KR20210110336A - 클라미도모나스 아시도필라의 추출물, 이를 제조하는 방법 및 이를 포함하는 미용적 조성물 및 피부과학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 미세조류 클라미도모나스 아시도필라 (Chlamydomonas acidophila)의 펩티드 추출물, 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 추출물을 포함하는 조성물, 유리하게 미용적 또는 파부과학적 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 피부, 점막 또는 피부 부속기관을 침범하는 장애 또는 질환의 예방 또는 치료에 사용되거나, 혈관 장애의 예방 또는 치료에 사용되거나, 이밖에도 지방 조직 변형의 예방 또는 치료에 사용되는 조성물 또는 이러한 추출물에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 피부, 피부 부속기관 또는 점막의 미용 관리 방법으로서, 이들의 병태 또는 이들의 외양을 개선하는 견지에서 이러한 조성물 또는 이러한 추출물을 투여하는 것으로 구성되는, 방법에 관한 것이다.

Description

클라미도모나스 아시도필라의 추출물, 이를 제조하는 방법 및 이를 포함하는 미용적 조성물 및 피부과학적 조성물
본 발명은 미세조류 클라미도모나스 아시도필라 (Chlamydomonas acidophila)의 펩티드 추출물, 및 이러한 추출물을 포함하는 미용적, 피부과학적 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 클라미도모나스 아시도필라의 펩티드 추출물을 추출하는 방법 및 상기 방법에 의해 획득가능한 추출물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 피부, 점막 또는 피부 부속기관의 장애 또는 병리학의 예방 또는 치료에 사용되거나, 혈관 장애의 예방 또는 치료에 사용되거나, 지방 조직 변경의 예방 또는 치료에 사용되는 조성물 또는 이러한 추출물에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 피부, 점막 또는 피부 부속기관의 미용 관리 방법으로서, 이들의 병태 또는 이들의 외양을 개선하는 견지에서 이러한 조성물 또는 이러한 추출물을 투여하는 것으로 구성되는, 방법에 관한 것이다.
미세조류
미세조류는 광합성을 하는 단세포, 진핵 유기체이고, 따라서 고등 식물처럼 이들의 대사를 위해 인, 질산염 등과 같은 다른 영양분과 더불어 공기로부터 나온 CO2를 이용할 수 있다. 이들은 처음 지구에 번성한 종에 속한다. 약 30,000개의 종들이 기재되어 왔지만, 더 많을 것으로 여겨진다. 미세조류는 천연 상태에서 발견되어, 전세계적으로 담수, 반염수, 염수에 서식한다. 미세조류는 당업자라면 숙지하고 있는 방법에 따라, 예컨대 광-, pH- 및 영양분 조절된 환경의 광반응기에서 배양될 수 있고, 많은 응용 분야를 갖는다. 이들은 고등 유기체처럼 단백질, 탄수화물 및 지질을 합성할 수 있다. 일부 지질은 복합 지방산 또는 특정한 생물학적 성질을 갖는 색소 (크산토필)와 같이 특수하다. 이들은 생물연료의 생산 가능성으로 인해 인기가 높았으며, 생물반응기로 이들의 생산이 확장되어 왔다. 다른 응용 분야는 어류 사료 (아쿠아리움 및 어류 농장), 식품 및 인간 건강 (헤마토코커스 플루비아리스 (Haematococcus pluvialis)로부터 추출된 아스트라잔틴, 스피룰리나 단백질)으로 다양하고, 일부 응용 분야는 화장품 산업이다.
선행 기술 - 클라미도모나스 아시도필라
클라미도모나스 아시도필라는 클로로파이세애 목 (클라미도모나다세애 과)이고, 강한 산성 (pH 2.3 내지 3.4)에서 증식하고, 중금속이 실린 환경에 적응하는 녹색 민물 미세조류이다. 구체적으로, 이것은 아르헨티나의 화산 호수에서 처음 동정되고, 수집되었다. 이것은 금속을 킬레이팅할 수 있는 특수한 구조인 식물킬라틴 및 카로티노이드 (베타-카로틴, 루테인)가 풍부한 것으로 알려져 있다. 이의 가능한 배양 및 발생 조건 (극한 pH 및 중금속에 대한 내성)에 관련된 간행물과는 별도로, 이의 조성물 및 용도에 관한 것은 거의 없다. 이의 사촌격인 클라미도모나스 리인하드티 (Chlamydomonas reinhardtii)는 유전학과 같은 상이한 과학 섹터에서 모델 유기체로서 사용되고 있다.
본 출원인은 미세조류 클라미도모나스 아시도필라 (Chlamydomonas acidophila)의 펩티드 추출물이 이전에 기술된 적이 없는 미용적, 약학적 및 피부과학적 성질을 나타내는 것을 발견하였다. 구체적으로, 이러한 클라미도모나스 아시도필라 추출물은 마찬가지로 이들의 특이적 성질에 대해 사용된 것은 처음이다.
본 발명은 미세조류 클라미도모나스 아시도필라의 펩티드 추출물에 관한 것이다.
본 발명의 의미에서, "펩티드 추출물"은 주로 펩티드를 포함하는 추출물을 의미한다.
본 발명의 의미에서, "펩티드"는 펩티드 결합에 의해 다함께 연결된 아미노산의 중합체를 의미한다. 펩티드는 구체적으로 200 내지 10,000 달톤 (Da) 범위에 포함되는 분자량을 특징으로 한다.
유리하게, 본 발명에 따른 클라미도모나스 아시도필라 추출물은 적어도 20 중량%의 펩티드를 포함하고, 백분율은 상기 추출물의 총 중량을 기준으로 표현된다. 구체적으로, 본 발명에 따른 추출물은 20 중량% 내지 90 중량%, 유리하게 20 중량% 내지 75 중량%, 더욱 유리하게 3 중량% 내지 70 중량%, 전형적으로 65 중량%의 펩티드를 포함하고, 상기 백분율은 상기 추출물의 총 중량을 기준으로 표현된다.
유리하게, 본 발명에 따른 클라미도모나스 아시도필라 추출물은 실질적으로 임의의 단백질, 구체적으로 임의의 잔류하는 고유의 단백질이 없다. 무엇보다, 이것은 알레르기 반응을 회피하고, 본 발명에 따른 추출물의 가용성 및 생체유용성을 개선시킨다.
본 발명의 의미에서, "단백질"은 하나 이상의 폴리펩티드 사슬로 형성되는 생물학적 거대분자를 의미한다. 이들 사슬 각각은 펩티드 결합에 의해 다함께 연결된 아미노산의 서열을 의미한다. 단백질은 구체적으로 10,000 달톤 (Da) 이상의 분자량을 특징으로 한다.
유리하게, 본 발명에 따른 클라미도모나스 아시도필라 추출물은 실질적으로 유리 아미노산이 없다. 상기 유리 아미노산은 200 Da 미만의 분자량을 갖는다.
본 발명에 따른 클라미도모나스 아시도필라의 펩티드 추출물에서, 펩티드는은 유리하게 3,500 달톤 (Da) 미만의 분자량을 갖는다. 유리하게, 이들 펩티드는 추출물에 처음부터 존재하는 아미노산계 화합물 모두를 포괄한다.
유리하게, 본 발명에 따른 추출물에서, 상기 펩티드 중 적어도 80 중량%, 더욱 유리하게 적어도 90 중량%는 1,000 Da 미만의 분자량을 갖는다.
유리하게, 본 발명에 따른 추출물에서, 상기 펩티드 중 적어도 30 중량%, 더욱 유리하게 적어도 35 중량%, 더욱 더 유리하게 적어도 40%는 500 Da 미만의 분자량을 갖는다.
상기 펩티드의 분자량 분포는 총 펩티드 농도의 백분율로서 표현된다.
본 발명의 맥락에서, 클라미도모나스 아시도필라의 펩티드 추출물은 유리하게 효소적 가수분해에 의해, 더욱 유리하게 적어도 하나의 프로테아제의 존재 시 획득된다. 본 발명에 따른 추출물은 더욱 유리하게 하기 상세한 설명에 기술된 방법에 의해 획득가능하다.
또한, 본 발명은 미세조류 클라미도모나스 아시도필라의 펩티드 추출물을 제조하는 방법으로서, 적어도 하나의 효소적 가수분해 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 이러한 단계는 유리하게 당업자라면 숙지하고 있는 최적의 pH 및 온도 조건 하에, 구체적으로 사용된 효소와 관련된 최적의 pH 및 온도 조건 하에 수행된다.
유리하게, 상기 효소적 가수분해 단계는 적어도 하나의 프로테아제의 존재 시 수행된다. 상기 프로테아제는 유리하게 알칼리 프로테아제 또는 산 프로테아제일 수 있으며, 유리하게 알칼리 프로테아제이다.
유리하게 본 발명에 따르면, 클라미도모나스 아시도필라의 펩티드 추출물을 제조하는 방법은 다음의 단계
(a) 미세조류 클라미도모나스 아시도필라의 수용성 상 분산;
(b) 유리하게 적어도 하나의 프로테아제의 존재 시, 단계 (a)에서 획득된 상기 수용성 분산의 효소적 가수분해;
(c) 단계 (b)에서 획득된 상기 혼합물의 열 처리; 및
(d) 단계 (c)의 종결 시 상기 펩티드 추출물의 회수
중 적어도 하나를 포함한다.
단계 (a)에서, 수용성 상은 유리하게 물이다. 또한, 수용성 분산에서 미세조류 클라미도모나스 아시도필라의 함량은 유리하게 미세조류의 건조 추출물 당량으로 0.1% 내지 20%, 더욱 바람직하게 1% 내지 10% 범위에 포함된다.
효소적 처리 (단계 (b))는 바람직하게 적어도 하나의 프로테아제를, 유리하게 당업자라면 숙지하고 있는 최적의 pH 및 온도 조건 하에, 예를 들면 pH 3.0 내지 9.0에 포함되는 pH에서, 전형적으로 20℃ 내지 90℃에 포함되는 온도에서 첨가함으로써 수행된다. 구체적으로, 효소적 처리는 알칼리 또는 산 프로테아제, 바람직하게 알칼리 프로테아제의 첨가를 포함한다.
본 발명에 따른 방법의 효소적 가수분해 단계는 매우 중요하고, 클라미도모나스 아시도필라에 존재하는 고유의 단백질을 변형하거나 "절단"하여 펩티드를 획득하기 때문이다.
본 발명의 맥락에서, 효소적 가수분해 단계는 유리하게 열 처리 단계로 이어져서 효소를 변성시킨다. 이러한 열 처리 단계는 유리하게 40℃ 이상, 전형적으로 80℃ 내지 100℃의 온도에서 수행된다.
단계 (d)에서, 펩티드 추출물은 유리하게 pH 3.0 내지 9.0에 포함되는 pH에서 및 20℃ 내지 90℃에 포함되는 온도에서, 유리하게 교반하면서, 유리하게 단계 (c)의 종결 시 획득되는 분산의 추출에 의해 회수된다.
유리하게, 상기 방법은 단계 (c) 및 (d) 사이에 위치하고, 선택적으로 한외여과, 투석 또는 나노여과로 이어지는, 추가적인 여과 단계 또는 원심분리 단계를 포함한다.
상기 여과 또는 원심분리 단계는, 선택적으로 막 한외여과 또는 투석으로 이어지고, 잔류 단백질을 제거하는데 사용된다. 나노여과 단계는 예를 들면 미네랄 염 또는 유리 아미노산을 제거하는데 사용된다.
본 발명에 따른 방법은 단계 (c) 및 (d) 사이에서 수행되는, 15 kDa 유리하게 10 kDa 내지 15 kDa의 한외여과 단계를 포함하고, 이는 임의의 잠재적 알레르기성 잔류 단백질을 제거하는데 사용된다.
바람직하게, 본 발명에 따른 방법은 상기 한외여과 단계 이후에 일부 아미노산 또는 미네랄 염을 제거하기 위하여, 예를 들면 100 달톤 내지 300 달톤, 바람직하게 130 달톤 내지 300 달톤, 전형적으로 200 달톤 내지 300 달톤에 포함되는 컷오프 한계값을 갖는 나노여과 단계를 추가로 포함한다. 유리하게, 상기 나노여과 단계는 200 달톤 막 상에서 수행된다.
다음으로 획득된 수용성 가수분해물, 즉 본 발명에 따른 펩티드 추출물은 용매 예컨대 글리세롤 또는 1,3-프로판디올과 같은 글리콜을 안정화에 적합한 상이한 비율로 첨가하여 물리적으로 및 미생물적으로 안정화될 수 있다. 바람직하게, 글리세롤은 단독으로 또는 물 또는 글리콜과 조합하여, 바람직하게 펩티드 추출물 및 용매의 총 중량을 기준으로 40 중량% 내지 95 중량%, 바람직하게 50 중량% 내지 90 중량%에 포함되는 비율로 존재할 것이다. 유사하게, 글리콜 우선적으로 1,3-프로판디올은 단독으로 또는 물 또는 글리세롤과 조합하여, 바람직하게 펩티드 추출물 및 용매의 총 중량을 기준으로 40 중량% 내지 95 중량%, 바람직하게 50 중량% 내지 90 중량%에 포함되는 비율로 존재할 것이다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 클라미도모나스 아시도필라의 펩티드 추출물, 물리적 및 미생물적 안정화 작용에 효과적인 양으로 글리세롤, 글리콜 및 이들의 혼합물로부터 선택된 용매 및 선택적으로 물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 물리적 및 미생물적 안정화 작용을 위한 유효량은 상기에 기술된 바와 같다.
대안으로서, 펩티드 추출물은 예를 들면 말토덱스트린 또는 아카시아 섬유 (CNI사로부터 나온 파이버검(R))과 같은 담체의 존재 또는 부재 시, 당업자라면 숙지하는 방법에 의해 건조시킴으로써 안정화될 수 있다. 담체 함량은 전형적으로 추출물의 액상 형태에서 획득된 건조 물질의 백분율과 대비하여 0% 내지 80%의 담체 비율에 따라 달라질 수 있다. 추출물은 분무화, 냉동-건조화 또는 당업자kaus 숙지하는 임의의 방법에 의해 건조될 수 있고, 우선적으로 냉동-건조화에 의해 건조되어 최종 분말을 획득한다. 최종 분말은 유리하게 추출물의 건조 물질을 기준으로 30 중량% 내지 70 중량%을 포함하고, 냉동-건조화 담체로 100% 균형을 맞춘다. 더욱 유리하게, 최종 분말은 상기 추출물로부터 50%의 건조 물질 및 50%의 냉동-건조화 담체를 포함하고, 상기 냉동-건조화 담체는 바람직하게 말토덱스트린 또는 아카시아 섬유 유형이다.
우선적으로, 예로서, 상기 펩티드 추출물은 다음의 공정
(a) 물에서 미세조류의 약 10% 건조 추출물 당량의 함량으로 미세조류 클라미도모나스 아시도필라의 용해;
(b) 알칼리 프로테아제 (라이벤사로부터 나온 알칼라제)에 의한 효소적 가수분해;
(c) 효소를 변성시키도록 열 처리;
(c') 잠재적 알레르기성 잔류 단백질을 제거하기 위하여 원심분리, 한외여과 및 15kDa 막 상의 투석;
(c") 예를 들면 미네랄 염 또는 유리 아미노산을 제거하도록 200 Da 막 나노여과; 및
(d) 단계 (c")의 종결 시 획득된 펩티드 추출물의 회수
에 따라 획득될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 맥락에서, 미가공 물질로서 사용된 클라미도모나스 아시도필라 미세조류는 개방된 환경, 예를 들면 "경주장" (어류 부화장 사육에 사용되는 난형 트랙 구조의 탱크)에서의 배양, 또는 폐쇄된 환경인 광생물반응기에서의 배양으로부터 유래할 수 있다. 유리하게, 미가공 물질로서 사용된 상기 미세조류는 광생물반응기, 구체적으로 교반된 탱크 광생물반응기에서의 배양으로부터 유래한다. 더욱 유리하게, 미가공 물질로서 사용된 상기 미세조류는, 예를 들면 마이크로파이트사에 의해 개발된 광생물반응기와 같은 수평 튜브형 파도-통기되는 교반-탱크 광생물반응기에서의 배양으로부터 유래하고, 구체적으로 프랑스 특허출원 FR　2　943　685 및 국제특허출원 WO　2011/058267에 기술되어 있다.
또한, 본 발명은 상기 언급된 방법에 의해 획득가능한 클라미도모나스 아시도필라 추출물에 관한 것이다. 이러한 추출물은 상기 정의된 명세를 충족시킨다.
또한, 본 발명은 활성 성분으로서 클라도모나스 아시도필라의 펩티드 추출물 및 필요한 경우 적합한 부형제를 포함하는 미용적, 피부과학적 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
유리하게, 본 발명에 따른 조성물에서, 클라도모나스 아시도필라의 펩티드 추출물은 상기에 정의된 바와 같거나, 상기 언급된 방법에 의해 획득가능하다. 따라서, 상기 추출물은 유리하게 마찬가지로 본 발명에 따른 추출물에 관한 상기 단락 또는 본 발명의 방법에 의해 획득가능한 추출물에 관한 상기 단락에 정의된 바와 같다.
상기 조성물은 유리하게 외부에 국소로, 질로 또는 경구로 투여되도록 제형화된다.
유리하게, 본 발명에 따른 조성물은 클라미도모나스 아시도필라의 상기 펩티드 추출물을 상기 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 건조 추출물로서 표현되는 중량으로, 0.001 중량% 내지 10 중량%, 유리하게 0.01 중량% 내지 5 중량% 포함한다.
본 발명에 따른 조성물은 하나 이상의 다른 활성 성분을 추가로 포함할 수 있다.
제 1 대안에 따르면, 다양한 제조물은 국소 투여에 적합하고, 구체적으로 크림, 에멀전, 밀크, 연고, 로션, 오일, 수용성 또는 히드로알코올성 또는 글리콜성 용액, 분말, 패치, 스프레이, 샴푸, 바니쉬 또는 외부 적용을 위한 기타 다른 산물을 포함한다. 또한 다음의 대안에 따르면, 구체적으로 다양한 제조물은 예를 들면 치약, 경구용 용액, 치은 젤과 같은 친숙한 위생 관리, 경구 관리를 포함한다.
이의 (미용적, 약제학적 또는 피부과학적) 특성에 의존하여, 본 발명에 따른 조성물은 적어도 하나의 미용적으로, 약제학적으로 또는 피부과학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 조성물은 표면활성제, 증점제, 보존제, 향료, 염료, 화학적 또는 미네랄 필터, 보습제, 지열수 등으로부터 선택되는, 당업자라면 숙지하고 있는 적어도 하나의 미용적으로, 약제학적으로 또는 피부과학적으로 허용가능한 아쥬반트를 추가로 포함할 수 있다. 당업자라면 이들의 일반 지식을 사용하여 본 발명에 따른 조성물의 제형화에 적응시키는 방식을 숙지하고 있다.
본 발명에 따른 조성물의 최적의 용량 및 생약 형태는, 환자 또는 동물에게 적응된 약학적, 피부과학적 또는 미용적 치료의 확립 시 일반적으로 고려되는, 예를 들면 환자 또는 동물의 연령 또는 체중, 환자 또는 동물의 일반적인 병태의 중증도, 치료에 대한 내성, 관찰된 부작용 및 피부 유형과 같은 판정기준에 따라 결정될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 추출물, 본 발명에 따른 방법에 의해 획득가능한 추출물 또는 본 발명에 따른 조성물로서,
- 피부, 점막 (예를 들면, 치은, 치주, 생식기 막) 및/또는 피부 부속기관 (예를 들면, 모발 및 손발톱)의 장애 또는 병리학;
- 혈관 장애; 및
- 지방 조직의 변경
을 예방하고/거나 치료하는데 사용되는, 추출물, 방법에 의해 획득가능한 추출물 또는 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 추출물, 본 발명에 따른 방법에 의해 획득가능한 추출물 또는 본 발명에 따른 조성물의 용도로서,
- 피부, 점막 (예를 들면, 치은, 치주, 생식기 막) 및/또는 피부 부속기관 (예를 들면, 모발 및 손발톱)의 장애 또는 병리학;
- 혈관 장애; 및
- 지방 조직의 변경
을 예방하고/거나 치료하는 미용적, 약제학적 또는 피부과학적 조성물을 제조하는, 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은
- 피부, 점막 (예를 들면, 치은, 치주, 생식기 막) 및/또는 피부 부속기관 (예를 들면, 모발 및 손발톱)의 장애 또는 병리학;
- 혈관 장애; 및
- 지방 조직의 변경
을 예방하고/거나 치료하는 방법으로서,
본 발명에 따른 추출물, 본 발명에 따른 방법에 의해 획득가능한 추출물 또는 본 발명에 따른 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게, 구체적으로 국소적으로 투여하는 것을 포함하는, 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명에 따른 추출물, 본 발명에 따른 방법에 의해 획득가능한 추출물 또는 본 발명에 따른 조성물은 알레르기, 염증, 자극성 반응, 또는 피부, 미성숙, 정상 또는 성숙/노화 피부 부속기관 (모발 및 손발톱) 및/또는 점막의 장벽 또는 항상성의 병리학 또는 장애의 예방 및/또는 치료를 목적으로 한다.
유리하게, 본 발명에 따른 조성물 또는 추출물은 피부, 점막 및/또는 피부 부속기관의 반응, 장애 또는 병리학
- 피부, 예컨대 여드름, 장미증 또는 적혈구 쿠퍼증, 건선, 혈관 장애, 기저귀 발진, 아토피 피부염, 습진, 접촉성 피부염, 자극성 피부염, 알레르기성 피부염, 지루성 피부염 (유아 지방관), 건선, 민감성 피부, 반응성 피부, 건조 피부 (건조증), 탈수된 피부, 피부 붉은기 (redness), 피부 홍반, 노화 또는 광노화 피부, 광민감성 피부, 색소성 피부 (기미, 염증-후 색소침착 등), 탈색소성 피부 (백반증), 셀룰라이트성 피부, 처진 피부, 신장 마크를 갖는 피부, 가피, 갈라진 피부, 천공, 구체적으로 유방의 튼살, 화상, 모든 종류의 광선으로 인한 염증, 화학적, 물리적 (예를 들면, 임신한 여성의 스트레스), 세균학적, 진균성 또는 바이러스성, 기생충 (이, 옴, 백선증, 진드기, 피부 진균) 또는 방사선 제제에 의한 또는 선천성 (항미생물 펩티드) 또는 후천성 (세포성, 체액성 사이토카인) 면역의 결핍에 의한 자극,
- 점막, 예컨대 치은염 (신생아의 민감성 치은, 흡연 등에 의한 위생 문제)을 제시할 수 있는 치은 및 치주, 치주 질환 또는 남성 또는 여성의 외부 또는 내부 생식기 부위의 자극을 제시할 수 있는 생식기 점막, 및/또는
- 피부 부속기관, 예컨대 구체적으로 안드로겐성 급성, 국소화, 흉터, 선천성 또는 영유아 후두 탈모 (원형 탈모증), 원형 탈모증, 화학요법/방사선 요법 관련된 탈모 또는 휴지기 탈모, 성장기 탈모, 털 디스트로피, 발모광, 백선 또는 지성 또는 건성 비듬과 같은 두피의 장애를 제시하는 미성숙, 정상 또는 성숙 손발톱 (불완전, 깨지기 쉬운 손발톱 등) 및 모발 (탈모, 비듬, 다모증, 지루성 피부염, 모낭염)
의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 피부, 피부 부속기관 및/또는 점막의 미용 관리 방법으로서, 이들의 병태 및/또는 이들의 외양을 개선하는 견지에서 본 발명에 따른 추출물, 본 발명에 따른 방법에 의해 획득가능한 추출물 또는 본 발명에 따른 조성물을 투여하는 것으로 구성되는, 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 미용 관리 방법은 유리하게 피부, 피부 부속기관 및/또는 점막 상에서 국소 경로에 의해 피부를 견고하게 하고, "오렌지 껍질" 효과를 감소시킨다.
구체적으로, 본 발명은 피부 및/또는 피부 부속기관의 미용 관리 방법으로서, 피부의 탄력성 또는 견고성에, 구체적으로 긴장제 또는 주름 제거제로서 작용하거나, 민감성 피부에 작용하거나, 오염에 작용하고, 본 발명에 따른 조성물 또는 추출물을 피부 및/또는 피부 부속기관에 적용하는 것으로 구성되는, 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 피부 및/또는 피부 부속기관의 미용 관리 방법으로서, 장벽에 대한 손상 및 이의 탈수를 예방하는 견지에서 본 발명에 따른 조성물 또는 추출물을 피부 및/또는 피부 부속기관에 적용하는 것으로 구성되는, 방법에 관한 것이다.
본 발명은 미용적 피부 관리 방법으로서, 노화를 예방하는 견지에서 본 발명에 따른 조성물 또는 추출물을 피부에 적용하는 것으로 구성되는, 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명에 따른 조성물 또는 추출물은 유리하게 혈관 질환, 구체적으로 피부 붉은기 (redness) 및 쿠퍼증의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 조성물 또는 추출물은 유리하게 지방 조직의 변경의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 지방 조직의 변경은 구체적으로 셀루라이트 또는 "오렌지 껍질" 효과이다. 본 발명에 따른 조성물은 피부를 견고하게 올린다.
본 발명의 비-제한적인 방식으로 다음의 실시예에 의해 설명될 수 있다.
도 1은 홍반 강도의 측정 결과를 나타낸다: 활성 제제/위약/미처리 영역의 비교. NS: 유의하지 않은 차이. *: p < 0.05 (실시예 3B).
도 2는 시간 경과 시 혈액 유동의 변화를 나타낸다 (실시예 3B).
도 3은 D0 및 D28에서 획득된 TEWL 결과의 도시를 나타낸다 (실시예 3C).
도 4는 D0 및 D28에서 획득된 탈수 결과의 도시를 나타낸다 (실시예 3C).
도 5는 D0 및 D28에서 정량화된 NMF 양의 도시를 나타낸다 (실시예 3C).
도 6은 D0 및 D28에서 정량화된 세라마이드 양의 도시를 나타낸다 (실시예 3C).
도 7은 D0 및 D28에서 정량화된 IL1RA 양의 도시를 나타낸다 (실시예 3C).
도 8은 D0 및 D28에서 나일 레드/인볼루크린 비율의 도시를 나타낸다 (실시예 3C).
실시예
실시예 1: 본 발명에 따른 추출물
펩티드 추출물은 다음의 공정에 따라 획득된다:
(a) 물에서 약 10% 건조 물질의 미세조류 클라미도모나스 아시도필라의 용해;
(b) 알칼리 프로테아제 (라이벤사로부터 나온 알칼라제)에 의한 가수분해;
(c) 효소를 변성시키도록 80℃ 내지 100℃에 포함되는 온도에서 열 처리;
(c') 잠재적 알레르기성 잔류 단백질을 제거하기 위하여 원심분리, 한외여과 및 15 kDa 막 상의 투석;
(c") 미네랄 염 또는 유리 아미노산 또는 단당류를 제거하도록 200 Da 막 나노여과;
(d) 펩티드 추출물의 회수; 및
(e) 글리세롤/1,3-프로판올 혼합물에서 안정화.
이에 따라 획득된 액상 펩티드 추출물은 다음의 특징을 갖는다:
1 - 물리화학적 분석 (% / 총 건조 물질)
건조 추출물 (2시간, 105℃, 통기된 오븐): 1.2%
pH: 5.1
α-아미노 질소 (OPA, 류신 당량): 29%
펩티드 (즈에달, N × 6.25): 70%
총 회분: 4%
2 - 펩티드 분자량 분포의 프로파일
500 Da 미만: 40%
500 내지 1,000 Da: 55%
1,000 내지 3,500 Da: 4%
3,500 Da 이상: 1%
실시예 2: 본 발명에 따른 추출물의 생물학적 활성의 테스트 ( 시험관내 )
실시예 1에서 획득된 클라미도모나스 아시도필라 (CAP) 추출물의 생물학적 활성을 하기에 기술된 바와 같이 시험관내에서 입증하였다.
이러한 시험관내 연구는
- 피부 장벽 (구체적으로 지질 장벽)의 강화;
- 히알루론산 합성, NMF 생산 및 삼투용질 운반 경로를 통한 피부 수분 공급;
- 비-특이적인 스트레스 또는 대기 오염과 연결된 스트레스에 대한 항산화 및 항-염증 방어;
- 구체적으로 진피 기질의 항상성의 보존을 통한 항-노화 효과.
- 알레르기의 메커니즘
과 관련하여 CAP 추출물의 잠재력을 나타내었다.
I. 진피 섬유모세포 및 멜라닌화 재구성 표피에서 예비적인 활성 스크리닝
클라미도모나스 아시도필라 (CAP) 추출물의 잠재적 생물학적 활성을 진피 섬유모세포 및 멜라닌화 재구성 표피에서 유전자 발현 조정 테스트에 의해 조사하였다. 따라서, 피부 및 미용 생리학에서 주요 관심있는 96개 유전자의 발현을 섬유모세포 및 멜라닌화 재구성 표피에서 PCR 어레이에 의해 연구하였다.
a. 재료 및 방법:
0.05% 건조 물질의 클라미도모나스 아시도필라 (CAP) 추출물을 정상 인간 진피 섬유모세포 (NHDF) 또는 멜라닌화 재구성 인간 표피의 배양 배지에 첨가하였다. 6시간 또는 24시간의 배양 이후에, 선택된 마커의 발현을 정량적 RT-PCR (TaqMan 마이크로플루이드 카드)에 의해 평가하였다. 대조군과 비교하여 연구된 마커의 발현 변화를 상대 정량으로서 표현하였다 (RQ, RQ > 1: 증가, RQ < 1: 감소).
b. 결과:
재구성 표피에서 유전자 발현에 미치는 CAP 추출물의 효과를 보여주는 가장 유의한 결과는 하기 표 1에 나타낸다.
Figure pct00001
이러한 결과는 클라미도모나스 아시도필라 추출물이 특정 마커의 유전자 발현을 변화시킴으로써 다음의 활성에서 특히 흥미로울 수 있음을 보여주려고 한다.
지질 합성 및 표피 장벽 기능의 리모델링:
- 효소 글루코실세라미다제 또는 β-글루코세레브로시다제를 인코딩하는 GBA/GBAP1 유전자가 CAP 처리 6시간 이후에 과발현된다.
- RAB11A가 각질형성세포 내에서 라멜라체의 생합성에 관여하는 GTPase (Ras 관련 단백질 Rab-11A)를 인코딩한다. 이것은 표피 장벽의 항상성에서 RAB11A의 중요성을 강조한다.
히알루론산 생합성 및 표피 수분 공급
- 히알루로난 합성효소 2 및 3 (HAS2 및 HAS3)은 히알루론산 (HA)의 합성을 책임지는 효소이다.
- 표피의 침상 및 과립 층에서 SLC6A6의 점진적 발현이 건조한 환경에서 표피의 필요한 수분 공급을 유지시킨다.
- PADI1, BLMH 및 CASP14 유전자가 천연 보습인자 (NMF)의 생산에 관여하는 효소를 코딩한다.
하기 표 2는 섬유모세포에서 유전자 발현에 미치는 CAP 추출물의 가장 유의한 결과를 제시한다.
Figure pct00002
이들 결과는 다음의 영역에서 CAP 추출물의 잠재적 활성을 나타낸다.
피부 항-노화:
- 진피의 섬유모세포에 의해 생산되는 3가지 히알루로난 합성효소, HAS1, HAS2 (5.76 0.008) 및 HAS3은 히알루론산 (HA)의 생합성을 책임진다.
- 또한, 피부 노화가 섬유모세포 증식의 감소와 연관되는 것으로 확인되어 왔다. 증식인자 Ki-67의 발현 감소가 연령과 관련하여 관찰된다 [Ma et al. 2011 Br. J. Dermatol, 164(3), pp. 479-482]. CAP 활성 제제가 24시간 처리 이후에 MKI67의 발현을 증가시키고, 세포 증식의 가능한 증가를 증명하고, 이는 항-노화 효과를 강화시킨다.
- 피부에서 라민 B1 (LMNB1)의 발현이 연령과 함께 증가하는 것으로 관찰되었다.
항산화제 방어:
- NAD(P)H 탈수소화효소, 퀴논 1 (NQO1)이 전사인자 Nrf-2의 조절 하의 세포질 플라보 단백질이다. NQO1이 환원에 의해 퀴논으로부터 히드로퀴논의 형성을 진하여 라디칼 종의 생산을 방지한다.
- HSP70 단백질 (HSPA1A 유전자에 의해 인코딩됨)이 변성된 단백질의 응집을 억제하고, 이들의 탈변성 (리폴딩)을 촉진하고, 세포사멸 기구의 필수 매개인자를 조절하는 샤퍼롱 분자 (열 충격 단백질 70)이다.
- 티오레독신 시스템이 주요 항산화 방어 시스템 중 하나이다. 티오레독신 환원효소의 3가지 이소형 중에서, CAP 추출물에 의해 조절되는 TXNRD1에 의해 인코딩되는 이소형 1이 가장 많이 연구되었다.
- 티오레독신 시스템 이외에도, 퍼옥시레독신/설피레독신 시스템도 존재한다. 퍼옥시레독신 중에서, 퍼옥시레독신 6 (PRDX6)이 CAP 추출물에 의해 24시간의 처리 이후에 과다발현된다. 이것은 과산화물의 존재로 향하는 활성 제제의 독소 제거 작용을 나타낸다.
- 마지막으로, CAP 추출물이 특정 카로보닐을 검출하여 중화시키는 GLO 시스템의 일부인 GLO1 유전자를 자극한다.
진피 기질 항상성:
- CAP 추출물이 프로테오좀의 베타 1 소단위체를 인코딩하는 유전자인 PSMB1의 발현을 자극한다. 프로테오좀이 세포성 기능을 변경시킬 수 있는 손상된 또는 기형 단백질을 제거함으로써 단백질 항상성을 유지하는데 주요 역할을 담당한다.
- LOXL2의 유전자 발현도 증가되고, 이 유전자가 엘라스틴 및 콜라겐 섬유의 조립에 관여하는 효소인 라이신 산화효소 패밀리의 일부이다.
Ⅱ. 항-염증 작용
A. PMA 화학적 스트레스에 대비한 항-염증 활성
a. 도입
염증 반응은 임의의 환경적 공격에 대한 신체의 정상적, 즉각적 및 일시적 반응이다.
그러나, 특정 병리학적 또는 생리학적 병태에서, 이러한 염증 반응이 과장될 수 있으며, 적절하지 않은 경우 조직 손상을 유발할 수 있다.
피부에서, 각질형성세포는 환경적 공격에 반응하여 염증 반응의 개시에 처음 관여하는 하나의 세포이다.
"공격 받은" 각질형성세포는 다음으로
- 면역계에 관여하는 연쇄 반응을 유도할 일차 사이토카인 (IL1α, IL1β 또는 TNFα) 또는 이차 사이토카인 (IL8)
- 프로스타노이드 패밀리의 구성원인 프로스타글란딘 (PGE)
을 방출할 것이다. PGE2 및 기타 PGE의 합성을 유도할 프로스타글란딘 합성 경로가 염증성 자극에 의해 유도된다.
본 발명에 따른 클라미도모나스 아시도필라 추출물의 항-염증 활성을 PMA (포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트) 처리에 의해 각질형성세포 상에 유도된 염증 모델에서 평가하였다. 사이토카인 TNFα 및 프로스타글란딘 E2 (PGE2)의 방출을 분석하였다.
b. 재료 및 방법:
정상 인간 표피 각질형성세포를 실시예 1에 따라 클라미도모나스 아시도필라 (CAP) 추출물의 0.0001% 내지 0.05% 건조 물질에 포함되는 농도로, 또는 항-염증 기준 분자인 0.1　μM의 덱사메타손 또는 0.1　μM의 인도메타신 (후자의 2가지 기준 분자는 각각 사이토카인 및 프로스타글란딘의 항-염증 기준으로서 작용함)으로 24시간 동안 전처리하였다.
다음으로 염증을 10　μg/mL의 PMA의 첨가에 의해 밤새 유도하였다.
다음으로 TNFα 및 PGE2 검정법을 세포 배양 상청액에서 수행하였다.
결과의 유의성을 원-웨이 ANOVA 이후의 터키 테스트에 의해 검토하였다 (그래프패드 프리즘 소프트웨어 버전 5.02, 그래프패드 소프트웨어사, 캘리포니아 샌디에고, USA).
c. 결과:
10　μg/mL의 PMA가 각질형성세포 상청액에서 TNFα의 방출을 유의하게 증가시키고, 이에 따라 염증을 유발하였다. 0.1　μM의 덱사메타손 및 0.1　μM의 인도메타신이 24시간의 전처리로서 TNFα 방출을 감소시키고, 이들의 항-염증 효과를 입증하고, 테스트를 확인하였다. 클라미도모나스 아시도필라 추출물은 상이한 농도에서 24시간 전처리로서 TNFα 방출을 유의하게 감소시키고, 이에 따라 PMA에 대한 항-염증 작용을 나타내었다.
Figure pct00003
10　μg/mL의 PMA가 각질형성세포 상청액에서 PGE2의 방출을 유의하게 증가시키고, 이에 따라 PMA가 염증을 유발하였다. 0.1　μM에서 덱사메타손 및 인도메타신이 24시간의 전처리로서 PGE2 방출을 유의하게 감소시켰다. 이들 2가지 기준의 항-염증 효과를 따라서 잘 확인하였다.
클라미도모나스 아시도필라 추출물은 둘 다의 농도에서 24시간 전처리로서 PGE2 방출을 유의하게 감소시키고, 이에 따라 PMA에 대한 항-염증 작용을 나타내었다.
Figure pct00004
d. 결론:
클라미도모나스 아시도필라 추출물의 항-염증 효과를 염증 조건 하에 TNFα 및 프로스타글란딘 E2의 방출에 미치는 이의 작용을 통해 입증하였다.
B. 니켈 스트레스에 대비한 항-염증 활성
a. 도입
니켈은 인구 집단에서 알레르기성 접촉 피부염의 주요 원인으로, 전세계적으로 대략 8.6%의 유병율을 갖는다. 하기에 설명된 연구의 목적은 니켈 자극된 각질형성세포에 의한 IL8의 방출에 미치는 CAP 추출물의 효과를 평가하는 것이다.
b. 재료 및 방법
정상 인간 표피 각질형성세포를 0.01% 및 0.05% 건조 물질의 CAP 추출물로 또는 항-염증 기준 분자인 1　μM의 덱사메타손으로 24시간 동안 전처리하였다. 다음으로 각질형성세포를 니켈, 10　μM의 NiSO4로 24시간 동안 처리하였다. 배양의 종결 시, 세포에 의해 생산된 IL8의 양을 상청액에서 ELISA에 의해 평가하였다.
검정된 IL8의 농도를 BC 검정법에 의해 평가된 총 세포내 단백질의 양으로 정규화하였다.
결과의 유의성을 스튜던트 t-테스트에 의해 통계적으로 분석하였다.
c. 결과
CAP 추출물은 각질형성세포에서 니켈 스트레스에 의해 유도된 IL8 방출의 감소를 유도하였다.
Figure pct00005
d. 결론
클라미도모나스 아시도필라 (CAP) 추출물은 니켈 유도된 염증성 스트레스의 맥락에서 주요 사이토카인, IL8의 방출을 억제하였다. 따라서, 추출물은 니켈과 관련된 접촉성 알레르기 또는 피부 과민성의 맥락에서 흥미롭다.
C. 카드뮴 스트레스에 대비한 항-염증 활성
a. 도입
본 연구의 목적은 카드뮴으로 대표되는 중금속 스트레스에 대비하여 정상 인간 각질형성세포에서 클라미도모나스 아시도필라 (CAP) 추출물의 항-염증 활성을 평가하는 것이다.
b. 재료 및 방법:
정상 인간 표피 각질형성세포를 0.01% 및 0.05% 건조 물질의 CAP 추출물로 또는 항-염증 기준 분자인 0.1　μM의 인도메타신으로 24시간 동안 전처리하였다. 다음으로 각질형성세포를 카드뮴, 100　μM의 CdCl2로 48시간 동안 처리하였다. 배양의 종결 시, 세포에 의해 생산된 PGE2의 양을 상청액에서 ELISA에 의해 평가하였다.
검정된 PGE2의 농도를 BC 검정법에 의해 측정된 총 세포내 단백질의 양으로 정규화하였다.
c. 결과:
CAP 추출물은 각질형성세포에서 카드뮴 스트레스에 의해 유도된 PGE2 방출의 감소를 유도하였다.
Figure pct00006
d. 결론
클라미도모나스 아시도필라 (CAP) 추출물은 카드뮴 스트레스에 의해 유도되는 프로스타글란딘 E2 (PGE2)의 생산을 억제하였다. 따라서, 추출물은 예를 들면 환경 오염의 맥락에서 중금속 스트레스로 향하는 피부의 보호작용을 제공한다.
D. SDS 스트레스에 대비한 항-염증 활성
a. 도입
클라미도모나스 아시도필라 (CAP) 추출물의 항-염증 활성을 재구성 표피 상의 소듐 도데실 설페이트 (SDS) 처리에 의해 유도되는 염증 모델에서 평가하였다.
b. 재료 및 방법
재구성 인간 표피 (RHE)를 0.01% 및 0.05% 건조 물질의 CAP 추출물의 존재 시 24시간 동안 사전 배양하였다. 다음으로 0.025%의 SDS를 상기 표피의 표면에 적용하고, 이를 다시 24시간 동안, 다시 CAP 추출물의 존재 시 배양하였다.
배양의 종결 시, 사이토카인 종양 괴사인자 알파 (TNFα)를 상청액에서 ELISA에 의해 검정하였다.
염증 및 장벽 마커의 유전자 발현을 qRT-PCR에 의해 평가하였다.
결과의 유의성을 원-웨이 ANOVA 이후의 터키 테스트에 의해 통계적으로 분석하였다.
c. 결과
재구성 표피의 SDS 처리가 TNFα의 증가를 유전자 수준 (qRT-PCR, 표 8) 및 단백질 수준 (ELISA, 표 7)에서 유도하였다. 또한, 이러한 전염증 효과가 케라틴 (KRT1) 발현의 감소를 동반하여 (표 8), 표피 장벽 기능의 손상을 증명하였다.
이러한 조건 하에, CAP 추출물은 TNFα 과다생산을 유의하게 억제하였으며, 케라틴-1 발현을 증가시켰다.
Figure pct00007
Figure pct00008
d. 결론
이들 결과는 클라미도모나스 아시도필라 추출물의 항-염증 잠재력을 검증하고, 외부 스트레스로부터 장벽을 보호하는 이의 능력을 보여준다.
Ⅲ. 항산화 작용
a. 도입
실시예 1에 따라 클라미도모나스 아시도필라 추출물 상에서 수행된 유전자 발현 스크리닝은 항산화 방어의 자극에서 잠재력을 나타내었다. 세포를 산화적 스트레스로부터 보호하는 성능을 H2O2에 의해 유도된 산화적 스트레스에 노출된 각질형성세포에서 반응성 산소 종 (ROS)의 생산을 측정함으로써 평가하였다.
활성 제제의 항산화 효과의 평가를 배양된 각질형성세포 내로 DCFH-DA (2',7'-디클로로플루오레신 디아세테이트)의 도입을 통해 시행한다. 이 분자는 산화되지 않은 상태에서 비-형광성 마커이다. 산화 조건 (본원에서는 H2O2 스트레스) 하에서, DCFH-DA가 형광을 방출할 분자인 DCF로 분해될 것이다. 측정된 형광은 H2O2 및/또는 추출물의 존재 시 세포에 의해 생산되는 반응성 산소 종의 양과 비례할 것이다.
b. 재료 및 방법
정상 인간 표피 각질형성세포를 0.0001% 건조 물질의 CAP 추출물, 10　μM의 퀘르세틴 또는 500　μM의 비타민 C (후자의 2가지 분자는 항산화제 기준으로서 작용함)의 존재 시 24시간 동안 사전 배양하였다.
다음으로 세포를 0.5　mM DCFH-DA의 존재 시 1시간 동안 처리한다.
산화를 100　μM H2O2 첨가함으로써 20분 동안 유도하였다. 테스트된 산물로의 제 2 처리를 H2O2 스트레스와 동시에 (전처리와 동일한 농도에서) 수행한다.
마지막으로, ROS 양에 해당하는 형광 밀도 (DFU)의 측정을 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 수행한다.
결과의 유의성을 원-웨이 ANOVA 이후의 터키 테스트에 의해 검토하였다 (그래프패드 프리즘 소프트웨어 버전 5.02, 그래프패드 소프트웨어사, 캘리포니아 샌디에고, USA).
c. 결과
ROS 생산의 증가를 H2O2 처리 이후에 관찰하여 모델을 확인하였다. 퀘르세틴 및 비타민 C가 H2O2 처리 이후의 ROS 생산을 유의하게 감소시켰다. 이들 2가지 기준 물질의 항산화 효과를 이 모델에서 잘 확인하였다.
클라미도모나스 아시도필라 추출물은 H2O2 처리에 의해 유도된 ROS 생산을 유의하게 감소시켰다.
Figure pct00009
d. 결론
클라미도모나스 아시도필라 추출물은 H2O2 유도된 스트레스에 대비한 항산화 효과를 입증하였다.
Ⅳ. 장벽 및 수분 공급에 미치는 활성
a. 도입
클라미도모나스 아시도필라 추출물 상에서 수행되고, 상기에 제시된 유전자 발현 스크리닝은 장벽 및 수분 공급에 관여하는 유전자 마커의 발현의 자극에 미치는 잠재적 효과를 보여주었다. 본 발명자는 각질형성세포에 미치는 이러한 효과를 검증하도록 연구하였다.
b. 재료 및 방법
정상 인간 표피 각질형성세포를 0.0001% 건조 물질의 CAP 추출물의 존재 시 48시간 동안 배양하였다.
장벽 기능 및 수분 공급 마커의 유전자 발현을 qRT-PCR에 의해 평가하였다.
결과를 원-웨이 ANOVA 이후의 듀넷 테스트에 의해 통계적으로 분석하였다.
c. 결과:
클라미도모나스 아시도필라 추출물이 표피 지질 및 히알루론산의 합성에 각각 관여하는 마커 GBA (베타-글루코세레브로시다제) 및 HAS3 (히알루로난 합성효소-3)의 유전자 발현을 자극하였다. 이러한 결과는 표피 투과가능한 장벽 및 수분 공급의 강화 효과를 선호하고, 게놈 발현 스크리닝의 맥락에서 관찰된 경향성을 검증하고 있다.
또한, 클라미도모나스 아시도필라 추출물은 TAUT (타우린 막 수송체 통로) 및 SMIT (미오이노시톨 수송체 통로)를 각각 인코딩하는 마커 SLC6A6 및 SLC5A3의 발현도 자극하였다.
이들 2가지 유전자는 삼투용질 수송체를 코딩하고, 이에 따라 피부 수분 공급을 유지하고, 세포를 외부 스트레스로부터 보호하는데 관여한다.
마지막으로, 상기 추출물은 천연 보습인자 (NMF) 요소의 합성에 관여하는 단백질 및 효소인 필라그린 (FLG) 및 PADI1 (펩티딜 아르기닌 탈이민화효소)의 발현 증가를 유도하였다.
Figure pct00010
d. 결론
이들 결과는 클라미도모나스 아시도필라의 추출물이 피부 장벽의 강화 및 피부 수분 공급의 유지에서 잠재력이 있음을 보여준다.
V. 알레르기 메커니즘에서 클라미도모나스 아시도필라 추출물의 효과 평가
A. 도입
클라미도모나스 아시도필라 추출물의 항-알레르기 효과의 잠재력을
- 후기 "아토피 피부염" 유형의 표현형 (만성 염증)을 모방하는, Th2 사이토카인 (IL-4 + IL-13 + IL-22 + TNFα)의 혼합물에 의해 자극된 정상 인간 표피 각질형성세포 (NHEK)에서 전염증성 케모카인의 유전자 발현;
- fMLP에 의해 유도된 인간 호중구의 활성화
와 관련하여 조사하였다. 상기 활성화를 특이적 키트 및 유세포 측정법을 사용하여 CCR3 마커의 발현에 의해 확인되는 총 호중구 집단에서 활성화된 호중구 세포의 특이적 마커 (CD63)를 정량화함으로써 측정하였다. 동시에, 항-FCεRI 항체로의 ㅎ활성화를 양성 대조군으로서 수행하였다.
B. TH2 스트레스에 이어진 화학유인인자의 억제
a. 재료 및 물질
정상 인간 표피 각질형성세포를 0.01% 건조 물질 (DM)의 CAP 추출물 또는 10　μM의 기준 JAK 저해제 I의 존재 시 24시간 동안 사전 배양하였다. 사전 배양 이후에, 세포를 CAP 추출물 또는 기준 물질로 재처리한 다음 세포를 Th2 사이토카인 칵테일 (10 ng/mL의 IL4 + IL13 + IL22 + TNFα)로 24시간 동안 자극하였다.
배양의 종결 시, 관심 있는 마커의 유전자 발현을 qRT-PCR에 의해 평가하였다.
b. 결과
Th2 스트레스에 노출된 각질형성세포에서, 클라미도모나스 아시도필라 추출물이 피부 염증성 및 알레르기성 반응의 증폭에 관여하는 케모카인을 인코딩하는 CCL5 (C-C 모티브 케모카인 리간드 5 또는 RANTES) 및 CCL27 (C-C 모티브 케모카인 리간드 27)의 유전자 발현을 억제하였다.
Figure pct00011
c. 결론
클라미도모나스 아시도필라 추출물은 각질형성세포에서 화학유인인자 CCL5 및 CCL27의 유전자 발현을 억제함으로써 Th2 스트레스 유도된 염증을 조정한다.
C. 호중구 활성화의 억제
a. 재료 및 방법
호중구 활성화 테스트 (BAT)를 플로우 캐스트® 키트 (BUHLMANN, 항목 코드 FKCCR)를 사용하여 수행하였다.
전혈을 0.033% 및 0.1% 건조 물질 (DM)의 CAP추출물 또는 기준 물질 (30 μM의 SB202190 또는 10 mM의 크로모글리케이트)의 존재 시 사전 배양하였다.
다음으로 자극제, 1 μM fMLP를 첨가하고, 혈액을 단일클론 항체의 혼합물 (항-CD63-FITC 및 항-CCR3-PE)을 포함하는 표지화 완충액의 존재 시 추가 15분 동안 배양하였다.
다음으로 유세포 측정법 분석을 수행하여 호중구 (CCR3+) 및 활성화된 호중구 (CCR3+/CD63+)의 총 집단을 계수하였다.
b. 결과
fMLP 펩티드로의 자극이 호중구의 매우 분명한 활성화를 유도하였다 (40.1%의 활성화된 세포 또는 4527%의 자극).
본 연구에서, 2가지 잠재적 기준 화합물을 fMLP의 존재 시 테스트하였다:
- SB202190, p38 MAP 키나제의 저해제, 이 키나제의 활성화가 과립 제거를 유도하는 호중구의 활성화 메커니즘에 필수적이고,
- 크로모글리케이트, 공지된 항-알레르기제, 이의 작용 메커니즘이 원형질막의 안정화에 관여하고, 여기서 이는 Ca++의 세포내 투과를 억제하며, 이 이온은 비만 세포의 과립 제거에 필수적이다.
30 μM에서 테스트된 SB202190 및 10 mM에서 테스트된 크로모글리케이트 둘 다가 fMLP 유도된 호중구 활성화에 미치는 유의한 억제 효과를 나타내었다 (각각 26% 및 46% 억제).
본 연구의 실험적 조건 하에서, 0.033% 및 0.1%에서 테스트된 CAP 추출물은 fMLP 유도된 호중구 활성화에 미치는 명백한 농도-의존적 억제 효과를 나타내었다 (각각 22% 및 39% 억제).
Figure pct00012
c. 결론
클라미도모나스 아시도필라 추출물은 호중구 활성화를 억제한다.
D. 결론
한편으로, Th2 스트레스에 노출된 각질형성세포에서 화학유인제 사이토카인의 유전자 발현 및 다른 한편으로 호중구의 활성화를 억제함으로써, 클라미도모나스 아시도필라 추출물은 알레르기 반응의 개시에 관여하는 공정을 조절하는데 기여할 수 있다.
실시예 3: 본 발명에 따른 추출물의 임상 테스트
실시예 1에서 획득된 클라미도모나스 아시도필라 (CAP) 추출물의 생물학적 활성을 하기에 설명된 바와 같은 임상 연구에 의해 입증하였다.
이들 결과 모두는 "CAP" 활성 제제의 유의한 효과, 예컨대
- 보호작용 효과;
- 장벽 효과;
- 보습 효과; 및
- 항-염증/항-붉은기 효과
를 입증한다.
이들 임상 연구가
_민감성 피부;
- 붉은기;
- 염증; 및
- 알레르기
의 예방 또는 치료를 위한 CAP 추출물의 잠재력을 강조하였다.
A. 임상 결과의 요약
화학적 홍반 연구
CAP 활성 제제 (3% 건조 물질)가 다음의 매개변수에 미치는 유의한 효능을 입증하였다:
- 0.1% 메틸-니코티네이트 용액의 적용 20분 후에 최대 홍반의 강도
TiVi에 의해 측정되는 혈액 유동 강도가 처리되지 않은 영역과 비교하여 활성 제제로 처리된 영역에서 유의하게 더 낮다.
분광비색측정법에 의해 측정되는 붉은기가 처리되지 않은 영역과 비교하여 활성 제제로 처리된 영역에서 유의하게 더 낮다.
- 최대 강도 홍반 30분 후에 홍반의 변화
TiVi에 의해 측정되는 혈액 유동 강도의 감소가 처리되지 않은 영역과 비교하여 활성 제제로 처리된 영역에서 유의하게 더 높다.
분광비색측정법에 의해 측정되는 붉은기의 감소가 처리되지 않은 영역과 비교하여 활성 제제로 처리된 영역에서 유의하게 더 높다.
민감성 피부 연구
CAP 활성 제제 (3% 건조 물질)가 다음의 매개변수에 미치는 유의한 효능을 입증하였다:
- 기계적 측정
활성 제제는
- 적용 28일 후에 표피통과 물 손실을 유의하게 감소시키고,
- 적용 28일 후에 붉은기를 유의하게 감소시키고,
- 적용 28일 후에 수분 공급을 유의하게 증가시킨다.
- 생화학적 평가
활성 제제는
- 적용 28일 후에 NMF의 양을 유의하게 증가시키고,
- 적용 28일 후에 위약 영역에서 관찰되는 세라마이드의 감소를 유의하게 보상하고,
- 적용 28일 후에 IL1RA의 양을 유의하게 감소시키고,
- 적용 28일 후에 IL1α의 양을 유의하게 감소시키고,
- 적용 28일 후에 IL1RA/IL1α의 양을 유의하게 감소시키고,
- 적용 28일 후에 IL8의 양을 유의하게 감소시킨다.
B. TiVi에 의한 혈액 유동의 평가 및 분광비색측정기에 의한 피부색의 평가에 의한 위약 대비 활성 제제의 보호작용/항-붉은기/항-염증 효능의 평가
연구 설계:
- 이중 맹검 연구.
- 무작위화, 활성 제제 vs 위약 비교 연구
인구 집단:
본 연구를 위해 19명 (19)의 대상체를 분석하였다. 19명의 대상체에게 활성 제제 및 위약을 2개의 정의된 영역 상에 적용하였다. 처리되지 않은 영역도 정의하였다.
본 연구를 위해 다음의 개인
- 18세 내지 60세, 평균 연령 38 ± 3세, 최소 18세, 최대: 60세의 건강한 여성,
- 프로토타입 Ⅰ 내지 Ⅲ 피부의 백인
을 채용하였다.
본 연구의 사용 및 시행 방법
대상체 자신이 집에서 D-14 내지 D0t0의 14일 동안 매일 2회 (아침 및 저녁) 아래팔의 정의된 영역 위에 산물을 적용한다. 14일 후에, 대상체가 임상 유닛에 재방문하였다. 다음으로 기본 D0t0 측정을 시행하였다. 산물의 최종 적용을 수행하였다. 다음으로 화학적 홍반을 0.1% 메틸-니코티네이트 용액으로 각 영역에 유도하였다. 다음으로 각 영역 상의 측정을 홍반의 유도에 이어서 D0t20으로 표시된 20분 (최대 강도) 및 50분 (최대 홍반 이후 30분) 후에 시행하였다.
2가지 매개변수를 평가된 각 매개변수
- 각 산물의 홍반 외양에 미치는 예방적 효과를 반영하는 D0t20 및 D0t0 사이의 변화,
- 각 산물의 홍반 변화에 미치는 예방적 효과를 반영하는 D0t50 및 D0t20 사이의 변화
에 대해 분석하였다.
TiVi에 의한 혈액 유동의 평가
TiVi 700에 의해 사용되는 방법은 녹색 광이 혈관 세포에 의해 강하게 흡수되는 반면, 적색 광은 약간 흡수되는 점을 기초로 한다. 편광 광원을 사용함으로써, 상기 방법은 정반사를 고려하지 않고, 광은 피부 조직에 의해 반사된다. 상기 장치가 피부에서 혈액 세포의 농도를 나타내는 각 픽셀로 강도 맵을 생성한다.
→ 피부에서 혈액 세포의 농도 강도의 감소가 항-염증 효과를 반영한다.
결과: 홍반 외양에 미치는 예방적 효과
도 1a, 도 1b 및 도 1c의 도면은 TiVi에 의해 측정되는 메틸-니코티네이트 적용 20분 후에 홍반 강도에 관한 활성 제제, 위약 및 처리되지 않은 영역 사이의 쌍을 이룬 비교를 나타낸다. 세포축 매개변수가 혈액 유동의 강도 (적혈구 세포 농도)를 나타낸다. 정확한 수치 값은 하기 표 13a 및 표 13b에 나타낸다 (표 13a 및 표 13b: 양성 효과를 나타내는 대상체%로 측정한 평균 및 표준 편차. 차이% 및 p 값 (유의성의 정확한 값)).
도 2의 도면은 시간 경과 시 혈액 유동 값의 변화를 나타낸다.
→ 결과는 활성 제제가 처리되지 않은 영역과 비교하여 제조된 홍반의 강도를 유의하게 감소시키는 것을 보여준다. 위약 영역 상의 홍반의 강도는 처리된 영역과 상이하지 않았다. 활성 제제 영역 상의 홍반 강도는 위약과 비교하여 유의하게 더 낮다.
Figure pct00013
Figure pct00014
C. 테와측정기에 의한 표피통과 물 손실의 평가, 각질 측정법에 의한 수분 공급의 평가, 면봉 채취에 의한 생화학적 성질의 평가에 의한 활성 제제 대비 위약의 효능 평가
연구 설계:
- 이중 맹검 연구.
- 무작위화, 얼굴 반쪽의 활성 제제 vs 위약 비교 연구
인구 집단:
수분 공급, 표피통과 물 손실, 피부색 및 설문지와 관련하여 36명의 대상체를 분석에 포함하였다.
생화학적 분석과 관련하여, 10명의 대상체를 분석에 포함하였다.
본 연구를 위해 다음의 개인
- 18세 이상의 평균 연령 51 ± 3세, 최소 21세, 최대: 68세의 건강한 여성,
- 프로토타입 Ⅰ 내지 Ⅳ의 백인 피부,
- 얼굴에 민감성 피부를 갖음 (대상체의 피부가 다음의 3가지 스트레스, 환경적, 화학적 또는 기계적 스트레스 중 적어도 2가지에 반응해야 함)
을 채용하였다.
본 연구의 사용 및 연구 방법
DO에서,
* 포함된 및 포함되지 않은 판정기준의 확인
* 30분 동안 순화
* 각 얼굴 반쪽 위에 측정 영역의 정의
* 기계적 측정 및 생물학적 시료
D0 내지 28에서,
* 매일 2회 (아침 및 저녁) 얼굴 반쪽에 활성 제제 및 위약의 적용
D28에서,
* 30분 동안 순화
* 기계적 측정 및 생물학적 시료
표피통과 물 손실의 평가
피부 장벽은 증발을 통한 물 손실을 조절한다. 이러한 장벽이 손상될 때, 표피통과 물 손실이 증가한다. 역으로, 강화된 장벽이 더 낮은 표피통과 물 손실에 상응한다.
표피통과 물 손실을 테와측정기 TM 300에 의해 측정하였다. 원리는 2개의 상이한 높이에 위치하는 2개의 센서에 의해 피부에 장착되는 하나의 입구를 갖는 튜브에서 이의 온도 및 상대 습도를 측정하는 것이다. 다음으로 픽 법칙을 표피통과 물 손실를 결정하는데 사용하였다.
D0 및 D28에서 TEWL 측정으로 획득된 결과는 표 14에 주어진다. 변화의 도시는 도 3에 주어진다.
Figure pct00015
획득된 결과는 TEWL이 활성 제제 및 위약으로 D0 내지 D28에서 유의하게 감소하는 것을 나타낸다. 활성 제제로 관찰된 D0 내지 D28의 변화 대비 위약으로 관찰된 변화의 비교는 활성 제제를 선호하는데 통계적으로 유의하다.
수분 공급의 평가
피부 수분 공급의 측정을 CM 825 각질 측정기에 의해 수행하였다. 이러한 장치는 용량 (capacitance) 측정의 원리를 기초로 하고, 피부 표면 층 (10 μm 내지 20 μm 깊이)의 수분 공급을 측정한다.
D0 내지 D28에서 수분 공급에 대해 획득된 결과는 표 15에 주어진다. 변화의 도시는 도 4에 주어진다.
획득된 결과는 수분 공급이 활성 제제로 D0 내지 D28에서 유의하게 증가되는 반면 위약으로는 변화되지 않는 것을 나타낸다. 활성 제제로 관찰된 D0 내지 D28의 변화 대비 위약으로 관찰된 변화의 비교는 활성 제제를 선호하는데 통계적으로 유의하다.
Figure pct00016
생화학적 평가
다음의 생화학적 평가를 수행하였다:
면봉 시료로부터,
* UV 검출과 연결된 액체 크로마토그래피 (LC/UV)에 의한 천연 보습인자 (NMF). NMF의 양에는 우로칸산 (UCA), 피롤리돈 카르복실산 (PCA) 및 세린을 포함한다. NMF 함량이 피부의 수분 공급 상태에 관한 정보를 제공한다.
* 질량 분광분석법 검출과 연결된 액체 크로마토그래피 (LC/MS)에 의한 세라마이드, 세라마이드의 양에는 [S], [DS] 및 [P] 베이스와 함께 세라마이드를 포함한다. 세라마이드 함량이 피부 장벽의 상태에 관한 정보를 제공한다.
* 사이토카인의 정량화 (ELISA에 의함)를 통한 염증 상태
o IL1RA
o IL1α
o IL8
D-스쿠아민 시료로부터,
* 나일 레드/인볼루크린 염색
NMF
D0 및 D28에서 NMF에 대해 획득된 결과는 표 16에 주어진다. 변화의 도시는 도 5에 주어진다.
획득된 결과는 NMF의 양이 활성 제제로 D0 내지 D28에서 유의하게 증가되는 반면 위약이 이러한 양을 유의하게 감소시키는 것을 나타낸다. 활성 제제로 관찰된 D0 내지 D28의 변화 대비 위약으로 관찰된 변화의 비교는 활성 제제를 선호하는데 통계적으로 유의하다.
Figure pct00017
세라마이드
D0 내지 D28에서 세라마이드에 대해 획득된 결과는 표 17에 주어진다. 변화의 도시는 도 6에 주어진다.
획득된 결과는 세라마이드의 양이 위약으로 감소하고, 활성 제제는 이러한 감소를 보상하는 것을 나타낸다 (위약 및 활성 제제에 대한 D0 내지 D28의 변화가 유의하지 않음). 활성 제제로 관찰된 D0 내지 D28의 변화 대비 위약으로 관찰된 변화의 비교는 활성 제제를 선호하는데 통계적으로 유의하다.
Figure pct00018
IL1RA
D0 및 D28에서 IL1RA에 대해 획득된 결과는 표 18에 주어진다. 변화의 도시는 도 7에 주어진다.
획득된 결과는 IL1RA의 양이 활성 제제 및 위약으로 D0 내지 D28에서 유의하게 감소하는 것을 나타낸다. 활성 제제로 관찰된 D0 내지 D28의 변화 대비 위약으로 관찰된 변화의 비교는 활성 제제를 선호하는데 통계적으로 유의하다.
Figure pct00019
나일 레드/인볼루크린 비율
D0 및 D28에서 나일 레드/인볼루크린 비율에 대해 획득된 결과는 표 19에 주어진다. 변화의 도시는 도 8에 주어진다.
획득된 결과는 나일 레드/인볼루크린 비율이 활성 제제 및 위약으로 D0 내지 D28에서 유의하게 변하지 않는 것을 나타낸다. 활성 제제로 관찰된 D0 내지 D28의 변화 대비 위약으로 관찰된 변화의 비교는 활성 제제를 선호하는데 통계적으로 유의하다.
Figure pct00020

Claims (16)

  1. 미세조류 클라미도모나스 아시도필라 (Chlamydomonas acidophila)의 펩티드 추출물로서, 적어도 하나의 효소적 가수분해 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 획득되고, 적어도 20 중량%의 펩티드를 포함하고, 상기 백분율은 상기 추출물의 총 중량을 기준으로 표현되는, 추출물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 추출물은 20 중량% 내지 90 중량%, 유리하게 20 중량% 내지 75 중량%, 전형적으로 30 중량% 내지 70 중량%의 펩티드를 포함하고, 상기 백분율은 상기 추출물의 총 중량을 기준으로 표현되는, 추출물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 펩티드는 3,500 달톤 (Da) 미만의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 펩티드 중 적어도 80 중량%는 1,000 Da 미만의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 펩티드 중 적어도 30 중량%, 유리하게 적어도 35 중량%는 500 Da 미만의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  6. 클라미도모나스 아시도필라의 펩티드 추출물을 제조하는 방법으로서, 적어도 하나의 효소적 가수분해 단계를 포함하는, 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 효소적 가수분해 단계는 적어도 하나의 프로테아제, 유리하게 적어도 하나의 알칼리 프로테아제의 존재 시 수행되는, 방법.
  8. 제 6항 또는 제 7항에 있어서,
    상기 방법은 다음의 단계
    (a) 미세조류 클라미도모나스 아시도필라의 수용성 상 분산;
    (b) 유리하게 적어도 하나의 프로테아제의 존재 시, 단계 (a)에서 획득된 상기 수용성 분산의 효소적 가수분해;
    (c) 단계 (b)에서 획득된 상기 혼합물의 열 처리; 및
    (d) 단계 (c)의 종결 시 상기 펩티드 추출물의 회수
    중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
  9. 제 6항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 단계 (c) 및 (d) 사이에 위치하고, 선택적으로 한외여과, 투석 또는 나노여과로 이어지는, 추가적인 여과 단계 또는 원심분리 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  10. 제 6항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 단계 (c) 및 (d) 사이에서, 또는 상기 추가적인 여과 단계 또는 원심분리 단계 이후에 수행되는, 15 kDa 한외여과 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 방법은 상기 15 kDa 한외여과 단계 이후에 수행되는, 100 Da 내지 300 Da의 컷오프를 갖는 나노여과 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  12. 활성 성분으로서 적어도 하나의 효소적 가수분해 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 획득된 미세조류 클라미도모나스 아시도필라의 펩티드 추출물 및 적합한 부형제를 포함하는 조성물.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 추출물은 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따라 정의된 바와 같거나, 제 6항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 획득가능한 것을 특징으로 하는, 조성물.
  14. 제 12항 또는 제 13항에 있어서,
    클라미도모나스 아시도필라의 상기 펩티드 추출물을 상기 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 건조 추출물로서 표현되는, 0.001 중량% 내지 10 중량%, 유리하게 0.01 중량% 내지 5 중량% 포함하는, 조성물.
  15. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 추출물, 제 6항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 획득가능한 추출물, 또는 제 12항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 조성물로서,
    - 피부, 점막 및/또는 피부 부속기관의 장애 또는 병리학, 유리하게 알레르기, 염증, 자극성 반응, 또는 피부, 미성숙, 정상 또는 성숙/노화 피부 부속기관 및/또는 점막의 장벽 또는 항상성의 병리학 또는 장애,
    - 혈관 장애, 구체적으로 붉은기 (redness) 또는 쿠퍼증 (couperosis), 및/또는
    - 지방 조직의 변경
    을 예방하고/거나 치료하는데 사용되는, 추출물, 방법에 의해 획득가능한 추출물 또는 조성물.
  16. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 추출물, 제 6항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 획득가능한 추출물, 또는 제 12항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 조성물로서, 피부, 피부 부속기관 및/또는 점막의 병태 또는 외양을 개선하는데 사용되는, 추출물, 방법에 의해 획득가능한 추출물 또는 조성물.
KR1020217023693A 2018-12-28 2019-12-30 클라미도모나스 아시도필라의 추출물, 이를 제조하는 방법 및 이를 포함하는 미용적 조성물 및 피부과학적 조성물 KR20210110336A (ko)

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