TWI445541B

TWI445541B - 逆境豐年蝦卵萃取物、其製備方法及其用途

Info

Publication number: TWI445541B
Application number: TW101105362A
Authority: TW
Inventors: Shu Wen Hsiao; Shih Hui Chen
Original assignee: Taiyen Biotech Co Ltd
Priority date: 2012-02-17
Filing date: 2012-02-17
Publication date: 2014-07-21
Also published as: CN103251652B; TW201334785A; CN103251652A

Description

逆境豐年蝦卵萃取物、其製備方法及其用途

本發明係關於豐年蝦卵萃取物及其製備方法。本發明亦關於該萃取物於治療及/或預防皮膚異常之用途。

現今全球因氣候變遷或各種污染物，已嚴重威脅到人類之健康，例如全球暖化、溫室效應、臭氧層破洞、紫外線過量、汽機車排放有害氣體、室內室外廢氣及二手煙等。尤其過去100年來，台灣的氣溫已上升1.3度，是全球平均值的2倍，估計未來之夏日將漫長又炎熱，使氣候因素與污染物更彼此作用加乘，這些外在環境的改變，對於人體產生危害，尤以防禦最前線之皮膚為最。

當皮膚新陳代謝減緩，受到陽光、紫外線、污染源，甚至生活方式與壓力的侵襲，導致逐漸失去應有的修復反應與平衡狀態，此時細紋、斑點、鬆弛、粗糙、下垂等現象一一浮現。引發這些老化現象的原因之一是皮膚接受諸多內外刺激，會於內部產生發炎反應，根據特性與肇發原因可分為慢性發炎反應與神經性發炎反應。皮膚連番接受兩種發炎反應影響，會使老化反應加劇、皺紋提早出現及加深、皮膚失去緊實度等困擾。皮膚發炎反應已成為抗老趨勢新顯學，除此之外，肌膚黑色素成因是一項極為複雜的生理反應，皮膚的發炎、氧化反應，也會導致黑色素生成，當細胞內出現發炎，會分泌細胞激素，刺激「酪胺酸酶」促使黑色素形成。

源於地球上四億年前最原始的海洋浮游生物鹵蟲屬(學名：Artemia)，俗稱豐年蝦(Artemia Salina)、鹵蟲、海猴子、鹽水蝦、鹽蟲子、水馬騮等，是無背甲目鹵蟲科下唯一的屬，可當成寵物飼養，也可作為魚飼料，是軟珊瑚的主要食物之一，而在歷史紀載中，當歐洲人初進入北美大陸之時，就曾發現東北美的一些印第安原住民就以曬乾的豐年蝦卵做為輔助性食物。

豐年蝦經過漫長生物進化，已發現極耐各種惡劣的環境，豐年蝦能於連魚類也無法生存的含鹽分超逾海水六倍的水域存活。豐年蝦卵稱之為耐久卵，可長期抗拒外界環境不利因子的傷害，保護其中休眠的胚胎，等到環境適合豐年蝦繁殖生存時，再破壁而出繁衍種族。目前已發現豐年蝦卵在長期高強度紫外線、輻射線照射、高溫乾旱，在有毒溶劑中，皆表現出令人驚歎的生命力和活動力。1978年法國和俄國科學家將豐年蝦卵送上外太空，長達96小時接受外太空極惡劣的環境，例如極溫、大量宇宙輻射線照射等，當這些卵帶回地球後，在接下來的一、二十年中做了大量的研究，包括孵化率及卵的化學成分改變等，結果帶回的豐年蝦卵有高達96%的孵化率。

依照豐年蝦的生活史和從成蟲到幼蟲的過程，有各種對抗外界不利環境的分子，以保護豐年蝦卵渡過極端不利的環境，例如p26、青蒿琥酯(Artemin)、二鳥苷四磷酸(diguanosine tetraphosphate，GP4G)及海藻糖(Trehalose)。其中二鳥苷四磷酸已證實具有多種療效，例如歐洲專利第1049455號揭示其可加強皮膚免疫系統，刺激皮膚細胞再生，並且同時由改善角質隔層的輔助提供紫外防護；中華民國專利公開第200640475號揭示其可刺激真皮或表皮巨分子合成及/或防止其降解；日本專利公開第204238297號揭示二鳥苷四磷酸具有保護皮膚對抗外部壓力的作用，並可促進熱休克蛋白之產生；日本專利公開第204238297號、美國專利公開第2009148544號、美國專利第7,615,546及7,544,375號及法國專利第2834887號揭示二鳥苷四磷酸具有活化再生細胞功能、改善皮膚細胞狀態、防止皮膚粗糙並可除皺及抗老化；中華民國專利第I281413號揭示其可調節細胞間之聯繫；歐洲專利第1336402號揭示可促進頭髮生長及/或減少掉髮。

由於豐年蝦卵之成分豐富，極具治療潛力，本發明因此關注開發新穎豐年蝦卵萃取物、製造方法及其用途。

本發明為提供一種製備豐年蝦卵萃取物之方法，其包含下列步驟：

(a)提供豐年蝦卵；

(b)寒逆境處理該豐年蝦卵；及

(c)均質化步驟(b)之豐年蝦卵。

本發明另提供一種豐年蝦卵萃取物。

本發明又提供一種包含本發明豐年蝦卵萃取物的組合物。

本發明亦提供一種根據本發明之豐年蝦卵萃取物於預防及/或治療皮膚異常之用途。

本發明在以下部分中詳細描述。本發明之其他特徵、目的及優點可易見於本發明之實施方式及申請專利範圍中。

除非本文中另外定義，否則結合本發明使用之科技術語應具有一般技術者通常理解之含義。術語之含義及範疇應為明確的；然而，若存在任何潛在含糊性，則本文所提供之定義優先於任何詞典或外來定義。

除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數，複數術語也應包括單數。

除非另外指示，否則應瞭解如本案所用之以下術語具有以下含義：

如本文所用之術語「預防」表示延緩易罹病個體之症狀之起始或降低病症之發生。

如本文所用之術語「治療」表示減少及/或改善罹病個體之症狀。

如本文所用之術語「個體」表示動物，特別是哺乳動物。根據本發明之較佳態樣，「個體」係指人類。

如本文所用之術語「治療有效量」表示一活性成分單獨或與其他治療/藥物合併使用時之用量，該用量足以顯示治療功效。

如本文所用之術語「載劑」或「醫藥可接受之載劑」係指稀釋劑、賦形劑、接受體(acceptors)或類似物，其為製造醫藥組合物技術中之一般技術者所熟知。

製備方法

根據本發明，製備豐年蝦卵萃取物之方法可包含下列步驟：

(a)　提供豐年蝦卵；

(b)　寒逆境處理該豐年蝦卵；及

(c)　均質化步驟(b)之豐年蝦卵。

如本文所用之術語「豐年蝦卵」，係指Artemia Salina或Brine Shrimp之卵(Cysts或Eggs)，豐年蝦亦稱鹵蟲、海猴子、鹽水蝦、鹽蟲子、水馬騮，屬無背甲目鹵蟲科鹵蟲屬。

根據本發明之豐年蝦卵之收集方法、取得期間及取得條件係為本發明所屬技術領域中具通常知識者所熟知，並無特殊限制。

根據本發明，係將收集而得之豐年蝦卵遭受寒逆境。於本發明之一較佳具體實施例中，該寒逆境處理係將該豐年蝦卵於約-70℃至約-183℃處理；更佳係於約-70℃至約-100℃處理。另一方面，處理時間較佳為約1天至約7天。於本發明之一最佳具體實施例中，該寒逆境處理係將該豐年蝦卵於約-80℃處理約3天。

根據本發明之方法，步驟(c)均質化步驟(b)之豐年蝦卵係為取得萃取物之處理步驟。較佳地，經由步驟(b)逆境處理後之豐年蝦卵係先經過濾雜質及清洗後，再進行均質化。此過濾雜質及清洗之手段為本發明所屬技術領域中具通常知識者可完成者。根據本發明之均質豐年蝦卵之方法可為一般細胞破碎方法，例如使用細胞破碎儀或超音波震盪儀進行。為使均質化可方便進行，可先將經逆境處理之豐年蝦卵加入水，較佳地，係以約3至約10倍之水混合步驟(b)之豐年蝦卵，以獲得一豐年蝦卵水混合物；更佳地，係以約6倍之水混合步驟(b)之豐年蝦卵。

於本發明之一較佳具體實施例中，根據本發明之方法另包含去除步驟(c)所得之均質化豐年蝦卵之細胞碎片，並獲得澄清液。此去除細胞碎片之手段為本發明所屬技術領域中具通常知識者可完成者，例如使用離心或過濾方式去除。

於本發明之一具體實施例中，步驟(c)係包含：

(c1)以約3至約10倍之水混合步驟(b)之豐年蝦卵，以獲得一豐年蝦卵水混合物；

(c2)均質化步驟(c1)之豐年蝦卵水混合物；及

(c3)去除步驟(c2)所得之均質化豐年蝦卵水混合物中之細胞碎片，並獲得澄清液；較佳地，步驟(c3)係以離心去除步驟(c2)所得之均質化豐年蝦卵水混合物中之細胞碎片。

根據本發明之方法，較佳係另包含步驟(d)，以濃縮該豐年蝦卵萃取物，其可以任何習知方法濃縮豐年蝦卵萃取物，例如冷凍乾燥或蒸發(J. Pharmacol. Sci.,99:294-300,2005及J. Chromatography,932:91-95,2001)以獲得經濃縮之豐年蝦卵萃取物，並可視需要加入賦形劑，例如甲基纖維素共同冷凍乾燥。

於本發明之一較佳具體實施例中，該經處理之豐年蝦卵係經過濾，以去除處理過程所添加之溶劑，該過濾之方法係為本發明所屬技術領域中具通常知識者可實施者例如使用一般濾紙過濾，於過濾後以水清洗，再以約3至約10倍量的含蛋白酶抑制劑之水混合後打碎細胞；較佳係以約6倍量的含蛋白酶抑制劑之水混合後打碎細胞，後於4℃ 4500 rpm離心20分鐘取其上清液，經過濾、濃縮、冷凍乾燥，保存於-20℃冰櫃中備用。

萃取物

本發明提供一種豐年蝦卵萃取物，其係根據前述之方法所製得。

於本發明之具體實施例中，將萃取物進行高壓液相層析(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)，使用之層析管柱為LiChroCART250-4 HPLC-Cartridge NH₂ ，5 μm，管柱溫度(Column oven Temp.)為25℃，注入體積為10 μL，流速為1.0 mL/min，執行時間(Run time)為30 min，流動相為CH₃ CN：H₂ O=4：1(體積比)，根據本發明之萃取物於滯留時間約1.39分鐘、約2.45分鐘、約3.15分鐘、約4.00分鐘、約4.61分鐘、約5.21分鐘及約5.60分鐘具有吸收峰。其高壓液相層析圖譜示於圖1。

組合物

本發明提供一種包含治療有效量之本發明豐年蝦卵萃取物的組合物。本發明組合物可作為食品組合物、醫藥組合物或化妝品組合物。

本發明組合物可藉由任何適當途徑投與至個體，例如口服投與。本發明組合物適當調配形式包括，但不限於錠劑、喉片、硬式或軟式膠囊、水性或油性懸浮液、乳劑、可分散粉末或顆粒、糖漿或酏劑(elixir)。如需要，可針對該組合物滅菌或與任何醫藥可接受之載劑，例如安定劑、濕化劑等混合。

本發明組合物可藉由任何習知方法與習知醫藥可接受之賦形劑予以混合。因此，欲用於口服之本發明組合物可包含，例如一或多種呈色劑、甜味劑、增味劑及/或保存劑。

本發明組合物可與其他一或多種目前正在使用的藥物併用，以治療及/或預防皮膚異常。

根據本發明之化妝品組合物較佳係存於一水性液態介質中，或粉體形式。

水相可本質上包括水；其亦可包含水及與水互溶溶劑之混合物(在25℃為大於50重量%之水互溶力)，例如含1至5個碳原子之低碳單醇，如乙醇或異丙醇，含2至8個碳原子之二醇，如丙二醇、乙二醇、1,3-丁二醇、或二丙二醇，C₃ -C₄ 酮與C₂ -C₄ 醛，及甘油。

此水性調配物可作為皮膚爽膚劑、濕潤劑或保濕劑，以對暴露於環境元素或病理情況或受損之皮膚促進皮膚屏蔽修補及回復正常皮膚屏蔽功能。

視需要地，本發明之化妝品組合物亦可為乳液或乳霜調配物之形式。其可含乳化界面活性劑，可選自陰離子及非離子界面活性劑。對於界面活性劑之性質及功能(乳化)，可參考文件「Encyclopedia of Chemical Technology,Kirk-Othmer」，第22卷，第333-432頁，第3版，1979,Wiley，對於陰離子及非離子界面活性劑，特別是該參考資料之第347-377頁。

較佳地用於本發明組合物之界面活性劑係選自：非離子界面活性劑：脂肪酸，脂肪醇，聚乙氧化或聚乙二醇化脂肪醇，如聚乙氧化硬脂醇或鯨蠟基硬脂醇，蔗糖之脂肪酸酯，烷基葡萄糖酯，特別是C₁ -C₆ 烷基葡萄糖之聚氧伸乙基化脂肪酸酯，及其混合物；陰離子界面活性劑：經胺、氨水或鹼鹽中和之C₁₆ -C₃₀ 脂肪酸，及其混合物。較佳為使用可得到水包油或水包蠟乳液之界面活性劑。

視需要地，本發明之組合物為水性凝膠或水凝膠調配物之形式。水凝膠調配物包含增稠劑以將液態溶液增稠。增稠劑之實例包括但不限於碳合物、纖維素為主材料、膠、海藻素、瓜爾膠、果膠、鹿角菜苷、明膠、礦物性或經改質礦物性增稠劑、聚乙二醇與多醇、聚丙烯醯胺、及其他之聚合增稠劑。較佳為使用對組合物賦與安定性及最適流動特性之增稠劑。

本發明之組合物可進一步包含有效量之生理上可接受抗氧化劑、天然或改質胺基酸、天然或改質固醇化合物、天然或改質膠蛋白、絲蛋白或大豆蛋白。

本發明之組合物較佳為調配成局部應用於角蛋白材料，如皮膚、毛髮、睫毛、或指甲。其可為正常用於此型應用之任何表現形式，特別是水性或油性溶液、水包油或油包水乳液、聚矽氧乳液、微乳液或奈米乳液、水性或油性凝膠或液體、漿狀或固態水合產物之形式。

本發明通常可為流體且可具有白色或有色乳霜、軟膏、乳汁、洗劑、漿液、漿料、慕斯、或凝膠之外觀。其可視需要以氣溶膠、貼片或粉末之形式局部地應用於皮膚上。其亦可為固態形式，例如棒形式。其可作為皮膚用保養產品及/或化妝產品使用。或者，其可調配成洗髮精或潤絲精。

在已知方式中，本發明之組合物亦可含化妝品常用之添加劑及佐劑，如親水性或親脂性膠化劑、防腐劑、抗氧化劑、溶劑、香料、填料、顏料、臭味吸收劑、與染料。

本發明化妝品組合物可包含脂肪物質，例如油，而且特別是礦物油(液態石油膠)、植物來源油(酪梨油、月見草油、紅花油、大豆油、小麥胚芽油、杏仁核油)、動物來源油(羊毛脂)、合成油(全氫鯊烯)、聚矽氧油(環甲矽脂)，及氟油(全氟多醚)。脂肪醇(如鯨蠟醇)、脂肪酸、蠟、及膠，特別是聚矽氧膠，亦為代表性脂肪物質。

本發明化妝品組合物可包含乳化劑及共乳化劑包括聚乙二醇之脂肪酸酯，如PEG-100硬脂酸酯、PEG-50硬脂酸酯與PEG-40硬脂酸酯；多元醇之脂肪酸酯，如硬脂酸乙二酯、葡萄糖醇三硬脂酸酯與氧伸乙基化葡萄糖醇硬脂酸酯，例如市售之商標名Tween^TM 20或Tween^TM 60；及其混合物。

本發明化妝品組合物可包含親水性膠化劑特別地包括羧基乙烯基聚合物(碳合物)、丙烯酸共聚物(如丙烯酸酯/烷基丙烯酸酯共聚物)、聚丙烯醯胺、多醣、天然膠、及黏土。例示親脂性膠化劑特別地包括改質黏土，例如膨土，脂肪酸之金屬鹽，及疏水性矽石。

根據本發明之化妝品組合物極適合對角質素基質/材料局部應用，如皮膚、角質素纖維(頭髮與睫毛)及指甲。

用途

本發明提供一種根據本發明之豐年蝦卵萃取物於預防及/或治療皮膚異常之用途，其中該皮膚異常係選自由發炎、黑色素生成、皮膚氧化、纖維母細胞損傷及老化所組成之群。

於本發明之較佳具體實施例中，與發炎相關之皮膚異常如：老化、皮膚粗糙、皮膚或毛髮色素沉澱症、皮膚乾燥、高皮脂溢、高皮脂溢相關缺陷、敏感性皮膚、頭皮屑、自然掉髮、禿頭、異常痤瘡、黑頭粉刺或多態、老年粉刺、日光及醫藥或專業粉刺、玫瑰斑、大規模及/或嚴重形式之牛皮癬、魚鱗病與似魚鱗病狀態、毛囊角化病、手掌角化病、白化病與似白化病狀態、扁平苔癬、所有良性或惡性皮膚增生、大規模或嚴重類風濕病牛皮癬、搔癢；紅斑、特異性皮炎、接觸性皮炎、接觸性濕疹、扁平苔癬、癢疹、蕁麻疹、癢疹毒性皮炎、及角化過度。

如本文所用之術語「敏感性皮膚」之症狀通常包括皮膚區域經歷之疼痛感，如螫痛、刺痛、癢或癬癢、燒痛、發紅、熱痛、不適、緊繃等。

於本發明之較佳具體實施例中，以豐年蝦卵萃取物處理巨噬細胞，可明顯減少因脂多醣誘發之一氧化氮產生且呈劑量依賴效應。

發炎與許多細胞激素相關，其中介白素-6(Interleukin-6，IL-6)主要由巨噬細胞和T細胞所分泌，可刺激T細胞和B細胞的增生分化，和急性蛋白質增加，為感染時早期發炎反應(acute phase reaction)的重要細胞激素。

於本發明之一更佳具體實施例中，以豐年蝦卵萃取物處理巨噬細胞，IL-6的產生量也被豐年蝦卵萃取物所抑制，特別是可抑制IL-6的生成達55%。因此根據本發明之豐年蝦卵萃取物可有效增加吞噬活力，並降低發炎激素之釋出，可增強免疫並能抑制發炎。

於本發明之一較佳具體實施例中，該預防及/或治療黑色素生成係可抑制黑色素細胞產生黑色素，其生成原因不限於自然生成或因如紫外線照射之外界壓力所引起之黑色素生成。於本發明之一較佳具體實施例中，最終濃度為100 μg/mL豐年蝦卵萃取物可抑制56.63%黑色素生成；最終濃度為10 μg/mL豐年蝦卵萃取物則可抑制50.52%黑色素生成。顯示豐年蝦卵可有效抑制黑色素細胞所生成之黑色素。

於本發明之一較佳具體實施例中，該預防及/或治療皮膚氧化係清除螯合亞鐵離子。亞鐵離子極易與過氧化氫作用，產生氫氧自由基，促進油脂氧化，進而損害到人體健康。於本發明之一較佳具體實施例中，最終濃度為10 mg/mL之豐年蝦卵萃取物，其螯合亞鐵離子之抗氧化能力為74.38%，顯示其抗氧化能力可達七成以上。

於本發明之一較佳具體實施例中，該預防及/或治療纖維母細胞損傷係可刺激纖維母細胞增生，其纖維母細胞損傷原因不限於自然損傷或因如紫外線照射之外界壓力所引起之纖維母細胞損傷。於本發明之一較佳具體實施例中，添加100 μg/mL豐年蝦卵萃取物可促進纖維母細胞增生約五成；而添加10 μg/mL的豐年蝦卵萃取物，約可增加兩成纖維母細胞，顯示豐年蝦卵萃取物可治療纖維母細胞損傷，並同時促進纖維母細胞增生。

如本文所用之術語「老化」係指皺紋與細紋、失去皮膚之堅實及/或彈性、皮膚萎縮、存在擴大毛細孔之較不規則皮膚粒、失去皮膚光彩、及/或色素沉澱痕跡。較佳地，該老化係因膠原蛋白之醣化所引起，故於本發明之一較佳具體實施例中，該預防及/或治療老化係抑制皮膚膠原蛋白之醣化。蛋白質的胺基與還原醣的醛基或酮基相互作用時，會產生一自發的反應形成希夫鹼(Schiff base)，接著由阿馬道里(Amadori)重排作用形成較穩定之阿馬道里產物，而當此產物經由氧化後，即產生醣化終產物(Advanced glycation end products；AGEs)。此一過程又稱為「非酵素醣化反應(non-enzymatic glycation)」，即為「梅納反應(Maillard reaction)」。皮膚中的膠原蛋白易受到醣化影響，會產生皺紋、鬆弛，並降低皮膚彈性造成皮膚的老化。於本發明之一較佳具體實施例中，豐年蝦卵萃取物於10 mg/mL濃度下，可抑制四至五成之蛋白質醣化。

根據本發明之豐年蝦卵萃取物係為一可行之治療藥劑，其對正常細胞並不造成毒性，於本發明之一較佳具體實施例中，以豐年蝦卵萃取物及未添加萃取物組處理正常皮膚纖維母細胞，豐年蝦卵萃取物處理組相較於未添加萃取物組有較高的細胞貼附及存活比例，可知豐年蝦卵萃取物具有保護正常細胞生長的作用。

本發明所屬技術領域中具通常知識者當可無困難地選擇適當的投與途徑及劑量以進行治療。根據本發明，較佳途徑係口服投與。劑量則根據疾病之本質及其狀況、個體的年紀及健康狀況、投與途徑及前處理等情形而定。本發明所屬技術領域中具通常知識者當瞭解劑量會隨著個體的年紀、體重、健康狀況及其他相關因素而變化。

以下之非限制性之實例有助於本發明所屬技術領域中具通常知識者實施本發明。該等實例不應視為過度地限制本發明。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可在不背離本發明之精神或範疇的情況下對本文所討論之實施例進行修改及變化，而仍屬於本發明之範圍。

實例 實例一、豐年蝦卵萃取物之製備

本實施例提供豐年蝦卵萃取物為將豐年蝦卵加入純水經過-80℃冷凍3天後，秤取5g過濾並以純水清洗，分別以6倍量的含1:1000蛋白酶抑制劑之水混合，並以細胞破碎儀(Planetary micro mill machine)於500 rpm處理5分鐘打碎，並於4℃ 4500 rpm離心20分鐘，萃取液經過濾、濃縮、冷凍乾燥，保存於-20℃冰櫃中備用。

實例二、豐年蝦卵萃取物對正常皮膚纖維母細胞之存活率分析

本實例所使用之NIH 3T3正常皮膚纖維母細胞購自新竹食品工業發展研究所，細胞生長在內含10%胎牛血清和1mM丙酮酸鈉(Sodium pyruvate)的DMEM(Dulbecco's modified Eagles medium)之細胞培養液中。上述細胞置於37℃培養箱內培養。

將6×10⁴ 之NIH 3T3正常皮膚纖維母細胞接種於六孔盤中，並培養過夜，再以1至2 mg/mL之豐年蝦卵萃取物，或未添加萃取物處理5天，於顯微鏡下照相，其結果示於圖2。

在缺乏CO₂ 的狀態之下，豐年蝦卵萃取物處理組細胞型態和未添加萃取物組有些微的變化；以豐年蝦卵萃取物處理後有較高的細胞貼附、平鋪的比例，並且有較多的樹狀突觸產生，纖維母細胞的附著與伸展對於細胞增生是必要的，在穩定狀態下的纖維母細胞會長出絲狀偽足、細胞質呈網狀、平鋪的型態以及成長的數目明顯的增加。因此加入豐年蝦卵萃取物的細胞持續且穩定的生長，在嚴苛環境之下添加豐年蝦卵萃取物具有保護正常細胞的作用。

將6×10⁴ 之NIH 3T3正常皮膚纖維母細胞接種於六孔盤中，並培養過夜，再以1至2 mg/mL之豐年蝦卵萃取物，或未添加萃取物處理5天。去除澄清液之培養盤之每孔加入300 μL之2%結晶紫，並於室溫染色15分鐘，接著以流動之自來水清洗以去除死細胞，並乾燥3小時。再以1 mL之30%醋酸溶解，並於OD 580 nm下以ELISA儀讀取，並計算細胞存活率。其結果示於表1。

在缺乏CO₂ 的狀態之下，以不同濃度之豐年蝦卵萃取物處理NIH 3T3正常皮膚纖維母細胞5天之後，未添加萃取物組作為細胞存活率的比較標準，以結晶紫法測試結果可以看出，豐年蝦卵萃取物處理組相較於未添加萃取物組有較高的細胞貼附及存活比例。此結果顯示在缺乏CO₂ 的狀態之下，豐年蝦卵萃取物具有保護正常細胞生長的作用。

實例三、豐年蝦卵萃取物對抑制一氧化氮之生成分析

抑制一氧化氮自由基(NO)的生成為評估抗發炎活性的主要方法之一，其原理為利用脂多醣(lipopolysaccharide，LPS)刺激老鼠巨噬細胞RAW264.7，模擬發炎反應時由誘導型一氧化氮生成酵素(inducible nitric oxide synthase,iNOS)，iNOS會產生大量自由基。並利用萃取物進行清除NO自由基的能力來評估成分是否有抗發炎活性。

亞硝酸鹽濃度的分析測定方法是用Griess反應劑[0.1% N-(1-萘)乙二胺(N-(1-naphthyl) ethylenediamine)及1%磺胺(Sulfanilamide)於5%磷酸]和亞硝酸鹽反應，所生成的顏色變化，在548 nm下測定吸光值，對照吸光值-濃度標準曲線後，即可得到NO在組織培養液中的含量。由於NO的半衰期很短，迅速會被氧化成亞硝酸鹽，再進一步氧化成硝酸鹽，因此在短時間內可使用Griess反應劑測定亞硝酸鹽的量，來間接表示NO的釋放量(Paul et al.,1994，Anal Biochem. 1982 Oct;126(1): 131-8)。

將6×10⁴ 之RAW264.7巨噬細胞接種於六孔盤中，並培養過夜，再以0.25至1 mg/mL之豐年蝦卵萃取物、海藻糖或未添加萃取物處理1小時，加入100 ng/mL之脂多醣處理2天，並收穫澄清液樣品。

先混合5 μL之N-(1-萘)乙二胺及5 μL之磺胺，再加入75 μL之樣品或標準品(0至25 μM之亞硝酸鹽)，並以超純水作為空白組，再加入65 μL之超純水後，於室溫避光培育此混合物30分鐘，接著以ELISA儀讀取OD 548 nm之吸光值。

其結果示於圖3。

以豐年蝦卵萃取物處理之巨噬細胞中，NO產生明顯減少；比較不同濃度(0.5 mg/mL和0.25 mg/mL)添加的豐年蝦卵萃取物，0.5 mg/mL具有更佳抑制NO產生的能力，此證實根據本發明之萃取物具有抑制NO生成之效果，且呈劑量依賴效應。

同時以iNOS抑制劑(NG-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)作為正向控制組，結果10 μM L-NAME具抑制RAW264.7巨噬細胞產生NO的活性。

海藻糖為豐年蝦中具保護休眠卵的成分之一，但在此實例中添加高量海藻糖組(1.25、2.5 mg/mL)抑制RAW264.7巨噬細胞產生NO的活性效果較豐年蝦卵萃取物低，顯示存在於豐年蝦卵萃取物中之其他複合成份之抑制NO能力較海藻糖佳。

實例四，豐年蝦卵萃取物對促發炎激素IL-6之影響

本實例所使用之小鼠巨噬細胞株RAW264.7購自新竹食品工業發展研究所，細胞生長在內含10%胎牛血清和1mM丙酮酸鈉(Sodium pyruvate)的DMEM(Dulbecco's modified Eagles medium)之細胞培養液中。上述細胞置於37℃培養箱內培養。

將小鼠巨噬細胞株RAW264.7植入24孔細胞培養盤中，於37℃培養箱培養3小時後，加入豐年蝦卵萃取物，或未添加萃取物及脂多醣(100 ng/mL)之細胞培養液，分別培養18小時後，收集細胞培養上清液，並儲放於-80℃冰箱待後續細胞激素之分析。

細胞激素分析測定是採用小鼠IL-6 ELISA套組(R&D system，USA)。以ELISA儀偵測OD 450 nm吸光值，細胞培養上清液中IL-6濃度以內插標準曲線求得。

IL-6之結果示於圖4。

結果顯示，IL-6的產生量被豐年蝦卵萃取物所抑制。初步結果顯示添加不同濃度(1 mg/mL、0.5 mg/mL和0.25 mg/mL)的豐年蝦卵萃取物，1 mg/mL有更佳抑制IL-6的產生。豐年蝦卵萃取物在濃度1 mg/mL時抑制IL-6的生成達55.49%。

實例五、豐年蝦卵萃取物對黑色素生成之影響

利用細胞培養技術，由體外測定豐年蝦卵萃取物對黑色素細胞內黑色素生成的影響。B16F10黑色素瘤細胞株的基本結構，特別是黑色素合成功能與人正常的黑色素細胞基本一致，在人體原代皮膚黑色素細胞培養非常困難的情況下，為現今廣泛採用該細胞株作為美白祛斑添加劑功效測定的受試細胞。

其先將B16F10細胞植入於12孔培養盤中，並添加細胞培養基於二氧化碳培養箱培養24小時。接著將培養基移除，以1X PBS清洗後再加入細胞培養基。分別加入100 μL濃度分別為1,000 μg/mL及100 μg/mL之豐年蝦萃取物，於二氧化碳培養箱培養20分鐘，接著置入UV燈箱，UVB照射25 mJ/cm² ，再於二氧化碳培養箱培養24小時，接著將培養基移除，以1X PBS清洗後加入細胞培養基。

分別加入100 μL豐年蝦萃取物，樣品濃度分別為1,000 μg/mL及100 μg/mL。分別加入100 μL濃度分別為1,000 μg/mL及100 μg/mL之豐年蝦萃取物，於二氧化碳培養箱培養20分鐘，接著置入UV燈箱，UVB照射50 mJ/cm² ，再於二氧化碳培養箱培養20小時，進行黑色素含量測定。

其結果示於表2。

經計算，使用最終濃度為100 μg/mL豐年蝦卵萃取物可抑制56.63%黑色素生成，最終濃度為10 μg/mL豐年蝦卵萃取物則可抑制50.52%黑色素生成。顯示豐年蝦卵可有效抑制UV照射後黑色素細胞所生成之黑色素。

實例六、豐年蝦卵萃取物對皮膚氧化之影響

測定螯合亞鐵離子的能力，測試原理為在甲醇溶液中，藉菲洛嗪(ferrozine)與Fe²⁺ 螯合，產生菲洛嗪-Fe²⁺ 錯化合物為鮮紅色，在562 nm下有強的吸光值，若Fe²⁺ 與抗氧化物結合，減少菲洛嗪-Fe²⁺ 的生成，將會降低吸光值，由此藉以判斷豐年蝦卵萃取物對於螯合亞鐵離子的能力，其吸光值愈低，表示豐年蝦卵萃取物清除螯合亞鐵離子的能力愈強。

照表3依序加入，其中步驟5加入50 μl之2 mM氯化亞鐵(ferrous chloride)後，混合均勻靜置室溫反應2分鐘，再進行步驟6。

於室溫靜置10分鐘後，測562 nm吸光值。

測出吸光值後，代入以下公式：

[A_控制組 -(A_實驗組 -A_空白組 )]/A_控制組 ×100。

其結果示於表4。

經計算，最終濃度為10 mg/mL之豐年蝦卵萃取物，其螯合亞鐵離子之抗氧化能力為74.38%，顯示其抗氧化能力可達七成以上。

實例七、豐年蝦卵萃取物對纖維母細胞損傷之影響

將NIH3T3細胞植入於12孔培養盤中，並添加細胞培養基，並於二氧化碳培養箱培養24小時後，將培養基移除，以1X PBS清洗後加入細胞培養基。分別加入100 μL濃度分別為1,000 μg/mL及100 μg/mL之豐年蝦卵萃取物，於二氧化碳培養箱培養20分鐘，接著置入UV燈箱，UVB照射25 mJ/cm² ，再於二氧化碳培養箱培養24小時，接著將培養基移除，以1X PBS清洗後加入細胞培養基。

分別加入100 μL豐年蝦卵萃取物，樣品濃度分別為1,000 μg/mL及100 μg/mL。分別加入100 μL濃度分別為1,000 μg/mL及100 μg/mL之豐年蝦卵萃取物，於二氧化碳培養箱培養20分鐘，接著置入UV燈箱，UVB照射50 mJ/cm² ，再於二氧化碳培養箱培養20小時，進行黑色素含量測定，及MTT測試。

分別加入100 μL豐年蝦卵萃取物，樣品濃度分別為1,000 μg/mL及100 μg/mL。分別加入100 μL濃度分別為1,000 μg/mL及100 μg/mL之豐年蝦卵萃取物，於二氧化碳培養箱培養20分鐘，接著置入UV燈箱，UVB照射50 mJ/cm² ，再於二氧化碳培養箱培養20小時，進行MTT測試。

其結果示於表5：

針對纖維母細胞，添加100 μg/mL豐年蝦卵萃取物可促進纖維母細胞增生約五成，而添加10 μg/mL的豐年蝦卵萃取物，約可增加兩成纖維母細胞，顯示豐年蝦卵萃取物可保護UVB照射後之纖維母細胞損傷，並同時促進纖維母細胞增生。

實例八、豐年蝦卵萃取物對皮膚老化之影響

採用葡萄糖、小牛血清球蛋白(bovine serum albumin，BSA)與待測樣品混合均勻後，再以60℃培養，以370 nm/440 nm螢光下檢測醣化值，螢光值越高代表醣化之表現高，螢光值越低代表醣化之表現降低。

陽性對照組：芸香素(rutin)

空白組：取BSA、磷酸鈉緩衝液及待測樣品，混合均勻。

控制組：取BSA、葡萄糖、磷酸鈉緩衝液，混合均勻

實驗組：取BSA、葡萄糖、待測樣品，混合均勻。

以上各組靜置於培養箱中24小時。

偵測370/440 nm之螢光值。

測出螢光值後，代入下列公算式：

抑制率%=[1-(OD_實驗組 /OD_控制組 ] x100，即可得到抑制最終醣化生成之百分比。

其結果示於表6。

豐年蝦卵萃取物於10 mg/mL濃度下，可抑制四至五成蛋白質醣化。

統計分析

採用Statistical Analysis System(SAS)軟體進行統計分析，以變方分析(Analysis of variance，ANOVA)進行統計處理，並以Duncan's test比較各因子間顯著差異程度(p<0.05)，所得數據以平均值±標準偏差(Mean±SD)表示。

圖1顯示以實例1之豐年蝦卵萃取物進行之高壓液相層析圖。

圖2顯示以實例1之豐年蝦卵萃取物或未添加萃取物處理正常皮膚纖維母細胞於顯微鏡觀察之結果圖。

圖3顯示以實例1之豐年蝦卵萃取物、海藻糖或未添加萃取物處理巨噬細胞後，其經脂多醣誘發之一氧化氮生成量分析結果圖。

圖4顯示以實例1之豐年蝦卵萃取物或未添加萃取物處理巨噬細胞後，其經脂多醣誘發之IL-6生成量分析結果圖。

(無元件符號說明)

Claims

一種製備豐年蝦卵萃取物之方法，其包含下列步驟：(a)提供豐年蝦卵；(b)寒逆境處理該豐年蝦卵，其中寒逆境處理係將該豐年蝦卵於約-70℃至約-183℃處理；及(c)均質化步驟(b)之豐年蝦卵。
根據請求項1之方法，另包含去除步驟(c)所得之均質化豐年蝦卵之細胞碎片，並獲得澄清液。
根據請求項1之方法，其中步驟(c)包含：(c1)以約3至約10倍之水混合步驟(b)之豐年蝦卵，以獲得一豐年蝦卵水混合物；(c2)均質化步驟(c1)之豐年蝦卵水混合物；及(c3)去除步驟(c2)所得之均質化豐年蝦卵水混合物中之細胞碎片，並獲得澄清液。
根據請求項3之方法，其中步驟(c3)係以離心去除步驟(c2)所得之均質化豐年蝦卵水混合物中之細胞碎片。
一種豐年蝦卵萃取物，其係根據請求項1至3中任何一項之方法所製得。
根據請求項5之萃取物，其經高壓液相層析(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)，使用之層析管柱為LiChroCART® 250-4 HPLC-Cartridge NH₂ ，5μm，管柱溫度(Column oven Temp.)為25℃，注入體積為10μL，流速為1.0mL/min，執行時間(Run time)為30min，流動相為CH₃ CN：H₂ O=4：1(體積比)，滯留時間約1.39分鐘、約2.45分鐘、約3.15分鐘、約4.00分鐘、約4.61分鐘、約5.21分鐘及約5.60分鐘具有吸收峰。
一種組合物，其包含治療有效量之如請求項5或6之豐年蝦卵萃取物及視需要之醫藥可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
如請求項7之組合物，其係食品組合物、醫藥組合物或化妝品組合物。
一種根據請求項5或6之豐年蝦卵萃取物之用途，其係用於製備預防及/或治療皮膚異常之藥物之用途，其中該皮膚異常係選自由抑制一氧化氮之生成、抑制促發炎激素IL-6之生成、黑色素生成、皮膚氧化、纖維母細胞損傷及老化所組成之群。
根據請求項9之用途，其中該預防及/或治療皮膚氧化係清除螯合亞鐵離子。
根據請求項9之用途，其中該預防及/或治療老化係抑制皮膚蛋白質之醣化。