieux se défendre.
Exemple 9 ; Test3D (DNA Damaged Détection) : Mise en évidence des effets réparateurs d'un milieu de culture clarifié de l'invention sur l'ADN.
Le milieu de culture clarifié testé est Skeletonema costatum.
La mesure du pouvoir réparateur de l'ADN est effectuée à l'aide d'un kit de dosage (réf. IDN 003) commercialisé par la société SFRI Laboratoire (F- Saint Jean d'Illac) ayant pour but la mise en évidence de l'activation de la réparation de l'ADN par des extraits afin de réparer des lésions causées par les radicaux hydroxyles (représentés par « OH0 » ) , radicaux générés par la réaction de Fenton ci- dessous :
Fe2+ + H2O2 ^OH° + OH" + Fe3+
Le protocole détaillé est le suivant :
Les puits sont prélavés : on ajoute 300 μl de solution de lavage (tampon phosphate, pH 7), diluée au l/10ème avec de l'eau ultra pure ne contenant pas de traces de métaux, puis on élimine l'eau par aspiration. On répète l'opération une fois.
On distribue 50 μl d'ADN préalablement lésé ou non lésé dans le puits. On recouvre la microplaque de titration d'un film adhésif et on incube 30 minutes à 300C sous agitation douce. On lave les puits 2 fois.
On distribue les milieux de culture clarifiés à tester : 50 μl de chaque échantillon dilué est distribué par puits (les milieux de culture clarifiés étant testés dans une zone de concentration allant de pure à une dilution au l/100ème) .
On incube 30 minutes à 300C sous agitation douce. On lave les puits 3 fois. On répare les lésions de l'ADN par un système enzymatique de réparation (mélange fourni dans le kit de dosage et breveté par le fournisseur) a raison de 50 μl par puits de réparation dans chaque puits. On recouvre la plaque d'un film adhésif et on incube 3 heures à 300C sans agiter. On lave les puits 3 fois. On distribue 50 μl de la solution de révélation I (nucléotide marqué par l'avidine peroxydase) dans tous les puits.
On recouvre la plaque d'un film adhésif et on incube 15 minutes à 300C sous agitation douce. On lave les puits 5 fois. On distribue 50 μl de la solution de révélation II (substrat chimiluminescent de l'avidine peroxydase) dans chaque puits. On incube 5 minutes à 3O0C sous agitation douce à l'obscurité. On lit la plaque à l'aide d'un luminomètre.
Les résultats sont exprimés en unité arbitraire de chimiluminescence (RLU) .
• pourcentage d'augmentation du taux de réparation :
(RLU ADN lésé + échantillon)* 100 / (RLU ADN lésé) ; Conclusion : le milieu de culture clarifié de Skeletonema costatum induit une augmentation du taux de réparation de l'ADN de 40% à 1 μg/ml.
Lors d'un stress externe les cellules expriment un taux élevé de radicaux libres, ayant pour conséquence des effets délétères sur la cellule dont des lésions sur l'ADN.
Un extrait présentant la capacité d'augmenter la vitesse de réparation de l'ADN lésé, comme l'extrait de Skeletonema costatum, permettra à la cellule de plus vite récupérer son capital ADN intact.
Exemple 10 ; Émulsion cosmétique dépigmentante d'un milieu de culture clarifié de Tetraselmis suecica.
La composition d'une émulsion cosmétique dépigmentante de l'invention est par exemple :
milieu de culture clarifié de Tetraselmis suecica obtenu selon l'exemple 1 : 20 g
émulsion cosmétique classique (alcools gras, alcools gras polyoxyéthylénés, huile végétale, palmitate d'isopropyle, glydérine, gélifiant type carbopol, conservateurs, parfums, eau) : qsp 100 g
Exemple 11 : Poudre protectrice anti-peau sèche pour le bain d'un milieu de culture clarifié de Scenedesmus acutus.
Le milieu de culture clarifié de Scenedesmus acutus est obtenu selon l'exemple 2, puis est concentré par évaporation thermique et lyophylisé jusqu'à obtention d'une poudre à homogénéiser avant conditionnement dans des poches de 20 g à utiliser dans le bain.
Exemple 12 : Lotion hydratante pour peaux sensibles d'un milieu de culture clarifié de Dunalliela primolecta
Le milieu de culture clarifié de Dunalliela primolecta est obtenu selon le protocole décrit ci-dessous.
Un photobioréacteur, après désinfection au Deptil PA 5, est rempli avec 300 Litres d'eau douce.
Un milieu nutritif stérile (milieu CONWAY) est ajouté à l'eau douce.
La composition du milieu nutritif est la suivante:
Na2 EDTA : 0,045 g/L Na2 NO3 : 0,1 g/L
H3BO3 : 0,0336 g/L
NaH2PO4, 2H2O : 0,026 g/L
MnCl2, 4H2O : 3,6.10"4 g/L
FeCl3 : 6H2O : 1,3.10~3 g/L ZnCl2 : 2,1.10"5 g/L
CoCl2, 6H2O : 2.10"5 g/L
(NHJ6MO7O24, 4H2O : 9.10"6 g/L
CuSO4, 5H2O : 2.10"5 g/L
Vitamine B1 : 2.10"4 g/L Vitamine B12 : 1.10"5 g/L
Le photobioréacteur est inoculé avec 10 Litres d'une culture stérile et concentrée de Dunaliella primolecta. Un bullage en air et en CO2 assure à la culture un brassage permanent des cellules et un maintien du pH aux alentours de la neutralité. La culture de Dunaliella est réalisée à une température aux environs de 200C.
24 heures après l'inoculation, des rampes de néons sont allumées autour de la culture afin d'apporter la lumière essentielle à la photosynthèse.
Un suivi hebdomadaire de la culture est effectué afin d'évaluer la croissance cellulaire. Les paramètres mesurés sont les suivants : pH, T0, O2, DO.
La culture est effectuée à un pH compris entre 6,5 et 8, et à une température comprise entre 19 et 27°C. La culture est menée jusqu'à l'obtention d'une concentration cellulaire correspondant à une densité optique de 0,6 à la longueur d'onde de 438 nm.
Après 16 jours, la culture est centrifugée (16500 tours/min.
Le milieu de culture clarifié est ensuite concentré par évaporation thermique et dessalé par membrane de dialyse (seuil de coupure = 500 Da)
La composition d'une lotion hydratante de
1'invention est par exemple :
milieu de culture clarifié de Dunalliela primolecta obtenu tel que décrit ci-dessus : 50 g
- milieu de culture clarifié de Porphyridium cruentum obtenu selon la première phase du protocole décrit dans l'exemple 3, mais jusqu'à obtention d'un clarifié visqueux (commercialisé par la Demanderesse sous la dénomination « hydrocomplexe 2 ») : 50 g Exemple 13 : Fond de teint bioprotecteur.
Le milieu de culture clarifié de Scenedesmus dimorphus est préparé selon le protocole ci-après :
Un photobioréacteur, après désinfection au Deptil PA 5, est rempli avec 300 Litres d'eau douce.
Un milieu nutritif stérile (milieu MLA) est ajouté à 1 'eau douce.
La composition du milieu nutritif est la suivante:
Na2 EDTA : 4, 36.10~3 g/L
FeCl3 : 6H2( D : 1,58.10'3 g/L
NaHCO3 : 0, 6. 10"3 g/L
MnCl2, 4H2O • • 0,36.10"3 g/L
CuSO4, 5H2O • • 1.10-5 g/L
ZnSO4, 7H2O • • 2,2.10"5 g/L
CoCl2, 6H2O • • 1.10"5 g/L
MgSO4 : 4,95. 10"2 g/L
NaN03 : 0,17 g/L
H3BO3 : 2,47. 10"3 g/L
NaHCO3 : 4,23. 10"3 g/L K2HPO4 : 3,475. 10"2 g/L
CaCl2 : 2,94. 10"2 g/L
Vitamine B1 : 1. 10"4 g/L
Vitamine B12 : 5. 10~8 g/L
Vitamine H : 5. 10"8 g/L
Le photobioréacteur est inoculé avec 10 Litres d'une culture stérile et concentrée de Scenedesmus dimorphus. Un bullage en air et en CO2 assure à la culture un brassage permanent des cellules et un maintien du pH aux alentours de la neutralité. La culture de Scenedesmus est réalisée à une température de 200C.
24 heures après l'inoculation, des rampes de néons sont allumées autour de la culture afin d'apporter la lumière essentielle à la photosynthèse.
Un suivi hebdomadaire de la culture est effectué afin d'évaluer la croissance cellulaire. Les paramètres mesurés sont les suivants : pH, T°, O2, DO.
La culture est effectuée à un pH compris entre 6,5 et 8, et à une température comprise entre 17 et 23°C. La culture est menée jusqu'à l'obtention d'une concentration cellulaire correspondant à une densité optique de 1,8 à la longueur d'onde de 677 nm.
Après 22 jours, la culture est centrifugée (16500 tours/min) et le clarifié obtenu est conditionné et stocké en chambre froide.
Le milieu de culture clarifié est ensuite concentré par évaporation thermique
La composition d'un fond de teint bioprotecteur de l'invention est par exemple :
milieu de culture clarifié de Scenedesmus dimorphus obtenu tel que décrit ci-dessus 25 g
- formulation classique du fond de teint (alcools et esters gras, silicones, phospholipides de soja, butylène glycol, gomme xanthane, oxydes de fer, filtres solaires, conservateurs, parfums, eau)
qsp 100g Exemple 14 : Comprimé pour absorption orale.
La composition d'un comprimé pour absorption orale est par exemple :
- milieu de culture clarifié obtenu à partir d'une co-culture de Phaeodactylum tricornutum et de Skeletonema costatum comme décrit dans l'exemple 4 puis lyophilisé
100 mg
- amidon 25 mg
- lactose 80 mg
- arôme 5 mg
- excipients pour comprimés (talc, stéarate de magnésium) qsp 250 mg

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'un milieu de culture clarifié d'au moins un microorganisme marin et/ou d'eau douce photosynthétique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de :
a) sélection d'au moins un microorganisme marin et/ou d'eau douce photosynthétique choisi parmi les cyanobactéries et les microalgues issues de milieux aquatiques,
b) introduction, dans un milieu de culture, du ou des microorganisme(s) sélectionné(s) lors de l'étape a) précédente,
c) amplification dudit ou desdits microorganismes dans ledit milieu de culture,
d) élimination de l'ensemble des microorganismes obtenus à l'issue de l'étape c) d'amplification, afin d'obtenir un milieu de culture clarifié dudit ou desdits microorganismes marins et/ou d'eau douce photosynthétiques.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu de culture de l'étape b) est choisi dans le groupe constitué par l'Eau de Source Marine de l'Ile Grande, l'eau de mer, l'eau d'océan, l'eau saumâtre, l'eau saline, l'eau douce, un milieu de culture clarifié d'au moins un microorganisme et leurs mélanges.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le milieu de culture comprend de l'Eau de source marine de l'Ile Grande, éventuellement enrichie en éléments nutritifs.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le milieu de culture utilisé à l'étape b) est un milieu de culture clarifié susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la cyanobactérie et/ou la microalgue est issue de milieux marins et appartient à la division des chlorophytes et est choisie dans le groupe constitué par cyanophytes, les chlorophytes, les chrysophytes, les chlorarachniophytes, les dinophytes, les cryptophytes, les euglenophytes et les rhodophytes.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la cyanobactérie et/ou la microalgue est choisie dans le groupe constitué par la classe des cyanophycées, des chlorophycées, des prasinophycées, des pedinophycées, des prymnesiophycées, des eustigmatophycées, des raphidophycées, des chrysophycées, des diatomophycées, des tribophycées, des chlorarachniophycées, des dinophycées, des cryptophycées, des euglenophycées et des rhodophycées.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend en outre (e) une étape de dessalage.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre (f) une étape de concentration.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le milieu de culture de l'étape b) est enrichi en éléments nutritifs choisis dans le groupe constitué par les minéraux, les oligo¬ éléments et les vitamines.
10. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape supplémentaire de vectorisation du milieu clarifié obtenu dans des liposomes ou d'autres vecteurs permettant de favoriser leur activité pharmaceutique, cosmétique, dermatologique ou alimentaire.
11. Utilisation d'un milieu de culture clarifié susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 comme principe actif cosmétique à activité éclaircissante et/ou dépigmentante.
12. Utilisation d'un milieu clarifié susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 comme principe actif cosmétique à activité protectrice contre les radicaux libres.
13. Utilisation d'un milieu clarifié susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 comme principe actif cosmétique pour lutter contre la sensibilité cutanée et les réactions inflammatoires.
14. Utilisation d'un milieu clarifié susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 comme principe actif cosmétique anti-stress, notamment pour améliorer la réparation de l'ADN.
PCT/FR2005/001831 2004-07-16 2005-07-18 Composition comprenant un milieu de culture de microorganisme marin et/ou d'eau douce photosynthetique. WO2006008401A2 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0407932A FR2873038B1 (fr) 2004-07-16 2004-07-16 Composition comprenant un milieu de culture de microorganisme marin et/ou d'eau douce photosynthetique
FR0407932 2004-07-16

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2006008401A2 true WO2006008401A2 (fr) 2006-01-26
WO2006008401A3 WO2006008401A3 (fr) 2006-04-13

Family

ID=34947954

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2005/001831 WO2006008401A2 (fr) 2004-07-16 2005-07-18 Composition comprenant un milieu de culture de microorganisme marin et/ou d'eau douce photosynthetique.

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR2873038B1 (fr)
WO (1) WO2006008401A2 (fr)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008044939A (ja) * 2006-08-11 2008-02-28 Lvmh Recherche 藻類ネオクロリス・オレオアブンダンスのバイオマスの抽出物を含有する化粧料としての痩身組成物
FR2913336A1 (fr) * 2007-03-08 2008-09-12 Lvmh Rech Utilisation d'un extrait d'algue phaeodactylum pour depigmenter la peau
CN101649339B (zh) * 2009-09-18 2013-03-13 华南师范大学 一种琼脂糖的制备方法
JP2014530890A (ja) * 2011-10-25 2014-11-20 アーチ・パーソナル・ケアー・プロダクツ・リミテッド・パートナーシップ 連続または同時発酵の抽出物を含有する組成物
EP2193785A3 (fr) * 2008-12-05 2015-01-07 Symrise AG Extraits de Tetraselmis sp. à visée cosmétique ou thérapeutique
IT201600124434A1 (it) * 2016-12-07 2018-06-07 Stazione Zoologica Anton Dohrn Estratto grezzo di microalga verde Tetraselmis suecica e suoi usi
CN114703066A (zh) * 2022-04-29 2022-07-05 山东大学 一种栅藻、其活性成分的提取方法与应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0876813A1 (fr) * 1997-05-05 1998-11-11 L'oreal Composition comprenant un milieu de culture de micro-organisme
FR2785910A1 (fr) * 1998-11-16 2000-05-19 Aquamer Procede d'obtention, a partir du milieu de culture de micro-algues, d'un extrait thermostable possedant une activite anti-oxydante et pro-cicatrisante

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0876813A1 (fr) * 1997-05-05 1998-11-11 L'oreal Composition comprenant un milieu de culture de micro-organisme
FR2785910A1 (fr) * 1998-11-16 2000-05-19 Aquamer Procede d'obtention, a partir du milieu de culture de micro-algues, d'un extrait thermostable possedant une activite anti-oxydante et pro-cicatrisante

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Source marine de l'île-Grande: Vers une production industrielle de microalgues"[Online] novembre 1998 (1998-11), XP002313909 Extrait de l'Internet: URL:http://www.sciences-ouest.org/reseau/f 0149004.htm> [extrait le 2005-01-18] *
A. HUMEAU, I- RENIMEL, S. BERNARD, C. GODENIR, M. BERMUDES, P. ANDRE: "BIODIVERSITY OF MICROALGAE: BEAUTY CARE APPLICATIONS" COSM'ING 2004, 30 juin 2004 (2004-06-30), - 2 juillet 2004 (2004-07-02) XP001204854 ST MALO, FRANCE *
RAPHAËLLE LEMPERT: "Aquatique et futuriste: la nouvelle ligne de soins Christian Dior"[Online] 7 septembre 2002 (2002-09-07), XP002313910 Extrait de l'Internet: URL:http://www.phmag.com/V2/art.php3?idtex te=394> [extrait le 2005-01-18] *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008044939A (ja) * 2006-08-11 2008-02-28 Lvmh Recherche 藻類ネオクロリス・オレオアブンダンスのバイオマスの抽出物を含有する化粧料としての痩身組成物
KR101506648B1 (ko) 2006-08-11 2015-03-27 엘브이엠에이취 러쉐르쉐 네오클로리스 올레오어번던스 조류의 바이오매스의추출물을 포함하는 화장용 슬리밍 조성물
FR2913336A1 (fr) * 2007-03-08 2008-09-12 Lvmh Rech Utilisation d'un extrait d'algue phaeodactylum pour depigmenter la peau
WO2008125789A2 (fr) * 2007-03-08 2008-10-23 Lvmh Recherche Utilisation d'un extrait d'algue phaeodactylum pour depigmenter la peau
WO2008125789A3 (fr) * 2007-03-08 2008-12-18 Lvmh Rech Utilisation d'un extrait d'algue phaeodactylum pour depigmenter la peau
US8372408B2 (en) 2007-03-08 2013-02-12 Lvmh Recherche Use of Phaeodactylum algae extract for depigmenting the skin
EP2193785A3 (fr) * 2008-12-05 2015-01-07 Symrise AG Extraits de Tetraselmis sp. à visée cosmétique ou thérapeutique
EP3348255A1 (fr) 2008-12-05 2018-07-18 Symrise AG Extraits de tetraselmis sp. à visée cosmétique ou thérapeutique
CN101649339B (zh) * 2009-09-18 2013-03-13 华南师范大学 一种琼脂糖的制备方法
JP2014530890A (ja) * 2011-10-25 2014-11-20 アーチ・パーソナル・ケアー・プロダクツ・リミテッド・パートナーシップ 連続または同時発酵の抽出物を含有する組成物
IT201600124434A1 (it) * 2016-12-07 2018-06-07 Stazione Zoologica Anton Dohrn Estratto grezzo di microalga verde Tetraselmis suecica e suoi usi
CN114703066A (zh) * 2022-04-29 2022-07-05 山东大学 一种栅藻、其活性成分的提取方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2006008401A3 (fr) 2006-04-13
FR2873038B1 (fr) 2009-11-27
FR2873038A1 (fr) 2006-01-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yarkent et al. Potential of microalgal compounds in trending natural cosmetics: A review
WO2006008401A2 (fr) Composition comprenant un milieu de culture de microorganisme marin et/ou d'eau douce photosynthetique.
EP3370833B1 (fr) Extrait synergique de palmaria palmata
Stoyneva-Gärtner et al. Enigmatic microalgae from aeroterrestrial and extreme habitats in cosmetics: The potential of the untapped natural sources
FR3065172A1 (fr) Preparation cosmetique contenant un extrait de truffe blanche et procede cosmetique associe
FR2980698A1 (fr) Utilisation d'une association d'extraits d'algues destinees a limiter les desordres cutanes de la peau a tendance grasse et/ou acneique
EP3519056A1 (fr) Procédé pour empêcher ou ralentir l'apparition des signes inesthétiques générés par les agents polluants présents dans l'atmosphère sur la peau, le cuir chevelu, les cheveux ou les muqueuses
FR3004108A1 (fr) Extrait d'arthrobacter agilis pour son utilisation en cosmetique
EP3806819B1 (fr) Procede d'obtention d'un extrait aqueux de dunaliella salina et ses utilisations cosmetiques
CA2908535A1 (fr) Applications cosmetiques et pharmaceutiques de lactobacillus pentosus
EP3962447A1 (fr) Procédé de soin cosmétique à base d'extraits photoactifs de microalgues
FR3034780A1 (fr) Procede d'obtention de culture de cellules de l'algue rouge acrochaetium moniliforme, methode d'obtention d'un extrait de sa biomasse et son utilisation en cosmetique
EP1874137A1 (fr) Composition de spirulines riche en principes actifs, son procédé d'obtention et son utilisation.
EP1732576A1 (fr) Procede de photo-stabilisation de phycobiliproteines dans un extrait aqueux, compositions contenant des phycobiliproteines stabilisees et utilisation de phycobiliproteines stabilisees
EP3191106B1 (fr) Composition comprenant une microalgue enrichie en silicium pour une utilisation therapeutique
WO2004071519A1 (fr) Micro-organismes photosynthetiques enrichis en molecules biologiquement actives, leurs procedes de preparation, et leurs utilisations
EP1427387B1 (fr) Produit cosmetique pour les soins de la peau
FR2881952A1 (fr) Composition cosmetique a base d'algues symbiodinium
KR102493311B1 (ko) 4종의 해조류 추출물을 포함하는 항산화용 또는 항균용 화장료 조성물
dos Santos et al. Algae materials for cosmetics and cosmeceuticals
FR3055544A1 (fr) Association de olea eupopaea et rosmarinus officinalis a moduler l'activite des mitrochondries
FR3052070B1 (fr) Soin cutane oral d'origine naturelle protegeant contre les effets attaques exterieures et regenerant par l'activation de l'expression genique des facteurs de croissance epidermique (egf)
FR3133132A1 (fr) Procédé de production d’un extrait de la microalgue Emiliania huxleyi essentiellement sans coccolithes, extrait ainsi obtenu, composition comprenant cet extrait, et utilisations associées.
EP3902518A1 (fr) Extrait de chlamydomonas acidophila, son procede de preparation et les compositions cosmetiques, et dermatologiques le comprenant
OA21067A (fr) Extrait de graines de Moringa Peregrina riche en 2,5-diformylfuran, son procédé d'obtention et son utilisation dans des compositions cosmétiques.

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KM KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NG NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase