EP3902518A1 - Extrait de chlamydomonas acidophila, son procede de preparation et les compositions cosmetiques, et dermatologiques le comprenant - Google Patents

Extrait de chlamydomonas acidophila, son procede de preparation et les compositions cosmetiques, et dermatologiques le comprenant

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EP3902518A1
EP3902518A1 EP19835309.6A EP19835309A EP3902518A1 EP 3902518 A1 EP3902518 A1 EP 3902518A1 EP 19835309 A EP19835309 A EP 19835309A EP 3902518 A1 EP3902518 A1 EP 3902518A1
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EP
European Patent Office
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extract
advantageously
skin
acidophila
composition
Prior art date
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Pending
Application number
EP19835309.6A
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German (de)
English (en)
Inventor
Sophie Leclere-Bienfait
Stéphanie BREDIF
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Laboratoires Expanscience SA
Original Assignee
Laboratoires Expanscience SA
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Filing date
Publication date
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    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor

Definitions

  • the invention relates to a peptide extract of the microalga Chlamydomonas acidophila and to a cosmetic, dermatological or pharmaceutical composition comprising such an extract.
  • the invention also relates to a method of extracting a peptide extract of Chlamydomonas acidophila, as well as the extract capable of being obtained by said method.
  • the invention also relates to a composition or such an extract for its use in the prevention or treatment of disorders or pathologies of the skin, mucous membranes or integuments, for its use in the prevention or treatment of vascular disorders, or also for its use in the prevention or treatment of adipose tissue alterations.
  • the invention relates to a cosmetic care process for the skin, integuments or mucous membranes, with a view to improving their condition or their appearance, consisting in administering such a composition or such an extract.
  • Micro-algae are single-celled, eukaryotic organisms, endowed with photosynthesis and which are therefore capable, like higher plants, of using CO2 from the air for their metabolism but also other nutrients such as phosphorus, nitrates, etc. They were among the first species to colonize the earth. There are around 30,000 species described but it is assumed that there are many more. Microalgae are found in their natural state, both in fresh and brackish to salt water around the world.
  • Microalgae can be cultivated according to methods known to those skilled in the art, such as photo-reactors in environments controlled in light, pH and nutrients, and they have many outlets. Like the higher organisms, they are capable of synthesizing proteins, carbohydrates and lipids. Certain lipids are specific such as complex fatty acids or pigments with specific biological properties (xanthophylls). They have experienced a particular craze for a possible production of biofuel and their production in bioreactor has expanded. The other outlets are diverse: food for fish (aquarium and fish farms), food and human health (asthaxanthin extracted from Haematococcus pluvialis, spirulina proteins) and some outlets in the cosmetic industry.
  • Chlamydomonas acidophila of the class Chlorophyceae (Family: Chlamydomonadaceae) is a green freshwater microalgae that proliferates in very acidic waters (pH 2.3 to 3.4) and adapted to environments loaded with heavy metals. In particular, it was identified and removed for the first time from volcanic lakes in Argentina. It is said to be rich in phytochelatins, special structures capable of chelating metals and in carotenoids (beta-carotene, lutein). Apart from publications, concerning its possible conditions of culture and development (tolerance to extreme pH, and heavy metals), there is little about its composition and its use. Its “cousin” Chlamydomonas reinhardii is used as a model organism in various scientific fields such as genetics.
  • the subject of the invention is a peptide extract of the microalga Chlamydomonas acidophila.
  • peptide extract is meant, within the meaning of the present invention, an extract comprising predominantly peptides.
  • peptide is meant, within the meaning of the present invention, a polymer of amino acids linked together by peptide bonds.
  • a peptide is in particular characterized by a molecular mass of between 200 and 10,000 Daltons (Da), limits included.
  • the extract of Chlamydomonas acidophila according to the invention comprises at least 20% by weight of peptides, the percentages being expressed relative to the total weight of said extract.
  • the extract according to the invention comprises from 20% to 90%, advantageously from 20% to 75%, more advantageously from 30% to 70%, typically 65%, by weight of peptides, the percentages being expressed relative to the total weight of said extract.
  • the extract of Chlamydomonas acidophila according to the invention is substantially free of any protein, in particular any residual native protein. This makes it possible in particular to avoid allergic reactions, and to improve the solubility and the bioavailability of the extract according to the invention.
  • protein is meant, within the meaning of the present invention, biological macromolecules formed from one or more polypeptide chains. Each of these chains consists of the chain of amino acid residues linked together by peptide bonds.
  • a protein is notably characterized by a molecular mass greater than 10,000 Daltons (Da).
  • the extract of Chlamydomonas acidophila according to the invention is substantially free of free amino acids. Free amino acids have a molecular weight of less than 200 Da.
  • the peptides advantageously have a molecular mass of less than 3500 Daltons (Da).
  • these peptides cover all of the amino acid-based compounds initially present in the extract.
  • At least 80%, more advantageously at least 90%, of the peptides have a molecular mass of less than 1000 Da.
  • At least 30% of the peptides more advantageously at least 35%, more advantageously at least 40% of the peptides, have a molecular mass of less than 500 Da.
  • the distribution of the molecular weights of the peptides is expressed as a percentage relative to the total concentration of peptides.
  • the peptide extract of Chlamydomonas acidophila is advantageously obtained by enzymatic hydrolysis, more advantageously in the presence of at least one protease.
  • the extract according to the invention is more advantageously obtainable by the process described later in the description.
  • the invention also relates to a process for the preparation of a peptide extract of the microalga Chlamydomonas acidophila, comprising at least one step of enzymatic hydrolysis.
  • This step is advantageously carried out under the optimal conditions of pH and temperature, known to those skilled in the art, in particular under the optimal conditions of pH and temperature linked to the enzyme used.
  • said enzymatic hydrolysis step is carried out in the presence of at least one protease.
  • Said protease can advantageously be an alkaline protease or an acid protease, advantageously it is an alkaline protease.
  • the process for preparing a peptide extract of Chlamydomonas acidophila comprises at least the following steps:
  • step a) recovery of the peptide extract at the end of step c).
  • the aqueous phase is advantageously water.
  • the content of Chlamydomonas acidophila microalga in the aqueous dispersion is advantageously between 0.1% and 20%, more advantageously 1% and 10%, equivalent dry extract of the microalga.
  • the enzymatic treatment (step b) is advantageously carried out by adding at least one protease, advantageously under the optimal pH and temperature conditions known to those skilled in the art, for example at a pH between 3.0 and 9.0 and typically at a temperature between 20 ° C and 90 ° C.
  • the enzymatic treatment comprises the addition of an alkaline or acidic protease, advantageously an alkaline protease.
  • the enzymatic hydrolysis step of the process according to the invention is very important, since it allows the native proteins present in Chlamydomonas acidophila to be transformed or "cut out" to obtain peptides.
  • the enzymatic hydrolysis step is advantageously followed by a heat treatment step in order to denature the enzymes.
  • This heat treatment step is advantageously carried out at a temperature above 40 ° C, typically between 80 ° C and 100 ° C.
  • step d) the peptide extract is advantageously recovered by extraction of the dispersion obtained at the end of step c), advantageously with stirring, and advantageously at a pH of between 3.0 and 9.0 and at a temperature between 20 ° C and 90 ° C.
  • the method comprises an additional filtration or centrifugation step, located between steps c) and d), optionally followed by an ultrafiltration, diafiltration, or nanofiltration.
  • the filtration or centrifugation steps, optionally followed by ultrafiltration or diafiltration on membranes make it possible in particular to remove the residual proteins.
  • the nanofiltration stages make it possible in particular to remove mineral salts or free amino acids for example.
  • the method according to the invention advantageously comprises an ultrafiltration step at 15 kDa, advantageously between 10 and 15 kDa, carried out between steps c) and d), which makes it possible to eliminate any residual protein which is potentially allergenic.
  • the method according to the invention also comprises a nanofiltration step with, for example, a cutoff threshold of between 100 Daltons and 300 Daltons, advantageously between 130 and 300 Daltons, typically between 200 Daltons and 300 Daltons, to remove part of the acids. amino or mineral salts, following the ultrafiltration stage.
  • a nanofiltration step is carried out on a 200 Da membrane.
  • the aqueous hydrolyzate obtained, ie the peptide extract according to the invention, can then be physically and microbiologically stabilized by adding a solvent such as glycerol or glycols like 1,3-propanediol in different proportions adapted to such stabilization.
  • a solvent such as glycerol or glycols like 1,3-propanediol
  • the glycerol will be present alone or in combination with water or a glycol, advantageously in a proportion of between 40 and 95% and preferably between 50 and 90%, by mass relative to the total mass of the peptide extract and solvent.
  • the glycol and preferably 1,3-propanediol will advantageously be present alone or in combination with water or glycerol, advantageously in a proportion of between 40% and 95% and preferably between 50% and 90%, in mass relative to the total mass of the peptide extract and the solvent.
  • the present invention further relates to a composition comprising the peptide extract of Chlamydomonas acidophila according to the invention, a solvent chosen from glycerol, glycols and their mixtures in an amount effective for a physical and microbiological stabilization action, and optionally some water.
  • the effective amounts for a physical and microbiological stabilization action are as described above.
  • the peptide extract can be stabilized by drying, by methods known to those skilled in the art, in the presence or absence of a support of the type, for example, maltodextrins or acacia fibers.
  • a support of the type for example, maltodextrins or acacia fibers.
  • the content of support typically varies according to a ratio ranging from 0% to 80% of support relative to the percentage of dry matter obtained in the liquid form of the extract.
  • the extract can be dried by atomization, lyophilization or any process known to those skilled in the art and is preferably dried by lyophilization in order to obtain a final powder.
  • the final powder advantageously comprises 30% to 70% by weight of dry matter of the extract, the complement to 100% being the lyophilization support. More advantageously, the final powder comprises 50% of dry matter obtained from the extract and 50% of lyophilization support, said lyophilization support preferably being of maltodextrin or acacia fiber type.
  • the peptide extract can be obtained according to the following method:
  • said microalgae used as a raw material comes from a culture in photobioreactor, in particular in photobioreactor in an agitated medium.
  • said microalgae used as raw material comes from a culture in horizontal tubular photobioreactors ventilated in waves in an agitated medium, such as for example those developed by the company Microphyt and in particular described in patent application FR 2 943 685 and international application WO 2011/058267.
  • the present invention also relates to an extract of Chlamydomonas acidophila, capable of being obtained by the process mentioned above.
  • Such an extract meets the specifications defined above
  • the subject of the invention is also a cosmetic, dermatological or pharmaceutical composition
  • a cosmetic, dermatological or pharmaceutical composition comprising a peptide extract of Chlamydomonas acidophila, as active ingredient, and if appropriate an appropriate excipient.
  • the peptide extract of Chlamydomonas acidophila is as defined above or is capable of being obtained by the process mentioned above.
  • said extract is advantageously as defined in the above paragraphs relating to the extract according to the invention as such or those relating to the extract capable of being obtained by the process according to the invention.
  • composition is advantageously formulated to be administered by external topical, vaginal or oral route.
  • the composition according to the invention comprises from 0.001 to 10%, advantageously 0.01 to 5%, of said peptide extract of Chlamydomonas acidophila, by weight expressed as dry extract, relative to the total weight of the composition.
  • composition according to the invention can also comprise one or more other active ingredients.
  • the various preparations are suitable for topical administration and include in particular creams, emulsions, milks, ointments, lotions, oils, aqueous or hydro-alcoholic or glycolic solutions, powders, patches, sprays, shampoos, varnishes or any other product for external application.
  • the various preparations notably include intimate hygiene care, oral care, such as, for example, toothpaste, oral solutions, gingival gels.
  • the composition according to the invention can also comprise at least one cosmetically, pharmaceutically or dermatologically acceptable excipient.
  • composition according to the present invention can also comprise at least one cosmetically, pharmaceutically or dermatologically known adjuvant known to those skilled in the art, chosen from surfactants, thickeners, preservatives, perfumes, dyes, chemical filters or minerals, moisturizers, thermal waters, etc.
  • cosmetically, pharmaceutically or dermatologically known adjuvant known to those skilled in the art, chosen from surfactants, thickeners, preservatives, perfumes, dyes, chemical filters or minerals, moisturizers, thermal waters, etc.
  • compositions according to the invention can be determined according to the criteria generally taken into account in the establishment of a pharmacological, dermatological or cosmetic treatment suitable for a patient or an animal, such as for example the age or body weight of the patient or animal, the severity of his general condition, the tolerance to treatment, the side effects observed, the type of skin.
  • the subject of the invention is also an extract according to the invention or extract capable of being obtained by the process according to the invention or a composition according to the invention, for its use for preventing and / or treating:
  • the subject of the invention is also the use of an extract according to the invention or of an extract capable of being obtained by the process according to the invention or of a composition according to the invention, for the manufacture of a cosmetic, pharmaceutical or dermatological composition for preventing and / or treating:
  • the invention further relates to a method for preventing and / or treating: - disorders or pathologies of the skin and / or mucous membranes (for example the gums, periodonts, genital mucosa) and / or integuments (for example the hair and nails);
  • - disorders or pathologies of the skin and / or mucous membranes for example the gums, periodonts, genital mucosa
  • / or integuments for example the hair and nails
  • composition according to the invention comprising the administration, in particular the topical administration, of an effective amount of an extract according to the invention or of an extract capable of being obtained by the process according to the invention or of a composition according to the invention , to a subject in need.
  • the extract according to the invention or the extract capable of being obtained by the process according to the invention or the composition according to the invention is intended for the prevention and / or treatment of allergic, inflammatory reactions or pathologies , irritants or disorders of the barrier or homeostasis of the skin, appendages (hair and nails) and / or mucous membranes (gums, periodonts, genital mucosa) immature (normal) or mature (s) ) / aged (s).
  • composition or the extract according to the invention can be used for the prevention and / or the treatment of reactions, disorders or pathologies:
  • mucous membranes such as the gums and periodonts which can present gingivitis (sensitive gums of newborns, hygiene problems, due to smoking or others), periodontopathies, or genital mucous membranes which can present irritations of the external male or female genital spheres or internal and / or
  • integuments such as nails (brittle, fragile nails ...) and hair (alopecia, dandruff, hirsutism, seborrheic dermatitis, folliculitis) immature, normal or mature, presenting in particular scalp disorders such as alopecia (or alopecia areata) androgenetic, acute, localized, scarring, congenital, occipital of the infant, aerata, due to chemotherapy / radiotherapy or telogen effluvium, anagen effluvium, hair dystrophy, trichotillomania, ringworm or oily or dry dandruff.
  • the invention also relates to a method of cosmetic care of the skin and / or the integuments and / or mucous membranes, with a view to improving their condition and / or their appearance, consisting in administering an extract according to the invention or an extract capable to be obtained by the process according to the invention or a composition according to the invention.
  • the cosmetic care process makes it possible to firm the skin and to reduce the “orange peel” effect advantageously topically on the skin and / or integuments and / or mucous membranes.
  • the invention relates to a cosmetic care process for the skin and / or integuments, to act on the elasticity or firmness of the skin, in particular as a tightening or anti-wrinkle agent, to act on sensitive skin. , or also to act against pollution, consisting in applying to the skin and / or the integuments a composition or an extract according to the present invention.
  • the invention relates to a cosmetic care process for the skin and / or the appendages, with a view to preventing alterations of the barrier and its dehydration, consisting in applying to the skin and / or the appendages a composition or an extract according to the present invention.
  • the invention relates to a cosmetic skin care process, with a view to preventing aging thereof, consisting in applying to the skin a composition or an extract according to the present invention.
  • composition or extract according to the present invention can also be advantageously used in the prevention and / or treatment of vascular disorders, in particular redness and rosacea.
  • composition or extract according to the present invention can also be advantageously used in the prevention and / or treatment of alterations in adipose tissue.
  • the adipose tissue alterations are in particular cellulite or the "orange peel” effect.
  • the composition according to the invention makes it possible to firm the skin.
  • Figure 1 represents the measurement results of erythema intensity: Active / Placebo / Untreated Zone comparisons. NS: non-significant difference. *: p ⁇ 0.05 (Example 3B).
  • Figure 2 shows the evolution over time of the blood flow (Example 3B).
  • FIG. 3 shows the illustrations of the PIE results obtained at D0 and D28 (Example 3C).
  • Figure 4 shows the illustrations of the hydration results obtained at D0 and D28 (Example 3C).
  • Figure 5 shows the illustrations of the quantity of NMFs quantified at D0 and D28 (Example 3C).
  • Figure 6 represents the illustrations of the quantity of ceramides quantified with DO and D28 (Example 3C).
  • Figure 7 shows the illustrations of the amount of ILIRA quantified at DO and D28 (Example 3C).
  • Figure 8 shows the illustrations of the Nile red / lnvolucrine ratio at DO and D28 (Example 3C).
  • Example 1 extract according to the invention
  • a peptide extract is obtained according to the following process:
  • Example 2 Tests of biological activities of the extract according to the invention in vitro) The biological activity of the extract of Chlamydomonas acidophila (CAP) obtained in Example 1 was demonstrated in vitro as described below.
  • CAP Chlamydomonas acidophila
  • CAP Chlamydomonas acidophila
  • the GBA / GBAP1 gene encoding the enzyme Glucosylceramidase or b-glucocerebrosidase is over expressed after 6 hours of treatment with CAP.
  • RAB11A codes for a GTPase (Ras-related protein Rab-llA) involved in the biogenesis of lamellar bodies in keratinocytes. This underlines the importance of RAB11A in the homeostasis of the epidermal barrier.
  • GTPase Ras-related protein Rab-llA
  • Hyaluronan synthases-2 and -3 are enzymes responsible for the synthesis of hyaluronic acid (HA).
  • the PADI1, BLMH, CASP14 genes code for enzymes involved in the production of natural hydration factors (or NMF for Natural Moisturizing Factors).
  • Table 2 below presents the most significant results of the CAP extract on the expression of genes in fibroblasts.
  • Table 2 Variations in the expression of genes of interest in normal human dermal fibroblasts (NHDFs) Relative quantity (QR) compared to the equal control 1 / p value determined following a Student test
  • HAS1, HAS2 5.76 0.008
  • HAS3, produced by fibroblasts in the dermis are responsible for the biosynthesis of hyaluronic acid (AH).
  • NAD (P) H dehydrogenase, quinone 1 (NQOl) is a cytosolic flavoprotein under the control of the transcription factor Nrf-2. NQOl promotes, by reduction, the formation of hydroquinones from quinones, preventing the production of radical species.
  • the HSP70 protein encoded by the HSPA1A gene
  • is a chaperone molecule heat shock protein 70 which inhibits the aggregation of denatured proteins, promotes their renaturation (refolding) and controls essential mediators of the apoptotic machinery.
  • the thioredoxin system is one of the major antioxidant defense systems. Among the 3 isoforms of thioredoxine reductase, isoform 1 encoded by the TXNRD1 gene regulated by the CAP extract is the most studied.
  • peroxyredoxin-6 PRDX6
  • PRDX6 peroxyredoxin-6
  • the CAP extract stimulates the GLOl gene, which is part of the GLO system which detects and neutralizes certain carbonyls, and thus prevents them from attacking cells and their components.
  • the CAP extract stimulates the expression of PSMB1, a gene coding for the beta 1 subunit of the proteasome.
  • the proteasome plays a major role in the maintenance of protein homeostasis by eliminating damaged or malformed proteins that could alter cell functioning.
  • LOXL2 The gene expression of LOXL2 is also increased, this gene is part of the family of Lysyl oxidases, enzymes involved in the assembly of elastin and collagen fibers.
  • the inflammatory response is the normal, immediate and transient response of the body to any attack on the environment.
  • the keratinocyte is one of the first cells participating in the initiation of the inflammatory reaction in response to an attack on the environment.
  • PGE prostaglandins
  • the anti-inflammatory activity of the extract of Chlamydomonas acidophila according to the invention was evaluated on a model of inflammation induced on keratinocytes by treatment with PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate). The release of TNF ⁇ and Prostaglandin E2 (PGE2) cytokines was analyzed.
  • PMA Phorbol 12-Myristate 13-Acetate
  • PGE2 Prostaglandin E2
  • the inflammation was then induced by adding PMA at 10 pg / mL overnight.
  • the PMA at 10 pg / ml significantly increased the release of TNF ⁇ into the supernatants of keratinocytes and therefore induced inflammation well.
  • 0.1 pM dexamethasone and 0.1 pM indomethacin, 24 h pretreatment significantly reduced the release of TNFa, thus demonstrating their anti-inflammatory effect and validating the test.
  • the extract of Chlamydomonas acidophila in 24h pre-treatment at different concentrations, significantly reduced the release of TNFa and therefore showed an anti-inflammatory action against PMA.
  • Nickel is the major cause of allergic contact dermatitis in the population, with a global prevalence of around 8.6%
  • the objective of the study described below is to assess the effect of the CAP extract on the release of IL8 by nickel-stimulated keratinocytes.
  • Normal human epidermal keratinocytes were pretreated for 24 hours with the extract of CAP at 0.01% and 0.05% of dry matter or with the anti-inflammatory reference molecule Dexamethasone at 1 mM.
  • the keratinocytes were then treated for 24 hours with Nickel: NiS0 4 at 10 mM.
  • the amount of IL8 produced by the cells was evaluated by an ELISA test in the supernatants.
  • the IL8 concentration assayed was normalized with respect to the amount of total intracellular proteins evaluated by BC Assay.
  • the CAP extract induces a significant reduction in the release of IL8 induced by nickel stress in keratinocytes.
  • the extract of Chlamydomonas acidophila inhibits the release of a major cytokine, IL8, against the background of inflammatory stress induced by Nickel.
  • the extract is therefore of interest in the context of contact allergy or skin hypersensitivity linked by Nickel.
  • the objective of this study is to evaluate the anti-inflammatory activity of the extract Chlamydomonas acidophila (CAP) vis-à-vis a stress with heavy metals, represented by Cadmium, on normal human keratinocytes.
  • CAP Chlamydomonas acidophila
  • the PGE2 concentration assayed was normalized with respect to the amount of total intracellular proteins evaluated by BC Assay.
  • the CAP extract induces a decrease in the release of PGE2 induced by Cadmium stress in keratinocytes.
  • the extract of Chlamydomonas acidophila inhibits the production of Prostaglandin E2 (PGE2) induced by Cadmium stress.
  • the extract therefore provides protection for the skin against heavy metal stress, for example in the context of environmental pollution.
  • the anti-inflammatory activity of the extract of Chlamydomonas acidophila was evaluated on a model of inflammation induced by treatment with SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) on reconstituted epidermis.
  • Reconstructed Human Epidermis were preincubated for 24 hours in the presence of 0.01% CAP and 0.05% dry matter. 0.025% SDS was then applied to the surface of the epidermis which was again incubated for 24 hours, still in the presence of the CAP extract.
  • TNF ⁇ cytokine Tumor Necrosis Factor alpha
  • the gene expression of inflammatory markers and of the barrier was evaluated by qRT-PCR.
  • the CAP extract significantly inhibited the overproduction of TNF ⁇ and increased the expression of keratin 1.
  • the antioxidant effect of the active ingredient is evaluated by the incorporation of DCFH-DA (2 ′, 7 ′ - Dichlorofluorescin diacetate) in cultured keratinocytes.
  • DCFH-DA (2 ′, 7 ′ - Dichlorofluorescin diacetate)
  • This molecule is a non-fluorescent marker in the non-oxidized state.
  • oxidative conditions here H2O2 stress
  • DCFH-DA will be degraded into DCF, a molecule which will emit fluorescence.
  • the fluorescence thus measured will be proportional to the quantity of reactive oxygen species produced by the cell in the presence of H2O2 and / or of the extract.
  • the cells are then treated for 1 h in the presence of DCFH-DA at 0.5 mM. Oxidation is induced by adding H2O2 at 100 mM for 20 minutes. A second treatment with the tested products is carried out simultaneously with H2O2 stress (at the same concentrations as the pre-treatment).
  • DFU fluorescence density
  • the extract of Chlamydomonas acidophila has demonstrated an antioxidant effect against stress induced by H 2 0 2 .
  • the gene expression of the markers of the barrier function and of the hydration was evaluated by qRT-PCR.
  • the extract of Chlamydomonas acidophila also stimulated the expression of the markers SLC6A6 and SLC5A3, coding for TAUT (taurine membrane transport channel) and SMIT (myoinositol transport channel) respectively.
  • the extract of Chlamydomonas acidophila modulates the inflammation induced by Th2 stress in keratinocytes by inhibiting the gene expression of the chemoattractant factors CCL5 and CCL27.
  • the basophil activation test was carried out using the Flow CAST ® kit (BÜHLMANN, ref. FKCCR).
  • the stimulant, fM LP at 1 mM was then added and the blood was incubated for an additional 15 minutes in the presence of the labeling buffer containing a mixture of monoclonal antibodies (anti-CD63-FITC and anti-CCR3-PE).
  • Cromoglycate a known anti-allergic, the mechanism of action of which involves stabilizing the plasma membrane at which it inhibits intracellular penetration of Ca ++ , this ion being essential for mast cell degranulation.
  • SB202190 tested at 30 mM, as well as cromoglycate, tested at 10 mM, both showed a significant inhibitory effect on the activation of basophils induced by fMLP (respectively, 26% and 46% inhibition).
  • the CAP extract tested at 0.033% and 0.1%, showed a clear and concentration-dependent inhibitory effect on the activation of basophils induced by fMLP (respectively, 22% and 39% inhibition).
  • Chlamydomonas acidophila extract inhibits the activation of basophils.
  • Chlamydomonas extract acidophila could help modulate the processes involved in initiating the allergic response.
  • the CAP active ingredient (3% active ingredient) has demonstrated significant effectiveness on the following parameters:
  • the intensity of blood flow measured by TiVi is significantly lower over the area treated with the active ingredient compared to the untreated area.
  • the redness measured by spectrocolorimetry is significantly lower on the area treated with the active ingredient compared to the untreated area.
  • the decrease in the intensity of the blood flow measured by Tivi is significantly greater over the area treated with the active ingredient compared to the untreated area.
  • the reduction in redness measured by spectrocolorimetry is significantly greater in the area treated with the active ingredient compared to the untreated area.
  • the CAP active ingredient (3% active ingredient) has demonstrated significant effectiveness on the following parameters: Instrumental measurements
  • the people recruited for this study are subjects:
  • the method used by the TiVi 700 is based on the fact that green light is strongly absorbed by the cells of blood vessels, while red light is moderately absorbed.
  • the method eliminates specular reflection to take into account only the light returned by the skin tissue.
  • the device thus produces an intensity map with each pixel representing a concentration of blood cells in the skin.
  • a decrease in the intensity of the concentration of blood cells in the skin indicates an anti-inflammation effect.
  • the graphs of Figures IA, IB and IC represent the pair-to-pair comparisons between the active, the placebo and the untreated zone on the intensity of the erythema 20 minutes after application of Methyl-Nicotinate measured by TiVi.
  • the ordinate parameter represents the intensity of the blood flow (concentration of red blood cells).
  • Tables 13A and 13B below (Tables 13A and B: mean and standard deviation of the measurements with% of subjects with a positive effect% difference and p value (exact value of significance).
  • the graph Figure 2 shows the evolution over time of the blood flow values.
  • the results show that the active ingredient significantly reduces the intensity of the erythema created compared to the untreated area.
  • the intensity of the erythema on the placebo area does not differ from the area treated.
  • the intensity of the erythema on the active area is significantly lower compared to placebo.
  • the people recruited for this study are subjects:
  • the skin barrier helps regulate water loss through evaporation. When this barrier is damaged, the insensible water loss increases. Conversely, a reinforced barrier corresponds to an insensible loss of water less.
  • the insensible water loss was measured by a Tewameter TM 300.
  • the principle is to measure the temperature and the relative humidity in a tube with one of the openings applied to the skin by 2 sensors located at 2 different heights. Fick's law is then used to determine the insensible water loss.
  • Table 14 values at D0 and D28 of the insensible water loss. Evolution percentages and statistics.
  • the hydration of the skin was measured by a CM 825 corneometer. This device is based on the principle of capacitance measurement, allowing a measurement of the hydration of the surface layers of the skin (10 to 20 ⁇ m of depth).
  • Table 15 values at D0 and D28 of hydration. Evolution percentages and statistics.
  • NMFs Natural Hydration Factors
  • the quantity of NMFs includes urocanic acid (UCA), Pyrrolidone carboxylic acid (PCA) and serine.
  • UCA urocanic acid
  • PCA Pyrrolidone carboxylic acid
  • serine serine
  • Ceramides by Liquid Chromatography coupled with detection by mass spectroscopy (LC / MS).
  • the amount of ceramides includes ceramides with bases [S], [DS] and [P]
  • the content of ceramides provides information on the state of the skin barrier.
  • Table 16 values at DO and D28 of the quantity of NMFs. Evolution percentages and statistics.
  • Table 17 values at DO and D28 of the quantity of ceramides. Evolution percentages and statistics.
  • Table 18 values at DO and D28 of the amount of ILIRA. Evolution percentages and statistics.
  • Table 19 DO and D28 values of the Nile red / lnvolucrine ratio. Evolution percentages and statistics.

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Abstract

L'invention se rapporte à un extrait peptidique de la microalgue Chlamydomonas acidophila, et son procédé de préparation. L'invention se rapporte également à une composition, avantageusement cosmétique ou dermatologique comprenant un tel extrait. L'invention concerne également une telle composition ou un tel extrait pour son utilisation dans la prévention ou le traitement des troubles ou pathologies de la peau, des muqueuses ou des phanères, pour son utilisation dans la prévention ou le traitement des troubles vasculaires, ou encore pour son utilisation dans la prévention ou le traitement des altérations du tissu adipeux. L'invention concerne enfin un procédé de soin cosmétique de la peau, des phanères ou des muqueuses, en vue d'améliorer leur état ou leur aspect, consistant à administrer une telle composition ou un tel extrait.

Description

DESCRIPTION
EXTRAIT DE CHLAMYDOMONAS ACIDOPHILA, SON PROCEDE DE PREPARATION ET LES
COMPOSITIONS COSMETIQUES, ET DERMATOLOGIQUES LE COMPRENANT
DOMAINE DE L'INVENTION
L'invention se rapporte à un extrait peptidique de la microalgue Chlamydomonas acidophila et à une composition cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique comprenant un tel extrait. L'invention a également pour objet un procédé d'extraction d'un extrait peptidique de Chlamydomonas acidophila, ainsi que l'extrait susceptible d'être obtenu par ledit procédé. L'invention concerne également une composition ou un tel extrait pour son utilisation dans la prévention ou le traitement des troubles ou pathologies de la peau, des muqueuses ou des phanères, pour son utilisation dans la prévention ou le traitement des troubles vasculaires, ou encore pour son utilisation dans la prévention ou le traitement des altérations du tissu adipeux. L'invention concerne enfin un procédé de soin cosmétique de la peau, des phanères ou des muqueuses, en vue d'améliorer leur état ou leur aspect, consistant à administrer une telle composition ou un tel extrait.
LES MICROALGUES
Les micro-algues sont des organismes unicellulaires, eucaryotes, doués de photosynthèse et qui sont donc capables comme les végétaux supérieurs d'utiliser le CO2 de l'air pour leur métabolisme mais également d'autres nutriments comme le phosphore, les nitrates, etc. Elles ont été parmi les premières espèces à coloniser la terre. Il existe environ 30 000 espèces décrites mais on suppose qu'il en existe bien plus. On trouve les microalgues à l'état naturel, aussi bien en eau douce que saumâtre à salée à travers le monde.
Les microalgues sont cultivables selon des procédés connus de l'homme de l'art, comme en photo réacteurs dans des milieux contrôlés en lumière, pH et nutriments, et elles connaissent de nombreux débouchés. Elles sont capables comme les organismes supérieurs de synthétiser des protéines, carbohydrates et lipides. Certains lipides sont particuliers comme des acides gras complexes ou des pigments à propriétés biologiques particulières (xanthophylles). Elles ont connu un engouement particulier pour une éventuelle production de biocarburant et leur production en bioréacteur s'est étendue. Les autres débouchés sont divers : alimentation pour poissons (aquarium et piscicultures), alimentation et santé humaine (asthaxanthine extraite d'Haematococcus pluvialis, protéines de la spiruline) et quelques débouchés dans l'industrie cosmétique.
ART ANTERIEUR - Chlamydomonas acidophila
Chlamydomonas acidophila de la classe des Chlorophyceae (Famille : Chlamydomonadaceae) est une microalgue verte d'eau douce qui prolifère dans les eaux très acides (pH 2,3 à 3,4) et adaptées à des milieux chargés en métaux lourds. Elle a été notamment identifiée et prélevée la première fois dans des lacs volcaniques en Argentine. Elle serait riche en phytochélatines, structures particulières capables de chélater les métaux et en caroténoïdes (béta-carotène, lutéine). En dehors des publications, concernant ses conditions éventuelles de culture et développement (tolérance aux pH extrêmes, et aux métaux lourds), il existe peu de choses concernant sa composition et son utilisation. Sa « cousine » Chlamydomonas reinhardii est utilisée comme organisme modèle dans différents secteurs scientifiques comme la génétique.
DESCRIPTION DE L'INVENTION
La Demanderesse a découvert que les extraits peptidiques de la microalgue Chlamydomonas acidophila présentent des propriétés cosmétiques, pharmacologiques et dermatologiques jamais décrites jusqu'à présent. En particulier, c'est la première fois que de tels extraits de Chlamydomonas acidophila sont utilisés en tant que tels, pour leurs propriétés spécifiques.
L'invention a pour objet un extrait peptidique de la microalgue Chlamydomonas acidophila.
Par « extrait peptidique » on entend, au sens de la présente invention un extrait comprenant majoritairement des peptides.
Par « peptide » on entend, au sens de la présente invention, un polymère d'acides aminés reliés entre eux par des liaisons peptidiques. Un peptide est notamment caractérisé par une masse moléculaire comprise entre 200 et 10 000 Daltons (Da), bornes incluses.
Avantageusement, l'extrait de Chlamydomonas acidophila selon l'invention comprend au moins 20 % en poids de peptides, les pourcentages étant exprimés par rapport au poids total dudit extrait. En particulier, l'extrait selon l'invention comprend de 20 % à 90 %, avantageusement de 20 % à 75 %, plus avantageusement de 30 % à 70 %, typiquement 65 %, en poids de peptides, les pourcentages étant exprimés par rapport au poids total dudit extrait.
Avantageusement, l'extrait de Chlamydomonas acidophila selon l'invention est substantiellement débarrassé de toute protéine, notamment de toute protéine native résiduelle. Ceci permet notamment d'éviter des réactions allergiques, et d'améliorer la solubilité et la biodisponibilité de l'extrait selon l'invention.
Par « protéine » on entend, au sens de la présente invention, des macromolécules biologiques formées d'une ou de plusieurs chaînes polypeptidiques. Chacune de ces chaînes est constituée de l'enchaînement de résidus d'acides aminés liés entre eux par des liaisons peptidiques. Une protéine est notamment caractérisée par une masse moléculaire supérieure à 10 000 Daltons (Da). Avantageusement, l'extrait de Chlamydomonas acidophila selon l'invention est substantiellement débarrassé des acides aminés libres. Les acides aminés libres ont une masse moléculaire inférieure à 200 Da.
Dans l'extrait peptidique de Chlamydomonas acidophila selon l'invention, les peptides ont avantageusement une masse moléculaire inférieure à 3500 Daltons (Da). De manière avantageuse, ces peptides recouvrent tous les composés à base d'aminoacides initialement présents dans l'extrait.
Avantageusement, dans l'extrait selon l'invention, au moins 80 %, plus avantageusement au moins 90 %, des peptides ont une masse moléculaire inférieure à 1000 Da.
Avantageusement, dans l'extrait selon l'invention, au moins 30 % des peptides, plus avantageusement au moins 35 %, plus avantageusement au moins 40 % des peptides, ont une masse moléculaire inférieure à 500 Da.
La répartition des masses moléculaires des peptides est exprimée en pourcentage par rapport à la concentration totale de peptides.
Dans le cadre de la présente invention, l'extrait peptidique de Chlamydomonas acidophila est avantageusement obtenu par hydrolyse enzymatique, plus avantageusement en présence d'au moins une protéase. L'extrait selon l'invention est plus avantageusement susceptible d'être obtenu par le procédé décrit plus loin dans la description.
L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'un extrait peptidique de la microalgue Chlamydomonas acidophila, comprenant au moins une étape d'hydrolyse enzymatique. Cette étape est avantageusement effectuée dans les conditions optimales de pH et de température, connues de l'homme de l'art, notamment dans les conditions optimales de pH et de température liées à l'enzyme utilisée.
Avantageusement, ladite étape d'hydrolyse enzymatique est effectuée en présence d'au moins une protéase. Ladite protéase peut être avantageusement une protéase alcaline ou une protéase acide, avantageusement il s'agit d'une protéase alcaline.
Avantageusement selon l'invention, le procédé de préparation d'un extrait peptidique de Chlamydomonas acidophila comprend au moins les étapes suivantes :
a) dispersion en phase aqueuse de la microalgue Chlamydomonas acidophila ;
b) hydrolyse enzymatique de la dispersion aqueuse obtenue à l'étape a) ;
c) traitement thermique du mélange obtenu à l'étape b) ; et
d) récupération de l'extrait peptidique à la fin de l'étape c). A l'étape a), la phase aqueuse est avantageusement de l'eau. En outre, la teneur en microalgue Chlamydomonas acidophila dans la dispersion aqueuse est avantageusement comprise entre 0,1 % et 20 %, plus avantageusement 1 % et 10 %, équivalent extrait sec de la microalgue.
Le traitement enzymatique (étape b) est avantageusement réalisé par ajout d'au moins une protéase, avantageusement dans les conditions optimales de pH et de température connues de l'homme de l'art, par exemple à un pH compris entre 3,0 et 9,0 et typiquement à une température comprise entre 20 °C et 90 °C. En particulier, le traitement enzymatique comprend l'ajout d'une protéase de type alcaline ou acide, avantageusement d'une protéase alcaline.
L'étape d'hydrolyse enzymatique du procédé selon l'invention est très importante, puisqu'elle permet de transformer ou de « découper » les protéines natives présentes dans Chlamydomonas acidophila pour obtenir des peptides.
Dans le cadre de la présente invention, l'étape d'hydrolyse enzymatique est avantageusement suivie d'une étape de traitement thermique afin de dénaturer les enzymes. Cette étape de traitement thermique est avantageusement effectuée à une température supérieure à 40°C, typiquement entre 80 °C et 100°C.
Lors de l'étape d), l'extrait peptidique est avantageusement récupéré par extraction de la dispersion obtenue à la fin de l'étape c), avantageusement sous agitation, et avantageusement à un pH compris entre 3,0 et 9,0 et à une température comprise entre 20 °C et 90°C.
De manière avantageuse, le procédé comprend une étape supplémentaire de filtration ou centrifugation, située entre les étapes c) et d), éventuellement suivie d'une ultrafiltration, diafiltration, ou nanofiltration.
Les étapes de filtration ou de centrifugation, suivies éventuellement d'une ultrafiltration ou diafiltration sur membranes permettent notamment d'éliminer les protéines résiduelles. Les étapes de nanofiltration permettent notamment d'éliminer des sels minéraux ou des acides aminés libres par exemple.
Le procédé selon l'invention comprend avantageusement une étape d'ultrafiltration à 15 kDa, avantageusement entre 10 et 15 kDa, effectuée entre les étapes c) et d), ce qui permet d'éliminer toute protéine résiduelle potentiellement allergisante.
Avantageusement, le procédé selon l'invention comprend également une étape de nanofiltration avec par exemple un seuil de coupure compris entre 100 Daltons et 300 Daltons, avantageusement entre 130 et 300 Daltons, typiquement entre 200 Daltons et 300 Daltons, pour éliminer une partie des acides aminés ou les sels minéraux, suite à l'étape d'ultrafiltration. Avantageusement, ladite étape de nanofiltration est réalisée sur membrane 200 Da.
L'hydrolysat aqueux obtenu, i.e. l'extrait peptidique selon l'invention, peut ensuite être stabilisé physiquement et microbiologiquement par ajout de solvant tel que le glycérol ou les glycols comme le 1,3-propanediol dans différentes proportions adaptées à une telle stabilisation. Avantageusement, le glycérol sera présent seul ou en combinaison avec l'eau ou un glycol, avantageusement dans une proportion comprise entre 40 et 95% et préférentiellement entre 50 et 90%, en masse par rapport à la masse totale de l'extrait peptidique et du solvant. De même, le glycol et préférentiellement le 1,3-propanediol, sera avantageusement présent seul ou en combinaison avec l'eau ou le glycérol, avantageusement dans une proportion comprise entre 40 % et 95 % et préférentiellement entre 50 % et 90 %, en masse par rapport à la masse totale de l'extrait peptidique et du solvant. Ainsi, la présente invention porte en outre sur une composition comprenant l'extrait peptidique de Chlamydomonas acidophila selon l'invention, un solvant choisi parmi le glycérol, les glycols et leurs mélanges en quantité efficace pour une action de stabilisation physique et microbiologique, et éventuellement de l'eau. Les quantités efficaces pour une action de stabilisation physique et microbiologique sont telles que décrites ci-dessus.
Il existe une variante dans laquelle, l'extrait peptidique peut être stabilisé par séchage, par des procédés connus de l'homme de l'art, en présence ou non d'un support de type, par exemple, maltodextrines ou fibres d'acacia (Fibregum(R) société CNI). La teneur en support varie typiquement selon un ratio allant de 0 % à 80 % de support par rapport au pourcentage de matière sèche obtenue dans la forme liquide de l'extrait. L'extrait peut être séché par atomisation, lyophilisation ou tout procédé connu de l'homme de l'art et est préférentiellement séché par lyophilisation afin d'obtenir une poudre finale. La poudre finale comprend avantageusement 30 % à 70% en poids de matière sèche de l'extrait, le complément à 100 % étant le support de lyophilisation. Plus avantageusement la poudre finale comprend 50 % de matière sèche issue de l'extrait et 50 % de support de lyophilisation, ledit support de lyophilisation étant de préférence de type maltodextrines ou fibres d'acacia.
Préférentiellement, à titre d'exemple, l'extrait peptidique peut être obtenu selon le procédé suivant :
a) mise en solution de la microalgue, Chlamydomonas acidophila dans de l'eau à une teneur d'environ 10 % équivalent extrait sec de la microalgue ;
b) hydrolyse enzymatique par une protéase alcaline (l'alcalase de la société Lyven) ;
c) traitement thermique afin de dénaturer les enzymes ;
c') centrifugation, ultrafiltration et diafiltration sur membranes 15 kDa afin d'éliminer les protéines résiduelles potentiellement allergisantes ;
c") nanofiltration sur membrane 200 Da afin d'éliminer des sels minéraux ou des acides aminés libres par exemple ; et
d) récupération de l'extrait peptidique obtenu à la fin de l'étape c").
Dans le cadre du procédé selon l'invention, la microalgue Chlamydomonas acidophila utilisée en tant que matière première peut être issue d'une culture en milieu extérieur, par exemple dans des « raceways » (= bac en forme de circuit utilisé pour l'élevage en écloserie), ou d'une culture en milieu fermé, dans des photobioréacteurs. Avantageusement, ladite microalgue utilisée en tant que matière première est issue d'une culture en photobioréacteur, notamment en photobioréacteur en milieu agité. Plus avantageusement, ladite microalgue utilisée en tant que matière première est issue d'une culture en photobioréacteurs tubulaire horizontaux ventilé à vagues en milieu agité, tels par exemple ceux développés par la société Microphyt et notamment décrits dans la demande de brevet FR 2 943 685 et la demande internationale WO 2011/058267.
La présente invention a également pour objet un extrait de Chlamydomonas acidophila, susceptible d'être obtenu par le procédé mentionné ci-dessus. Un tel extrait répond aux spécifications définies précédemment
L'invention a également pour objet une composition cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique comprenant un extrait peptidique de Chlamydomonas acidophila, en tant que principe actif, et le cas échéant un excipient approprié.
Avantageusement, dans la composition selon l'invention, l'extrait peptidique de Chlamydomonas acidophila est tel que défini ci-dessus ou est susceptible d'être obtenu par le procédé mentionné ci-dessus. Ainsi, ledit extrait est avantageusement tel que défini dans les paragraphes ci- dessus concernant l'extrait selon l'invention en tant que tel ou ceux concernant l'extrait susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention.
Ladite composition est avantageusement formulée pour être administrée par voie topique externe, vaginale ou par voie orale.
Avantageusement, la composition selon l'invention comprend de 0,001 à 10 %, avantageusement 0,01 à 5 %, dudit extrait peptidique de Chlamydomonas acidophila, en poids exprimé d'extrait sec, par rapport au poids total de la composition.
La composition selon l'invention peut comprendre en outre un ou plusieurs autres principes actifs.
Selon une première variante, les différentes préparations sont adaptées à l'administration topique et incluent notamment les crèmes, les émulsions, les laits, les pommades, les lotions, les huiles, les solutions aqueuses ou hydro-alcooliques ou glycoliques, les poudres, les patchs, les sprays, les shampooings, les vernis ou tout autre produit pour application externe. Et selon les variantes suivantes, les différentes préparations incluent notamment les soins d'hygiène intime, les soins bucco- dentaires, comme par exemple, les dentifrices, solutions buccales, gels gingivaux. Selon sa nature (cosmétique, pharmaceutique ou dermatologique), la composition selon l'invention peut en outre comprendre au moins un excipient cosmétiquement, pharmaceutiquement ou dermatologiquement acceptable. Notamment, la composition selon la présente invention peut en outre comprendre au moins un adjuvant cosmétiquement, pharmaceutiquement ou dermatologiquement connu de l'homme du métier, choisi parmi les tensioactifs, les épaississants, les conservateurs, les parfums, les colorants, des filtres chimiques ou minéraux, les agents hydratants, les eaux thermales, etc. L'homme du métier sait adapter la formulation de la composition selon l'invention en utilisant ses connaissances générales.
Les posologies et les formes galéniques optimales des compositions selon l'invention peuvent être déterminées selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement pharmacologique, dermatologique ou cosmétique adapté à un patient ou à un animal, comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient ou de l'animal, la gravité de son état général, la tolérance au traitement, les effets secondaires constatés, le type de peau.
L'invention a aussi pour objet un extrait selon l'invention ou extrait susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention ou une composition selon l'invention, pour son utilisation pour prévenir et/ou traiter :
- des troubles ou pathologies de la peau et/ou des muqueuses (par exemples les gencives, parodontes, muqueuses génitales) et/ou des phanères (par exemples les cheveux et ongles) ;
- des troubles vasculaires ; et
- des altérations du tissu adipeux.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un extrait selon l'invention ou d'un extrait susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention ou d'une composition selon l'invention, pour la fabrication d'une composition cosmétique, pharmaceutique ou dermatologique pour prévenir et/ou traiter :
- des troubles ou pathologies de la peau et/ou des muqueuses (par exemples les gencives, parodontes, muqueuses génitales) et/ou des phanères (par exemples les cheveux et ongles) ;
- des troubles vasculaires ; et
- des altérations du tissu adipeux.
L'invention a en outre pour objet une méthode pour prévenir et/ou traiter : - des troubles ou pathologies de la peau et/ou des muqueuses (par exemples les gencives, parodontes, muqueuses génitales) et/ou des phanères (par exemples les cheveux et ongles) ;
- des troubles vasculaires ; et
- des altérations du tissu adipeux,
comprenant l'administration, notamment l'administration topique, d'une quantité efficace d'un extrait selon l'invention ou d'un extrait susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention ou d'une composition selon l'invention, à un sujet en ayant besoin.
En particulier, l'extrait selon l'invention ou l'extrait susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention ou la composition selon l'invention est destiné à la prévention et/ou au traitement des réactions ou pathologies allergiques, inflammatoires, irritatives ou des troubles de la barrière ou de l'homéostasie de la peau, des phanères (cheveux et ongles) et/ou des muqueuses (gencives, parodontes, muqueuses génitales) immature(s), normale(s) ou mature(s)/âgée(s).
Avantageusement, la composition ou l'extrait selon l'invention peut être utilisé(e) pour la prévention et/ou le traitement des réactions, troubles ou pathologies :
de la peau, telles que l'acné, la rosacée ou érythrocouperose, le psoriasis, les troubles vasculaires, la dermite du siège, la dermatite atopique, l'eczéma, la dermatite de contact, la dermatite irritative, la dermatite allergique, la dermite séborrhéique (croûte de lait), le psoriasis, la peau sensible, la peau réactive, la peau sèche (xérose), la peau déshydratée, la peau avec rougeur, l'érythème cutané, la peau âgée ou photoâgée, la peau photosensibilisée, la peau pigmentée (mélasma, pigmentation post-inflammatoire...), la peau dépigmentée (vitiligo), la peau avec cellulite, la peau relâchée, la peau avec vergetures, les dartres, les gerçures, les piqûres, les crevasses en particulier des seins, les coups de soleil, les inflammations dues aux rayons de toutes sortes, les irritations par agents chimiques, physiques (par exemple contrainte de tension pour les femmes enceintes), bactériologiques, fongiques ou viraux, parasitaires (poux, gale, teigne, acariens, dermatophytes), radiologiques ou par déficit de l'immunité innée (peptides antimicrobiens) ou acquise (cellulaire, humorales, cytokines), et/ou
des muqueuses telles que les gencives et parodontes pouvant présenter des gingivites (gencives sensibles des nouveaux nés, problèmes d'hygiène, dus au tabagisme ou autres), des parodontopathies, ou des muqueuses génitales pouvant présenter des irritations des sphères génitales males ou femelles externes ou internes et/ou
des phanères tels que les ongles (ongles cassants, fragiles ...) et des cheveux (alopécie, pellicules, hirsutisme, dermites séborrhéiques, folliculites) immatures, normaux ou matures, présentant en particulier des troubles du cuir chevelu tels que les alopécies (ou pelade) androgénétiques, aiguës, localisées, cicatricielles, congénitales, occipitales du nourrisson, aerata, dues à la chimiothérapie/radiothérapie ou encore l'effluvium télogène, l'effluvium anagène, la dystrophie pilaire, la trichotillomanie, la teigne ou les pellicules grasses ou sèches.
L'invention concerne également un procédé de soin cosmétique de la peau et/ou des phanères et/ou des muqueuses, en vue d'améliorer leur état et/ou leur aspect, consistant à administrer un extrait selon l'invention ou un extrait susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention ou une composition selon l'invention.
En particulier, le procédé de soin cosmétique permet d'affermir la peau et de diminuer l'effet « peau d'orange » avantageusement par voie topique sur la peau et/ou phanères et/ou muqueuses.
En particulier, l'invention concerne un procédé de soin cosmétique de la peau et/ou des phanères, pour agir sur l'élasticité ou la fermeté de la peau, en particulier comme agent tenseur ou anti-rides, pour agir sur les peaux sensibles, ou encore pour agir contre la pollution, consistant à appliquer sur la peau et/ou les phanères une composition ou un extrait selon la présente invention.
En particulier, l'invention concerne un procédé de soin cosmétique de la peau et/ou des phanères, en vue d'en prévenir les altérations de la barrière et sa déshydratation, consistant à appliquer sur la peau et/ou les phanères une composition ou un extrait selon la présente invention.
L'invention concerne un procédé de soin cosmétique de la peau, en vue d'en prévenir le vieillissement, consistant à appliquer sur la peau une composition ou un extrait selon la présente invention.
La composition ou l'extrait selon la présente invention peut également être avantageusement utilisée dans la prévention et/ou le traitement des troubles vasculaires, en particulier les rougeurs et les couperoses.
La composition ou l'extrait selon la présente invention peut également être avantageusement utilisée dans la prévention et/ou le traitement des altérations du tissu adipeux. Les altérations des tissus adipeux sont en particulier la cellulite ou l'effet « peau d'orange ». La composition selon l'invention permet d'affermir la peau.
La présente invention peut être illustrée de manière non-limitative par les exemples qui suivent.
DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 représente les résultats de mesure d'intensité de l'érythème : comparatifs Actif/Placebo/Zone Non traitée. NS: différence non significative. *: p<0,05 (Exemple 3B).
La Figure 2 représente l'évolution dans le temps du flux sanguin (Exemple 3B).
La Figure 3 représente les illustrations des résultats de PIE obtenus à D0 et D28 (Exemple 3C).
La Figure 4 représente les illustrations des résultats d'hydratation obtenus à D0 et D28 (Example 3C). La Figure 5 représente les illustrations de la quantité de NMFs quantifiée à D0 et D28 (Example 3C). La Figure 6 représente les illustrations de la quantité de céramides quantifiée à DO et D28 (Example 3C).
La Figure 7 représente les illustrations de la quantité d'ILIRA quantifiée à DO et D28 (Example 3C).
La Figure 8 représente les illustrations du ratio Nile red/lnvolucrine à DO et D28 (Exemple 3C).
EXEMPLES
Exemple 1 : extrait selon l'invention
Un extrait peptidique est obtenu selon le procédé suivant :
a) mise en solution de la micro-algue Chlamydomonas acidophila, à 10 % de matière sèche dans l'eau ; b) hydrolyse par une protéase alcaline (Alcalase de la société Lyven) ;
c) traitement thermique à température comprise entre 80 °C et 100 °C afin de dénaturer les enzymes; c') centrifugation, ultrafiltration et diafiltration sur membranes 15 kDa afin d'éliminer les protéines résiduelles potentiellement allergisantes
c") nanofiltration sur membrane 200 Da afin d'éliminer des sels minéraux ou des acides aminés ou monosaccharides libres
d) récupération de l'extrait peptidique
e) Stabilisation dans un mélange glycérol / 1, 3 - propanediol
L'extrait peptidique liquide ainsi obtenu présente les caractéristiques suivantes :
1 - Analyse physico-chimique (% / matière sèche totale)
Extrait sec (2h, 105 °C, étuve ventilée) : 1,2 %
pH : 5,1
Azote a-aminé (OPA, équivalent leucine) : 29 %
Peptides (Kjeldahl, N x 6.25) : 70 %
Cendres totales : 4 %
2 - Profil des répartitions des masses molaires des peptides
Inférieur à 500 Da : 40 %
Entre 500 - 1000 Da : 55 %
Entre 1000 - 3500 Da : 4 %
Supérieur à 3500 Da : 1 %
Exemple 2 : Tests d'activités biologiques de l'extrait selon l'invention lin vitro) L'activité biologique de l'extrait de Chlamydomonas acidophila (CAP) obtenu à l'exemple 1 a été démontrée in vitro comme décrit ci-après.
Ces études in vitro ont permis de mettre en évidence le potentiel de l'extrait CAP sur : le renforcement de la barrière cutanée (en particulier la barrière lipidique) ;
l'hydratation cutanée via la synthèse d'acide hyaluronique, la production des NMF et les voies de transport des osmolytes ;
les défenses anti-oxydantes et anti-inflammatoires vis-à-vis de stress aspécifiques ou liés à la pollution atmosphérique ;
un effet anti-âge, notamment via la préservation de l'homéostasie de la matrice dermique ; les mécanismes de l'allergie.
I. Screening préliminaire d'activité sur fibroblastes dermiques et épidermes reconstruits mélanisés
Les activités biologiques potentielles de l'extrait de Chlamydomonas acidophila ont été recherchées par un test de modulation d'expression de gènes sur fibroblastes dermiques et épidermes reconstruits mélanisés. Ainsi, l'expression de 96 gènes d'intérêts majeurs en physiologie cutanée et cosmétique a été étudiée par PCR-array sur des fibroblastes et des épidermes reconstruits mélanisés.
a. Matériel et Méthodes :
L'extrait de Chlamydomonas acidophila (CAP) à 0,05 % de matière sèche a été ajouté dans le milieu de culture de fibroblastes dermiques humains normaux (NHDFs) ou d'épidermes humains mélanisés reconstitués.
Après 6 heures ou 24 heures d'incubation, l'expression des marqueurs sélectionnés a été évaluée par RT-PCR quantitative (carte microfluidique TaqMan). La variation d'expression des marqueurs étudiés par rapport au témoin a été exprimée en quantité relative (QR, QR > 1 : augmentation, QR < 1 : diminution).
b. Résultats :
Les résultats les plus significatifs montrant l'effet de l'extrait CAP sur l'expression de gènes dans des épidermes reconstruits sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1 : Variations de l'expression de gènes d'intérêt dans des épidermes humains reconstruits mélanisés
Quantité Relative (QR) par rapport au contrôle = 1 / p value déterminée suite à un test de Student
Ces résultats tendent à montrer que l'extrait de Chlamydomonas acidophila, en faisant varier l'expression génique de certains marqueurs, pourrait avoir un intérêt particulier dans les activités suivantes :
La synthèse et le remodelage des lipides dans la fonction barrière de l'épiderme :
Le gène GBA/GBAP1 encodant l'enzyme Glucosylcéramidase ou b-glucocérébrosidase est sur exprimé après 6h de traitement avec CAP.
RAB11A code pour une GTPase (Ras-related protein Rab-llA) impliquée dans la biogenèse des corps lamellaires au sein de kératinocytes. Ceci souligne l'importance de RAB11A dans l'homéostasie de la barrière épidermique.
La biosynthèse de l'acide hyaluronique et l'hydratation de l'épiderme :
Les hyaluronan-synthases-2 et -3 (HAS2 et HAS3) sont des enzymes responsables de la synthèse d'acide hyaluronique (AH).
- L'expression graduelle de SLC6A6 dans les couches spineuse et granuleuse de l'épiderme permet de maintenir l'hydratation nécessaire au niveau de l'épiderme dans un environnement sec.
Les gènes PADI1, BLMH, CASP14 codent pour des enzymes impliquées dans la production des facteurs naturels d'hydratation (ou NMF pour Natural Moisturizing Factors).
Le tableau 2 ci-après présente les résultats les plus significatifs de l'extrait CAP sur l'expression de gènes dans des fibroblastes.
Tableau 2 : Variations de l'expression de gènes d'intérêt dans des fibroblastes dermiques humains normaux (NHDFs) Quantité Relative (QR) par rapport au contrôle égal 1 / p value déterminée suite à un test de Student
Ces résultats montrent un potentiel d'activité de l'extrait CAP dans les axes suivants : Anti-vieillissement cutané :
- Les trois hyaluronan-synthases, HAS1, HAS2 (5,76 0,008) et HAS3, produites par les fibroblastes au niveau du derme sont responsables de la biosynthèse de l'acide hyaluronique (AH).
- Par ailleurs, il est démontré que le vieillissement cutané est associé à la diminution de la prolifération des fibroblastes. On observe une diminution d'expression du facteur de prolifération Ki-67 liée à l'âge [Ma et al., 2011 Br. J. Dermatol., 164(3), pp. 479-482], L'actif CAP augmente l'expression de MKI67 après 24h de traitement témoignant d'une possible augmentation de la prolifération des cellules, ce qui renforce son effet anti-âge.
- Il a été montré que l'expression de la lamine B1 (LMNB1) au sein de la peau diminue avec l'âge. Les défenses anti-oxydantes :
- La NAD(P)H déshydrogénase, quinone 1 (NQOl) est une flavoprotéine cytosolique sous le contrôle du facteur de transcription Nrf-2. NQOl favorise, par réduction, la formation des hydroquinones à partir des quinones, empêchant la production d'espèces radicalaires. - La protéine HSP70 (encodée par le gène HSPA1A) est une molécule chaperone (heat shock protein 70) qui inhibe l'agrégation des protéines dénaturées, favorise leur renaturation (refolding) et contrôle des médiateurs essentiels de la machinerie apoptotique.
- Le système thiorédoxine est un des systèmes majeurs de défense anti-oxydante. Parmi les 3 isoformes de la thioredoxine réductase, l'isoforme 1 codée par le gène TXNRD1 régulé par l'extrait CAP est la plus étudiée.
- A côté du système thiorédoxine, on retrouve également le système peroxyrédoxine / sulfirodoxine. Parmi les peroxyrédoxines, la peroxyrédoxine-6 (PRDX6) est surexprimée par l'extrait CAP après 24h de traitement. Ceci témoigne d'une action détoxifiante de l'actif vis-à-vis de la présence de peroxydes.
- Enfin l'extrait CAP stimule le gène GLOl, qui fait partie du système GLO qui détecte et neutralise certains carbonyles, et les empêche ainsi d'attaquer les cellules et leurs composants.
L'homéostasie de la matrice dermique :
- L'extrait CAP stimule l'expression de PSMB1, gène codant pour la sous-unité béta 1 du protéasome. Le protéasome joue un rôle majeur dans le maintien de l'homéostasie protéique en éliminant les protéines endommagées ou malformées qui pourraient altérer le fonctionnement cellulaire.
- L'expression génique de LOXL2 est également augmentée, ce gène fait partie de la famille des Lysyl oxidases, enzymes impliquées dans l'assemblage des fibres d'élastine et de collagène.
II. Action anti-inflammatoire
A. Activité anti-inflammatoire vis-à-vis d'un stress chimique au PMA
a. Introduction :
La réponse inflammatoire est la réponse normale, immédiate et transitoire de l'organisme vis à vis de toute agression de l'environnement.
Cependant, dans certaines conditions pathologiques ou physiologiques, cette réaction inflammatoire peut être exacerbée et, mal contrôlée, peut conduire à des dommages tissulaires.
Au niveau de la peau, le kératinocyte est l'une des premières cellules participant à l'initiation de la réaction inflammatoire en réponse à une agression de l'environnement.
Le kératinocyte « agressé » va alors relarguer :
- des cytokines primaires (ILla, Iίΐb ou TNFa) ou secondaires (IL8) qui vont induire une cascade de réactions impliquant le système immunitaire. - des prostaglandines (PGE), qui font partie de la famille des prostanoïdes. La voie de synthèse des prostaglandines qui aboutit à la synthèse de la PGE2 et d'autres PGEs est induite par des stimuli inflammatoires.
L'activité anti-inflammatoire de l'extrait de Chlamydomonas acidophila selon l'invention a été évaluée sur un modèle d'inflammation induite sur kératinocytes par un traitement au PMA (Phorbol 12- Myristate 13-Acetate). Le relargage des cytokines TNFa et Prostaglandine E2 (PGE2) a été analysé. b. Matériels et Méthodes :
Des kératinocytes épidermiques humaines normaux ont été pré-traités pendant 24 h par l'extrait de Chlamydomonas acidophila (CAP) selon l'exemple 1, à des concentrations comprises entre 0,0001 % et 0,05 % de matière sèche, ou par les molécules de références anti-inflammatoires dexaméthasone à 0,1 mM ou indométacine à 0,1 pM (ces deux dernières références servant de référence anti inflammatoire pour les cytokines et prostaglandines respectivement).
L'inflammation a ensuite été induite par ajout de PMA à 10 pg/mL pendant une nuit.
Un dosage de TNFa et PGE2 a ensuite été réalisé dans les surnageants de culture cellulaire.
La significativité des résultats a été vérifiée par une analyse de variance à un facteur suivie d'un test de Tuckey (logiciel GraphPad Prism version 5.02, GraphPad Software, San Diego California USA). c. Résultats :
Le PMA à 10 pg/ml a significativement augmenté le relargage de TNFa dans les surnageants des kératinocytes et a donc bien induit une inflammation. La dexaméthasone à 0,1 pM et l'indométacine 0,1 pM, en prétraitement 24 h, ont bien diminué le relargage de TNFa, démontrant ainsi leur effet anti-inflammatoire et validant le test.
L'extrait de Chlamydomonas acidophila, en prétraitement 24h aux différentes concentrations, a diminué significativement le relargage de TNFa et donc a montré une action anti-inflammatoire face au PMA.
Tableau 3 : Dosage de TNF-alpha dans des kératinocytes humains normaux stimulés par du PMA
$$$p < 0,001 vs Contrôle / ***p < 0,001 vs PMA- ANOVA à un facteur suivi d'un test de Tukey
Le PMA à 10 pg/ml a significativement augmenté le relargage de la PGE2 dans les surnageants des kératinocytes donc le PMA a bien induit une inflammation. L'indométacine et la dexaméthasone à 0,1 mM, en prétraitement 24 h, ont significativement diminué le relargage de PGE2. L'effet anti inflammatoire de ces deux références a donc bien été validé.
L'extrait de Chlamydomonas acidophila, en prétraitement 24 h aux deux concentrations, a diminué significativement le relargage de PGE2 et donc a montré une action anti-inflammatoire face au PMA.
Tableau 4 : Dosage de PGE2 dans des kératinocytes humains normaux stimulés par du PMA
$$$ p < 0,001 vs contrôle/ **p < 0,01 ; ***p < 0,001 vs PMA - ANOVA à 1 facteur suivi d'un test Tukey
d. Conclusion :
L'effet anti-inflammatoire de l'extrait de Chlamydomonas acidophila a été mis en évidence grâce à son action sur le relargage de TNFa et de la prostaglandine E2 en condition inflammatoire.
B. Activité anti-inflammatoire vis-à-vis d'un stress au Nickel
a. Introduction
Le Nickel est la cause majeure de dermatite allergique de contact dans la population, avec une prévalence mondiale d'environ 8,6 % L'objectif de l'étude décrite ci-après est d'évaluer l'effet de l'extrait CAP sur le relargage d'IL8 par des kératinocytes stimulés au Nickel.
b. Matériel et méthodes
Des kératinocytes épidermiques humains normaux ont été pré-traités 24 heures par l'extrait CAP à 0,01 % et 0,05 % de matière sèche ou par la molécule de référence anti-inflammatoire Dexaméthasone à 1 mM. Les kératinocytes ont ensuite été traités pendant 24 heures par du Nickel : NiS04 à IOmM. A la fin de l'incubation, la quantité d'IL8 produite par les cellules a été évaluée par un test ELISA dans les surnageants.
La concentration en IL8 dosée a été normalisée par rapport à la quantité de protéines totales intracellulaires évaluée par BC Assay.
La significativité des résultats a été analysée statistiquement par un test t de Student.
c. Résultats
L'extrait CAP induit une diminution significative du relargage d'IL8 induit par un stress au Nickel dans des kératinocytes.
Tableau 5 : Dosage d'IL8 dans des kératinocytes humains normaux stimulés par du NiS04
d. Conclusion L'extrait de Chlamydomonas acidophila (CAP) inhibe le relargage d'une cytokine majeure, l'IL8, dans le contexte d'un stress inflammatoire induit par le Nickel. L'extrait présente donc un intérêt dans le contexte de l'allergie de contact ou de l'hypersensibilité cutanée liée par le Nickel.
C. Activité anti-inflammatoire vis-à-vis d'un stress au Cadmium
a. Introduction
L'objectif de cette étude est d'évaluer l'activité anti-inflammatoire de l'extrait Chlamydomonas acidophila (CAP) vis-à-vis d'un stress aux métaux lourds, représenté par le Cadmium, sur des kératinocytes humains normaux.
b. Matériel et méthodes
Des kératinocytes épidermiques humains normaux ont été pré-traités 24 heures par l'extrait CAP à 0,001 % et 0,01 % de matière sèche ou par la molécule de référence anti-inflammatoire Indométhacine à 0,1 mM. Les kératinocytes ont ensuite été traités pendant 48 heures par du Cadmium : CdCI2 à 100 pM. A la fin de l'incubation, la quantité de PGE2 produite par les cellules a été évaluée par un test ELISA dans les surnageants.
La concentration en PGE2 dosée a été normalisée par rapport à la quantité de protéines totales intracellulaires évaluée par BC Assay.
c. Résultats
L'extrait CAP induit une diminution du relargage de PGE2 induit par un stress au Cadmium dans des kératinocytes.
Tableau 6 : Dosage de PGE2 dans des kératinocytes humains normaux stimulés par du Cadmium
d. Conclusion
L'extrait de Chlamydomonas acidophila (CAP) inhibe la production de Prostaglandine E2 (PGE2) induite par un stress au Cadmium. L'extrait apporte donc une protection de la peau vis-à-vis d'un stress aux métaux lourds, dans le cadre de la pollution environnementale par exemple. D. Activité anti-inflammatoire vis-à-vis d'un stress au SDS
a. Introduction
L'activité anti-inflammatoire de l'extrait de Chlamydomonas acidophila (CAP) a été évaluée sur un modèle d'inflammation induite par un traitement au SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) sur épidermes reconstitués.
b. Matériel et méthodes
Des épidermes humains reconstruits (ou RHE pour Reconstructed Human Epidermis) ont été pré incubés pendant 24 heures en présence de CAP à 0,01 % et 0,05 % de matière sèche. Du SDS à 0,025 % a ensuite été appliqué à la surface des épidermes qui ont de nouveau été incubés 24 heures, toujours en présence de l'extrait CAP.
A l'issue de l'incubation, la cytokine TNFa (Tumor Necrosis Factor alpha) a été dosée par ELISA dans les surnageants.
L'expression génique de marqueurs inflammatoires et de la barrière a été évaluée en qRT-PCR.
La significativité des résultats a été analysée statistiquement par une Analyse de Variance à un facteur suivie par un test de Tukey.
c. Résultats
Le traitement des épidermes reconstruits par le SDS induit une augmentation de l'expression du TNFa au niveau génique (qRT-PCR, tableau 8) et protéique (ELISA, tableau 7). Cet effet pro-inflammatoire s'accompagne également d'une diminution de l'expression de la kératine 1 (KRT1) (tableau 8), témoignant d'une altération de la fonction de barrière épidermique.
Dans ces conditions, l'extrait CAP a significativement inhibé la surproduction de TNFa et a augmenté l'expression de la kératine 1.
Tableau 7 : Dosage du TNFa produit par des épidermes humains reconstruits stimulés par du SDS
Tableau 8 : Expression génique dans des épidermes humains reconstruits stimulés par du SDS
*p < 0,05 ; ***p < 0,001 - ANOVA à un facteur suivi d'un test de Tukey
d. Conclusion
Ces résultats confirment le potentiel anti-inflammatoire de l'extrait de Chlamydomonas acidophila et montrent sa capacité à protéger la barrière d'un stress externe.
III. Action anti-oxydante
a. Introduction
Le screening d'expression génique réalisé sur l'extrait de Chlamydomonas acidophila selon l'exemple 1 ayant montré un potentiel dans la stimulation des défenses anti-oxydantes ; la capacité à protéger la cellule d'un stress oxydatif a été évalué par mesure de la production d'espèces réactives de l'oxygène (ERO ou ROS pour Reactive Oxygen Species) dans des kératinocytes soumis à un stress oxydatif induit par IΉ2O2.
L'évaluation de l'effet anti-oxydant de l'actif se fait grâce à l'incorporation de DCFH-DA (2', 7'- Dichlorofluorescin diacétate) dans des kératinocytes en culture. Cette molécule est un marqueur non fluorescent à l'état non oxydé. En condition oxydante (ici stress H2O2), le DCFH-DA va être dégradé en DCF, molécule qui va émettre de la fluorescence. La fluorescence ainsi mesurée sera proportionnelle à la quantité d'espèces réactives de l'oxygène produites par la cellule en présence de H2O2 et/ou de l'extrait.
b. Matériels et Méthodes
Des kératinocytes épidermiques humains normaux ont été pré-incubés pendant 24 heures en présence de l'extrait CAP à 0,0001% de matière sèche, de Quercétine à 10 mM ou de Vitamine C à 500 pM (ces deux dernières molécules servant de référence anti-oxydante).
Les cellules sont ensuite traitées lh en présence de DCFH-DA à 0,5 mM. L'oxydation est induite par ajout de H2O2 à 100 mM pendant 20 minutes. Un deuxième traitement par les produits testés est effectué simultanément au stress H2O2 (aux mêmes concentrations que le pré traitement).
Enfin, une mesure de la densité de fluorescence (DFU) correspondant à la quantité d'ERO est réalisée à l'aide d'un lecteur microplaque.
La significativité des résultats a été vérifiée par une analyse de variance à un facteur suivie d'un test de Tuckey (logiciel GraphPad Prism version 5.02, GraphPad Software, San Diego California USA). c. Résultats
Une augmentation de la production des ERO a été observée après traitement par IΉ2O2 validant ainsi le modèle. La Quercétine et la Vitamine C ont significativement diminué la production des ERO suite au traitement par H2O2. L'effet anti-oxydant de ces deux références a bien été validé sur le modèle. L'extrait de Chlamydomonas acidophila a significativement diminué la production des ERO induits par un stress H2O2.
Tableau 9 : Production d'espèces réactives de l'oxygène (ERO) dans des kératinocytes traités par le peroxyde d'hydrogène (H2O2)
*** p < 0,001 - ANOVA à un facteur suivie d'un test de Tuckey
d. Conclusion :
L'extrait de Chlamydomonas acidophila a démontré un effet anti-oxydant face un stress induit par H202.
IV. Activité sur la barrière et l'hydratation
a. Introduction
Le screening d'expression génique réalisé sur l'extrait de Chlamydomonas acidophila et présenté précédemment a montré un potentiel effet sur la stimulation de l'expression des marqueurs géniques impliqués dans la barrière et l'hydratation. Nous avons cherché à confirmer cet effet sur des kératinocytes.
b. Matériel et méthodes
Des kératinocytes épidermiques humains normaux ont été incubés pendant 48 heures en présence de l'extrait CAP à 0,001 % de matière sèche.
L'expression génique des marqueurs de la fonction barrière et de l'hydratation a été évaluée par qRT- PCR.
Les résultats ont été analysés statistiquement par une Analyse de Variance à un facteur suivie d'un test de Dunnett.
c. Résultats
L'extrait de Chlamydomonas acidophila a stimulé l'expression génique des marqueurs GBA (Beta- Glucocérébrosidase) et HAS3 (Hyaluronane Synthase 3) impliqués respectivement dans la synthèse des lipides épidermiques et dans la synthèse de l'acide hyaluronique. Ces résultats, en faveur d'un effet de renforcement de la barrière perméable épidermique et de l'hydratation, confirment les tendances observées dans le cadre du screening d'expression génomique.
Par ailleurs, l'extrait de Chlamydomonas acidophila a également stimulé l'expression des marqueurs SLC6A6 et SLC5A3, codant respectivement pour TAUT (canal transporteur membranaire de la taurine) et SMIT (canal transporteur du myoinositol).
Ces deux gènes codent pour des transporteurs d'osmolytes, ils sont donc impliqués dans le maintien de l'hydratation de la peau et la protection des cellules vis-à-vis de stress externes.
Enfin l'extrait a induit une augmentation de l'expression génique de la Filagrine (FLG) et de PADI1 (Peptidyl Arginine Deiminase), protéine et enzyme impliqués dans la synthèse des éléments des facteurs naturels d'hydratation (NMF). Tableau 10 : Expression génique de marqueurs de la barrière et de l'hydratation dans des kératinocytes
*p < 0,05 - ANOVA à un facteur suivi d'un test de Dunnett
d. Conclusion
Ces résultats montrent que l'extrait de Chlamydomonas acidophila a un potentiel dans le renforcement de la barrière cutanée et le maintien de l'hydratation cutanée.
V. Evaluation des effets de l'extrait de Chlamydomonas acidophila dans les mécanismes de l'allergie A. Introduction
Les potentiels effets anti-allergiques de l'extrait de Chlamydomonas acidophila ont été recherchés sur :
- L'expression génique de chimiokines pro-inflammatoires dans des kératinocytes épidermiques humains normaux (NHEK) stimulés par un mélange de cytokines Th2 (IL-4 + IL-13 + IL-22 + TNF-a) reproduisant un phénotype de type « dermatite atopique » de phase tardive (inflammation chronique).
- L'activation de basophiles humains induite par le fMLP. Cette activation a été mesurée à l'aide d'un kit spécifique et d'une analyse par cytométrie en flux en quantifiant un marqueur spécifique des cellules basophiles activées (CD63) dans la population totale des basophiles identifiés par l'expression du marqueur CCR3. En parallèle, une activation par l'anticorps anti-FCeRI a été réalisée comme contrôle positif.
B. Inhibition de facteurs chémoattractants suite à un stress TH2
a. Matériel et méthodes
Des kératinocytes épidermiques humains normaux ont été pré-incubés pendant 24 heures en présence de l'extrait CAP à 0,01 % de matière sèche (ms) ou de la référence JAK Inhibitor I à 10 mM. Après la pré incubation, le traitement des cellules par l'extrait CAP ou la référence a été renouvelé puis les cellules ont été stimulées par un cocktail de cytokines Th2 (IL4+IL13+IL22+TNFa à 10 ng/ml) pendant 24 heures. A l'issue de l'incubation, l'expression génique des marqueurs d'intérêt a été évaluée par qRT-PCR. b. Résultats Dans des kératinocytes soumis à un stress Th2, l'extrait de Chlamydomonas acidophila a inhibé l'expression génique de CCL5 (C-C motif chemokine ligand 5 ou RANTES) et CCL27 (C-C motif chemokine ligand 27), codant pour des chimiokines impliquées dans l'amplification de la réaction inflammatoire et allergique cutanée.
Tableau 11 : Expression génique dans des kératinocytes épidermiques soumis à un stress Th2
c. Conclusion
L'extrait de Chlamydomonas acidophila module l'inflammation induite par un stress Th2 dans des kératinocytes en inhibant l'expression génique des facteurs chémoattractants CCL5 et CCL27.
C. Inhibition de l'activation de basophiles
a. Matériel et méthodes
Le test d'activation de basophiles (BAT) a été réalisé à l'aide du kit Flow CAST® (BÜHLMANN, réf. FKCCR).
Du sang total a été pré-incubé pendant 15 minutes en présence de l'extrait CAP à 0,033 % et 0,1 % de matière sèche (ms) ou des références (SB202190 à 30 mM ; ou cromoglycate à 10 mM).
Le stimulant, fM LP à 1 mM a ensuite été ajouté et le sang a été incubé pendant 15 minutes supplémentaires en présence du tampon de marquage contenant un mélange d'anticorps monoclonaux (anti-CD63-FITC et anti-CCR3-PE).
Une analyse en cytométrie de flux a ensuite été réalisée afin de comptabiliser la population totale de basophiles (CCR3+) et basophiles activés (CCR3+/CD63+).
b. Résultats
La stimulation par le peptide fM LP a entraîné une très nette activation des basophiles (40,1 % de cellules activées, soit 4527 % de stimulation).
Dans le cadre de cette étude, 2 composés de référence potentiels ont été testés en présence de fMLP: Le SB202190, un inhibiteur de la p38 MAPkinase ; l'activation de cette kinase est indispensable dans le mécanisme d'activation des basophiles conduisant à la dégranulation ;
Le cromoglycate, un anti-allergique connu, dont le mécanisme d'action passe par une stabilisation de la membrane plasmique au niveau de laquelle il inhibe la pénétration intracellulaire de Ca++, cet ion étant indispensable à la dégranulation mastocytaire.
Le SB202190, testé à 30 mM, ainsi que le cromoglycate, testé à 10 mM, ont tous deux présenté un effet inhibiteur significatif sur l'activation des basophiles induites par le fMLP (respectivement, 26 % et 46 % d'inhibition).
Dans les conditions expérimentales de cette étude, l'extrait CAP, testé à 0,033 % et 0,1 %, a présenté un effet inhibiteur net et dépendant de la concentration sur l'activation des basophiles induites par le fMLP (respectivement, 22 % et 39 % d'inhibition).
Tableau 12 : Effet des composés sur l'activation de basophiles humains en condition stimulée avec fMLP
Analyse en cytométrie en flux après double marquage anti-CCR3 et anti-CD63
Test t de Student
c. Conclusion
L'extrait de Chlamydomonas acidophila inhibe l'activation de basophiles.
D. Conclusion
En inhibant, d'une part l'expression génique de cytokines chémoattractantes dans des kératinocytes soumis à un stress Th2, et d'autre part, l'activation de basophiles ; l'extrait de Chlamydomonas acidophila pourrait contribuer à moduler les processus impliqués dans l'initiation de la réponse allergique.
Exemple 3 : Tests cliniques de l'extrait selon l'invention
L'activité biologique de l'extrait de Chlamydomonas acidophila (CAP) obtenu à l'exemple 1 a été démontrée par études cliniques comme décrit ci-après.
L'ensemble de ces résultats démontre ainsi des effets significatifs de l'actif "CAP", tels qu'un :
effet protecteur ;
effet barrière ;
effet hydratant ; et
effet anti inflammatoire/ anti rougeur.
Ces études cliniques ont permis de mettre en évidence le potentiel de l'extrait CAP sur la prévention ou le traitement :
Des peaux sensibles ;
Des rougeurs ;
Des inflammations ; et
Des allergies.
A. Synthèse des résultats cliniques
Etude érythème chimique
L'actif CAP (3% matière active) a démontré une efficacité significative sur les paramètres suivants :
Intensité de l'érythème maximal 20 minutes après application d'une solution à 0.1% de Méthyl-
Nicotinate
L'intensité du flux sanguin mesurée par TiVi est significativement plus faible sur la zone traitée par l'actif comparé à la zone non traitée.
La rougeur mesurée par spectrocolorimétrie est significativement inférieure sur la zone traitée par l'actif comparé à la zone non traitée.
Evolution de l'érythème 30 minutes après l'érythème d'intensité maximale
La diminution de l'intensité du flux sanguin mesuré parTivi est significativement plus élevée sur la zone traitée par l'actif comparé à la zone non traitée. La diminution de la rougeur mesurée par spectrocolorimétrie est significativement plus importante sur la zone traitée par l'actif comparé à la zone non traitée.
Etude Peau Sensible
L'actif CAP (3% matière active) a démontré une efficacité significative sur les paramètres suivants : Mesures instrumentales
L'actif :
- diminue significativement la Perte Insensible en Eau après 28 jours d'application.
- diminue significativement la rougeur après 28 jours d'application.
- augmente significativement l'hydratation après 28 jours d'application.
Evaluations biochimiques
L'actif :
- augmente significativement la quantité de NMFs après 28 jours d'application.
- compense significativement la baisse de Céramides observée sur la zone placebo après 28 jours d'application.
- diminue significativement la quantité de d'ILIRA après 28 jours d'application.
- diminue significativement la quantité de d'ILla après 28 jours d'application.
- diminue significativement le ratio ILIRA/ILla après 28 jours d'application.
- diminue significativement la quantité d'IL8 après 28 jours d'application.
B. Evaluation de l'efficacité protectrice/anti rougeur/anti inflammation d'un actif versus placebo par évaluation du flux sanguin par tivi et évaluation de la couleur par spectrocolorimètre
Design de l'étude :
- Etude en double aveugle.
- Etude comparative actif vs placebo, randomisée
Population :
19 sujets ont été analysés pour cette étude. Les 19 sujets ont appliqué l'actif et le placebo sur 2 zones définies. Une zone non traitée a également été définie.
Les personnes recrutées pour cette étude sont des sujets :
sains de sexe féminin, âgés entre 18 et 60 ans âge moyen 38±3 min :18 max :60
ayant la peau de type caucasien, phototype de I à III
Modalités d'utilisation et déroulement de l'étude :
Applications des produits réalisées par les sujets eux-mêmes, à leur domicile, 2 fois par jour (matin et soir) pendant 14 jours de D-14 à DOtO sur chaque zone définie au niveau de l'avant-bras. Au bout de 14 jours, les sujets reviennent à l'unité clinique. Les mesures basales DOtO sont alors réalisées. Une dernière application des produits est réalisée. Un érythème chimique est ensuite induit sur chaque zone avec une solution à 0.1% de Méthyl-Nicotinate. Les mesures sur chaque zone sont ensuite réalisées après 20 minutes (intensité maximale) noté D0t20 et 50 minutes (30 minutes après l'érythème maximal) noté D0t50 suivant l'induction de l'érythème.
Deux paramètres sont analysés pour chaque paramètre évalué :
- La variation entre D0t20 et DOtO traduisant l'effet préventif sur l'apparition de l'érythème de chaque produit.
- La variation entre D0t50 et D0t20 traduisant l'effet préventif sur l'évolution de l'érythème de chaque produit.
EVALUATION DU FLUX SANGUIN PAR TIVI
La méthode utilisée par le TiVi 700 repose sur le fait que la lumière verte est fortement absorbée par les cellules des vaisseaux sanguins, alors que la lumière rouge l'est modérément. En utilisant une source de luminosité polarisée, la méthode s'affranchit de la réflexion spéculaire pour ne prendre en compte que la lumière renvoyée par le tissu cutanée. L'appareil produit ainsi une cartographie d'intensité avec chaque pixel représentant une concentration en cellules sanguines de la peau.
Une diminution de l'intensité de la concentration en cellules sanguines de la peau traduit un effet anti inflammation.
Résultats : Effet préventif sur l'apparition de l'érythème
Les graphiques des Figures IA, IB et IC représentent les comparaisons paire-à-paire entre l'actif, le placebo et la zone non traitée sur l'intensité de l'érythème 20 minutes après application de Méthyl- Nicotinate mesuré par TiVi. Le paramètre en ordonné représente l'intensité du flux sanguin (concentration en globules rouges). Les valeurs numériques exactes sont dans les tableaux 13A et 13B ci-dessous (Tableaux 13A et B : moyenne et écart type des mesures avec % de sujets présentant un effet positif % de différence et p value (valeur exacte de significativité).
Le graphique Figure 2 montre l'évolution dans le temps des valeurs de flux sanguin.
Les résultats montrent que l'actif diminue significativement l'intensité de l'érythème créé en comparaison à la zone non traitée. L'intensité de l'érythème sur la zone placebo ne diffère pas de la zone traitée. L'intensité de l'érythème sur la zone actif est significativement plus faible en comparaison au placebo.
Tableau 13A
Tableau 13B
C. Evaluation de l'efficacité d'un actif versus placebo par évaluation de la perte insensible en eau par tewamètre, évaluation de l'hydratation par cornéométrie, évaluation des propriétés biochimiques par prélèvement écouvillon
Design de l'étude :
- Etude en double aveugle.
- Etude comparative actif vs placebo, randomisée, en hémi visage
Population :
Concernant la mesure d'hydratation, de la perte insensible en eau, de la couleur et du questionnaire, 36 sujets ont été inclus dans l'analyse.
Concernant les analyses biochimiques, 10 sujets ont été inclus dans l'analyse.
Les personnes recrutées pour cette étude sont des sujets :
sains de sexe féminin, âgés entre de plus de 18, âge moyen 51±3 min :21 max :68
ayant la peau de type caucasien, phototype de I à IV
ayant la peau sensible au niveau du visage (la peau du sujet doit réagir à au moins 2 des 3 stress suivants : environnemental, chimique ou mécanique)
Modalités d'utilisation et déroulement de l'étude :
A D0 :
• Vérification des critères d'inclusion et de non inclusion
• Acclimatation pendant 30 minutes
• Définition des zones de mesures sur chaque hémi visage
• Mesures instrumentales et prélèvements biologiques
Entre DO et D28 :
Application de l'actif et du placebo en hémivisage 2 fois par jour (matin et soir) A D28 :
• Acclimatation pendant 30 minutes
• Mesures instrumentales et prélèvements biologiques
EVALUATION DE LA PERTE INSENSIBLE EN EAU
La barrière cutanée permet de réguler la perte en eau par évaporation. Lorsque cette barrière est endommagée, la perte insensible en eau augmente. A l'inverse, une barrière renforcée correspond à une perte insensible en eau plus faible.
La perte insensible en eau a été mesurée par un Tewamètre TM 300. Le principe est de mesurer dans un tube dont une des ouvertures est appliquée sur la peau la température et l'humidité relative par 2 capteurs situés à 2 hauteurs différentes. La loi de Fick est ensuite utilisée pour déterminer la perte insensible en eau.
Les résultats obtenus pour la mesure de PIE à DO et D28 sont donnés dans le tableau 14. L'illustration des évolutions est donnée figure 3.
Tableau 14 : valeurs à D0 et D28 de la perte insensible en eau. Pourcentages d'évolution et statistiques.
Les résultats obtenus montrent que la PIE diminue significativement entre DO et D28 avec l'actif et le placebo. La comparaison de l'évolution entre DO et D28 observée avec l'actif par rapport à l'évolution observée avec le placebo est statistiquement significative en faveur de l'actif.
EVALUATION DE L'HYDRATATION
La mesure de l'hydratation de la peau a été réalisée par un Cornéomètre CM 825. Cet appareil est basé sur le principe de la mesure de capacitance, permettant une mesure de l'hydratation des couches superficielles de la peau (10 à 20 pm de profondeur).
Les résultats obtenus pour l'hydratation à D0 et D28 sont donnés dans le tableau 15. L'illustration des évolutions est donnée Figure 4.
Les résultats obtenus montrent que l'hydratation augmente significativement entre D0 et D28 avec l'actif alors qu'elle ne varie pas avec le placebo. La comparaison de l'évolution entre D0 et D28 observée avec l'actif par rapport à l'évolution observée avec le placebo est statistiquement significative en faveur de l'actif.
Tableau 15 : valeurs à D0 et D28 de l'hydratation. Pourcentages d'évolution et statistiques.
EVALUATIONS BIOCHIMIQUES
Les évaluations biochimiques suivantes ont été réalisées :
A partir du prélèvement de type écouvillon :
• Les Facteurs Naturels d'Hydratation (NMFs) par chromatographie Liquide couplée à une détection UV (LC/UV). La quantité de NMFs regroupe l'acide urocanique (UCA), l'acide Pyrrolidone carboxylique (PCA) et la sérine. La teneur en NMFs permet de renseigner sur l'état d'hydratation de la peau.
• Les céramides par chromatographie Liquide couplée à une détection par spectroscopie de masse (LC/MS). La quantité de céramides regroupe les céramides présentant des bases [S], [DS] et [P] La teneur en céramides permet de renseigner sur l'état de la barrière cutanée.
• L'état inflammatoire via la quantification des Cytokines (par ELISA):
o IL1RA
o ILla
o I LS
A partir du prélèvement de type D-squames :
Marquage Nile Red/lnvolucrine
NMFs
Les résultats obtenus pour les NMFs à DO et D28 sont donnés dans le tableau 16. L'illustration des évolutions est donnée Figure 5.
Les résultats obtenus montrent que la quantité de NMFs augmente significativement entre DO et D28 avec l'actif alors que le placebo diminue significativement cette quantité. La comparaison de l'évolution entre DO et D28 observée avec l'actif par rapport à l'évolution observée avec le placebo est statistiquement significative en faveur de l'actif.
Tableau 16 : valeurs à DO et D28 de la quantité de NMFs. Pourcentages d'évolution et statistiques.
Céramides
Les résultats obtenus pour les céramides à DO et D28 sont donnés dans le tableau 17. L'illustration des évolutions est donnée Figure 6.
Les résultats obtenus montrent que la quantité de céramides diminue avec le placebo, et que l'actif compense cette diminution (les évolutions entre DO et D28 pour le placebo et l'actif ne sont cependant pas significatives). La comparaison de l'évolution entre DO et D28 observée avec l'actif par rapport à l'évolution observée avec le placebo est statistiquement significative en faveur de l'actif.
Tableau 17 : valeurs à DO et D28 de la quantité de céramides. Pourcentages d'évolution et statistiques.
IL1RA
Les résultats obtenus pour IL1RA à DO et D28 sont donnés tableau 18. L'illustration des évolutions est donnée Figure 7.
Les résultats obtenus montrent que la quantité d'ILIRA diminue de manière significative entre DO et D28 avec l'actif et le placebo. La comparaison de l'évolution entre DO et D28 observée avec l'actif par rapport à l'évolution observée avec le placebo est statistiquement significative en faveur de l'actif.
Tableau 18 : valeurs à DO et D28 de la quantité d'ILIRA. Pourcentages d'évolution et statistiques.
Ratio Nile red/lnvolucrine
Les résultats obtenus pour le ratio Nile red/lnvolucrine à DO et D28 sont donnés dans le tableau 19. L'illustration des évolutions est donnée Figure 8.
Les résultats obtenus montrent que le ratio Nile red/lnvolucrine ne varie pas de manière significative entre DO et D28 avec l'actif et pour le placebo. La comparaison de l'évolution entre DO et D28 observée avec l'actif par rapport à l'évolution observée avec le placebo est statistiquement significative en faveur de l'actif.
Tableau 19 : valeurs à DO et D28 du ratio Nile red/lnvolucrine. Pourcentages d'évolution et statistiques.

Claims

REVENDICATIONS
1. Extrait peptidique de la microalgue Chlamydomonas acidophila obtenu par un procédé de préparation comprenant au moins une étape d'hydrolyse enzymatique, comprenant au moins 20 % en poids de peptides, les pourcentages étant exprimés par rapport au poids total dudit extrait.
2. Extrait selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend de 20 % à 90 %, avantageusement de 20 % à 75 %, typiquement de 30 % à 70 %, en poids de peptides, les pourcentages étant exprimés par rapport au poids total dudit extrait.
3. Extrait selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les peptides ont une masse moléculaire inférieure à 3500 Daltons (Da).
4. Extrait selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'au moins 80 % en poids des peptides ont une masse moléculaire inférieure à 1000 Da.
5. Extrait selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'au moins 30 %, avantageusement au moins 35 %, en poids des peptides, ont une masse moléculaire inférieure à 500 Da.
6. Procédé de préparation d'un extrait peptidique de chlamydomonas acidophila, comprenant au moins une étape d'hydrolyse enzymatique.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'étape d'hydrolyse enzymatique est effectuée en présence d'au moins une protéase, avantageusement d'au moins une protéase alcaline.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes :
a) dispersion en phase aqueuse de la microalgue Chlamydomonas acidophila ;
b) hydrolyse enzymatique de la dispersion aqueuse obtenue à l'étape a), avantageusement en présence d'au moins une protéase,
c) traitement thermique du mélange obtenu à l'étape b), et
d) récupération de l'extrait peptidique à la fin de l'étape c).
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend une étape supplémentaire de filtration ou centrifugation, située entre les étapes c) et d), éventuellement suivie d'une ultrafiltration, diafiltration, ou nanofiltration.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape d'ultrafiltration à 15 kDa, effectuée entre les étapes c) et d), ou après l'étape de filtration ou centrifugation supplémentaire.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de nanofiltration avec un seuil de coupure compris entre 100 Daltons et 300 Daltons, effectuée après l'étape d'ultrafiltration à 15 kDa.
12. Composition comprenant un extrait peptidique de la microalgue Chlamydomonas acidophila obtenu par un procédé de préparation comprenant au moins une étape d'hydrolyse enzymatique, en tant que principe actif, et un excipient approprié.
13. Composition selon la revendication 12, caractérisé en ce que ledit extrait est tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou est susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 11.
14. Composition selon l'une quelconque des revendications 12 ou 13, comprenant 0,001 % à 10 %, avantageusement 0,01 % à 5 %, dudit extrait peptidique de Chlamydomonas acidophila, en poids exprimé d'extrait sec, par rapport au poids total de la composition.
15. Extrait selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou extrait susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 11 ou composition selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, pour son utilisation pour prévenir et/ou traiter :
- des troubles ou pathologies de la peau et/ou des muqueuses et/ou des phanères, avantageusement des réactions ou pathologies allergiques, inflammatoires, irritatives ou des troubles de la barrière ou de l'homéostasie de la peau, des phanères et/ou des muqueuses immature(s), normale(s) ou mature(s)/âgée(s), et/ou
- des troubles vasculaires, notamment les rougeurs ou les couperoses, et/ou
- des altérations du tissu adipeux.
16. Extrait selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou un extrait susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 11 ou une composition selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, pour son utilisation pour améliorer l'état et/ou l'aspect de la peau et/ou des phanères et/ou des muqueuses.
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