FR2855968A1 - Stimulation de la synthese et de l'activite d'une isoforme de la lysyl oxydase-like loxl pour stimuler la formation de fibres elastiques - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne la stimulation de la synthèse et de l'activité d'une isoforme de la lysyl oxydase, et plus particulièrement de l'isoforme LOXL (lysyl oxidase-like).L'invention concerne notamment une méthode d'identification d'un principe actif stimulant la formation de fibres élastiques.L'invention a principalement pour but de fournir une telle méthode d'identification afin de réaliser des compositions permettant de stimuler la formation de fibres élastiques.
Description
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L'invention concerne la stimulation de l'activité d'une isoforme de la lysyl oxydase, et plus particulièrement de l'isoforme LOXL (lysyl oxidase-like).
Etat de la technique :
Les propriétés de résistance et d'élasticité de la peau et des muqueuses sont définies essentiellement par les fibres de collagène et d'élastine du derme. L'élastine est une protéine composant les fibres élastiques en s'associant avec d'autres molécules comme les fibrillines et les MAGP (Microfibrillar Associated Glycoproteins).
Les propriétés de résistance et d'élasticité de la peau et des muqueuses sont définies essentiellement par les fibres de collagène et d'élastine du derme. L'élastine est une protéine composant les fibres élastiques en s'associant avec d'autres molécules comme les fibrillines et les MAGP (Microfibrillar Associated Glycoproteins).
Les fibres élastiques sont formées de l'élastine déposée sur des microfibrilles.
L'élastine est synthétisée sous la forme de tropoélastine soluble qui acquiert ses propriétés physico-chimiques (insolubilité, élasticité) après sa réticulation intra- et intermoléculaire par une lysyl oxydase et son dépôt sur les microfibrilles. Les fibres élastiques sont responsables de la propriété élastique des organes qui les contiennent (vaisseaux, parenchyme pulmonaire, cartilages élastiques, peau...). Les fibres élastiques sont constituées majoritairement d'élastine déposée sur les microfibrilles. Le nom élastine fut réservé à la protéine formant la portion amorphe des fibres élastiques et leur conférant leur élasticité. Récemment, des composants de ces fibres élastiques ont été mis en évidence dans l'épiderme.
Les fibrilles de collagènes sont formées par l'assemblage trimérique de chaînes de collagène. Ces fibres de collagène sont aussi réticulées par une lysyl oxydase.
Le vieillissement des peaux et des muqueuses est associé à une modification de ces réseaux fibrillaires, notamment celui des fibres élastiques qui se dégradent et ne se reforment plus correctement. De même, dans les cicatrices, le réseau de fibres élastiques ne se reforme pas correctement. Il existe 5 isoformes connues de la famille des lysyl oxydases (LO) : LOX, LOXL, LOXL2, LOXL3, LOXL4 (Csiszar, Lysyl oxidases : A novel multifunctional amine
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oxidase family, Nucleic Acid Research and Molecular Biology, 2001, vol 70, p2- 28). LOX est clairement impliquée dans la réticulation des fibres de collagène (Sève et al, Expression analysis of recombinant lysyl oxidase (LOX) in myofibroblast-like cells, Connective Tissue Research, 2002,43 : 613-619).
Les fibres élastiques fonctionnelles (que l'on trouve principalement dans la peau, les vaisseaux, la macula de la rétine et les disques intervertébraux) sont formées au cours du développement prénatal et immédiatement après la naissance. Dans la peau, ces fibres élastiques sont formées par les fibroblastes du derme, mais certains composants nécessaires à l'élaboration des fibres élastiques ont aussi été retrouvés dans les cellules de l'épiderme. Les fibres de collagène sont synthétisées dans les tissus conjonctifs tout au long de la vie.
Le taux de renouvellement des fibres élastiques est très faible dans la vie adulte, bien que le taux global d'élastine de la peau puisse augmenter (Ashcroft et al, Age-related changes in the temporal and spatial distributions of fibrillin and elastin mRNAs and proteins in acute cutaneous wounds of healthy humans, J. Pathol., 1997,183 : 80-89). Chez le nouveau né, les microfibrilles ne sont pas toutes complètement couvertes d'élastine, et le deviennent vers la puberté. Dès 40 ans, on voit apparaître sur les fibres des inclusions, plus fréquentes chez les femmes, puis la fragmentation des fibres élastiques et leur disparition sous la jonction dermo-épidermique (JDE). Ce fractionnement et/ou cette disparition sous la JDE se traduisent par la perte d'élasticité de la peau et la formation de rides. La synthèse de fibres élastiques non fonctionnelles est observée lors du photo-vieillissement, mais cette augmentation s'accompagne de la perte accélérée des fibres élastiques sous la JDE. (Watson et al, Fibrillin- rich microfibrils are reduced in photoaged skin. Distribution at the dermal- epidermal junction, J. Invest. Dermatol., 1999,112 : 782-787).
D'autre part, la néosynthèse de fibres élastiques s'effectue peu dans les cicatrices de personnes adultes, bien que paradoxalement, cette propriété soit en partie retrouvée chez les personnes âgées (plus de 70 ans) dont les fibres
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élastiques produites sont très fragmentées. Pourtant, les principaux composants intervenant dans la composition finale des fibres élastiques sont présents (élastine, microfibrilles) et l'activité lysyl oxydase globale se maintient (Pasquali-Ronchetti et Baccarani-Contri, Elastic fiber during development and aging, Microscopy Res. Tech., 1997, 38 : 428-435). Ceci a suggéré aux inventeurs qu'il manquait un ou des facteurs permettant la formation de fibres élastiques fonctionnelles chez l'adulte, mais existant lors du développement embryonnaire et lors des premiers âges.
L'art antérieur ne permet pas de fournir des critères permettant d'évaluer l'impact de principe actif en dermato-cosmétologie sur une néo- élastogénèse fonctionnelle. Dans ce cadre, il est également très difficile d'obtenir des critères objectifs permettant de juger de l'impact de ces actifs.
Les méthodes d'identification de principes actifs actuels portent sur l'évaluation de l'expression des gènes impliqués dans la formation des fibres élastiques, comme l'élastine ou les fibrillines.
D'autre part, à ce jour l'expérimentation animale est interdite en cosmétique en Europe et l'expérimentation humaine est éthiquement discutée.
Il n'est donc pas acceptable pour les inventeurs d'effectuer, pour des applications cosmétiques, une méthode de criblage mettant en #uvre des animaux ou des êtres humains.
Dans les modèles tridimensionnels, tels que Mimeskin (Coletica, Lyon, France), les kératinocytes induisent la synthèse de tropoélastine et le dépôt de tropoélastine sur les microfibrilles (Duplan-Perrat et al, Keratinocytes influence the maturation and organization of the elastin network in a skin équivalent. J.
Invest. Dermatol. 114 : 365-70,1999). Dans le modèle Mimeskin, la matrice extracellulaire a montré une organisation ultrastructurale voisine de celle de la peau, avec le collagène organisé en faisceaux et des fibres élastiques constituées d'élastine déposée sur les microfibrilles. Ce modèle a aussi été utilisé pour tester l'efficacité de certaines molécules, comme les inhibiteurs des
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lysyl oxydases. Cela a permis de prouver que l'inhibition des lysyl oxydases induisait une désorganisation des fibres de collagène et d'élastine, mais aussi une déviation du programme de différenciation des kératinocytes, avec une réduction du niveau d'expression des marqueurs de différenciation terminale comme la filaggrine (Farjanel et al, brevet français 01. 10443, CNRS, Utilisation d'inhibiteurs des lysyl oxydases pour la culture cellulaire et le génie tissulaire).
Dans ce brevet, il n'est pas fait de distinction entre les différentes isoformes de LO.
Cependant, ces études n'ont pas permis de mettre au point une méthode d'identification de principes actifs permettant de stimuler la formation de fibres élastiques fonctionnelles.
L'art antérieur ne permet donc pas la fourniture de principes actifs permettant de stimuler la formation de fibres élastiques fonctionnelles.
D'autre part, l'art antérieur ne permet pas un suivi dynamique de la zone d'expression de l'isoforme de la lysyl oxydase LOXL, notamment par le fait que les méthodes fournies par l'art antérieur sont imprécises.
Buts de l'invention :
L'invention a principalement pour but de résoudre les problèmes techniques énoncés ci-dessus et notamment le problème technique visant à fournir une méthode d'identification de principes actifs stimulant la formation de fibres élastiques fonctionnelles.
L'invention a principalement pour but de résoudre les problèmes techniques énoncés ci-dessus et notamment le problème technique visant à fournir une méthode d'identification de principes actifs stimulant la formation de fibres élastiques fonctionnelles.
L'invention concerne également l'utilisation de l'isoforme L de la lysyl oxydase ou de principe actif stimulant l'activité enzymatique ou l'expression de l'isoforme L de la lysyl oxydase (LOXL), notamment pour stimuler la formation de fibres élastiques fonctionnelles.
L'invention permet de résoudre le problème technique consistant en la fourniture d'une méthode de localisation de l'expression de LOXL et du suivi de cette expression.
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Résumé de l'invention
Dans ce texte, les inventeurs entendent par le terme LOXL, ou hLOXL, l'isoforme L de la protéine humaine de la lysyl oxydase LOXL.
Dans ce texte, les inventeurs entendent par le terme LOXL, ou hLOXL, l'isoforme L de la protéine humaine de la lysyl oxydase LOXL.
Dans ce texte, les inventeurs entendent par le terme LOX, ou hLOX, l'isoforme initiale de la protéine humaine de la lysyl oxydase LOX.
Les inventeurs entendent par stimuler l'expression de l'isoforme de lysyl oxydase LOXL, la stimulation de l'expression du gène codant LOXL ou de son promoteur, et notamment la stimulation de la synthèse de l'ARN messager codant LOXL, mais aussi la stimulation de la synthèse de LOXL à partir de cet ARN messager.
Les inventeurs entendent par stimuler l'expression de l'élastine, la stimulation de l'expression du gène codant la protéine élastine ou de son promoteur, et notamment la stimulation de la synthèse de l'ARN messager codant la protéine élastine, mais aussi la stimulation de la synthèse de la protéine élastine ou de son précurseur la tropoélastine, à partir de cet ARN messager.
Dans cette invention, les inventeurs visent donc à stimuler principalement soit l'expression de LOXL ainsi décrite, soit l'activité enzymatique de LOXL.
Cette stimulation doit être suffisamment efficace pour permettre de stimuler la formation de fibres élastiques fonctionnelles.
Sont considérés comme efficaces les principes actifs permettant d'obtenir une activation ou une augmentation d'environ 1,5 fois de l'expression et/ou de l'activité de LOXL sur un modèle, comprenant au moins un type cellulaire présentant une expression et/ou une activité de LOXL, au contact de ces principes actifs par rapport au niveau d'expression et/ou d'activité de LOXL dans un modèle témoin (sans mise au contact des principes actifs).
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C'est ainsi que la présente invention concerne, selon un premier aspect l'utilisation de l'isoforme like de la lysyl oxydase ayant la Séquence ID N 1, encore appelée LOXL, ou d'une forme dérivée, ou d'une substance favorisant l'activité et/ou l'expression de LOXL, pour la fabrication d'une composition pour la stimulation de la formation de fibres élastiques.
Avantageusement, l'expression de LOXL est soit l'expression d'une séquence de nucléotides codant LOXL soit l'expression d'une séquence de peptides constituant une fraction de la protéine LOXL, de préférence ladite séquence de peptides étant choisie parmi la Séquence ID N 1.
Avantageusement, ladite composition est une composition cosmétique, neutraceutique, médicale ou pharmaceutique.
Avantageusement, la composition comprend en outre une seconde substance stimulant l'expression de la protéine élastine, notamment pour stimuler la formation de fibres élastiques, ladite seconde substance étant de préférence la substance favorisant l'activité et/ou l'expression de LOXL.
Avantageusement, ladite substance active comprend une région se fixant à au moins une partie de la séquence de nucléotides du promoteur du gène humain de LOXL (Pr) (SEQ ID N 3) ou module l'expression d'une protéine se fixant à au moins une partie de la séquence de nucléotides du promoteur du gène humain de LOXL (Pr) (SEQ ID N 3). Cette séquence est donnée à partir du nucléotide -2630 avant le codon ATG, et les nucléotides de -2172 à-1 ont particulièrement été étudiés.
Avantageusement, la substance active est choisie parmi le groupe consistant en l'aneth, la groseille, la cardamone, le radis noir, le petit houx, la cannelle, les fermentations à base de bactéries lactiques, l'avoine, la pomme de terre, la soie, la gomme asae foetida, l'hexénoate d'éthyle et ses dérivés, le butyrate de méthyle et ses dérivés, et le décadiènoate d'éthyle et ses dérivés.
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Avantageusement, l'utilisation d écrite précédemment est effectuée pour induire une néo-élastogenèse des tissus, et notamment stimuler l'élasticité des tissus ainsi obtenus, et réduire les rides cutanées.
Avantageusement, l'utilisation décrite précédemment est effectuée pour lutter contre le relâchement des tissus, notamment lorsque le relâchement des tissus est observé au cours du vieillissement ou au cours des expositions solaires, pour densifier la matrice extracellulaire, pour raffermir les tissus souscutanés, pour réduire les rides cutanées, pour exercer un effet anti-rides, pour améliorer la qualité du tissu cicatriciel et l'aspect des cicatrices, notamment des cicatrices dystrophiques et kéloïdes, ou pour lutter contre les vergetures.
Selon un second aspect, l'invention concerne une composition cosmétique comprenant une substance active telle que définie précédemment, éventuellement en mélange avec un excipient cosmétiquement acceptable.
Selon un troisième aspect, l'invention concerne une composition neutraceutique comprenant une substance active telle que définie précédemment, éventuellement en mélange avec un excipient alimentairement acceptable.
Selon un troisième aspect, l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant une substance active telle que définie précédemment, éventuellement en mélange avec un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Pour les compositions cosmétiques ou pharmaceutiques, l'excipient contient par exemple au moins un composé choisi parmi le groupe consistant en les conservateurs, les émollients, les émulsifiants, les tensioactifs, les hydratants, les épaississants, les conditionneurs, les agents matifiant, les stabilisants, les antioxydants, les agents de texture, les agents de brillance, les agent filmogènes, les solubilisants, les pigments, les colorants, les parfums et les filtres solaires. Ces excipients sont de préférence choisis parmi le groupe
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consistant en les acides aminés et leurs dérivés, les polyglycerols, les esters, les polymères et dérivés de cellulose, les dérivés de Lanoline, les phospholipides, les lactoferrines, les lactoperoxidases, les stabilisants à base de sucrose, les vitamines E et ses dérivés, les cires naturelles et synthétiques, les huiles végétales, les triglycérides, les insaponifiables, les phytosterols, les esters végétaux, les silicones et ses dérivés, les hydrolysats de protéines, l'huile de Jojoba et ses dérivés, les esters lipo/hydrosolubles, les betaines, les aminoxides, les extraits de plantes les esters de Saccharose, les dioxydes de Titane, les glycine, et les parabens, et encore de préférence parmi le groupe consistant en le butylène glycol, le stéareth-2, le stéareth-21, le glycol-15 stéaryl éther, le cétéaryl alcool, le phénoxyéthanol, le méthylparaben, l'éthylparaben, le propylparaben, le butylparaben, le butylène glycol, les tocopherols naturels, la glycérine, le sodium dihydroxycétyle, l'isopropyl hydroxycétyl éther, le glycol stéarate, le triisononaoine, l'octyl cocoate, le polyacrylamide, l'isoparaffine, le laureth-7, un carbomer, le propylène glycol, le glycérol, le bisabolol, une diméthicone, l'hydroxyde de sodium, le PEG 30dipolyhydroxystérate, les caprique/caprylique triglycérides, le cétéaryl octanoate, le dibutyl adipate, l'huile de pépin de raisin, l'huile de jojoba, le sulfate de magnésium, l'EDTA, une cyclométhicone, la gomme de xanthane, l'acide citrique, le lauryl sulfate de sodium, les cires et les huiles minérales, l'isostéaryl isostéarate, le dipélargonate de propylène glycol, l'isostéarate de propylène glycol, le PEG 8 Beewax, les glycérides d'huile de coeur de palme hydrogénée, les glycérides d'huile de palme hydrogénée, l'huile de lanoline, l'huile de sésame, le cétyl lactate, le lanoline alcool, l'huile de ricin, le dioxyde de titane, le lactose, le saccharose, le polyéthylène basse densité, une solution isotonique salée.
Avantageusement, les compositions précitées sont formulées sous une forme choisie parmi le groupe consistant en une solution, aqueuse ou huileuse, une crème ou un gel aqueux ou un gel huileux, notamment en pot ou en tube,
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notamment un gel douche, un shampoing ; unlait ; une émulsion, une microémulsion ou une nanoémulsion, notamment huile-dans-eau ou eau-danshuile ou multiple ou siliconée ; une lotion, notamment en flacon de verre, de plastique ou en flacon doseur ou en aérosol ; une ampoule ; un savon liquide ; un pain dermatologique ; pommade ; mousse ; produit anhydre, de préférence liquide, pâteux ou solide, par exemple sous forme de bâtonnet, notamment sous forme de rouge à lèvre.
Avantageusement, les compositions suffisamment liquides peuvent être administrées, notamment par voie parentérale, oculaire, pulmonaire, orale ou nasale.
Avantageusement, les compositions pâteuses ou sèches (pâtes, poudres, comprimés, gélules, granules, suppositoires..), peuvent être introduits dans le corps notamment par voie orale, sublinguale, nasale ou rectale.
Avantageusement, quand la formulation de la composition le permet, la voie d'administration est cutanée ou transmuqueuse, notamment par application de la composition sur la peau ou sur une muqueuse.
Avantageusement, parmi ces différentes formulations et voies d'administration, l'homme de l'art choisira celle adéquate à l'efficacité recherchée.
Selon un quatrième aspect, l'invention concerne un procédé de soin cosmétique caractérisé en ce qu'il comprend l'utilisation d'une composition décrite précédemment.
Avantageusement, le soin cosmétique est choisi parmi le groupe consistant en la lutte contre le relâchement des tissus, notamment lorsque le relâchement des tissus est observé au cours du vieillissement ou au cours des expositions solaires, la densification de la matrice extracellulaire, le raffermissement des tissus sous-cutanés, la réduction des rides cutanées, les effets anti-rides, l'amélioration de la qualité du tissu cicatriciel et de l'aspect
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des cicatrices, notamment des cicatrices dystrophiques et kéloïdes, et la lutte contre les vergetures.
Selon un cinquième aspect, l'invention concerne une méthode d'identification d'une substance favorisant l'activité de LOXL, pour la stimulation de la formation de fibres élastiques, caractérisée en ce qu'elle comprend : - la mise en contact d'une substance potentiellement active avec LOXL, et - a) l'analyse de l'activité de LOXL, notamment dans le but d'identifier si ladite substance potentiellement active stimule l'activité de LOXL, ou - b) l'analyse de l'expression de LOXL, notamment dans le but d'identifier si ladite substance potentiellement active stimule l'expression de LOXL.
Dans le cadre de l'analyse de l'expression de LOXL :
Avantageusement, l'on recherche si ladite substance potentiellement active stimule : - l'expression d'au moins une séquence de nucléotides codant la protéine LOXL, et/ou - l'expression d'une séquence de peptides constituant essentiellement une fraction peptidique de la protéine LOXL.
Avantageusement, l'on recherche si ladite substance potentiellement active stimule : - l'expression d'au moins une séquence de nucléotides codant la protéine LOXL, et/ou - l'expression d'une séquence de peptides constituant essentiellement une fraction peptidique de la protéine LOXL.
Avantageusement, l'analyse de l'expression de LOXL est effectuée par l'analyse qualitative et/ou quantitative de l'expression d'au moins une partie d'une séquence de nucléotides codant LOXL.
Avantageusement, la séquence de nucléotides est l'ADNc, complémentaire de l'ARNm codant LOXL, l'ADNc de LOXL étant défini par la Séquence ID N 2.
Avantageusement, l'analyse de l'expression de LOXL met en #uvre une étape de transcription réversée de réaction de polymérisation en chaîne (RTPCR) comprenant l'utilisation d'amorces s'hybridant avec au moins une partie de la séquence de nucléotides de l'ADN complémentaire codant LOXL (SEQ ID N 2), pour amplifier au moins une partie de la séquence de nucléotides codant la LOXL.
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Avantageusement, la méthode comprend également une étape de localisation de l'expression de LOXL qui est effectuée sur un modèle de peau reconstruite ou sur un modèle à base de biopsies : # par hybridation in situ, notamment d'au moins une partie d'une séquence de nucléotides codant LOXL par exemple en utilisant au moins une sonde
ADN s'hybridant avec au moins une partie de la séquence de nucléotides de l'ADN complémentaire codant LOXL (SEQ ID N 2) ; ou # par immunodétection notamment en utilisant au moins un anticorps spécifique de la LOXL.
ADN s'hybridant avec au moins une partie de la séquence de nucléotides de l'ADN complémentaire codant LOXL (SEQ ID N 2) ; ou # par immunodétection notamment en utilisant au moins un anticorps spécifique de la LOXL.
Les anticorps spécifiques sont détaillés à l'exemple 1.
Avantageusement, la méthode d'identification comprend la comparaison de l'expression de LOXL avec l'expression de LOXL exprimée dans un témoin ne comprenant pas ladite substance potentiellement active.
Avantageusement, les cellules vivantes comprennent des fibroblastes, notamment issus de peau humaine normale, telle que par exemple issus de prépuce ou d'une peau d'un sujet adulte.
Avantageusement, les cellules vivantes comprennent des cellules épithéliales, par exemple des kératinocytes, notamment issus de peau humaine normale, telle que par exemple issus de prépuce ou d'une peau d'un sujet adulte.
Avantageusement, les cellules vivantes sont issues d'au moins une peau ayant une localisation particulière, par exemple du visage, de l'abdomen, ou des seins et pouvant être caractérisées comme étant vieillies ou comme étant exposées au rayonnement solaire ou non, ou d'une peau provenant d'une zone présentant des cicatrices ou des vergetures.
Avantageusement, la méthode d'identification met en oeuvre un modèle de peau reconstruite, de préférence au moins un modèle de derme comprenant des fibroblastes, ou un modèle à base de biopsies.
Avantageusement, la méthode d'identification met en oeuvre un modèle de
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peau reconstruite ou un modèle à base de biopsies. Le modèle de peau reconstruite utilisé est avantageusement le modèle de peau reconstruite Mimeskin mais peut également être un modèle de matrice conjonctive, d'épiderme ou d'épithélium, ou de peau ou de muqueuse reconstruite : 1) Le modèle de culture tridimensionnel de matrices conjonctives (derme ou chorion 1 comprend un support ensemencé par des cellules stromales pour former des dermes reconstruits ou des chorions reconstruits.
Ce support est choisi de préférence parmi : - un support inerte choisi parmi le groupe consistant d'une membrane synthétique semi-perméable, en particulier une membrane de nitrocellulose semi-perméable, une membrane de nylon semi-perméable, une membrane ou une éponge de téflon, une membrane de polycarbonate ou de polyéthylène, polypropylène, ou polyéthylène téréphtalate (PET) semi- perméable, une membrane inorganique Anopore semi-perméable, d'acétate ou d'ester de cellulose (HATF), une membrane Biopore-CM semi- perméable, une membrane de polyester semi-perméable, une membrane ou un film d'acide polyglycolique. Dans ce groupe on trouve par exemple les modèles dermiques Skin 2 TM modèle ZK1100 et Dermagraft et Transcyte# (Advanced Tissue Sciences) ; - un plastique traité culture cellulaire (formation d'un feuillet dermique :
Michel M. et al dans In Vitro Cell. Dev Biol.-Animal (1999) 35 : - un gel ou une membrane à base d'acide hyaluronique (Hyalograft 3D -
Fidia Advanced Biopolymers) et/ou de collagène et/ou de fibronectine et/ou de fibrine ; dans ce groupe on trouve par exemple modèle dermique Vitrix (Organogenesis) ; - une matrice poreuse, surfacée ou non surfacée, réalisée à partir de collagène pouvant contenir un ou plusieurs glycosaminoglycannes et/ou
Michel M. et al dans In Vitro Cell. Dev Biol.-Animal (1999) 35 : - un gel ou une membrane à base d'acide hyaluronique (Hyalograft 3D -
Fidia Advanced Biopolymers) et/ou de collagène et/ou de fibronectine et/ou de fibrine ; dans ce groupe on trouve par exemple modèle dermique Vitrix (Organogenesis) ; - une matrice poreuse, surfacée ou non surfacée, réalisée à partir de collagène pouvant contenir un ou plusieurs glycosaminoglycannes et/ou
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éventuellement du chitosane (EP0296078A1 du CNRS, WO 01/911821 et
WO 01/92322 de Coletica).
WO 01/92322 de Coletica).
2 Le modèle de culture tridimensionnel d'épidémie ou d'épithélium comprend un support ensemencé ou non au préalable par des cellules stromales, en particulier des fibroblastes, puis par des cellules épithéliales et en particulier des kératinocytes afin d'obtenir des épithélia ou épidermes reconstruits. Ce support est de préférence choisi parmi : - un support inerte choisi parmi le groupe consistant d'une membrane synthétique semi-perméable, en particulier une membrane de nitrocellulose semi-perméable, une membrane de nylon semi-perméable, une membrane ou une éponge de téflon, une membrane de polycarbonate ou de polyéthylène, polypropylène, ou polyéthylène téréphtalate (PET) semi- perméable, une membrane inorganique Anopore semi-perméable, d'acétate ou d'ester de cellulose (HATF), une membrane Biopore-CM semi- perméable, une membrane de polyester semi-perméable ; dans ce groupe on trouve les modèles Epiderme et Epithelia reconstruits (Skinethic#) ainsi que les modèles EpiDerm# EpiAirway, EpiOccular (Mattek Corporation) ; - un film ou une membrane à base d'acide hyaluronique et/ou de collagène et/ou de fibronectine et/ou de fibrine. Dans ce groupe on peut citer particulèrement les modèles . Episkin (L'Oréal) et Laserskin# (Fidia
Advanced Biopolymers).
Advanced Biopolymers).
3) Le modèle de culture tridimensionnel de peau ou de muqueuse reconstruite comprend un support matriciel (dermique ou de chorion) ensemencé par des cellules épithéliales pour obtenir une muqueuse reconstruite ou des kératinocytes pour obtenir une peau reconstruite. Ce support est de préférence choisi parmi :
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- un support inerte choisi parmi le groupe consistant d'une membrane synthétique semi-perméable, en particulier une membrane de nitrocellulose semi-perméable, une membrane de nylon semi-perméable, une membrane ou une éponge de téflon, une membrane de polycarbonate ou de polyéthylène, polypropylène, ou de polyéthylène téréphtalate (PET) semi- perméable, une membrane inorganique Anopore semi-perméable, d'acétate ou d'ester de cellulose (HATF), une membrane Biopore-CM semi- perméable, une membrane de polyester semi-perméable, ledit support inerte contenant des cellules stroma les, en particulier des fibroblastes, - un gel à base de collagène et/ou acide hyaluronique et/ou fibronectine, et/ou de fibrine comprenant des cellules stroma les en particulier des fibroblastes, - une matrice poreuse, surfacée ou non surfacée, réalisée à partir de collagène pouvant contenir un ou plusieurs glycosaminoglycannes et/ou éventuellement du chitosane, ces matrices poreuses intégrant des cellules stroma les, en particulier des fibroblastes, - un derme désépidermisé ou derme mort, humain ou animal.
Dans ce groupe, on peut citer particulièrement les modèles Apligraf (Organogenesis), ATS-2000 (CellSystems# Biotechnologie Vertrieb) ainsi que Skin 2TM (ZK1200-1300-2000 - Advanced Tissue Science).
Il existe par ailleurs des modèles dédiés à la thérapie tissulaire qui peuvent également faire l'objet de telles études. On peut citer les modèles Epidex TM (Modex Thérapeutiques), Epibase (Laboratoire Genévrier), Epicell TM (Genzyme), Autoderm TM et Transderm TM (Innogenetics).
Avantageusement, la méthode d'identification met en oeuvre un modèle de peau reconstruite, de préférence au moins un modèle d'épiderme comprenant des kératinocytes.
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Avantageusement, la méthode comprend une étape d'analyse de l'expression d'une séquence au moins de la protéine élastine et/ou tropoélastine, ou d'une séquence de nucléotides codant la protéine élastine, notamment pour détecter une éventuelle stimulation de l'expression de la protéine élastine lorsque ladite substance active est en contact avec lesdites cellules vivantes.
Avantageusement, la méthode comprend une étape d'immuno-détection de l'expression de la protéine LOXL, notamment dans le but d'effectuer la traçabilité de la néo-élastogenèse, notamment dans les tissus épithéliaux et/ou dans les tissus conjonctifs, lesdits tissus étant issus d'au moins un modèle de peau reconstruite ou d'un modèle à base de biopsies.
Avantageusement, ladite substance active est choisie parmi le groupe consistant en l'aneth, la groseille, la cardamone, le radis noir, le petit houx, la cannelle, les fermentations à base de bactéries lactiques, l'avoine, la pomme de terre, la soie, la gomme asae foetida, l'hexénoate d'éthyle et ses dérivés, le butyrate de méthyle et ses dérivés, et le décadiènoate d'éthyle et ses dérivés.
Selon un septième aspect, l'invention concerne une méthode de localisation de l'expression de LOXL dans des tissus dans le but d'effectuer la traçabilité de la néo-élastogenèse, notamment dans des tissus conjonctifs, lesdits tissus étant issus d'au moins un modèle de peau reconstruite ou de biopsies, caractérisée en ce que la méthode comprend une étape d'immunodétection de la protéine LOXL ou d'hybridation in situ d'au moins une partie d'une séquence de nucléotides codant LOXL.
L'invention concerne également une méthode de localisation de l'expression de LOXL dans des tissus dans le but d'effectuer la traçabilité de la néo-élastogenèse, notamment dans des tissus épithéliaux et/ou dans des tissus conjonctifs, caractérisée en ce que la méthode comprend une étape
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d'immunodétection de la protéine LOXL ou d'hybridation in situ du gène codant LOXL.
L'invention concerne également l'utilisation d'un principe actif modifiant l'activité enzymatique ou l'expression de la protéine LOXL pour stimuler la formation de fibres élastiques.
L'invention concerne également une méthode de traitement d'une déficience associée avec l'activité enzymatique de Ilsoforme de la protéine lysyl oxydase LOXL comprenant l'administration à un sujet d'une quantité thérapeutiquement efficace d'une composition comprenant la protéine lysyl oxydase LOXL, ou une forme dérivée, ou un composé stimulant l'activité enzymatique ou l'expression de la protéine lysyl oxydase LOXL.
Avantageusement cette méthode de traitement permet d'effectuer un traitement choisi parmi la lutte contre le relâchement des tissus, notamment lorsque le relâchement des tissus est observé au cours du vieillissement ou au cours des expositions solaires, la densification de la matrice extracellulaire, le raffermissement des tissus sous-cutanés, la réduction des rides cutanées, les effets anti-rides, l'amélioration de la qualité du tissu cicatriciel et de l'aspect des cicatrices, notamment des cicatrices dystrophiques, en particulier dystrophiques, et kéloïdes, et la lutte contre les vergetures.
Description détaillée de l'invention :
Les inventeurs ont mis en évidence de façon inattendue que l'activité de LOXL était un chaînon principal manquant dans l'élastogenèse chez l'adulte et qu'il était possible de réactiver la synthèse de cette isoforme de la lysyl oxydase afin d'obtenir un effet stimulant sur l'élastogenèse.
Les inventeurs ont mis en évidence de façon inattendue que l'activité de LOXL était un chaînon principal manquant dans l'élastogenèse chez l'adulte et qu'il était possible de réactiver la synthèse de cette isoforme de la lysyl oxydase afin d'obtenir un effet stimulant sur l'élastogenèse.
En effet, les inventeurs ont mis en évidence que cette isoforme de la famille des lysyl oxydases (LO) est associée à l'élastogenèse dans un modèle de peau reconstruite produisant des fibres élastiques. En recherchant si cette isoforme était présente ou absente dans la peau à différents âges et lors des
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remaniements cutanés, les inventeurs ont constaté la présence ou l'absence simultanée de cette isoforme et de l'élastogenèse, permettant d'indiquer que l'activité de cette isoforme de LO correspond à un chaînon manquant dont il faut moduler la synthèse pour orchestrer une élastogenèse fonctionnelle.
Les inventeurs ont alors mis au point un modèle permettant de visualiser des expressions accrues de cette isoforme de LO (LOXL), puis ont recherché des actifs, notamment parmi des extraits végétaux ou des molécules chimiques, stimulant en particulier l'expression des ARNm codant LOXL. Les actifs sélectionnés ont été ensuite incorporés dans des formulations cosmétiques, dermo-pharmaceutiques et pharmaceutiques, en particulier, pour des applications dans la lutte contre le relâchement des tissus au cours du vieillissement, ainsi que dans l'amélioration de la qualité du tissu cicatriciel et de l'aspect des cicatrices et des vergetures.
Les inventeurs ont développé des anticorps spécifiques des formes matures de LOXL (voir les exemples 1 et 2), et ont mis en évidence de cette manière que l'absence de cette isoforme lysyl oxydase est corrélée aux troubles de la synthèse de fibres élastiques fonctionnelles notamment lors du vieillissement des tissus cutanés, qu'ils soient naturels ou induits par le rayonnement solaire.
Les isoformes LOXL2, LOXL3 et LOXL4 ne sont pas ou peu exprimées dans le derme et ne sont pas impliquées dans l'élastogenèse (voir exemple 4).
L'isoforme LOX est présente dans le derme et peut être associée aux microfibrilles, mais LOX est impliquée dans la formation des fibres de collagène fonctionnelles et n'est pas manquante dans les peaux adultes. L'absence de LOX n'est donc pas corrélée à la perte d'élasticité des fibres élastiques au cours du vieillissement (voir exemple 3).
Cette mise en évidence du rôle de LOXL dans l'élastogenèse a été cruciale pour la réalisation de la présente invention (voir exemple 5).
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L'association entre LOXL et les fibres élastiques ou les microfibrilles a été clairement démontrée par microscopie électronique lors de la réalisation de la présente invention. LOXL associée aux microfibrilles constitue la trame sur laquelle se dépose l'élastine.
LOXL est l'enzyme responsable de la maturation de l'élastine par réticulation et permet donc la formation de fibres élastique fonctionnelles.
Dans le cadre de la présente invention, les inventeurs ont mis en #uvre une méthode de localisation de l'expression de LOXL.
Notamment, cette méthode de localisation comprend l'immunodétection de LOXL. Par cette méthode on peut également mettre en évidence l'expression de la protéine élastine. De par les études des inventeurs, il a été mis en évidence que LOXL est détectée en association avec les dépôts denses ou sur les microfibrilles, mais pas avec les fibres de collagène. L'élastine a été détectée dans les mêmes dépôts denses et dans les microfibrilles. Cette détection s'est effectuée sur des modèles de peau reconstruite, et notamment sur des modèles de peau reconstruite 30 jours après l'application des kératinocytes (voir exemple 5).
L'association de LOXL aux microfibrilles et aux fibres élastiques a été également confirmée dans la peau de prépuce, notamment par microscopie électronique à transmission après immunodétection.
LOXL est exprimée dans le derme de peau de prépuce prélevé chez de jeunes patients (quelques mois) présentant encore une synthèse forte d'élastine. Mais LOXL n'est pas exprimée au niveau du derme de la peau du cou, du sein, de l'abdomen ou du visage de personnes adultes. Cette absence de détection de LOXL dans le derme de la peau, du cou, du sein, de l'abdomen, ou du visage, est confirmée chez l'adulte quel que soit l'âge. Il a été également observé une forte expression de LOXL au niveau de l'épiderme de peau humaine, cependant avec une extinction de l'expression de cette
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enzyme lorsque les peaux humaines sont issues de sujets âgés d'environ 80 ans et plus (voir exemple 6).
Concernant les cicatrices, LOXL n'a pas été observée dans le derme de ces zones, ni trois mois après la cicatrice, ni cinq ans après la formation de la cicatrice.
Dans ce cadre, il faut noter que l'élastine qui était présente à trois mois, n'est plus présente sur cette zone cicatricielle cinq ans après la formation de la cicatrice.
Les inventeurs ont ainsi mis en évidence le rôle de LOXL dans la formation des fibres élastiques, notamment en utilisant des modèles de peau reconstruite ou des dermes de prépuce de jeunes patients.
Les inventeurs ont mis également en évidence le déficit d'expression de LOXL dans les zones cicatricielles, ainsi que au niveau du derme de la peau humaine à différents âges, donc au cours du vieillissement.
Parmi les isoformes des lysyl oxydases, LOXL, est l'une des isoformes permettant la réticulation des fibres élastiques. Cependant, seule cette isoforme, LOXL, est manquante chez l'adulte pour la réticulation des fibres élastiques permettant d'obtenir des fibres fonctionnelles.
A partir de ces découvertes inattendues, les inventeurs ont réalisé une méthode d'identification de principe actif stimulant la formation de fibres élastiques fonctionnelles, dans le but d'identifier des principes actifs pour réaliser des compositions cosmétiques ou pharmaceutiques.
La présente invention concerne encore l'activation du promoteur du gène humain codant LOXL (voir exemple 7).
Différentes zones d'activités de ce promoteur ont été mises en évidence.
La séquence de ce promoteur est donnée en annexe et est désignée dans la suite du texte par PrhLOXL.
Sur ce promoteur, la région correspond aux nucléotides -712/-391 (selon la numérotation définie à partir du +1 de traduction du gène hLOXL)
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présente une activité régulatrice positive sur le gène rapporteur luciférase, exprimée par exemple après transfection transitoire dans des fibroblastes de peau de prépuce humain.
Les inventeurs ont pu définir des sites putatifs de régulation par des facteurs nucléaires. Ces facteurs ont été corrélés à des cytokines ou autres facteurs connus pour agir sur la transcription de certains gènes.
Différentes régions de PrhLOXL ont pu être identifiées comme étant des zones activatrices ou inhibitrices.
Notamment les régions-2172/-2002 ; -1438/-968 ; -712/-391 ont été repérées comme étant des régions activatrices ; etles régions -2002/-1438 ; - 968/-712 ont été identifiées comme étant des régions inhibitrices. La région - 80/-1 n'est pas active et se situe en aval du +1 de transcription. Dans cette numérotation, le +1 de transcription putatif se situe en position-342 par rapport au site d'initiation de la traduction. De cette façon il a été mis en évidence plusieurs sites de ces régions susceptibles de réguler le gène hLOXL.
Ces sites sont notamment deux sites putatifs de réponse à l'acide rétinoïque, deux sites putatifs de réponse au TGF-ss (Transforming Growth Factor ss), un site putatif de réponse à l'EGF (Epidermal Growth factor), trois sites putatifs de réponse aux oestrogènes et deux sites putatifs de réponse aux glucocorticoïdes (GRE).
Ceci implique que les principes actifs stimulant la néosynthèse et/ou l'activité de hLOXL et donc ainsi stimulant la formation de fibres élastiques agissent sur le promoteur du gène hLOXL, et notamment dans ces zones soit de façon directe, soit de façon indirecte en modulant l'expression d'une protéine se fixant sur ces sites. Une substance pourra donc être considérée active lorsqu'elle comportera une région capable soit de s'associer avec au moins une partie de la séquence de nucléotides de PrhLOXL, et en particulier de s'associer avec les sites putatifs définis précédemment, soit de moduler l'expression d'une protéine capable de le faire.
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L'ensemble des études des inventeurs ont permis de mettre au point une méthode d'identification de principe actif stimulant la formation de fibres élastiques.
Dans le cadre de la présente invention, les inventeurs ont mis en oeuvre une hybridation in situ permettant ainsi de localiser et de vérifier la présence de l'expression des ARN messagers codant LOXL en particulier. Cette hybridation in situ est notamment effectuée par des sondes d'ADN double brins marquées à la digoxigénine sur des sections de modèles de peau reconstruite obtenues 30 jours après l'ajout des kératinocytes, et inclues en paraffine. Cette hybridation in situ a été effectuée également pour vérifier l'expression des ARN messagers de la tropoélastine et du collagène al(I) (voir exemple 8).
L'expression des ARNm de LOXL est positive dans le derme profond et à travers tout l'épiderme. L'expression de l'ARNm de la tropoélastine est localisée près des fibroblastes dermiques et dans l'épiderme. L'expression de l'ARNm du collagène I[alpha]1 est localisée dans le derme mais pas dans l'épiderme. Ceci permet, dans le cadre de la présente invention, de localiser et de vérifier la présence de l'expression des ARNm de LOXL notamment dans un modèle de peau reconstruite, par exemple après application d'un principe actif stimulant la formation de fibres élastiques fonctionnelles.
Dans le cadre de la présente invention, le gène hLOXL a été activé par l'addition de kératinocytes dans un modèle de peau reconstruite, et notamment dans le modèle de peau reconstruite Mimeskin@, (Coletica, Lyon, France). L'induction de la synthèse des ARNm de LOXL est concomitante notamment à celle de la tropoélastine, et notamment apparaît environ 6 jours après l'addition de kératinocytes sur le derme équivalent.
La présente invention a permis également de mettre en évidence la baisse du niveau d'expression du gène hLOXL notamment, ainsi que du gène humain de l'élastine, dans des fibroblastes issus de donneurs âgés.
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Pour cela, les inventeurs ont utilisé 5 souches de fibroblastes de prépuce (FP) (issues de jeunes enfants) et 6 souches de fibroblastes adultes (FA, dont 3 sujets de 20 ans en moyenne et 3 sujets de 60 ans en moyenne) issues de chirurgie plastique au niveau de l'abdomen. L'expression du gène codant la protéine LOX a également été testée (voir exemple 9).
L'expression de ces 3 gènes d'intérêt ainsi que de l'actine a été analysée par RT-PCR en temps réel. L'invention n'est pas limitée à ce type d'analyse.
Cette technique permet de quantifier précisément l'expression d'un gène en la rapportant à celle de l'actine qui est considérée comme constante. On peut donc quantifier la régulation du niveau d'expression de ce gène.
Les résultats présentés dans la figure 12 montrent tout d'abord que la synthèse d'ARNm de LOXL chute de façon spectaculaire et statistiquement significative dans les fibroblastes d'adultes avec une baisse de près de 70% par rapport aux fibroblastes de prépuce, tandis que l'ARNm de l'élastine ne varie pas de façon significative en fonction de l'âge. Cette donnée est en accord avec la littérature sur l'élastine puisque si le tissu élastique se détériore et n'est pas remplacé, cela ne semble pas dû à une inhibition de l'activité du gène de l'élastine.
La synthèse d'ARNm LOX diminue en moyenne de 40% dans les FA par rapport aux FP, mais cette enzyme étant toujours exprimée dans la peau normale humaine, cette variation est peu significative des phénomènes in vivo.
Il est avantageux de stimuler également l'expression de l'élastine afin de stimuler d'autant plus la formation de fibres élastiques.
La présente invention fournit une méthode permettant d'identifier l'expression de LOXL, notamment dans des fibroblastes.
La présente invention a visé à mettre en #uvre ces différentes techniques de manière à identifier des principes actifs stimulant la formation de fibres élastiques.
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De manière générale les méthodes de la présente invention mettent en #uvre la recherche de l'expression de la protéine LOXL, et notamment la recherche de l'expression des ARN messagers codant LOXL (voir exemple 10).
L'invention concerne également les principes actifs stimulant la formation de fibres élastiques (voir exemples 11 et 12).
L'invention concerne également l'utilisation de l'enzyme LOXL, ou d'une forme dérivée, ou des principes actifs tels que décrits précédemment pour la réalisation de compositions cosmétiques ou pharmaceutiques (voir exemples 13 à 18). La stimulation de LOXL peut être effectuée au niveau du gène, de l'ARN messager, ou de la protéine directement. Cette activation permet la formation de fibres élastiques, notamment grâce à la réticulation de l'élastine par l'enzyme LOXL.
D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à l'homme de l'art suite à la lecture de la description explicative qui fait référence aux exemples suivants.
Les exemples font partie intégrante de la présente invention et toute caractéristique apparaissant nouvelle par rapport à un état de la technique antérieure quelconque à partir de la description prise dans son ensemble, incluant les exemples, fait partie intégrante de l'invention dans sa fonction et dans sa généralité.
Ainsi, chaque exemple a une portée générale.
D'autre part, dans les exemples, tous les pourcentages sont donnés en poids, sauf indication contraire, la température est exprimée en degré Celsius sauf indication contraire, et la pression est la pression atmosphérique, sauf indication contraire.
Exemples :
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Exemple 1
L'invention a d'abord porté sur le développement de nouveaux anticorps spécifiques de LOX et LOXL mais capables de détecter leurs formes matures. Les anticorps ont été développés contre les régions matures de LOX et LOXL. Les régions antigéniques ont été choisies pour présenter le minimum de similarité avec les régions correspondantes sur les autres isoformes des lysyl oxydases (LO). Les anticorps obtenus contre la région des peptides LOXV228-S280 ont été appelés anti-LOXmat et similairement pour les anticorps obtenus contre la région des peptides LOXLR231-G368 appelés anti-LOXLpro.
L'invention a d'abord porté sur le développement de nouveaux anticorps spécifiques de LOX et LOXL mais capables de détecter leurs formes matures. Les anticorps ont été développés contre les régions matures de LOX et LOXL. Les régions antigéniques ont été choisies pour présenter le minimum de similarité avec les régions correspondantes sur les autres isoformes des lysyl oxydases (LO). Les anticorps obtenus contre la région des peptides LOXV228-S280 ont été appelés anti-LOXmat et similairement pour les anticorps obtenus contre la région des peptides LOXLR231-G368 appelés anti-LOXLpro.
Sur la figure 1 : description des séquences des LO définies pour faire les anticorps spécifiques. Cette figure représente les étapes qui ont conduit au choix des régions antigéniques pour développer les anticorps antiLOX et anti-LOXL.
Figure 1 (A) : Représentation schématique de hLOX (protéine LOX humaine) et hLOXL (protéine LOXL humaine).
Les séquences d'hLOX et hLOXL sont indiquées avec des boîtes ouvertes, pointillées dans les régions C-terminales pour mettre en valeur les régions de haute similarité. La position de la coupure de la pré-région et du site de coupure par procollagène-C-protéinase (PCP), sur les résidus A22 et D169 de hLOX respectivement, a été indiquée. La position de la coupure de la pré-région de LOXL, avant le résidu Q26, du site de maturation N-Terminal du précurseur 56 kDa (avant Q135), et la position des sites de coupure par PCP du précurseur LOXL de 56 kDa (avant les résidus D338), sont indiquées. Les protéines LOXL correspondantes Q26-S574, D135-S574 et D338-S574 afficheraient une masse moléculaire déduite d'approximativement 63 kDa, 54,6 kDa et 26,7 kDa, respectivement. L'emplacement des peptides recombinants utilisés pour obtenir les anticorps anti-LOX ont été indiqués : le peptide G128 - L212 pour
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l'anti-LOXpro, le peptide V228 - S280 pour l'anti-LOXmat, et le peptide D305N373 pour l'anti-LOXcat. L'emplacement des peptides recombinants utilisés pour développer les anticorps anti-LOXL ont été indiqués : le peptide R231G368 pour l'anti-LOXLpro et S355 - D415 pour l'anti-LOXLmat.
Figure 1 (B) : Le pourcentage de similarité entre les régions antigéniques de LOX et LOXL avec leurs équivalents sur les isoformes LO a été indiqué dans ce tableau.
Dans le tableau de la figure 1 (B), hLOXL représente la protéine humaine LOXL, bLOXL représente la protéine bovine LOXL, mLOXL représente la protéine de souris LOXL, hLOX représente la protéine humaine LOX, bLOX représente la protéine bovine LOX, hLOXL2 représente la protéine humaine LOXL2, hLOXL3 représente la protéine humaine LOXL3, hLOXL4 représente la protéine humaine LOXL4.
La colonne longueur (aa) contient la valeur du nombre d'acides aminés contenus dans les régions correspondantes.
Pour obtenir les anticorps, les gènes chimériques ont été construits par l'insertion de la séquence définie de hLOXL ou hLOX en phase avec le gène de la glutathion-S-transferase (GST), dans les sites BamHI-XhoI du plasmide d'expression pGEX-4T-3 (Amersham Biosciences).
Le gène de fusion GST-LOXLS355-D415 a été construit en introduisant la séquence d'ADNc de HLOXL (cDNA hLOXL), produit par PCR avec les amorces sens 5'-TTGGATCCAGCGTAGGCAGCGTGTAC-3', (SEQ ID N 17) et antisens 5'AAACTCGAGCATCGTAGTCGGTGGC-3' (SEQ ID N 18).
Le gène de fusion GST-LOX G128-L212 a été construit en introduisant l'ADNc hLOX amplifié avec les amorces sens 5'-TCGGATCCGGCTACTCGACATCTAGAGCC-3' (SEQ ID N 18) et antisens 5'-GTCCTCGAGACCGTACTGGAAGTAGCC-3' (SEQ ID N 19), respectivement.
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Le gène de fusion GST-LOXV228-S279 a été construit en introduisant la séquence hLOX amplifiée avec les amorces sens 5'-TTGGATCCGTGCAGAAGATGTCCATGTAC-3' (SEQ ID N 20) et antisens 5'-TTTCTCGAGGCTGGGTAAGAAATCTGATG-3' (SEQ ID N 21), respectivement.
Le gène de fusion GST-LOXD306-N373 a été construit en introduisant l'ADNc hLOX amplifié avec les amorces sens 5'-CACTATGGATCCCTTGATGCCAACACCC-3' (SEQ ID N 22) et antisens 5'-CACGACCTTTAGGATATCGTTTCCAGG-3' (SEQ ID N 23), respectivement.
Pour l'ensemble de ces amplifications par PCR, la Taq polymerase High Fidelity (Roche Diagnostic, Meylan, France) a été utilisée.
Les protéines de fusion GST-LOX et GST-LOXL ainsi que les anticorps polyclonaux de lapin ont été obtenus et purifiés comme décrit précédemment pour les protéines de fusion issues de l'expression des gènes de fusion GSTLOXLS355-D415 et GST LOXG128-L212 (Decitre et al., Lab Invest78 : 143-151,1998 ; Borel et al., J. Biol. Chem, 276 : 48944-49,2001).
Pour les expériences d'adsorption, les anticorps ont été incubés 3 h à 20 C avec les protéines de fusion adsorbées elles-mêmes sur une membrane de nitrocellulose membrane Hybond-ECL (Amersham Biociences) avant l'immuno-détection.
Ces travaux ont d'abord permis de mettre en évidence les formes matures de LOX et LOXL, grâce à la caractérisation immuno-chimique et biochimique des protéines matures (voir exemple 2, figure 2). Les anticorps développés se démarquent de ceux utilisés dans l'art antérieur pour LOXL, qui ne permettent pas une reconnaissance de la forme mature de LOXL (Decitre et al., Lab Invest78 : 143-151, 1998 ; Borel et al., J. Biol. Chem, 276 : 48944-49, 2001). L'invention a été d'utiliser l'anticorps anti-LOXLmat et anti-LOXmat, ce qui a permis de mettre en évidence une protéine de 31 kDa, qui est reconnue par l'anti-LOXLmat mais pas par l'anti-LOXmat, et qui correspond à la forme mature de LOXL. Cette partie de l'invention démontre un réel progrès par
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rapport à l'art antérieur, notamment en référence au brevet de Csiszar et al, qui décrit toutes les protéines issues des gènes de la famille LO sans en définir les caractéristiques (brevet WO 01/83702 A2 : Novel members of the lysyl oxidase family of amine oxidases related applications).
Exempte 2 : Immuno-détection de LOX et LOXL de cellules musculaires grâce aux nouveaux anticorps anti LOX et anti-LOXL Sur la Figure 2 :
La Figure 2 représente des photographies des électrophorèses réalisées comme indiquées ci-après. Ces électrophorèses mettent en évidence la caractérisation des protéines matures de LOX et LOXL de cellules musculaires lisses (CML) grâce aux anticorps anti-LOX et anti-LOXL identifiés à l'exemple 1.
La Figure 2 représente des photographies des électrophorèses réalisées comme indiquées ci-après. Ces électrophorèses mettent en évidence la caractérisation des protéines matures de LOX et LOXL de cellules musculaires lisses (CML) grâce aux anticorps anti-LOX et anti-LOXL identifiés à l'exemple 1.
Les protéines de la couche cellulaire (L) et du milieu de culture cellulaire (M) d'une lignée de cellules de muscle lisse de rat (développée par Jean-Marie Daniel Lamazière, Bordeaux) ont été extraites et détectées par transfert de Western (western blotting) en utilisant les anticorps anti-LOXLmat, antiLOXmat, anti-LOXLpro et anti-LOXpro. Les cellules ont été cultivées à 37 C dans une atmosphère à 5% de C02 dans le milieu DMEM (Sigma) contenant 10% de sérum du veau foetal, 2 mM de glutamine et 50 pg/ml de gentamicine.
Les protéines des couches cellulaires, lavées deux fois avec du tampon PBS, ont été extraites 2 heures à 4 C avec agitation douce dans le tampon de lyse (16 mM tampon phosphate pH 8, 0,5% NP40, avec des inhibiteurs de protéases (Complète Mini, Roche Diagnostic, Meylan, France) et urée 6 M). Les lysats ont été dilués avec deux volumes de tampon 16 mM phosphate pH 8, avec des inhibiteurs de protéases (Complète Mini, Roche Diagnostic, Meylan, France), et centrifugés 5 min à 15 000 g. Les protéines solubles ont été
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précipitées par l'addition d'acide trichloroacétique (TCA) à 10% avant l'électrophorèse.
Les protéines des milieux de culture de cellules cultivées 48h sans sérum sont récupérées, précipitées par l'addition de TCA à 10% ou de sulfate de l'ammonium à 50% de saturation.
Pour l'immuno-détection, les protéines sont séparées par électrophorèse sur gel SDS-polyacrylamide 10%. Les protéines ont été transférées sur une membrane en fluorure de polyvinylidène (PVDF) (Immobilon PSQ, Millipore) et immuno-détectées comme décrit précédemment (Borel et al, 2001).
Les anticorps développés permettent donc de caractériser et de localiser les formes matures et immatures de LOX et LOXL dans les tissus biologiques.
Exemple 3 : Mise en évidence du rôle de LOX et LOXL dans l'élastogenèse
Les inventeurs ont mis en évidence que les protéines LOX et LOXL peuvent être associées à la formation du tissu conjonctif dans le derme de modèles de peaux reconstruites par immuno-histochimie (fig 3). Cette démonstration a été obtenue sans ambiguïté grâce à l'utilisation des couples d'anticorps anti-LOX et anti-LOXL, dirigés contre les régions pro-enzymatiques et matures des 2 enzymes (LOX et LOXL).
Les inventeurs ont mis en évidence que les protéines LOX et LOXL peuvent être associées à la formation du tissu conjonctif dans le derme de modèles de peaux reconstruites par immuno-histochimie (fig 3). Cette démonstration a été obtenue sans ambiguïté grâce à l'utilisation des couples d'anticorps anti-LOX et anti-LOXL, dirigés contre les régions pro-enzymatiques et matures des 2 enzymes (LOX et LOXL).
Sur la Figure 3 : Il est représenté la détection immuno-histochimique de LOXL et LOX dans la peau reconstruite (PR) et la peau humaine normale.
L'immuno-détection de LOXL (A, C, E, G) sur la peau reconstruite aux jours 16 (A), 35 (C), et 45 (E), en utilisant l'anti-LOXL R231-G368 (A, C, E) ou l'anti-LOXLR231-G368 adsorbé avec le peptide GST-LOXLR231-G368 correspondant avant l'immuno-detection (G). L'immuno-detection de LOX (B, D, F, H) aux jours 16 (B), 35 (D), et 45 (F), en utilisant l'anti-LOXV228-S279 (B, D, F) ou l'anti-
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LOXV228-S279 adsorbé avec le peptide GST-LOXV228-S279 correspondant avant l'immuno-détection (H). L'immunodétection de LOXL (I) et de LOX (J) dans la peau de prépuce humain est réalisée en utilisant l'anti-LOXL R231-G368 (I) et l'anti-LOXV228-S279 (J). La position de la jonction dermo-épidermique est indiquée avec une flèche ouverte, celle du substrat dermique avec une flèche, et la localisation des kératinocytes au jour 16 est indiquée avec une tête de flèche.
La peau reconstruite (Mimeskin, Coletica, Lyon, France) a été préparée dans le fixateur de Bouin (LOX, LOXL, élastine) ou dans une solution de formol à 10% (pour l'élastine) puis incluse en paraffine. Des sections de 6 um d'épaisseur ont été déparaffinées et blanchies en glycine-HCI (100 mmol/l).
Les anticorps anti-LOX et anti-LOXL ont été décrits ci-dessus.
Les anticorps ont été utilisés à la dilution suivante : 1 :500 (antiLOXLR231-G368), 1:100 (anti-LOX V228-S279 , anti-LOXLS355-D416). Les complexes immuns sont détectés avec un anti IgG de lapin (chèvre) conjugué à la peroxydase (DAKO, Trappes, France), en utilisant la diaminobenzidine comme substrat (DAKO).
LOXL est donc un excellent candidat pour participer à l'élastogenèse dans un modèle de peau reconstruite tel que notamment Mimeskin.
Exemple 4 : Mise en évidence du rôle de LOXL2, LOXL3, et LOXL4 dans l'élastoaenèse
L'invention a aussi porté sur le développement de 2 nouveaux anticorps anti-LOXL2, un de ces anticorps reconnaissant aussi, théoriquement, LOXL3 et LOXL4. Ceci a permis de définir si ces enzymes sont exprimées avec l'élastine dans le derme d'un modèle de peau reconstruite. En fait, l'analyse par immuno-histochimie en utilisant les 2 anticorps anti-LOXL2 montrent que cet antigène, ainsi que les 2 protéines antigèniquement reliées LOXL3 et LOXL4,
L'invention a aussi porté sur le développement de 2 nouveaux anticorps anti-LOXL2, un de ces anticorps reconnaissant aussi, théoriquement, LOXL3 et LOXL4. Ceci a permis de définir si ces enzymes sont exprimées avec l'élastine dans le derme d'un modèle de peau reconstruite. En fait, l'analyse par immuno-histochimie en utilisant les 2 anticorps anti-LOXL2 montrent que cet antigène, ainsi que les 2 protéines antigèniquement reliées LOXL3 et LOXL4,
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ne sont pas ou peu exprimées dans le derme, et qu'elles ne participent donc pas à l'élastogenèse.
Sur la Figure 4 : il est représenté l'immuno-détection sur des sections de peaux reconstruites (16,35 et 45 jours) et de peaux de prépuce humain avec l'anticorps anti-LOXL2517-581 (colonne de gauche) et l'anticorps anti- LOXL2664- 720 reconnaissant théoriquement LOXL2, LOXL3 et LOXL4 (colonne de droite).
Les anticorps anti-LOXL2 ont été obtenus contre des peptides de fusion GST-LOXL2, comme décrit précédemment (Decitre et al., Lab. Invest. 78,143- 151,1998). Le gène de fusion GST-LOXL2 517-581 a été construit en introduisant la séquence 1543 à 1747 du gène humain de LOXL2 (hLOXL2) dans le plasmide décrit précédemment.
Ce segment a été généré par PCR avec les amorces sens 5GAGCTGGGATCCGCGCACTGCC-3' et antisens 5'-GGCTGAGTCGACGAGG CAGTTCTCC-3'.
Le gène de fusion GST-LOXL2 664-720 a été construit en introduisant la séquence hLOXL2 correspondante, grâce aux amorces sens 5'CACAGGATCCGAAGGAGACATCCAGAAG-3' et antisens 5'TTTCTGAGCTCCTGCATTTCATGATG-3'.
Les protéines de fusion et les anticorps anti-lapin générés contre ces protéines ont été préparés comme décrit précédemment. L'anticorps contre le peptide 517-580 a été appelé anti-LOXL2, car cette région est spécifique de LOXL2.
L'anticorps contre le peptide 664-734 a été appelé anti-LOXL-R (pour "relatif à"), car cette région de LOXL2 présente une forte similarité avec LOXL3 et LOXL4 (environ 74,6% et 60,5%, respectivement).
Les peaux reconstruites (Mimeskin, Coletica, Lyon France) à 16 jours (PR-J16), 35 jours (PR-J35) et 45 jours (PR-J45), et la peau de prépuce humain sont analysées comme précédemment par immuno-histochimie avec
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les anticorps anti-LOXL2-R et anti-LOXL2. L'anti-LOXL2 met en évidence une expression de LOXL2 dans l'épiderme, et non dans le derme. Alors que l'anticorps dirigé contre la région commune C-terminale de LOXL2, LOXL3 et LOXL4, confirme l'expression de ces enzymes dans l'épiderme et met en évidence une faible expression dans le derme mais dans une zone qui ne correspond pas aux sites d'élastogenèse.
LOXL2, LOXL3 et LOXL4 ne sont donc pas impliquées dans l'élastogenèse.
Exemple 5 : Mise en évidence du rôle de LOXL dans l'élastogenèse
L'association entre LOXL ou LOX d'une part, et les fibres élastiques ou les microfibrilles d'autre part, a été clairement démontrée en microscopie électronique à transmission par la présente invention.
L'association entre LOXL ou LOX d'une part, et les fibres élastiques ou les microfibrilles d'autre part, a été clairement démontrée en microscopie électronique à transmission par la présente invention.
LOX et LOXL associées aux microfibrilles constituent la trame sur laquelle se dépose l'élastine, tandis que seule LOX est associée à la formation des fibres de collagène (voir figure 5).
Sur la figure 5 : il est représenté l'immuno-détection de LOXL, de LOX et de l'élastine par microscopie électronique à transmission dans la partie dermique de la peau reconstruite 30 jours après l'application des kératinocytes, et de la peau humaine normale.
Les tissus ont été fixés pendant 3h à 4 C avec 4% de paraformaldéhyde dans du tampon PBS qui contient 0,1% de glutaraldéhyde, puis lavés dans du tampon phosphate qui contient 0,4M de saccharose cacodylate et de lysine à 0,2M, déshydratés dans les solutions d'éthanol, et inclus dans du LR White (Euromedex, France). La détection a été effectuée avec les anticorps primaires dilués au 1 :50 tampon Tris-HCI à pH 8,2, additionnés de 1% de d'albumine sérique bovine. Les complexes immuns sont détectés avec un anticorps antiIgG de lapin conjugué à des particules d'or colloïdal de 10 et 20 nm (Biocell,
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Tebu, France) dilué au 1 :40. Leséchantillons ont été contrastés avec 3% d'acétate d'uranyle aqueux et de citrate de plomb, puis examinés sur un microscope électronique à transmission JEOL 1200 EX. L'immuno-détection a été réalisée sur la peau reconstruite (A-D) et sur la peau de prépuce humain (F-I).
Sur la peau reconstruite, elle a été réalisée avec les anticorps anti-LOXL (A, B), anti-LOX (C), anti-élastine (Eln) (D), les anticorps anti-élastine humaine étant commercialement disponibles (Sigma, USA) et dilués au 1 :50, un contrôle négatif sans anticorps primaire dans le derme (control) (E). Sur la peau de prépuce humain un double marquage a été réalisé (F-I).
Références A-D : Immuno-détection de LOXL, LOX et de l'élastine par microscopie électronique dans la partie dermique de peaux reconstruites à 45 jours.
Référence E : positif avec l'anticorps anti-élastine et anti-collagène I dans le derme de peaux reconstruites à 45 jours soit 30 jours après l'ajout de kératinocytes.
Références F et I : Double immuno-détection de LOXL, LOX, élastine et collagène par microscopie électronique dans la partie dermique de prépuce humain.
Références G-H : Double marquage dans la partie dermique du prépuce humain avec l'anticorps de lapin anti-LOXL (l'anti-IgG de lapin est conjugué avec des particules d'or de 10 nm) et l'anticorps murin anti-élastine (l'anti-IgG de souris est conjugué avec des particules d'or de 20 nm).
Légendes de la figure : m : microfibrilles, c : fibres de collagène, e : élastine amorphe. Barre de l'échelle : 500 nm.
LOXL (A-B) est détectée en association avec les dépôts denses ou sur les microfibrilles, mais pas avec les fibres de collagène qui paraissent en blanc sur ces sections. Le marquage de LOX (C) est faible, pourtant quelques particules
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d'or pourraient être trouvées avec les dépôts denses, les microfibrilles et le collagène. Les anticorps anti-élastine ont détecté les mêmes dépôts denses et les microfibrilles (D). L'association de LOXL et LOX aux microfibrilles et aux fibres élastiques a été confirmée au niveau de la peau de prépuce humain, par microscopie électronique après immuno-détection (G-H). Comme dans les observations sur les modèles de peaux reconstruites, LOXL n'est pas associée aux fibres de collagène, à l'inverse de LOX qui est très présente avec les fibres de collagène et peu présente sur les microfibrilles. Les antigènes LOXL ont été détectés en association avec les microfibrilles et autour des fibres élastiques de la peau de prépuce humain. LOXL n'est pas associée à l'élastine amorphe qui s'étend autour des microfibrilles, mais est observée principalement à leur périphérie, et pas avec les fibres de collagène.
LOXL est associée aux fibres élastiques dans les modèles de peaux reconstruites et dans la peau de prépuce humain.
Exempte 6 : Mise en évidence de la relation entre l'expression de LOXL et l'élastoaenèse
LOXL et LOX sont exprimées dans le derme de peau de prépuce prélevée chez de jeunes patients (quelques mois) présentant encore une synthèse forte d'élastine. Mais LOXL n'est pas exprimé au niveau du derme de la peau d'adulte, au niveau du cou, du sein, de l'abdomen ou du visage, tandis que LOX est toujours exprimée dans le derme (figure 6).
LOXL et LOX sont exprimées dans le derme de peau de prépuce prélevée chez de jeunes patients (quelques mois) présentant encore une synthèse forte d'élastine. Mais LOXL n'est pas exprimé au niveau du derme de la peau d'adulte, au niveau du cou, du sein, de l'abdomen ou du visage, tandis que LOX est toujours exprimée dans le derme (figure 6).
Sur la Figure 6 : il est représenté l'immuno-détection de LOX et LOXL dans une peau humaine.
Les anticorps anti-LOX (A, C, E, G) et anti-LOXL (B, D, F, H) ont été utilisés pour détecter l'expression de LOX et LOXL dans des échantillons de peau de prépuce (A, B), de cou (C, D), de sein (E, F) et d'abdomen (G, H) provenant de la banque de tissus de l'hôpital Edouard Herriot, Lyon, France.
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Les tissus ont été fixés au réactif de Bouin, inclus en paraffine, et traités pour l'immuno-déctection comme il a été effectué pour les immuno-détections décrites précédemment.
L'absence de détection de LOXL dans le derme de la peau du cou, du sein, de l'abdomen ou du visage, est confirmée chez l'enfant et l'adulte (Figure 7 : Sur la Figure 7 : il est représenté l'immuno-détection de LOX et LOXL dans des peaux d'abdomen humain prélevées à différents âges.
Les anticorps anti-LOX (A, C, E, G) et anti-LOXL (B, D, F, H) ont été utilisés pour détecter l'expression de LOX et LOXL dans des échantillons de peau d'abdomen prélevés à 1,5 ans (A, B), 35 ans (C, D), 60 ans (E, F) et 91 ans (G, H) provenant de la banque de tissus de l'hôpital Edouard Herriot. Les tissus ont été fixés au réactif de Bouin, inclus en paraffine, et traités pour l'immuno-déctection comme décrit pour les immuno-détections précédentes.
Au cours des mêmes travaux, il a été observé une expression forte de LOX et LOXL au niveau de l'épiderme de peau humaine, avec une extinction de l'expression de ces 2 enzymes très tardivement (91 ans) (Figure 7).
Dans les cicatrices, ni LOXL ni LOX n'ont pu être observées dans les zones cicatricielles, 3 mois après la cicatrice et 5 ans après la cicatrice. Il faut noter que l'élastine était immuno-détectée à 3 mois et disparaissait à 5 ans dans cette cicatrice (figure 8).
Sur la Figure 8 : II est représenté l'immuno-détection de LOX et LOXL dans des peaux cicatricielles à différentes périodes après la cicatrisation.
Les anticorps anti-LOX (A, D, G), anti-élastine (B, E, H) et anti-LOXL (C, F, I) ont été utilisés pour détecter l'expression de LOX de l'élastine et de LOXL dans des échantillons de peau de cou d'une patiente de 17 ans, autour de la cicatrice (zone "normale", A-C), 3 mois (D-F) ou 5 ans (G-H) après une
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cicatrisation. Les tissus ont été fixés au réactif de Bouin, inclus en paraffine, et traités pour l'immuno-détection comme cela a été décrit pour les immunodétections précédentes. Le marquage d'élastine exige un démasquage à l'aide de 0,2% de hyaluronidase (Sigma).
Grâce à ces exemples, l'invention démontre qu'il existe (i) une implication indéniable de LOXL lors la formation des fibres élastiques dans les modèle de peaux reconstruites et dans le derme de prépuces de jeunes patients et (ii) un véritable déficit d'expression de LOXL dans le derme de la peau humaine à différents âges et dans les cicatrices. LOXL est donc bien la seule isoforme lysyl oxydase capable, d'une part, de permettre la réticulation des fibres élastiques fonctionnelles et, d'autre part, d'être manquante dans la situation où une réticulation des fibres élastiques est nécessaire pour produire des fibres fonctionnelles. LOX, qui pourrait aussi être associée à la formation de fibres élastiques, n'est pas manquante dans les peaux des adultes.
Exemple 7 : Etude de la régulation pré-transcriptionelle du gène LOXL
L'invention a permis de démontrer ensuite que le gène humain de LOXL (hLOXL) peut être activé au niveau de son promoteur (figure 9). La séquence ID N 3 décrit les nucléotides allant de-2730 à-1 de la séquence de ce promoteur. Plusieurs zones d'activité du promoteur hLOXL ont été mises en évidence. Notamment, la région correspondant aux nucléotides -712/-391 (selon la numérotation définie à partir du +1 de traduction du gène LOXL) présente une activité régulatrice positive sur le gène rapporteur luciférase, exprimé après transfection transitoire dans des fibroblastes de peau de prépuce humain (figure 9).
L'invention a permis de démontrer ensuite que le gène humain de LOXL (hLOXL) peut être activé au niveau de son promoteur (figure 9). La séquence ID N 3 décrit les nucléotides allant de-2730 à-1 de la séquence de ce promoteur. Plusieurs zones d'activité du promoteur hLOXL ont été mises en évidence. Notamment, la région correspondant aux nucléotides -712/-391 (selon la numérotation définie à partir du +1 de traduction du gène LOXL) présente une activité régulatrice positive sur le gène rapporteur luciférase, exprimé après transfection transitoire dans des fibroblastes de peau de prépuce humain (figure 9).
Il existe donc une régulation pré-transcriptionnelle positive du gène hLOXL, indiquant qu'il est possible d'activer la synthèse de ce gène, et donc de
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la protéine hLOXL correspondante puisque les inventeurs avaient démontré auparavant que les variations de l'expression de hLOXL peuvent être tracées concomitamment au niveau des gènes et/ou des protéines. Ceci avait aussi été démontré pour LOX (Decitre et al, Lab. Invest., 78, 143-151, 1998).
Une étude de la séquence nucléique PrLOXL à l'aide du logiciel Transfac sur Internet nous a permis de définir des sites putatifs de régulation par des facteurs nucléaires. Ces facteurs ont été corrélés à des cytokines ou autres effecteurs connus pour agir sur la transcription de certains gènes par la voie de ces facteurs de transcription. Les sites les plus intéressants sont présentés dans la figure 10. Ce schéma récapitule cette analyse et indique 2 sites putatifs de réponse à l'acide rétinoïque, 2 au TGF-(3, 1 à l'EGF, 3 aux #strogènes et 2 aux glucocorticoïdes. Nous avons ainsi pu définir plusieurs sites qui pourraient réguler la transcription du gène LOXL car ils étaient situés dans les zones régulatrices. Ce sont les éléments putatifs de réponse à l'acide rétinoïque, au TGF-ss, à l'EGF et aux glucocorticoïdes. Les zones correspondant à ces sites putatifs de régulation par l'acide rétinoïque et les #strogènes semblent avoir un réel effet activateur de la transcription, puisque l'activité du promoteur chute d'environ 50% et 60% respectivement sans ces éléments. Le site de régulation par le TGF- ss semble diminuer l'activité promotrice.
Les outils ainsi décrits sont utilisables pour le criblage de principes actifs ayant une action agoniste ou antagoniste au niveau du promoteur de hLOXL, et plus particulièrement au niveau des sites putatifs de régulation.
C'est ainsi qu'il est avantageux de rechercher des principes actifs comprenant une région s'hybridant avec au moins une partie de la séquence de nucléotides du promoteur de hLOXL, ou induisant des protéines effectrices ayant cette propriété.
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Analyse fonctionnelle du promoteur du gène hLOXL
Le promoteur du gène humain de LOXL (PrhLOXL) a été défini grâce aux séquences des banques de données. Le site d'initiation de la transcription étant inconnu, les inventeurs l'ont numéroté par rapport au +1 de traduction.
Le promoteur du gène humain de LOXL (PrhLOXL) a été défini grâce aux séquences des banques de données. Le site d'initiation de la transcription étant inconnu, les inventeurs l'ont numéroté par rapport au +1 de traduction.
Cependant, la recherche d'ADNc EST (Expressed Séquence Tags) correspondant à cette région n'a pas donné de séquence plus en amont de la position-342, ce qui permet de supposer que l'initiation de la transcription du gène de hLOXL se fait dans cette région (sans boîte TATA). Des amorces spécifiques ont été dessinées sur cette séquence en position-2172 et +189 (exon 1). Elles ont permis l'amplification et l'isolement du PrhLOXL à partir d'ADN génomique humain issu de fibroblastes de peau. Il a été cloné et séquence, sa séquence s'avérant conforme à celle prédite. Puis le promoteur dit "entier", allant de-2172 à-1, a pu être sous cloné dans le vecteur pGL3basic (Promega, Charbonnières, France) pour son étude dans des cellules eucaryotes. Il a été placé en amont d'un gène rapporteur, le gène de la luciférase. Ainsi la production de luciférase par les cellules transfectées est sous le contrôle du PrhLOXL et donc proportionnelle à son activité. Les cellules sont transfectées dans le même temps avec un promoteur exprimant de façon intense et reproductible la ss-galactosidase (ss-Gal) permettant de normaliser les résultats. Pour une même condition, les activités enzymatiques luciférase et ss-Gal sont mesurées.
Le PrhLOXL a été progressivement réduit (délétion 5') de façon à déterminer le rôle des régions retirées. Le but était d'étudier la régulation du PrhLOXL dans les fibroblastes de peau humaine, il a été mis au point la transfection de ces cellules. Contrairement aux lignées cellulaires qui se transfectent facilement, les fibroblastes normaux se transfectent très mal.
Superfect (Qiagen, Courtaboeuf, France) a été sélectionné car il permet la transfection d'environ 40% de fibroblastes en culture.
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Les constructions réalisées ainsi que leur activité dans les fibroblastes de prépuce sont présentées à la figure 9. Les inventeurs ont localisé trois grandes régions activatrices de la transcription et deux inhibitrices. Par exemple la région -712-391 est très activatrice puisque l'activité du promoteur chute considérablement lorsqu'elle est retirée (construction -391#-1). Cette étude a permis de préciser les zones à étudier pour stimuler la transcription du PrhLOXL.
Notamment, la figure 9 représente l'activité luciférase/ss-galactosidase en fonction de la séquence du promoteur PrhLOXL. Cette figure permet de faciliter la compréhension de la définition des régions activatrices et inhibitrices du promoteur au sein d'une cellule de fibroblaste humain de peau de prépuce.
Les réductions successives du PrhLOXL en 5' ont permis de générer 7 constructions, portant des séquences de plus en plus courtes du promoteur en amont du gène rapporteur luciférase : pLL-2172, pLL-2002, pLL-1438, pLL- 712,-pLL-391, -pLL-81. Les constructions ont été transfectées dans des fibroblastes de prépuce de peau humaine, et l'activité luciférase a été mesurée. Parallèlement, les cellules sont aussi transfectées avec un plasmide portant le gène de la ss-galactosidase, sous le contrôle du promoteur SV40, afin de servir de témoin d'efficacité de transfection. Les valeurs finales correspondent à l'activité luciférase (indiquant l'activité des séquences du promoteur hLOXL) rapportées à l'activité ss-galactosidase (témoignant de l'efficacité de transfection). L'évolution des activités permet de définir plusieurs zones de régulation sur le promoteur, dont 3 zones activatrices signalées par les signes + (-2172-2002 ; -1438-968 ; -712-391) et 2 zones inhibitrices signalées par les signes - (-2002-1438 ; -968-712). Le promoteur -81-1 n'est pas actif et se situe en aval du +1 de transcription. Le +1 de transcription putatif se situe en position-342 par rapport au site d'initiation de la traduction.
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La figure 10 représente une vue schématique du promoteur du gène hLOXL, et notamment identifie les sites putatifs de régulation de la transcription du gène hLOXL. Les zones indiquées par un signe "+" correspondent à une zone activatrice de l'expression du gène, celles représentées par un "-" correspondent à une zone inhibitrice de cette expression.
Exemple 8 : Mise en évidence de l'activation de LOXL par l'introduction de kératinocvtes dans un modèle de peaux reconstruites
La détection de l'expression du gène codant LOXL est mise en évidence par l'hybridation in situ de l'ARN messager de LOXL avec des sondes d'ADN double brins marquées à la digoxigénine, sur des sections inclues en paraffine.
La détection de l'expression du gène codant LOXL est mise en évidence par l'hybridation in situ de l'ARN messager de LOXL avec des sondes d'ADN double brins marquées à la digoxigénine, sur des sections inclues en paraffine.
Sur la figure 11 représentant des sections de modèle de peau (Mimeskin) au jour 35 : (A) L'expression de LOXL est positive dans le derme profond et à travers tout l'épiderme.
(B) L'expression de LOX est positive dans tout le derme et au niveau des couches suprabasales de l'épiderme.
(C) L'expression de tropoélastine (TE) est trouvée en association avec les fibroblastes dermiques et dans l'épiderme.
(D) L'expression du gène COL1A1 (collagène al (I)) est détectée dans le derme mais pas dans l'épiderme.
(E) Contrôle sans sonde.
La position de la JDE est indiquée par une flèche ouverte, la position du substrat dermique poreux est indiquée avec des flèches, et les cellules positives sont indiquées avec des têtes de flèches.
Les sondes d'ADN double brins sont produites par PCR. Les amorces suivantes ont été utilisées, respectivement :
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pour le gène du collagène I[alpha]1, sens 5'-GTGGAGAGTACTGGATTG-3' (SEQ ID N 14) et antisens 5'-TCGTGCAGCCATCGACAG-3' (SEQ ID N 15), pour la tropoélastine, sens 5'-GTATATACCCAGGTGGCGTG-3' (SEQ ID N 10) et antisens 5'-CGAACTTTGCTGCTGCTTTAG-3' (SEQ ID N 11); pour hLOX, sens 5'-GGTGGCCGACCCCTACTACATCC-3' (SEQ ID N 12) et antisens 5'GCAAATCGCCTCTGGTAGCCATAGTC-3' (SEQ ID N 13); pour hLOXL, sens 5'GACATAACCGACGTGCAGCC-3' (SEQ ID N 8) et antisens 5'ATCCACGTTCGCTCCCTGAG-3' (SEQ ID N 9).
Les ADN sont amplifiés avec la Taq Polymérase (Promega, Charbonnières, France) et le Dig-11-dUTP (Roche Diagnostic, Meylan, France) comme nucléotide de marquage, puis il sont purifiés après électrophorèse sur gel d'agarose en utilisant le kit d'extraction QIAquick (Qiagen, Courtaboeuf, France). L'hybridation in situ a été effectuée sur des sections inclues en paraffine. Les échantillons sont dé-paraffinés et traités avec la protéinase K (Roche) à 2 pg/ml pendant 15 min à 20 C. Les péroxydases endogènes sont inhibées comme indiqué dans le kit d'amplification TSA+ (NEN, Boston, USA).
Une pré-hybridation est effectuée pendant 2h à 37 C en tampon phosphate 20 mM à pH 7. 4, avec 50% de formamide désionisée, 2 x SSC (Sodium Salt Citrate), 5mM EDTA, 2,5 x solution de Denhardt, 200 pg/ml d'ADN dénaturé de hareng, 1 mg/ml ADN de sperme de saumon, et 10 mg/ml d'ARNt.
L'hybridation est effectuée pendant 16 h à 37 C en tampon phosphate 20 mM, avec 50% de formamide désionisé, 2 x SSC, 5mM EDTA, 2. 5 x de solution Denhardt, 200 pg/ml d'ADN de sperme de hareng dénaturé, 10% de dextrane sulfate, avec ou sans la sonde préalablement dénaturée pendant 5 min dans un bain-marie d'eau bouillante. Après l'hybridation, les coupes sont lavées à 20 C (ou 37 C pour le collagène) en 2 x SSC/ 50 % formamide, 1 x SSC/ 50 % formamide, 1 x SSC, et 0,5 x SSC. Après déshydratation, les hybrides marqués avec la digoxigénine sont détectés avec un anticorps anti-DIG conjugué avec la péroxydase de raifort (Roche). La détection finale des
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complexes est effectuée en utilisant le kit d'amplification TSA+ (NEN). Les signaux positifs correspondent à l'activité de la phosphatase alcaline liée à la procédure d'amplification du kit TSA, après 2 h d'activité à température ambiante, et définie par la précipitation des sels de tétrazolium formés (en utilisant les substrats Nitrobleu de tétrazolium bromochlorylindolophosphate (NBT/BCIP)).
L'invention démontre que les gènes LOXL et LOX peuvent être activés par l'addition de kératinocytes dans un modèle de peau reconstruite (Mimeskin, Coletica, Lyon, France), comme le démontre le suivi de l'expression des ARNm par hybridation in situ (figure 11).
L'induction de la synthèse de LOXL est concomitante à celle de la tropoélastine (6 jours après l'addition de kératinocytes sur le derme équivalent).
Le gène LOX est aussi activé après l'addition des kératinocytes, en même temps que le gène du collagène I[alpha]1 (CollAl).
Exemple 9 : Mise en évidence d'une baisse du niveau d'expression du gène LOXL dans les fibroblastes adultes
Les inventeurs ont utilisé 5 souches de fibroblastes de prépuce (FP) (issus de jeunes enfants) et 6 souches de fibroblastes adultes (FA, 3 de 20 ans en moyenne et 3 de 60 ans en moyenne) issus de chirurgie plastique au niveau de l'abdomen. L'expression des trois gènes d'intérêt ainsi que de l'actine a été analysée par RT-PCR en temps réel (reverse transcriptase polymerase chain reaction quantitative, figure 12). Cette technique permet de quantifier précisément l'expression d'un gène en la rapportant à celle de l'actine (considérée comme constante). On peut donc quantifier la régulation du niveau d'expression de ce gène.
Les inventeurs ont utilisé 5 souches de fibroblastes de prépuce (FP) (issus de jeunes enfants) et 6 souches de fibroblastes adultes (FA, 3 de 20 ans en moyenne et 3 de 60 ans en moyenne) issus de chirurgie plastique au niveau de l'abdomen. L'expression des trois gènes d'intérêt ainsi que de l'actine a été analysée par RT-PCR en temps réel (reverse transcriptase polymerase chain reaction quantitative, figure 12). Cette technique permet de quantifier précisément l'expression d'un gène en la rapportant à celle de l'actine (considérée comme constante). On peut donc quantifier la régulation du niveau d'expression de ce gène.
Les résultats présentés dans la figure 12 montrent tout d'abord que la synthèse d'ARNm de LOXL chute de façon spectaculaire et statistiquement
<Desc/Clms Page number 42>
significative dans les fibroblastes d'adultes, et ceci dès l'âge de 20 ans, avec une baisse de près de 70% par rapport aux fibroblastes de prépuce, tandis que l'ARNm de l'élastine ne varie pas de façon significative en fonction de l'âge.
Cette donnée est en accord avec la littérature sur l'élastine : si le tissu élastique se détériore et n'est pas remplacé, cela ne semble pas dû à une inhibition de l'activité du gène de l'élastine.
La synthèse d'ARNm de LOX diminue en moyenne de 40% dans les FA par rapport aux FP. Mais avec la variabilité individuelle, cet écart est peu significatif.
Les ARN totaux sont purifiés avec le kit SV 96Total RNA Isolation System (Promega, Charbonnières, France). Les ARN purifiés sont élués en 100 l d'eau RNase-free (Promega, Charbonnières, France), dosés et répartis en plaques (96 puits, 10 l d'ARN totaux à Sng/pl par PCR). Les amorces sélectionnées pour la réalisation de ce travail sont les suivantes et font l'objet du tableau I :
Tableau I :
Tableau I :
<tb>
<tb> Gène <SEP> Nom <SEP> Taille <SEP> Séquence <SEP> humaine <SEP> Position <SEP> sur <SEP> le <SEP> Température
<tb> (nucléotides) <SEP> gène <SEP> humain <SEP> de <SEP> fusion
<tb> ~~~~~~~~~~~~~~~ <SEP> (TM)
<tb> ELN <SEP> 1 <SEP> Ela <SEP> 20 <SEP> GTA <SEP> TAT <SEP> ACC <SEP> CAG <SEP> Sens <SEP> : <SEP> +443 <SEP> 62 C <SEP>
<tb> GTG <SEP> GCG <SEP> TG
<tb> 2 <SEP> Ela <SEP> 21 <SEP> CGA <SEP> ACT <SEP> TTG <SEP> CTG <SEP> Antisens <SEP> : <SEP> 52 C <SEP>
<tb> CTG <SEP> CTT <SEP> TAG <SEP> +799
<tb>
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<tb>
<Desc/Clms Page number 43>
<tb>
<tb> LOX <SEP> Ox <SEP> 64 <SEP> 21 <SEP> ACG <SEP> TAC <SEP> GTG <SEP> CAG <SEP> Sens <SEP> : <SEP> +676 <SEP> 52 C
<tb> AAG <SEP> ATG <SEP> TCC <SEP>
<tb> Ox <SEP> 65 <SEP> 21 <SEP> GGC <SEP> TGG <SEP> GTA <SEP> AGA <SEP> Antisens <SEP> : <SEP> 51 C <SEP>
<tb> AAT <SEP> CTG <SEP> ATG <SEP> +841
<tb> LOXL <SEP> 30 <SEP> L1 <SEP> 19 <SEP> GAC <SEP> TTC <SEP> GGC <SEP> AAC <SEP> Sens <SEP> : <SEP> +1480 <SEP> 60 C
<tb> CTC <SEP> AAG <SEP> C <SEP>
<tb> 30 <SEP> L2 <SEP> 20 <SEP> TGT <SEP> TGC <SEP> AGA <SEP> AAC <SEP> Antisens <SEP> : <SEP> 60 C <SEP>
<tb> GTA <SEP> GCG <SEP> AC <SEP> +1701
<tb> ACTI <SEP> Actine <SEP> U <SEP> 20 <SEP> GTG <SEP> GGG <SEP> CGC <SEP> CCC <SEP> 72 C <SEP>
<tb> NE <SEP> sens <SEP> AGG <SEP> CAC <SEP> CA <SEP>
<tb> Actine <SEP> D <SEP> 24 <SEP> CTC <SEP> CTT <SEP> AAT <SEP> GTC <SEP> 57 C
<tb> antisens <SEP> ACG <SEP> CAC <SEP> GAT <SEP> TTC
<tb>
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<tb>
La technique de RT-PCR en temps réel est réalisée avec le kit Quanti Tect SYBR Green RT-PCR (Qiagen, France) sur les puits contenant l'ARNm, dans un thermocycleur OPTICON, qui réalise les cycles d'amplification. La rétrotranscription (RT) s'effectue 30 minutes à 50 C, suivie de 15 minutes à 95 C pour inhiber la réverse transcriptase, activer la polymérase et dénaturer l'ADN complémentaire (ADNc) obtenu. 50 cycles de polymérisation en chaîne (PCR) sont effectués (15 secondes à 94 C, 30 secondes à 60 C, 30 à 72 C). A chaque fin de cycle, la fluorescence, qui est proportionnelle au nombre de fragments amplifiés est lue. Le niveau d'expression est défini par le rapport d'expression de chaque gène par rapport à l'actine.
Comme les travaux précédents démontrent l'implication de LOXL dans l'élastogenèse et sa disparition dans les peaux adultes, le point suivant de
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l'invention a porté sur les niveaux d'expression des gènes LOXL, de LOX et de l'élastine dans des fibroblastes de différents âges.
Les exemples ci-dessus démontrent que la synthèse des produits des gènes LOXL et LOX peut être activée au niveau du gène. L'activation de la synthèse des ARNm de LOXL et de la tropoélastine est concomitante dans la peau reconstruite. L'activation des gènes de LOXL et de tropoélastine permet la formation des fibres élastiques. Un criblage d'actifs permet d'aboutir à l'identification de molécules susceptibles de réinduire simultanément l'expression des gènes de l'élastine et de LOXL, afin de stimuler l'élastogenèse.
En conclusion, l'invention permet de démontrer la relation directe de LOXL avec les fibres élastiques, l'importance de LOXL pour la formation des fibres élastiques dans la peau reconstruite, et l'absence de LOXL des tissus où la synthèse de fibres élastiques fonctionnelles n'a pas lieu (tissus adultes, cicatrices). L'invention concerne notamment une méthode de criblage pour détecter de nouvelles molécules capables d'induire concomitamment la synthèse de LOXL et d'élastine dans le but de réinduire l'expression de fibres élastiques fonctionnelles dans la peau reconstruite, les biopsies de peau, et la peau humaine.
Exemple 10 : Analyse de l'expression des ARN messagers de LOXL et/ou de l'élastine, par exemple par RT-PCR qualitative avec ou sans mise en contact de principes actifs dont l'activité est à tester
Les actifs ont été testés à 1% (v/v) sur des fibroblastes de peau humaine normale (issue de prépuce d'enfant ou issue d'adulte). La culture a été effectuée, par exemple en monocouche sur plaques de culture 24 puits, en milieu défini sans sérum (Fibroblast Basal Medium). Les cellules ont été ensemencées, par exemple à 40 000 par cm2. A confluence, les cellules sont mises en contact avec les actifs avantageusement pendant 24h. En parallèle,
Les actifs ont été testés à 1% (v/v) sur des fibroblastes de peau humaine normale (issue de prépuce d'enfant ou issue d'adulte). La culture a été effectuée, par exemple en monocouche sur plaques de culture 24 puits, en milieu défini sans sérum (Fibroblast Basal Medium). Les cellules ont été ensemencées, par exemple à 40 000 par cm2. A confluence, les cellules sont mises en contact avec les actifs avantageusement pendant 24h. En parallèle,
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un témoin non traité (milieu seul) et 3 témoins positifs (TGF-ss à lng/ml, IL-la à 50 pg/ml et Phytokine (Coletica, Lyon, France) à 2% (v/v)) sont avantageusement réalisés, par exemple sur la même plaque de culture.
Le TGF-p à lng/ml et IIL-la à 50 pg/ml ont été testés au préalable et la stimulation de la synthèse d'ARNm de l'élastine induite par ces deux cytokines à ces concentrations a été vérifiée par une analyse des ARNm, par exemple par RT-PCR quantitative (xlO pour le TGF-ss et x6 pour l'IL-1 alpha).
*Après le temps de mise en contact des actifs avec les cellules, par exemple 24h, les milieux sont éliminés et les cellules sont conservées par exemple par congélation à sec à -80 C après un rinçage en tampon phosphate pH 7,4. Les ARN totaux sont extraits par exemple à l'aide d'un kit d'extraction en 96 puits sur colonnes de silice et dosés sur un spectrophotomètre 96 puits à 260nm (indicateur de pureté : dosage des protéines à 280nm). Les ARN sont dilués par exemple à 5ng/ l. La RT-PCR qualitative en 1 étape est réalisée par exemple sur 50 ng d'ARN initial sur plaque de 96 puits, sur les gènes de l'actine, de l'élastine, de LOX et de LOXL. Les amorces spécifiques de chaque gène sont utilisées par exemple à 0,5 M : - Gène élastine sens : 1Ela 5'-GTA TAT ACC CAG GTG GCG TG-3' (SEQ ID N 24); - Gène élastine antisens : 2Ela 5'-CGA ACT TTG CTG CTG CTT TAG-3' (SEQ ID N 25); - Gène LOXL sens : 30L1 5'-GAC TTC GGC AAC CTC AAG C-3' (SEQ ID N 26); - Gène LOXL antisens : 31L1 5'-TGT TGC AGA AAC GTA GCG AC-3' (SEQ ID N 27); - Gène LOX sens : Ox64 5'-ACG TAC GTG CAG AAG ATG TCC-3' (SEQ ID N 28); - Gène LOX antisens : Ox65 5'-GGC TGG GTA AGA AAT CTG ATG-3' (SEQ ID N 29);
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- Gène Actine sens : Actine U 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3' (SEQ ID N 30); - Gène Actine antisens : Actine D 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC- 3' (SEQ ID N 31).
Les paramètres d'amplification ont été avantageusement les suivants : 48 C, 30 min ; 94 C, 2 min ; (94 C, 30 s ; 60 C, 30s ; 68 C, 30s) 28 cycles pour l'actine, 30 cycles pour LOXL, 32 cycles pour LOX, ou 34 cycles pour l'élastine ; 68 C, 10 min ; 14 C, infini. Après amplification, les produits sont par exemple mélangés à raison de 3(il de produits d'amplification de l'actine + 5 l de produits d'amplification du gène de l'élastine + 5 l de produits d'amplification du gène LOX + 5 l de produits d'amplification du gène de LOXL. Un tampon de charge est ajouté (2 l) et le volume total (20 l) est déposé sur un gel précoulé d'agarose (Invitrogen, France) par exemple à 2%.
Les inventeurs ont visualisé les niveaux d'expression par les moyens connus de l'homme de l'art et par exemple . les bandes des échantillons ont été visualisées sous UV en chambre noire après migration (15min) et photographiées numériquement. Les photos des gels ont été analysées par analyse d'images et quantification de l'intensité des bandes (Phoretix 1D, France). Le niveau d'expression des gènes de l'élastine, de LOX et de LOXL ont été exprimés en pourcentage de variation par rapport à ceux obtenus pour le témoin négatif (sans traitement).
Interprétations des résultats : Cellules jeunes et cellules matures : On constate que les cellules de prépuce expriment des quantités de ARNm codant l'élastine à un niveau identique à celui observé en moyenne chez l'adulte, alors qu'elles sont très supérieures dans le cas de l'ARNm codant LOXL, ainsi que dans le cas de l'ARNm codant LOX. Il est donc possible d'inverser cette diminution de l'expression de LOXL et éventuellement de LOX
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dans les cellules âgées, et un criblage de principes actifs dans ce sens a été réalisé.
Criblage de principes actifs :
Les quantités d'ADNc de chaque essai sont rapportées à la quantité d'ADNc de l'actine puis aux contrôles négatifs (sans actifs). Une analyse préliminaire a permis de considérer comme significatif les essais présentant une augmentation de environ 1,3 fois l'ARNm de l'élastine (Eln), d'environ 2 fois LOXL. Sur plus de 900 molécules ou extraits actifs testés, 13 actifs répondent à ces critères, aux concentrations testées et dans les conditions définies. Ces actifs sont les suivants et font l'objet du tableau II.
Les quantités d'ADNc de chaque essai sont rapportées à la quantité d'ADNc de l'actine puis aux contrôles négatifs (sans actifs). Une analyse préliminaire a permis de considérer comme significatif les essais présentant une augmentation de environ 1,3 fois l'ARNm de l'élastine (Eln), d'environ 2 fois LOXL. Sur plus de 900 molécules ou extraits actifs testés, 13 actifs répondent à ces critères, aux concentrations testées et dans les conditions définies. Ces actifs sont les suivants et font l'objet du tableau II.
<tb>
<tb> Nom <SEP> Eln <SEP> LOXL <SEP> LOX
<tb> Témoin <SEP> Témoin <SEP> Témoin
<tb> multiplié <SEP> par <SEP> : <SEP> multiplié <SEP> par <SEP> : <SEP> multiplié <SEP> par <SEP> : <SEP>
<tb> Aneth <SEP> (fruit) <SEP> 2,28 <SEP> 2,03 <SEP> 3,08
<tb> Groseille <SEP> 4,11 <SEP> 2 <SEP> 4,55
<tb> Cardamone <SEP> 2,08 <SEP> 2 <SEP> 5,57
<tb> Radis <SEP> noir <SEP> 2,88 <SEP> 2,13 <SEP> 2,92
<tb> Petit <SEP> houx <SEP> 1,58 <SEP> 2,4 <SEP> 2,53
<tb> Cannelle <SEP> 1,56 <SEP> 2,09 <SEP> 5,08
<tb> Ferments <SEP> lactiques <SEP> 2,37 <SEP> 2,04 <SEP> 9,69
<tb> Pomme <SEP> de <SEP> terre <SEP> 2,4 <SEP> 1,88 <SEP> 3,55
<tb> Protéine <SEP> de <SEP> soie <SEP> 2 <SEP> 3,05 <SEP> 3,25
<tb> Avoine <SEP> 2,37 <SEP> 2,04 <SEP> 9,69
<tb> Gomme <SEP> Asae <SEP> foetida <SEP> 1,35 <SEP> 2 <SEP> 3,19
<tb> ethyl <SEP> hexenoate <SEP> 1,5 <SEP> 2,33 <SEP> 3,09
<tb>
<tb> Nom <SEP> Eln <SEP> LOXL <SEP> LOX
<tb> Témoin <SEP> Témoin <SEP> Témoin
<tb> multiplié <SEP> par <SEP> : <SEP> multiplié <SEP> par <SEP> : <SEP> multiplié <SEP> par <SEP> : <SEP>
<tb> Aneth <SEP> (fruit) <SEP> 2,28 <SEP> 2,03 <SEP> 3,08
<tb> Groseille <SEP> 4,11 <SEP> 2 <SEP> 4,55
<tb> Cardamone <SEP> 2,08 <SEP> 2 <SEP> 5,57
<tb> Radis <SEP> noir <SEP> 2,88 <SEP> 2,13 <SEP> 2,92
<tb> Petit <SEP> houx <SEP> 1,58 <SEP> 2,4 <SEP> 2,53
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<tb> Gomme <SEP> Asae <SEP> foetida <SEP> 1,35 <SEP> 2 <SEP> 3,19
<tb> ethyl <SEP> hexenoate <SEP> 1,5 <SEP> 2,33 <SEP> 3,09
<tb>
<Desc/Clms Page number 48>
<tb>
<tb> methyl <SEP> butyrate <SEP> 1,43 <SEP> 3,24 <SEP> 5,08
<tb> ethyl <SEP> decadienoate <SEP> 2,04 <SEP> 2,32 <SEP> 3,64
<tb>
Les extraits végétaux sont obtenus en faisant macérer les plantes à 2-5% (p/p) dans un mélange eau/(alcool, glycol ou polyol) (tels que éthanol, glycérol, butylène glycol et autres glycols, xylitol etc...) 100/0 à 0/100. Les extraits obtenus sont ensuite filtrés ou distillés afin de récupérer la fraction soluble qui est ensuite filtrée de façon stérile. Les molécules chimiques proviennent de Sigma (Saint-Louis, USA) et sont utilisés dilués ou dispersés à 1% dans un alcool ou un glycol.
<tb> methyl <SEP> butyrate <SEP> 1,43 <SEP> 3,24 <SEP> 5,08
<tb> ethyl <SEP> decadienoate <SEP> 2,04 <SEP> 2,32 <SEP> 3,64
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Les extraits végétaux sont obtenus en faisant macérer les plantes à 2-5% (p/p) dans un mélange eau/(alcool, glycol ou polyol) (tels que éthanol, glycérol, butylène glycol et autres glycols, xylitol etc...) 100/0 à 0/100. Les extraits obtenus sont ensuite filtrés ou distillés afin de récupérer la fraction soluble qui est ensuite filtrée de façon stérile. Les molécules chimiques proviennent de Sigma (Saint-Louis, USA) et sont utilisés dilués ou dispersés à 1% dans un alcool ou un glycol.
Conclusion : 13 actifs de la banque de 960 actifs sont capables d'activer significativement, dans les conditions considérées, le taux de synthèse d'ARNm des gènes codant LOXL, LOX et l'élastine dans les fibroblastes d'abdomen d'adulte d'âge mature (donneur de 63 ans dans ce cas).
Exemple 11 : Etude d'efficacité d'un actif cosmétique ou dermopharmaceutiaue par exemple par RT-PCR en temps réel
Les actifs sélectionnés à l'issue de la première étape de criblage ont été testés à plusieurs concentrations comprises entre 0,1% et 5%, (v/v) sur des fibroblastes de peau humaine normale (adulte). La culture a été effectuée par exemple en monocouche en plaques de culture 24 puits, en milieu défini sans sérum (Fibroblast Basal Medium). Les cellules sont ensemencées par exemple à 40 000 par cm2. Après le temps de mise en contact des actifs avec les cellules (24h), les milieux ont été éliminés et les cellules ont été conservées par exemple par congélation à sec à -80 C après un rinçage au tampon phosphate à pH 7,4. En fin d'expérimentation, la teneur en ARNm de l'élastine, de LOXL et de l'actine est évaluée par une technique d'analyse des ARNm, par exemple par RT-PCR en temps réel. Pour cela, les couples d'amorces
Les actifs sélectionnés à l'issue de la première étape de criblage ont été testés à plusieurs concentrations comprises entre 0,1% et 5%, (v/v) sur des fibroblastes de peau humaine normale (adulte). La culture a été effectuée par exemple en monocouche en plaques de culture 24 puits, en milieu défini sans sérum (Fibroblast Basal Medium). Les cellules sont ensemencées par exemple à 40 000 par cm2. Après le temps de mise en contact des actifs avec les cellules (24h), les milieux ont été éliminés et les cellules ont été conservées par exemple par congélation à sec à -80 C après un rinçage au tampon phosphate à pH 7,4. En fin d'expérimentation, la teneur en ARNm de l'élastine, de LOXL et de l'actine est évaluée par une technique d'analyse des ARNm, par exemple par RT-PCR en temps réel. Pour cela, les couples d'amorces
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permettant l'amplification de fragments spécifiques de ces gènes sont celles décrites précédemment (exemple 10).
Après extraction par exemple à l'aide d'un kit d'extraction en 96 puits sur colonnes de silice et dosage sur un spectrophotomètre 96 puits à 260nm, les ARNs sont dilués par exemple à 5ng/ l. Les réactions de RT-PCR (Reverse Polymerase Transcription Chain Reactions) ont été réalisées par RT-PCR quantitative en temps réel à l'aide du système Opticon (MJ Research). Avantageusement le mélange réactionnel (50 l) introduit dans les puits était le suivant, pour chaque échantillon :
10 l d'ARN à la concentration de 5ng/pl,
Les amorces spécifiques des différents marqueurs recherchés,
Mélange réactionnel (Qiagen - 25 l 2xQuantiTect SYBR Green RT-PCR master mix contenant 5mM MgCI2 + 0,5 l QuantiTect RT mix), le marqueur SYBR Green I s'intercalant dans l'ADN double brins au cours de l'étape d'élongation.
10 l d'ARN à la concentration de 5ng/pl,
Les amorces spécifiques des différents marqueurs recherchés,
Mélange réactionnel (Qiagen - 25 l 2xQuantiTect SYBR Green RT-PCR master mix contenant 5mM MgCI2 + 0,5 l QuantiTect RT mix), le marqueur SYBR Green I s'intercalant dans l'ADN double brins au cours de l'étape d'élongation.
Les conditions de RT-PCR ont été avantageusement les suivantes : Transcription réversée (Reverse Transcription) : min à 50 C, puis 15 min à 95 C, Réactions de PCR : sec à 94 C, 30 sec à 60 C et 30 sec à 72 C], 50 cycles.
L'absence de contamination et la pureté des produits amplifiés ont été vérifiées par exemple via les courbes de fusion des produits de PCR amplifiés.
Les produits présentant un double pic ou une température de fusion anormale ont été éliminés.
Analyse et Méthode de calcul :
L'incorporation de fluorescence dans l'ADN amplifié a été évaluée en continu au cours des cycles de PCR. Ce système a permis d'obtenir des
L'incorporation de fluorescence dans l'ADN amplifié a été évaluée en continu au cours des cycles de PCR. Ce système a permis d'obtenir des
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courbes de mesure de la fluorescence en fonction du nombre de cycles de PCR et ainsi d'évaluer une quantité relative d'ADN amplifié.
Afin de tenir compte de la population cellulaire présente, tous les résultats ont été rapportés au signal actine , utilisé comme gène de ménage (Housekeeping gene). Selon l'expérimentation, le seuil de mesure du C(T) (Cycle Threshold) a été fixé pour T compris entre 0,05 et 0,01 puis une unité arbitraire de mesure est calculée pour chaque gène selon la formule : Sgène x = 107 x (1/2)C(T)gène x , C(T)gène x signifiant le nombre de cycles nécessaires pour atteindre le seuil de mesure de 0,01-0,05 du gène x .
Les valeurs des gènes d'intérêt ont été rapportées au signal actine par calcul du rapport : R = Sgène x / Sactine.
Ces rapports ont été comparés entre les échantillons traités et non traités,"x" étant le gène de LOXL, ou de l'élastine.
Résultats : parmi les actifs sélectionnés, les résultats obtenus, à titre d'exemple pour deux d'entre eux, sont présentés dans le Tableau III :
Tableau III
Tableau III
<tb>
<tb> Nom <SEP> LOXL <SEP> LOX <SEP> EI
<tb> Témoin <SEP> multiplié <SEP> Témoin <SEP> multiplié <SEP> Témoin <SEP> multiplié
<tb> par: <SEP> par: <SEP> par:
<tb> methyl <SEP> butyrate <SEP> à <SEP> 0,01% <SEP> 0,89 <SEP> 1,04 <SEP> 0,92
<tb> methyl <SEP> butyrate <SEP> à <SEP> 0,1% <SEP> 1,56 <SEP> 1,76* <SEP> 0,96
<tb> methyl <SEP> butyrate <SEP> à <SEP> 1% <SEP> 2,10* <SEP> 2,17* <SEP> 1,25
<tb> methyl <SEP> butyrate <SEP> à <SEP> 5% <SEP> 0,91 <SEP> 0,91 <SEP> 1,70*
<tb> Protéine <SEP> de <SEP> soie <SEP> à <SEP> 0,01% <SEP> 1,18 <SEP> 0,96 <SEP> 1,00
<tb> Protéine <SEP> de <SEP> soie <SEP> à <SEP> 0,1% <SEP> 1,46* <SEP> 0,96 <SEP> 1,12
<tb> Protéine <SEP> de <SEP> soie <SEP> à <SEP> 1% <SEP> 2,39* <SEP> 1,16 <SEP> 1,24
<tb> Protéine <SEP> de <SEP> soie <SEP> à <SEP> 5% <SEP> 2,05 <SEP> 1,37 <SEP> 1,37
<tb> *résultats <SEP> statistiquement <SEP> significatifs <SEP> p<0,05 <SEP> (test <SEP> One <SEP> Way <SEP> Anova)
<tb>
<tb> Nom <SEP> LOXL <SEP> LOX <SEP> EI
<tb> Témoin <SEP> multiplié <SEP> Témoin <SEP> multiplié <SEP> Témoin <SEP> multiplié
<tb> par: <SEP> par: <SEP> par:
<tb> methyl <SEP> butyrate <SEP> à <SEP> 0,01% <SEP> 0,89 <SEP> 1,04 <SEP> 0,92
<tb> methyl <SEP> butyrate <SEP> à <SEP> 0,1% <SEP> 1,56 <SEP> 1,76* <SEP> 0,96
<tb> methyl <SEP> butyrate <SEP> à <SEP> 1% <SEP> 2,10* <SEP> 2,17* <SEP> 1,25
<tb> methyl <SEP> butyrate <SEP> à <SEP> 5% <SEP> 0,91 <SEP> 0,91 <SEP> 1,70*
<tb> Protéine <SEP> de <SEP> soie <SEP> à <SEP> 0,01% <SEP> 1,18 <SEP> 0,96 <SEP> 1,00
<tb> Protéine <SEP> de <SEP> soie <SEP> à <SEP> 0,1% <SEP> 1,46* <SEP> 0,96 <SEP> 1,12
<tb> Protéine <SEP> de <SEP> soie <SEP> à <SEP> 1% <SEP> 2,39* <SEP> 1,16 <SEP> 1,24
<tb> Protéine <SEP> de <SEP> soie <SEP> à <SEP> 5% <SEP> 2,05 <SEP> 1,37 <SEP> 1,37
<tb> *résultats <SEP> statistiquement <SEP> significatifs <SEP> p<0,05 <SEP> (test <SEP> One <SEP> Way <SEP> Anova)
<tb>
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Conclusion : les actifs sélectionnés permettent d'activer le taux de synthèse d'ARNm des gènes codant LOXL, LOX et l'élastine dans les fibroblastes d'abdomen d'adulte d'âge mature (donneur de 63 ans dans ce cas). L'étude réalisée permet de déterminer les concentrations optimales d'utilisation pour chaque actif sélectionné.
Pour les exemples 1 à 11 : l'homme de l'art saura tirer l'enseignement adéquat de ces exemples pour réaliser des variantes des compositions (formulations) décrites.
Exemple 12 : Utilisation des produits de l'invention dans des formulations cosmétiques ou pharmaceutiques de type émulsion huile dans eau Formulation 12a : A Eau qsp 100
Butylene Glycol 2
Glycérine 3
Sodium Dihydroxycetyl 2
Phosphate,
Isopropyl Hydroxycetyl Ether B Glycol Stearate SE 14
Triisononaoin 5
Octyl Cocoate 6 C Butylène Glycol, 2
Butylene Glycol 2
Glycérine 3
Sodium Dihydroxycetyl 2
Phosphate,
Isopropyl Hydroxycetyl Ether B Glycol Stearate SE 14
Triisononaoin 5
Octyl Cocoate 6 C Butylène Glycol, 2
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Methylparaben,
Ethylparaben, Propylparaben, pH ajusté à 5,5 D Produits de l'invention 0,01 - 10 % Formulation 12b : A Eau qsp 100
Butylene Glycol 2
Glycérine 3
Polyacrylamide, Isoparafin, 2,8
Laureth-7 B Butylene Glycol, 2
Methylparaben,
Ethylparaben, Propylparaben ;
2
Phenoxyethanol,
Methylparaben,
Propylparaben, Butylparaben,
Ethylparaben 0,5
Butylene Glycol D Produits de l'invention 0,01 - 10 % Formulation 12c :
Ethylparaben, Propylparaben, pH ajusté à 5,5 D Produits de l'invention 0,01 - 10 % Formulation 12b : A Eau qsp 100
Butylene Glycol 2
Glycérine 3
Polyacrylamide, Isoparafin, 2,8
Laureth-7 B Butylene Glycol, 2
Methylparaben,
Ethylparaben, Propylparaben ;
2
Phenoxyethanol,
Methylparaben,
Propylparaben, Butylparaben,
Ethylparaben 0,5
Butylene Glycol D Produits de l'invention 0,01 - 10 % Formulation 12c :
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A Carbomer 0,50
Propylene Glycol 3
Glycerol 5
Eau qsp 100 B Octyl Cocoate 5
Bisabolol 0,30
Dimethicone 0,30 C Sodium Hydroxide 1,60 D Phenoxyethanol, 0,50
Methylparaben,
Propylparaben, Butylparaben,
Ethylparaben E Parfum 0,30 F Produits de l'invention 0,01 - 10 % Exemple 13 : Utilisation des produits de l'invention dans une formulation de type eau dans huile A PEG 30 - 3 dipolyhydroxystearate
Capric Triglycerides 3
Cetearyl Octanoate 4
Dibutyl Adipate 3
Grape Seed Oil 1,5
Propylene Glycol 3
Glycerol 5
Eau qsp 100 B Octyl Cocoate 5
Bisabolol 0,30
Dimethicone 0,30 C Sodium Hydroxide 1,60 D Phenoxyethanol, 0,50
Methylparaben,
Propylparaben, Butylparaben,
Ethylparaben E Parfum 0,30 F Produits de l'invention 0,01 - 10 % Exemple 13 : Utilisation des produits de l'invention dans une formulation de type eau dans huile A PEG 30 - 3 dipolyhydroxystearate
Capric Triglycerides 3
Cetearyl Octanoate 4
Dibutyl Adipate 3
Grape Seed Oil 1,5
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Jojoba Oil 1,5
Phenoxyethanol, 0,5
Methylparaben,
Propylparaben, Butylparaben,
Ethylparaben B Glycerine 3
Butylene Glycol 3
Magnésium Sulfate 0,5
EDTA 0,05
Eau qsp 100 C Cyclomethicone 1
Dimethicone 1 D Parfum 0,3 E Produits de l'invention 0,01- 10 % Exemple 14 : Utilisation des produits de l'invention dans une formulation de type shampoing ou gel douche A Xantham Gum 0,8
Eau qsp 100 B Butylene Glycol, 0,5
Methylparaben,
Phenoxyethanol, 0,5
Methylparaben,
Propylparaben, Butylparaben,
Ethylparaben B Glycerine 3
Butylene Glycol 3
Magnésium Sulfate 0,5
EDTA 0,05
Eau qsp 100 C Cyclomethicone 1
Dimethicone 1 D Parfum 0,3 E Produits de l'invention 0,01- 10 % Exemple 14 : Utilisation des produits de l'invention dans une formulation de type shampoing ou gel douche A Xantham Gum 0,8
Eau qsp 100 B Butylene Glycol, 0,5
Methylparaben,
<Desc/Clms Page number 55>
Ethylparaben, Propylparaben
Phenoxyethanol, 0,5
Methylparaben,
Propylparaben, Butylparaben,
Ethylparaben C Citric acid 0,8 D Sodium Laureth Sulfate 40,0 E Produit de l'invention 0,01 - 10 % Exemple 15 : Utilisation des produits de l'invention dans une formulation de type rouge à lèvres et autres produits anhydres A Minerai Wax 17,0
Isostearyl Isostearate 31,5
Propylene Glycol Dipelargonate 2,6
Propylene Glycol Isostearate 1,7
PEG 8 Beewax 3,0
Hydrogenated Palm Kernel Oil 3,4
Glycerides,
Hydrogenated Palm Glycerides
Lanoline Oil 3,4
Sesame Oil 1,7
Cetyl Lactate 1,7
Minerai Oil, Lanolin Alcohol 3,0
Phenoxyethanol, 0,5
Methylparaben,
Propylparaben, Butylparaben,
Ethylparaben C Citric acid 0,8 D Sodium Laureth Sulfate 40,0 E Produit de l'invention 0,01 - 10 % Exemple 15 : Utilisation des produits de l'invention dans une formulation de type rouge à lèvres et autres produits anhydres A Minerai Wax 17,0
Isostearyl Isostearate 31,5
Propylene Glycol Dipelargonate 2,6
Propylene Glycol Isostearate 1,7
PEG 8 Beewax 3,0
Hydrogenated Palm Kernel Oil 3,4
Glycerides,
Hydrogenated Palm Glycerides
Lanoline Oil 3,4
Sesame Oil 1,7
Cetyl Lactate 1,7
Minerai Oil, Lanolin Alcohol 3,0
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B Castor Oil qsp 100
Titanium Dioxide 3,9 CI 15850 : 1 0,616 CI 45410 : 1 0,256
CI 19140 :1 0,048
CI 77491 2,048 C Produits de l'invention 0,01 - 5 % Exemple 16 : Utilisation des produits de l'invention dans une formulation de gels aqueux (contours de l'#il, amincissants, etc.) A Eau qsp 100
Carbomer 0,5
Butylene Glycol 15
Phenoxyethanol, Methylparaben, 0,5
Propylparaben, Butylparaben,
Ethylparaben B Produits de l'invention 0,01 - 10 % Exemple 17 : Préparation de formulations pharmaceutiques contenant LOXL Formulation 17a :préparation de comprimés
Titanium Dioxide 3,9 CI 15850 : 1 0,616 CI 45410 : 1 0,256
CI 19140 :1 0,048
CI 77491 2,048 C Produits de l'invention 0,01 - 5 % Exemple 16 : Utilisation des produits de l'invention dans une formulation de gels aqueux (contours de l'#il, amincissants, etc.) A Eau qsp 100
Carbomer 0,5
Butylene Glycol 15
Phenoxyethanol, Methylparaben, 0,5
Propylparaben, Butylparaben,
Ethylparaben B Produits de l'invention 0,01 - 10 % Exemple 17 : Préparation de formulations pharmaceutiques contenant LOXL Formulation 17a :préparation de comprimés
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A Excipients En g par comprimé
Lactose 0,359
Saccharose 0,240 B Extrait de LOXL* 0,001-0,1 *L'extrait de LOXL est obtenu, par exemple, selon le procédé d'extraction décrit à l'exemple 2 suivi d'une étape de séchage.
Lactose 0,359
Saccharose 0,240 B Extrait de LOXL* 0,001-0,1 *L'extrait de LOXL est obtenu, par exemple, selon le procédé d'extraction décrit à l'exemple 2 suivi d'une étape de séchage.
Formulation 17b : préparation d'une pommade A Excipients
Polyéthylène basse densité 5,5
Paraffine liquide qsp 100 B Extrait de LOXL* 0,001-0,1 *L'extrait de LOXL est obtenu, par exemple, selon le procédé d'extraction décrit à l'exemple 2 éventuellement suivi d'une étape de séchage.
Polyéthylène basse densité 5,5
Paraffine liquide qsp 100 B Extrait de LOXL* 0,001-0,1 *L'extrait de LOXL est obtenu, par exemple, selon le procédé d'extraction décrit à l'exemple 2 éventuellement suivi d'une étape de séchage.
Formulation 17c : préparation d'une formule injectable A Excipient
Solution isotonique salée 5 ml B Extrait de LOXL* 0,001-0,1 g *L'extrait de LOXL est obtenu, par exemple, selon le procédé d'extraction décrit à l'exemple 2 suivi d'une étape de séchage.
Solution isotonique salée 5 ml B Extrait de LOXL* 0,001-0,1 g *L'extrait de LOXL est obtenu, par exemple, selon le procédé d'extraction décrit à l'exemple 2 suivi d'une étape de séchage.
La phase A et la phase B sont conditionnées en ampoules séparées et mélangées avant utilisation.
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Exemple 18 : Evaluation de l'acceptation cosmétique d'une préparation contenant le sujet de l'invention
Les essais de toxicologie ont été réalisés sur les composés obtenus selon les exemples 10 et 11 incorporés à 10% dans un gel de xanthane à 0,5%, par une évaluation oculaire chez le lapin, par l'étude de ('absence de toxicité anormale par administration orale unique chez le rat et par l'étude du pouvoir sensibilisant sur le cobaye.
Les essais de toxicologie ont été réalisés sur les composés obtenus selon les exemples 10 et 11 incorporés à 10% dans un gel de xanthane à 0,5%, par une évaluation oculaire chez le lapin, par l'étude de ('absence de toxicité anormale par administration orale unique chez le rat et par l'étude du pouvoir sensibilisant sur le cobaye.
Evaluation de l'irritation primaire cutanée chez le lapin :
Les préparations décrites ci-dessus sont appliquées sans dilution à la dose de 0,5 mL sur la peau de 3 lapins selon la méthode préconisée par la directive OCDE concernant l'étude de l'effet irritant/corrosif aigu sur la peau .
Les préparations décrites ci-dessus sont appliquées sans dilution à la dose de 0,5 mL sur la peau de 3 lapins selon la méthode préconisée par la directive OCDE concernant l'étude de l'effet irritant/corrosif aigu sur la peau .
Les produits sont classés selon les critères définis par l'arrêté du 1/2/1982 publié au JORF du 21/02/82.
Les résultats de ces essais, ont permis de conclure que la préparation contenant le composé obtenu selon l'exemple 11 était classée non irritante pour la peau.
Evaluation de l'irritation oculaire chez le lapin :
Les préparations décrites ci-dessus ont été instillées pure en une seule fois, à raison de O,lmL, dans l'oeil de 3 lapins selon la méthode préconisée par la directive de l'OCDE n 405 du 24 février 1987 concernant l'étude de l'effet irritant/corrosif aigu sur les yeux .
Les préparations décrites ci-dessus ont été instillées pure en une seule fois, à raison de O,lmL, dans l'oeil de 3 lapins selon la méthode préconisée par la directive de l'OCDE n 405 du 24 février 1987 concernant l'étude de l'effet irritant/corrosif aigu sur les yeux .
Les résultats de ce test permettent de conclure que les préparations peuvent être considérées comme non irritantes pour les yeux, au sens de la directive 91/326 CEE utilisée pure ou sans dilution.
<Desc/Clms Page number 59>
Essai sur l'absence de toxicité anormale par administration orale unique chez le rat :
Les préparations décrites ont été administrées en une fois par voie orale à la dose de 5g/Kg de poids corporel, à 5 rats mâles et 5 rats femelles selon un protocole inspiré de la directive de l'OCDE n 401 du 24 février 1987 et adapté aux produits cosmétiques.
Les préparations décrites ont été administrées en une fois par voie orale à la dose de 5g/Kg de poids corporel, à 5 rats mâles et 5 rats femelles selon un protocole inspiré de la directive de l'OCDE n 401 du 24 février 1987 et adapté aux produits cosmétiques.
Les DLO et DL50 sont trouvées supérieures à 5000 mg/Kg. Les préparations testées ne sont donc pas classées parmi les préparations dangereuses par ingestion.
Evaluation du potentiel de sensibilisation cutanée chez le cobaye :
Les préparations décrites sont soumises au test de maximisation décrit par Magnusson et Kligmann, protocole en accord avec la ligne directrice n 406 de l'OCDE.
Les préparations décrites sont soumises au test de maximisation décrit par Magnusson et Kligmann, protocole en accord avec la ligne directrice n 406 de l'OCDE.
Les préparations sont classées comme non sensibilisantes par contact avec la peau.
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Précisions sur les séquences décrites :
Séquence ID N 1 : est la séquence peptidique de la protéine humaine LOXL.
Séquence ID N 1 : est la séquence peptidique de la protéine humaine LOXL.
Séquence ID N 2 : est la séquence de nucléotides de l'ADNc codant la protéine humaine LOXL décrite en séquence ID N 1.
Séquence ID N 3 : est la séquence de nucléotides de l'ADNc codant le promoteur du gène humain codant la protéine LOXL décrite en séquence ID N 1.
Séquence ID N 4 : est la séquence peptidique de la protéine humaine tropoélastine.
Séquence ID N 5 : est la séquence de nucléotides de l'ADNc codant la protéine humaine tropoélastine décrite en séquence ID N 4.
Séquence ID N 6 : est la séquence peptidique de la protéine humaine LOX.
Séquence ID N 7 : est la séquence de nucléotides de l'ADNc codant la protéine humaine LOX décrite en séquence ID N 6.
Pour les sondes d'ADN double brin :
Séquence ID N 8 : est une amorce sens de l'ADN codant la protéine humaine LOXL décrite en séquence ID N 1
Séquence ID N 9 :. est une amorce antisens de l'ADN codant la protéine humaine LOXL décrite en séquence ID N 1.
Séquence ID N 8 : est une amorce sens de l'ADN codant la protéine humaine LOXL décrite en séquence ID N 1
Séquence ID N 9 :. est une amorce antisens de l'ADN codant la protéine humaine LOXL décrite en séquence ID N 1.
Séquence ID N 10 : est une amorce sens de l'ADN codant la protéine humaine tropoélastine décrite en séquence ID N 4.
Séquence ID N 11 : est une amorce antisens de l'ADN codant la protéine humaine tropoélastine décrite en séquence ID N 4.
Séquence ID N 12 : est une amorce sens de l'ADN codant la protéine humaine LOX décrite en séquence ID N 6.
<Desc/Clms Page number 61>
Séquence ID N 13 : est une amorce antisens de l'ADN codant la protéine humaine LOX décrite en séquence ID N 6.
Séquence ID N 14 : est une amorce sens de l'ADN codant la protéine humaine collagène I alL.
Séquence ID N 15: est une amorce antisens de l'ADN codant la protéine humaine collagène I alL.
Pour les gènes de fusion GST :
Séquence ID N 16 : est une amorce sens de l'ADN du gène de fusion GST S355-D415.
Séquence ID N 16 : est une amorce sens de l'ADN du gène de fusion GST S355-D415.
Séquence ID N 17 : est une amorce antisens de l'ADN du gène de fusion GST S355-D415.
Séquence ID N 18 : est une amorce sens de l'ADN du gène de fusion GST G128-L212.
Séquence ID N 19 : est une amorce antisens de l'ADN du gène de fusion GST G128-L212.
Séquence ID N 20 : est une amorce sens de l'ADN du gène de fusion GST V228-S279.
Séquence ID N 21 : est une amorce antisens de l'ADN du gène de fusion GST V228-S279.
Séquence ID N 22 : est une amorce sens de l'ADN du gène de fusion GST D306-N373.
Séquence ID N 23 : est une amorce antisens de l'ADN du gène de fusion GST D306-N373.
Pour les amorces PCR :
Séquence ID N 24 : est une amorce sens pour la RT-PCR de l'ARNm codant la protéine humaine tropoélastine décrite en séquence ID N 4.
Séquence ID N 24 : est une amorce sens pour la RT-PCR de l'ARNm codant la protéine humaine tropoélastine décrite en séquence ID N 4.
<Desc/Clms Page number 62>
Séquence ID N 25 : est une amorce antisens pour la RT-PCR de l'ARNm codant la protéine humaine tropoélastine décrite en séquence ID N 4.
Séquence ID N 26 : est une amorce sens pour la RT-PCR de l'ARNm codant la protéine humaine LOXL décrite en séquence ID N 1.
Séquence ID N 27 : est une amorce antisens de la séquence de l'ARNm codant la protéine humaine LOXL décrite en séquence ID N 1.
Séquence ID N 28 : est une amorce sens pour la RT-PCR de l'ARNm codant la protéine humaine LOX décrite en séquence ID N 6.
Séquence ID N 29 : est une amorce antisens pour la RT-PCR de l'ARNm codant la protéine humaine LOX décrite en séquence ID N 6.
Séquence ID N 30 : est une amorce sens pour la RT-PCR de l'ARNm codant la protéine humaine actine.
Séquence ID N 31 : est une amorce antisens pour la RT-PCR de l'ARNm codant la protéine humaine actine.
Claims (29)
- Revendications : 1. Utilisation de l'isoforme like de la lysyl oxydase ayant la Séquence ID N 1, encore appelée LOXL, ou d'une forme dérivée pour la fabrication d'une composition pour stimuler la formation de fibres élastiques.
- 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la composition comprend en outre une substance, notamment favorisant l'activité et/ou l'expression de LOXL, choisie parmi le groupe consistant en un extrait d'aneth, de groseille, de cardamone, du radis noir, du petit houx, de cannelle, d'avoine, de pomme de terre, de soie, les fermentations à base de bactéries lactiques, la gomme asae foetida, l'hexénoate d'éthyle et ses dérivés, le butyrate de méthyle et ses dérivés, et le décadiènoate d'éthyle et ses dérivés.
- 3. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que l'expression de LOXL est soit l'expression d'une séquence de nucléotides codant LOXL soit l'expression d'une séquence de peptides constituant une fraction de la protéine LOXL, de préférence ladite séquence de peptides étant choisie parmi la Séquence ID N 1.
- 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour induire une néo-élastogenèse des tissus, et notamment stimuler l'élasticité des tissus ainsi obtenus, et réduire les rides cutanées.
- 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, pour lutter contre le relâchement des tissus, notamment lorsque le relâchement des tissus est observé au cours du vieillissement ou au cours des expositions solaires, pour densifier la matrice extracellulaire, pour raffermir les tissus sous-cutanés, pour réduire les rides cutanées, pour exercer un effet anti-rides, pour<Desc/Clms Page number 64>améliorer la qualité du tissu cicatriciel et l'aspect des cicatrices, notamment des cicatrices dystrophiques et kéloïdes, ou pour lutter contre les vergetures.
- 6. Composition cosmétique caractérisée en ce qu'elle comprend une substance active telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 5, éventuellement en mélange avec un excipient cosmétiquement acceptable.
- 7. Composition neutraceutique caractérisée en ce qu'elle comprend une substance active telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 5, éventuellement en mélange avec un excipient alimentairement acceptable.
- 8. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend une substance active telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 5, éventuellement en mélange avec un excipient pharmaceutiquement acceptable.
- 9. Procédé de soin cosmétique caractérisé en ce qu'il comprend l'utilisation d'une composition selon la revendication 6 ou 7.
- 10. Procédé de soin cosmétique selon la revendication 9, caractérisé en ce que la composition est utilisée pour lutter contre le relâchement des tissus, notamment lorsque le relâchement des tissus est observé au cours du vieillissement ou au cours des expositions solaires, ou pour densifier la matrice extracellulaire, ou pour raffermir les tissus sous-cutanés, ou pour réduire les rides cutanées, ou pour excercer un effet anti-rides, pour améliorer la qualité du tissu cicatriciel et l'aspect des cicatrices, notamment des cicatrices dystrophiques et kéloïdes, ou pour lutter contre les vergetures.<Desc/Clms Page number 65>
- 11. Méthode d'identification d'une substance favorisant l'activité de LOXL, pour la stimulation de la formation de fibres élastiques, caractérisée en ce qu'elle comprend : - la mise en contact d'une substance potentiellement active avec LOXL, et - l'analyse de l'activité de LOXL, notamment dans le but d'identifier si ladite substance potentiellement active stimule l'activité de LOXL.
- 12. Méthode d'identification d'une substance favorisant la formation de LOXL, pour la stimulation de la formation de fibres élastiques, caractérisée en ce qu'elle comprend : - la mise en contact d'une substance potentiellement active avec au moins un type de cellules, de préférence vivantes, capables d'exprimer l'isoformeL de la protéine lysyl oxydase, encore appelée LOXL, et - l'analyse de l'expression de LOXL, notamment dans le but d'identifier si ladite substance potentiellement active stimule l'expression de LOXL.
- 13. Méthode d'identification, selon la revendication 12, caractérisée en ce que l'on recherche si ladite substance potentiellement active stimule : - l'expression d'au moins une séquence de nucléotides codant la protéineLOXL, et/ou - l'expression d'une séquence de peptides constituant essentiellement une fraction peptidique de la protéine LOXL.
- 14. Méthode d'identification, selon la revendication 12 ou 13, caractérisée en ce que l'analyse de l'expression de LOXL est effectuée par l'analyse qualitative et/ou quantitative de l'expression d'au moins une partie d'une séquence de nucléotides codant LOXL.<Desc/Clms Page number 66>
- 15. Méthode d'identification, selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisée en ce que la séquence de nucléotides est l'ADNc, complémentaire de l'ARNm codant LOXL, l'ADNc de LOXL étant défini par la Séquence ID N 2.
- 16. Méthode d'identification, selon l'une quelconque des revendications 12 à 15, caractérisée en ce que l'analyse de l'expression de LOXL met en #uvre une étape de transcription réversée de réaction de polymérisation en chaîne (RTPCR) comprenant l'utilisation d'amorces s'hybridant avec au moins une partie de la séquence de nucléotides de l'ADN complémentaire codant LOXL (SEQ ID N 2), pour amplifier au moins une partie de la séquence de nucléotides codant la LOXL.
- 17. Méthode d'identification, selon l'une quelconque des revendications 12 à 16, caractérisée en ce que la méthode comprend également une étape de localisation de l'expression de LOXL qui est effectuée sur un modèle de peau reconstruite ou sur un modèle à base de biopsies : # par hybridation in situ, notamment d'au moins une partie d'une séquence de nucléotides codant LOXL par exemple en utilisant au moins une sondeADN s'hybridant avec au moins une partie de la séquence de nucléotides de l'ADN complémentaire codant LOXL (SEQ ID N 2) ; ou # par immunodétection notamment en utilisant au moins un anticorps spécifique de la LOXL.
- 18. Méthode d'identification, selon l'une quelconque des revendications 12 à 17, caractérisée en ce que la méthode d'identification comprend la comparaison de l'expression de LOXL avec l'expression de LOXL exprimée dans un témoin ne comprenant pas ladite substance potentiellement active.<Desc/Clms Page number 67>
- 19. Méthode d'identification, selon l'une quelconque des revendications 12 à 18, caractérisée en ce que les cellules vivantes comprennent des fibroblastes, notamment issus de peau humaine normale, telle que par exemple issus de prépuce ou d'une peau d'un sujet adulte.
- 20. Méthode d'identification, selon l'une quelconque des revendications 12 à 19, caractérisée en ce que les cellules vivantes comprennent des cellules épithéliales, par exemple des kératinocytes, notamment issus de peau humaine normale, telle que par exemple issus de prépuce ou d'une peau d'un sujet adulte.
- 21. Méthode d'identification, selon l'une quelconque des revendications 12 à 20, caractérisée en ce que les cellules vivantes sont issues d'au moins une peau ayant une localisation particulière, par exemple du visage, de l'abdomen, ou des seins et pouvant être caractérisées comme étant vieillies ou comme étant exposées au rayonnement solaire ou non, ou d'une peau provenant d'une zone présentant des cicatrices ou des vergetures.
- 22. Méthode d'identification, selon l'une quelconque des revendications 12 à 21, caractérisée en ce que la méthode d'identification met en oeuvre un modèle de peau reconstruite, de préférence au moins un modèle de derme comprenant des fibroblastes, ou un modèle à base de biopsies.
- 23. Méthode d'identification, selon l'une quelconque des revendications 12 à 22, caractérisée en ce que la méthode d'identification met en oeuvre un modèle de peau reconstruite, de préférence au moins un modèle d'épiderme comprenant des kératinocytes.<Desc/Clms Page number 68>
- 24. Méthode d'identification, selon l'une quelconque des revendications 12 à 23, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape d'analyse de l'expression d'une séquence au moins de la protéine élastine ou d'une séquence de nucléotides codant la protéine élastine, notamment pour détecter une éventuelle stimulation de l'expression de la protéine élastine lorsque ladite substance active est en contact avec lesdites cellules vivantes.
- 25. Méthode d'identification, selon l'une quelconque des revendications 12 à 24, caractérisée en ce que la méthode comprend une étape d'immunodétection de l'expression de la protéine LOXL, notamment dans le but d'effectuer la traçabilité de la néo-élastogenèse, notamment dans les tissus épithéliaux et/ou dans les tissus conjonctifs, lesdits tissus étant issus d'au moins un modèle de peau reconstruite ou d'un modèle à base de biopsies.
- 26. Méthode d'identification, selon l'une quelconque des revendications 12 à 25, caractérisée en ce que ladite substance active est choisie parmi le groupe consistant en un extrait d'aneth, de groseille, de cardamone, du radis noir, du petit houx, de cannelle, d'avoine, de pomme de terre, de soie, les fermentations à base de bactéries lactiques, la gomme asae foetida, l'hexénoate d'éthyle et ses dérivés, le butyrate de méthyle et ses dérivés, et le décadiènoate d'éthyle et ses dérivés.
- 27. Méthode de localisation de l'expression de LOXL dans des tissus dans le but d'effectuer la traçabilité de la néo-élastogenèse, notamment dans des tissus conjonctifs, lesdits tissus étant issus d'au moins un modèle de peau reconstruite ou de biopsies, caractérisée en ce que la méthode comprend une étape d'immuno-détection de la protéine LOXL ou d'hybridation in situ d'au moins une partie d'une séquence de nucléotides codant LOXL.<Desc/Clms Page number 69>
- 28. Procédé de fabrication d'une composition cosmétique, ou neutraceutique, ou pharmaceutique, caractérise en ce qu'il comprend : - l'identification d'une substance active stimulant l'expression de LOXL en utilisant une méthode selon les revendications 11 à 26 ; - le mélange de ladite substance avec un excipient cosmétiquement, ou alimentairement, ou pharmaceutiquement acceptable.
- 29. Utilisation d'une substance stimulant l'expression de LOXL pour la fabrication d'une composition pour stimuler la formation de fibres élastiques, ladite substance étant choisie parmi le groupe consistant en un extrait d'aneth, de groseille, de cardamone, du radis noir, du petit houx, de cannelle, d'avoine, de pomme de terre, de soie, les fermentations à base de bactéries lactiques, la gomme asae foetida, l'hexénoate d'éthyle et ses dérivés, le butyrate de méthyle et ses dérivés, et le décadiènoate d'éthyle et ses dérivés.
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