FR2999926A1 - Utilisations d'une substance inhibitrice de la methylation de l'adn pour stimuler la formation des fibres elastiques - Google Patents

Abstract

La présente invention se rapporte en particulier à l'utilisation cosmétique d'une substance inhibitrice de la méthylation de l'ADN pour stimuler la formation de fibres élastiques et à ladite substance pour son utilisation pharmaceutique.

Description

La présente invention se rapporte au domaine de la santé, et notamment cosmétique, dermatologique et pharmaceutique, et concerne en particulier la stimulation de la formation des fibres élastiques. La présente invention se rapporte en particulier à l'utilisation cosmétique d'une substance inhibitrice de la méthylation de l'ADN pour stimuler la formation de fibres élastiques et à ladite substance pour son utilisation pharmaceutique. L'élastine est une protéine composant les fibres élastiques en s'associant avec d'autres molécules comme les fibrillines et les MAGP (Microfibrillar Associated Glycoproteins). L'élastine est synthétisée sous la forme de tropoélastine soluble qui acquiert ses propriétés physico-chimiques (insolubilité, élasticité) après sa réticulation intra- et intermoléculaire par une lysyl oxydase (LOX) et son dépôt sur les microfibrilles. Les fibres élastiques sont responsables de la propriété élastique des organes qui les contiennent (vaisseaux, parenchyme pulmonaire, cartilages élastiques, peau...). Le nom élastine fut réservé à la protéine formant la portion amorphe des fibres élastiques et leur conférant leur élasticité. Le vieillissement des peaux et des muqueuses est associé à une modification des réseaux fibrillaires, notamment celui des fibres élastiques qui se dégradent et ne se reforment plus correctement. De même, dans les cicatrices, le réseau de fibres élastiques ne se reforme pas correctement. Dans la peau, les fibres élastiques fonctionnelles sont formées par les fibroblastes du derme, mais certains composants nécessaires à l'élaboration des fibres élastiques ont aussi été retrouvés dans les cellules de l'épiderme. Le taux de renouvellement des fibres élastiques est très faible dans la vie adulte, bien que le taux global d'élastine de la peau puisse augmenter. Chez le nouveau né, les microfibrilles ne sont pas toutes complètement couvertes d'élastine, et le deviennent vers la puberté. Dès 40 ans, on voit apparaître sur les fibres des inclusions, plus fréquentes chez les femmes, puis la fragmentation des fibres élastiques et leur disparition sous la jonction dermo-épidermique (3DE). Ce fractionnement et/ou cette disparition sous la 3DE se traduisent par la perte d'élasticité de la peau et la formation de rides. La synthèse de fibres élastiques non fonctionnelles est observée lors du photo-vieillissement, mais cette augmentation s'accompagne de la perte accélérée des fibres élastiques sous la 3DE.

D'autre part, la néosynthèse de fibres élastiques s'effectue peu dans les cicatrices de personnes adultes, bien que paradoxalement, cette propriété soit en partie retrouvée chez les personnes âgées (plus de 70 ans) dont les fibres élastiques produites sont néanmoins très fragmentées. La sénescence cellulaire est définie comme un programme physiologique entrainant une dégradation des fonctions de l'organisme. Un des principaux éléments déclencheurs de sénescence est la perte de la séquence télomérique aux extrémités des chromosomes. Mais le vieillissement peut être influencé par une multitude d'autres facteurs extérieurs et notamment par voie épigénétique dont fait partie le phenomène de méthylation La méthylation de l'ADN consiste en l'addition d'un groupement méthyle (-CH3) à la place d'un atome d'hydrogène sur les cycles aromatiques de l'une des quatre bases azotées de l'ADN. Chez les mammifères, cette méthylation de l'ADN correspond à la modification de l'ADN par méthylation du carbone 5' des bases cytosines associées à une Guanine, appelé doublet CpG (Riggs et al, 1983). Environ 80 % des régions riches en îlots CpG sont méthylées dans le génome humain (Cheung et al, 2005) et les gènes méthylés n'étant plus accessibles par l'ADN polymérase II, sont inhibés. Cette méthylation de la cytosine en 5-méthylcytosine est conduite par les DNA méthyltransférases (DNMTs). La DNMT1, DNMT la plus abondante dans les cellules animales, est principalement responsable du maintien des profils de méthylation au cours des divisions cellulaires en reproduisant sur le brin néosynthétisé, lors de la réplication de l'ADN (Chen et Li, 2006) et de sa réparation (Mortusewicz et al, 2005), la méthylation lue sur le brin matrice. La DNMT2 a une fonction inconnue, identifiée par homologie de séquence avec DNMT1. 2 99992 6 3 Les DNMT3a et DNMT3b sont des enzymes à l'origine de l'introduction de méthylation de cytosine sur des sites CpGs précédemment non méthylés. Elles sont ainsi considérées comme méthylases de novo car elles sont capables d'ajouter un groupement méthyle à partir d'ADN nu (Growher et al, 5 2001). La DNMT3a est impliquée dans la méthylation des promoteurs de l'expression des gènes. La DNMT3b est impliquée dans la méthylation des séquences entourant les centromères Dans les cellules sénescentes, il a été observé une diminution de l'expression de la DNMT1, entrainant ainsi une hypométhylation globale 10 (Zhang et al, 2008). Il a d'ailleurs été démontré dans le derme, par comparaison des profils d'ADN méthylé de fibroblastes dérivées de personnes jeunes (d'âge inférieur à 23 ans) à celles de donneurs âgés (d'âge supérieur à 60 ans), que 75% des sites CpGs observés augmentaient leur niveau de méthylation de 15% (Koch et al, 2011). Ainsi, au cours du temps, les 15 modifications épigénétiques s'accumulent au niveau des doublets CpGs et initient la progression des cellules vers un phénotype de vieillissement. Certains sites CpGs se retrouvent concentrés, et sont souvent associés à des promoteurs. Ces séquences riches en doublets CpG sont appelées îlots CpGs et sont définis comme une région de 200 paires de bases avec une 20 teneur en GC de 55% minimum, représentant environ 70% des promoteurs chez l'homme (Saxonov et al, 2006). Bien que la majorité des sites CpGs soit méthylée dans le génome, ceux des promoteurs actifs ne le sont pas durant le développement et dans les tissus normaux, c'est-à-dire non sénescents et non néoplasiques (Bird A, 2002). Certains îlots CpGs deviennent donc 25 méthylés avec l'âge (Issa et al, 2000), dérégulant ainsi l'activité transcriptionnelle normale du gène. Le promoteur accumulant un haut niveau de méthylation, diminue la transcription du gène associé. Il a été démontré concernant les fibres élastiques qui confèrent des propriétés mécaniques et de protection à la peau, que les gènes qui codent 30 pour les protéines des fibres élastiques sont diminués au cours du vieillissement. Dans le derme humain, la réticulation de l'élastine soluble est 2 99992 6 4 orchestrée par la lysyl oxydase de type-1 (LOXL1) pour obtenir des fibres élastiques matures. Des études ont récemment montré que : - l'activité du gène LOXL diminue au cours du vieillissement (Cenizo V. et al Exp. Dermatol. 2006) 5 - l'activation de ce gène LOXL, en l'absence de TATA box, se fait grâce à la fixation de transcription SP1 qui se fixe sur des séquences consensus riches en Cytosine et Guanine (Debret et al., 3 Invest Dermatol 2010). - le gène LOXL pourrait être régulé par des marques épigénétiques comme la méthylation puisque le promoteur LOXL contient des régions riches 10 en îlots CpG (Debret et al., J Invest Dermatol 2010). Partant de ces constats, il s'avère que de nombreux gènes exprimés dans la peau sont activés par le même mécanisme puisqu'ils portent de nombreux îlots CpG aux environs de la zone promotrice. Les plantes du genre Origanum appartiennent à la famille des 15 Lamiacées. En particulier, la marjolaine ou Origanum majorana, encore dénommée origan des jardins, est une plante annuelle originaire de l'Europe du sud et notamment de l'est du bassin méditerranéen. Elle possède toute une liste de vertus médicinales, et c'est spécialement pour son action antispasmodique, anti-bactérienne et anti-infectieuse qu'elle est utilisée, 20 notamment pour soigner les états d'anxiété, de nervosité, l'insomnie, les migraines, les rhumes et les affections des bronches. Les inventeurs ont découvert de manière surprenante et tout à fait inattendue que l'utilisation d'une substance inhibitrice de la méthylation de l'ADN permet de stimuler l'élasticité de la peau. En particulier, et sans vouloir 25 être liés par une quelconque théorie, les inventeurs ont trouvé que l'utilisation d'une telle substance permet de réactiver l'expression de gènes qui sont régulés par un mécanisme d'hyperméthylation notamment au cours du vieillissement et/ou du stress UV. Les inventeurs ont en particulier montré qu'un extrait de plante du genre Origanum, et notamment de marjolaine ou 30 Origanum majorana, possédait cette propriété d'action sur l'expression des gènes impliqués dans la synthèse des fibres élastiques et/ou leur organisation. s L'invention concerne ainsi l'utilisation d'une substance inhibitrice de la méthylation de l'ADN dans une composition cosmétique ou pharmaceutique comprenant, et en particulier comprenant au moins un extrait de plante du genre Origanum, et avantageusement au moins un extrait de marjolaine ou Onganum majorana. C'est ainsi que la présente invention a pour objet, selon un premier aspect, l'utilisation cosmétique d'une substance inhibitrice de la méthylation de l'ADN, pour stimuler la formation de fibres élastiques. Dans le cadre de l'invention, on entend par « substance inhibitrice de la méthylation de l'ADN» toute substance capable d'inhiber de manière directe ou indirecte, partiellement ou totalement la méthylation de l'ADN, en particulier des régions promotrices des gènes. Selon l'invention, l'inhibition est spécifique et non globale. Ainsi elle exclue l'inhibition totale ou partielle de la méthylation des gènes connus pour être des gènes inducteurs de cancer. Dans le cadre de l'invention, on entend par « stimuler la formation de fibres élastiques » toute augmentation et/ou amélioration de leur synthèse et/ou de leur organisation permettant d'obtenir des fibres élastiques. Dans le cadre de l'invention, on entend par «réactiver l'expression des gènes », tout rétablissement et/ou prévention de diminution de l'expression des gènes dont l'expression est diminuée par la méthylation de l'ADN, de nature pathologique ou non. On entend par « méthylation de l'ADN de nature non pathologique », la méthylation qui ne résulte pas d'une pathologie et/ou n'induit pas une pathologie, et en particulier la méthylation naturelle chronoinduite et/ou induite par des agents extèrieurs (agressions chimiques et/ou mécaniques, UV, stress cellulaire....). Les manifestations des effets d'une méthylation non pathologique sont ainsi d'ordre cosmétique, en particulier esthétiques et/ou inconfortables.

Avantageusement, la substance inhibitrice de la méthylation de l'ADN qui est utilisée selon la présente invention permet en particulier d'améliorer le dépôt et/ou l'organisation des fibres élastiques et/ou à réactiver l'expression des gènes, préférentiellement choisis parmi le gène codant LOXL (lysyl oxydase-like 1), le gène codant MAGP-1 (microfibril associated glycoprotein 1), le gène codant la fibuline 5. Sont considérés comme efficaces les substances permettant d'obtenir une inhibition de la méthylation de l'ADN suffisante pour conduire à une activation ou une augmentation d'environ 1,2, préférentiellement 1,5 fois de l'expression génique et/ou protéique et/ou de l'activité de protéines cibles impliquées dans la formation de fibres élastiques par rapport au niveau d'expression et/ou d'activité sans mise au contact avec lesdites substances.

De manière préférée, la substance inhibitrice est utilisée selon la présente invention pour réduire les rides cutanées, pour lutter contre le relâchement des tissus, notamment lorsque le relâchement des tissus est observé au cours du vieillissement ou au cours des expositions solaires, pour densifier la matrice extracellulaire, pour raffermir les tissus sous-cutanés, pour exercer un effet anti-rides, pour améliorer l'aspect et la souplesse des cicatrices, notamment des cicatrices dystrophiques et kéloïdes, ou pour lutter contre les vergetures. Différentes méthodes bien connues dans le domaine permettent d'évaluer le niveau de méthylation de l'ADN, en particulier au niveau des promoteurs riches en CpG. Parmi ces méthodes, on peut notamment citer la PCR Haute Définition de température de fusion (PCR FIRM High Resolution Melting), qui permet la détection de la méthylation au niveau de promoteurs définis grâce une étape d'amplification par PCR à l'aide d'amorces spécifiques. La température de fusion de chaque échantillon est directement proportionnelle à la quantité de cytosines méthylées contenues dans l'amplicon. La PCR Haute Définition de température de fusion est une méthode particulièrement préférée. Ces méthodes permettent donc d'identifier ou de sélectionner un ingrédient permettant de diminuer le niveau de méthylation du gène observé.

La substance inhibitrice de la méthylation de l'ADN qui est utilisée dans le cadre de l'invention inhibe en particulier l'action de la DNMT3, préférentiellement l'action de la DNMT3a, notamment sur le promoteur du gène codant LOXL, et de préférence sans modifier la synthèse ou l'activité de DNMT1. L'activité inhibitrice de la substance à utiliser selon l'invention peut également être vérifiée par l'augmentation conjointe d'autres gènes cibles de DNMT3a, et notamment à l'aide d'une technique de PCR quantitative ou Q- PCR. En particulier, parmi les substances inhibitrices que l'on peut utiliser selon l'invention, on préfère les substances qui inhibent la méthylation d'un ou de plusieurs gènes choisis parmi le gène codant LOXL (Lysyl Oxydase-Like 1), le gène codant MAGP-1 (Microfibril Associated GlycoProtein 1), le gène codant la fibuline 5 et en particulier celles qui inhibent la méthylation d'un ou de plusieurs de ces gènes au niveau de leur région promotrice. Dans ce texte, on entend par le terme « LOX », l'isoforme initiale de la protéine de la lysyl oxydase LOX. Dans ce texte, on entend par le terme « LOXL », l'isoforme L de la protéine de la lysyl oxydase, également nommée LOXL1. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, la substance inhibitrice qui est utilisée dans le cadre de la présente invention est un extrait d'une plante contenant des terpènes, et notamment monoterpènes. En particulier, la substance inhibitrice est un extrait d'une plante du genre Onganum, et notamment un extrait d'Origanum majorana encore nommée marjolaine, origan des jardins, marjolaine officinale, marjolaine à coquilles ou encore Majorana hoitensis Moench. Les parties de la plante, les solvants ainsi que les modes d'extraction qui peuvent être utilisés pour préparer l'extrait de plante ne sont pas 25 limitants. La substance inhibitrice selon l'invention peut ainsi être extraite à partir de l'ensemble de la plante ou d'une ou plusieurs parties de la plante, et notamment choisie parmi la racine, la tige, l'écorce, la fleur, la graine, le germe et/ou la feuille et leurs mélanges. L'extrait selon l'invention est 30 préférentiellement extrait des parties aériennes de la plante, en particulier la tige, les feuilles et leur mélange. s L'extrait peut alors être obtenu par les méthodes d'extraction de végétaux connues dans le domaine, par exemple par macération d'au moins une partie de la plante de préférence entre 1 et 10% (p/p) dans un solvant ou un mélange de solvants, de préférence un solvant polaire pratique, et avantageusement dans l'eau, un alcool, un glycol, un polyol, un mélange eau/alcool, eau/glycol ou eau/polyol (tels que l'eau en mélange avec éthanol, glycérol, butylène glycol ou autres glycols, tel que xylitol etc.) de 100/0 à 0/100 (v/v). Les extraits obtenus sont ensuite de préférence centrifugés et/ou filtrés et/ou distillés afin de récupérer la fraction soluble active (extrait brut). Des étapes supplémentaires de décoloration et/ou désodorisation peuvent être effectuées sur l'extrait à n'importe quel stade de l'extraction et selon les techniques connues par l'Homme du métier. L'extrait végétal est préférentiellement dissous dans un solvant notamment polaire, tel que l'eau, un alcool, un polyol, un glycol, ou un de leurs mélanges, préférentiellement de l'eau. La substance active peut être ensuite concentrée par évaporation du solvant, par exemple par lyophilisation ou par atomisation. Selon un mode de réalisation préférée, on utilise un extrait aqueux d'Orginanum majorana obtenu à partir des parties aériennes de la plante, préférentiellement des feuilles et encore préférentiellement de 5 % des parties aériennes de la plante. L'extrait est alors solubilisé dans un véhicule aqueux, préférentiellement de l'eau. De manière particulièrement préférée, cet extrait préférentiellement des parties aériennes de la plante, est obtenu par macération dans de l'eau, en particulier de l'eau distillée, pendant au moins 2 heures à température ambiante de préférence pendant 4h, ou à 4°C pendant une nuit. L'extrait est ensuite utilisé conformément à la présente invention, éventuellement après filtration, préférentiellement sur filtre PVDF ou nitrocellulose de porosité 0,45 pm, et le pH ajusté si besoin, de préférence entre 5 et 7,5. Selon l'invention, l'extrait végétal d'Origanum, préférentiellement de Origanum majorana peut être utilisé seul ou dans une composition cosmétique, ou pharmaceutique, notamment dermatologique à une concentration comprise entre 1.10-4 et 10% en poids, et avantageusement entre 1.10-4 et 5% et plus particulièrement entre 1.10-3 et 3% en poids, encore préférentiellement 1.10-2 à 1% par rapport au poids de la composition totale. La substance est préférentiellement utilisée en étant incluse dans une composition cosmétique, ou pharmaceutique, et préférentiellement dermatologique, notamment en combinaison avec un véhicule cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique approprié.

Au sens de la présente invention, le terme « véhicule cosmétique ou pharmaceutique approprié », signifie que la composition ou les composants de celle-ci sont adaptés à l'utilisation en contact avec la peau et/ou les muqueuses humaines sans toxicité, incompatibilité, instabilité, réponse allergique, ou leurs équivalents, indue.

Les compositions selon l'invention peuvent contenir tout solvant approprié et/ou tout véhicule approprié et/ou tout excipient approprié, éventuellement en combinaison avec d'autres composés d'intérêts. De ce fait, pour ces compositions, l'excipient contient par exemple au moins un composé choisi parmi le groupe consistant en les conservateurs, les émollients, les émulsifiants, les tensioactifs, les hydratants, les épaississants, les conditionneurs, les agents matifiant, les stabilisants, les antioxydants, les agents de texture, les agents de brillance, les agents filmogènes, les solubilisants, les pigments, les colorants, les parfums et les filtres solaires. Ces excipients sont de préférence choisis parmi le groupe consistant en les acides aminés et leurs dérivés, les polyglycérols, les esters, les polymères et dérivés de cellulose, les dérivés de Lanoline, les phospholipides, les lactoferrines, les lactoperoxidases, les stabilisants à base de sucrose, les vitamines E et ses dérivés, les cires naturelles et synthétiques, les huiles végétales, les triglycérides, les insaponifiables, les phytosterols, les esters végétaux, les silicones et ses dérivés, les hydrolysats de protéines, l'huile de Jojoba et ses dérivés, les esters Iipo/hydrosolubles, les betaines, les aminoxides, les extraits de plantes les esters de Saccharose, les dioxydes de Titane, les glycines, et les parabens, et encore de préférence parmi le groupe consistant en le butylène glycol, pentylene glycol, hexylene glycol, caprylyl glycol, le stéareth-2, le stéareth-21, le glycol-15 stéaryl éther, le cétéaryl alcool, le phénoxyéthanol, le méthylpara ben, l'éthylparaben, le propylparaben, le butylparaben, I, les tocopherols naturels, la glycérine, le dihydroxycetyl sodium phosphate, l'isopropyl hydroxycétyl éther, le glycol stéarate, le triisononanoin, l'octyl cocoate, le polyacrylamide, l'isoparaffine, le laureth-7, un carbomer, le propylène glycol, le glycérol, le bisabolol, une diméthicone, l'hydroxyde de sodium, le PEG 30-dipolyhydroxystérate, les caprique/caprylique triglycérides, le cétéaryl octanoate, le dibutyl adipate, l'huile de pépin de raisin, l'huile de jojoba, le sulfate de magnésium, I'EDTA, une cyclométhicone, la gomme de xanthane, l'hydroxyethylcellulose, l'acide citrique, l'acide sorbique, le lauryl sulfate de sodium, les cires et les huiles minérales, Visostéaryl isostéarate, le dipélargonate de propylène glycol, l'isostéarate de propylène glycol, le PEG 8, Beeswax, les glycérides d'huile de coeur de palme hydrogénée, les glycérides d'huile de palme hydrogénée, l'huile de lanoline, l'huile de sésame, le cétyl lactate, le lanoline alcool, l'huile de ricin, le dioxyde de titane, les dérivés de la cellulose ou de la cellulose microcristalline, les carbonates alcalino-terreux, le phosphate de magnésium, les amidons, les amidons modifiés, le lactose pour les formes solides, le beurre de cacao ou les stéarates de polyéthylèneglycol, l'eau, les solutés aqueux, le sérum physiologique, les solutés isotoniques, le lactose, le saccharose, le polyéthylène basse densité, une solution isotonique salée. Avantageusement, les compositions cosmétiques sont formulées sous une forme choisie parmi le groupe consistant en une solution, aqueuse ou huileuse, une crème ou un gel aqueux ou un gel huileux, notamment en pot ou en tube, notamment un gel douche, un shampoing ; un lait ; une émulsion, une microémulsion ou une nanoémulsion, notamment huile-danseau ou eau-dans-huile ou multiple ou siliconée ; une lotion, notamment en flacon de verre, de plastique ou en flacon doseur ou en aérosol ; une ampoule un savon liquide ; une pommade ; une mousse ; un produit anhydre, de préférence liquide, pâteux ou solide, par exemple sous forme de bâtonnet, notamment sous forme de rouge à lèvre. Avantageusement, les compositions pharmaceutiques, en particulier dermatologiques sont formulées sous forme de choisie parmi le groupe consistant en une solution, aqueuse ou huileuse, une crème ou un gel aqueux ou un gel huileux, notamment en pot ou en tube ; un lait ; une émulsion, une microémulsion ou une nanoémulsion, notamment huiledanseau ou eau-dans-huile ou multiple ou siliconée ; une lotion, notamment en flacon de verre, de plastique ou en flacon doseur ou en aérosol ; une ampoule ; un pain dermatologique ; une pommade ; une mousse ; un produit anhydre, de préférence liquide, pâteux ou solide, par exemple sous forme de bâtonnet. Les compositions pharmaceutiques suffisamment liquides peuvent être administrées, notamment par voie parentérale, oculaire, pulmonaire, orale ou nasale. Les compositions pâteuses ou sèches (pâtes, poudres, comprimés, gélules, granules, suppositoires..) peuvent être introduites dans le corps notamment par voie orale, sublinguale, nasale ou rectale. Avantageusement, quand la formulation de la composition le permet, la voie d'administration est cutanée ou transmuqueuse, notamment par application de la composition sur la peau ou sur une muqueuse. Parmi ces différentes formulations et voies d'administration, l'homme de l'art choisira celle adéquate à l'efficacité recherchée et à la zone à traiter. Avantageusement, une ou plusieurs substance(s) in hibitrice(s) sont utilisées, éventuellement associées à une ou plusieurs autre(s) substance(s) active(s) d'intérêt cosmétique, qui possèdent préférentiellement des propriétés complémentaires, voire synergiques, notamment sur la formation des fibres élastiques. De nombreux ingrédients cosmétiquement actifs sont connus par l'homme du métier pour améliorer l'apparence physique de la peau. De la même manière, une ou plusieurs substance(s) inhibitrice(s) sont avantageusement utilisées, éventuellement associées à une ou plusieurs autre(s) substance(s) active(s) d'intérêt pharmaceutique, en particulier dermatologique, qui possèdent préférentiellement des propriétés complémentaires, voire synergiques, notamment sur la formation des fibres élastiques. L'homme du métier sait formuler les compositions cosmétiques, pharmaceutiques, de préférence dermatologiques, pour obtenir les meilleurs effets. De manière particulièrement avantageuse, la substance inhibitrice selon l'invention, en particulier un extrait de plante du genre Onganum préférentiellement Ofiganum majorana selon l'invention peut être utilisé, éventuellement dans une composition cosmétique ou pharmaceutique, préférentiellement dermatologique, préférentiellement celles précédemment décrites, comme seul agent actif, ou en combinaison avec un ou plusieurs autres agents actifs choisis parmi : 1) un agent cosmétique et/ou dermatologique ayant une efficacité complémentaire sur les fibres élastiques en particulier : - un agent inhibiteur de MMP en particulier parmi des MMP-1, MMP-2, MMP3, MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP44, MMP-15, MMP-16 et MMP47, notamment un inhibiteur tissulaire des métalloprotéinases (TIMP) tel que les peptides connus dans l'art antérieur sous TIMP4, TIMP-2, TIMP-3 et TIMP-4, un inhibiteur de MMP tel que l'acide ursolique, les caroténoïdes, la vitamine C, les isoflavones comme la genistéine, le lycopène, le rétinol, l'acide rétinoïque et leurs dérivés et/ou un extrait végétal en contenant, et/ou l'extrait de malt commercialisé par la Demanderesse sous le nom de Collalift TM. - un agent anti-radicalaire tel que la vitamine E, les bioflavonoïdes, le coenzyme Q10 ou ubiquinone, l'acide nordihydroguaiaretique et leur dérivés et/ou un extrait végétal en contenant, certaines enzymes comme la catalase, le superoxyde dismutase, la lactoperoxydase, le glutathion peroxydase et les quinones réductases. - un agent inhibiteur d'élastase tels que le micrornérol - un agent de stimulation de l'expression de LOXL en particulier l'extrait d'aneth décrit dans la demande de brevet FR2855968 - un agent stimulant la synthèse de fibronectine, en particulier un extrait de mais, un tel extrait étant notamment commercialisé par la Demanderesse sous le nom DelinerTM et/ou 2) un agent cosmétique et/ou dermatologique ayant une efficacité complémentaire sur le traitement et/ou la prévention du vieillissement cutané : - un agent de protection du facteur de croissance des fibroblastes (FGF2) de la matrice extracellulaire contre sa dégradation et/ou sa dénaturation, notamment un extrait d'Hibiscus Abelmoscustel que décrit dans la demande de brevet au nom de la Demanderesse déposée sous le numéro FR0654316 et/ou un agent de stimulation de croissance des fibroblastes par exemple un extrait de soja fermenté contenant des peptides, connu sous le nom de PhytokineTM commercialisé par la Demanderesse et également décrit dans la demande de brevet EP1119344 B1 (Laboratoires Expanscience), et préférentiellement une combinaison de ces deux extraits. - un agent stimulant la synthèse de laminine, en particulier un extrait de malt modifié par biotechnologie, un tel extrait étant notamment commercialisé par la Demanderesse sous le nom Basaline TM ' t - un agent de regonflement notamment les sphères de comblement d'acide hyaluronique commercialisé par la Demanderesse sous le nom de Hyaluronic Filling Spheres TM. - un agent antipollution, c'est-à-dire un composé capable de piéger l'ozone, les composés aromatiques mono- ou polycycliques tels que le benzopyrène et/ou les métaux lourds tels que le cobalt, le mercure, le cadmium et/ou le nickel ; tels que la vitamine C et ses dérivés, les phénols et polyphénols, en particulier les tannins, l'acide ellagique et l'acide tannique, l'épigallocatéchine et les extraits naturels en contenant, les extraits de thé, en particulier de thé vert, les anthocyanes, les acides phénols, les stilbènes, en particulier le resvératrol et leurs dérivés. - un agent inhibiteur de la glycation comme ceux décrits dans la demande de brevet au nom de la Demanderesse W02009/007411, et/ou un agent de déglycation comme ceux décrits dans la demande de brevet au nom de la Demanderesse W02009/007412. - un agent à action globale anti-age, notamment anti-taches pigmentaires en particulier la niacinamide ou vitamine B3; - des filtres UVA et/ou UVB, sous forme de composés organiques ou inorganiques, tels que les oxydes de zinc, de fer, de zirconium, de cérium et/ou de titane, l'éthylhexyl salicylate, éthylhexyl methoxycinnamate, butylmethoxydibenzoyl méthane, éventuellement enrobés, émulsionnés ou encapsulés en particulier sous la forme de liposome. L'agent selon l'invention peut également être administré sous forme de et/ou en association avec une microsphère d'ADN marin encapsulant des dérivés de vitamine C et E se libérant sous irradiation UV, notamment celles commercialisées sous le nom de Smartvector UV Tm et décrites dans la demande de brevet au nom de la Demanderesse FR2848854. Selon un deuxième aspect, la présente invention concerne un procédé de soin cosmétique qui comprend l'application sur la peau de la substance inhibitrice telle que définie ci-dessus ou d'une composition comprenant une telle substance inhibitrice. Selon la présente invention, on entend par "application sur la peau ou topique" l'application de la composition sur la surface de la peau et/ou les muqueuses, notamment par application directe ou par vaporisation. Selon l'invention, on désigne par les muqueuses notamment la muqueuse buccale, labiale, nasale, oculaire, anale et/ou urogénitale, en particulier vaginale. De manière préférentielle, l'extrait de plante du genre Origanum préférentiellement Origanum majorana selon l'invention, préférentiellement sous la forme d'une composition cosmétique selon l'invention est appliqué sur au moins une zone du corps où on souhaite inhiber la méthylation et/ou rétablir l'expression des gènes en particulier sur au moins une zone du corps où il est inconfortable, inesthétique et/ou désagréable, cette ou ces zones étant préférentiellement une surface du corps choisie parmi la peau du visage, incluant le front, le contour des lèvres et /ou le contour des yeux (périorbite), l'oval du visage et la peau du corps incluant le cou, des mains, les bras, les cuisses, le ventre, les hanches et/ou le buste. La substance inhibitrice de la méthylation de l'ADN selon l'invention, préférentiellement l'extrait d'Origanum majorana, est en particulier destinées au soin et/ou au traitement cosmétique des peaux matures et/ou présentant des signes de vieillissement naturel ou induit, notamment UV induit, en particulier des rides. En particulier, le procédé de soin cosmétique selon l'invention consiste en la réduction des rides cutanées, la lutte contre le relâchement des tissus, notamment lorsque le relâchement des tissus est observé au cours du vieillissement ou au cours des expositions solaires, la densification de la matrice extracellulaire, le raffermissement des tissus sous-cutanés, les effets anti-rides, l'amélioration de l'aspect esthétique des cicatrices et la lutte contre les vergetures.

Selon un troisième aspect, la présente invention concerne une substance inhibitrice de la méthylation de l'ADN pour son utilisation pharmaceutique pour stimuler la formation de fibres élastiques. Ainsi, la substance qui est utilisée dans ce cadre permet d'induire une néo-élastogenèse des tissus, et notamment de stimuler l'élasticité des tissus ainsi obtenus, d'améliorer la qualité du tissu cicatriciel, notamment des cicatrices dystrophiques et kéloïdes et pour la prévention et/ou traitement thérapeutique de la pathologie cutis laxa. Préférentiellement, la substance inhibitrice de la méthylation de l'ADN, préférentiellement l'extrait d'Origanum, encore préférentiellement d'Origanum majorana, est utilisée en étant incluse dans une composition pharmaceutique selon l'invention précédemment définies, notamment en combinaison avec un véhicule pharmaceutique approprié, de préférence dermatologique. De nombreux ingrédients pharmaceutiquement actifs sont connus par 30 l'homme du métier pour améliorer la santé de la peau. L'homme du métier sait formuler les compositions pharmaceutiques pour obtenir les meilleurs effets.

Tous les modes de réalisation préférés et leurs combinaisons qui sont mentionnés ci-dessus concernant la substance inhibitrice à utiliser en cosmétique constituent également des modes de réalisation préférés s'agissant de son utilisation pharmaceutique.

Diverses autres caractéristiques ressortent de la description faite ci- dessous en référence aux figures annexées dans lesquelles : - la figure 1 représente la cartographie du plasmide Pcep4-DNMT3A utilisé pour la transfection de la DNMT3A dans des cellules humaines HEK 293 EBNA - la figure 2 représente un immunomarquage de l'élastine sur fibroblastes en monocouche traités par l'extrait d'Origanum majorana et les témoins positifs (5-azadC et TGF81) - la figure 3 représente un immunomarquage de la lysyl oxydase like (LOXL) sur fibroblastes en monocouche traités par l'extrait d'Origanum majorana et les témoins positifs (5-azadC et TGF81). EXEMPLES Dans les exemples, tous les pourcentages sont donnés sont en poids sauf indication contraire, la température est exprimée en degré Celsius sauf indication contraire, et la pression est la pression atmosphérique, sauf indication contraire. EXEMPLE 1 : Réalisation d'un extrait selon l'invention Un extrait végétal a été préparé comme suit : A 50 g d'eau distillée ont été ajoutés 2,5 g de matière première broyée (broyeur IKA) obtenue à partir de parties aériennes (mélange de tige et de feuilles) d'Origanum majorana et laissés en macération une nuit à 4°C sous agitation magnétique, puis l'extrait a été centrifugé à 8 000 tours par minute (rpm), avant d'être filtré (filtre PVDF 0,45 pm). Le pH initial de l'extrait aqueux a été mesuré à l'aide d'un pH mètre (microcomputer pHmeter HANNA instruments) et si nécessaire il a été ajusté par une solution de soude ou HC1 pour être compris entre 5 et 7,5. 2 99992 6 17 EXEMPLE 2: Etude par RT-PCR de l'effet d'un extrait de plante Origanum maiorana sur la stimulation de l'expression des 3 gènes : LOXL, Fibuline 5 et MAGP-1 connus pour porter des régions riches 5 en CpG potentiellement cibles de la méthvlation de novo L'effet de l'extrait de plante Onganum majorana obtenu à l'exemple 1 a été testé sur l'expression des 3 gènes suivants : gène codant pour la LOXL (lysyl oxydase-like 1), pour la MAGP-1 (microfibril associated glycoprotein 1) et pour la Fibuline-5. Ces gènes sont potentiellement éteints par 10 l'hyperméthylation au cours du vieillissement car les promoteurs sont porteurs d'Îlots CpG. L'association entre LOXL et les fibres élastiques ou les microfibrilles a été clairement démontrée. LOXL est l'enzyme responsable de la maturation de l'élastine par réticulation et permet donc la formation de fibres élastique 15 fonctionnelles et LOXL associée aux microfibrilles constitue la trame sur laquelle se dépose l'élastine. Les inventeurs ont d'ailleurs mis en évidence le déficit d'expression de LOXL dans les zones cicatricielles, ainsi que au niveau du derme de la peau humaine à différents âges, donc au cours du vieillissement. 20 Les fibroblastes d'un donneur de 62 ans ont été isolés de la peau abdominale après chirurgie esthétique. Après digestion à la coliagénase du derme, les fibroblastes ont été cultivés en monochouche à 37°C avec 5% de CO2 dans un milieu spécifique à la culture des fibroblastes : Dulbecco% modified Eagle's medium (DMEM-Ham F12, 50/50 y/y ; Invitrogen, USA) supplémenté 25 avec 10% de serum de veau (ThermoFisherScientific) et 1 ml d'antibiotique Normocine (InvivoGen, USA). Les cellules ont été cultivées à différents passages mais n'ont pas excédé les passages 7 (P7) ou 8 (P8) afin de conserver les profils de méthylation. Les cellules en P8 ont été ensemencées à 25 000 cell/cm2 en plaques 24 30 puits, avec pour chaque condition N=4, en milieu spécifique à la croissance des fibroblastes (FGM, Promocell). 2 99992 6 18 - ETUDE DE LA VARIATION DE L'EXPRESSION DES 3 GEIVES CIBLES L'extrait préparé à l'exemple 1 a été appliqué à une concentration de 1% pendant 24h sur les cellules à confluence dans un milieu de cultrue défini sans serum FGM (PromocellTm). Les témoins positifs suivants ont été 5 également appliqués dans les mêmes conditions : le 5-aza-2'-deoxycytidine à 5 Mm.La valeur du contrôle non traité a été ramenée à 1. VALIDATION EN EFFET DOSE L'extrait préparé comme décrit à l'exemple 1 a été appliqué, à des concentrations de 0,01% à 1% pendant 3 jours sur les cellules à pré- 10 confluence et leur traitement a été arrêté 24h après que les cellules aient atteint la confluence. Le témoin positif suivant a été également appliqué dans les mêmes conditions : le 5-aza-2'-deoxycytidine à 5 pM. Le traitement des cellules a été arrêté par un rinçage en PBS contenant du Ca2+ et du Mg2+ et les plaques ont été congelées à sec à -80°C, en attendant l'extraction des 15 ARNs totaux. - EXTRAC7ION DES ARN TOTAUX Les ARN totaux des fibroblastes cultivés en monocouche ont été extraits en plaque 96 puits à l'aide du Kit SV96 total RNA isolation system (Promega), qui permet d'isoler et de purifier les ARNs de cellules issues de culture. Les 20 ARN extraits dilués ont été quantifiés par spectrophotométrie à 260/280 nm au spectrophotomètre Spectramax 190 (Molecular Device) et à l'aide du logiciel SoftMax Pro. Puis les ARNs extraits ont été dilués de façon à être à une concentration finale de 5 ng/pL pour la Q-RT-PCR et répartis dans les plaques PCR, qui ont été congelées à -80°C en attendant la Q-RT-PCR. 25 - REAC770N QUANT1TA77VE EN CHAINE PAR POLYMERASE APRES TRANSCRIPTION INVERSE (Q RT PCR) Chaque protocole de réaction d'amplification a été réalisé avec le kit Quantitect Syber Green Kit (D (Qiagen, USA) qui contient du SYBR Green, intercalant fluorescent de l'ADN double brin permettant à chaque cycle, la 30 détection de fluorescence des produits PCR en fin d'élongation (ADNc). Les amplicons sont ainsi visualisés et quantifiés au fur et à mesure de leur synthèse par l'émission de fluorescence. Les amorces utilisées sont détaillées dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1. : Séquences des amorces (spécifiques à chaque gène) utilisées 5 pour les RT-PCR. Nom séquence amorce taille taille su l'ADN génomique Tm amplicon attendue amplicon Actine Up GTGGGGCGCCCCAGGCACCA 540 pb 1114 pb 86-87°C Actine Down CTCCTTATTGTCACGCACGATTTC LOXL Up GACTTCGGCAACCTCAAGC 220 pb 2359 pb 82-83°C LOXL Down TGTTGCAGAAACGTAGCGAC FBLN5 Up GTGAACCAGCCCGGCACATAC 259 pb 5402 pb 83°C FBLN5 Down CACGTCCATGTCCCGGTACAA MAGPI Up GCCTACCTCTTCCTGCTATTCC 307 pb 2563 pb 84-85°C MaGP1 Down GGGTGCACGGGTACTGTTC La réaction d'amplification a été effectuée avec le termocycleur chromo4 Real 10 Time PCR detector (Biorad DNA Engine Peltier). Un mix PCR de 50 pL contenant 10 pL d'ARNs à 5 ng/ml, 25 pL de mix SybrGreen, 0,5 pL de mix enzymatique et 0,625 pL de chaque amorce à 400 pM qsp eau été préparé dans les plaques PCR (après décongélation de celles-ci). Puis la plaque PCR a été centrifugée pendant 1 min à 1500 rpm. 15 Un protocole comportant 40 cycles d'amplification a été réalisé. Après avoir déposé la plaque PCR a été incubée à 50°C pendant 30 min, permettant la transcription inverse de l'ARN en ADNc par la transcriptase inverse, puis à 95°C pendant 15 min, correspondant à l'étape de dénaturation. Après avoir été incubée à 94°C pendant 15 secondes, un gradient de température de 20 56°C à 65°C est réalisé pendant pendant 30 secondes, permettant l'hybridation des amorces du brin d'ADNc, qui est ensuite élongé à 72°C pendant 30 secondes. Une incubation de la plaque à 78°C pendant 15 2 99992 6 20 secondes permet d'éliminer des éventuels dimères d'amorces avant la lecture de fluorescence. Une fois que la plaque ait été lue, les étapes d'amplification à partir de l'hybridation du brin d'ADNc sont répétées 39 fois. Une incubation à 90°C pendant 1h a été réalisée, suivie d'une incubation à 30°C pendant 1h.

Les courbes de fusion ont été évaluées de 50°C à 90°C par une lecture tous les 1°C (10 secondes d'incubation à chaque fois) et enfin une incubation finale à 17°C jusqu'à récupération de la plaque PCR. ANALYSE DES RESULTATS Les résultats bruts obtenus pour chaque gène après Q-RT-PCR ont été rapportés à l'expression de l'actine afin de normaliser les résultats. Puis les résultats normalisés ont été rapportés à la valeur moyenne du contrôle non traité afin de mesurer les régulations d'expression en fonction des différents témoins positifs potentiels et temps de traitements. Pour l'analyse du niveau d'expression des gènes, on estime qu'un gène est stimulé lorsque son expression est supérieure à 1,2 et qu'il est inhibé quand son expression est inférieure à 0,8. Les résultats sont regroupés dans le tableau 2 suivant et montrent que l'extrait d'Onganum majorana stimule LOXL.

Tableau 2 Cette effet a par ailleurs été validé en effet dose sur deux gènes (MAGP1 et FBLN5). L'extrait d'Origanum majorana s'est montré efficace sur l'induction de ces 2 gènes dès la concentration de 0,01% avec une efficacité croissante proportionnellement à la dose appliquée. Les résultats sont regroupés dans le tableau 3 suivant : Tableau 3 MAGP1 FBLN5 Contrôle (non traité) Origanum majorana 1% 1.66 Moyenne 1.00 Ecart-type 0.20 0.32 Ori anum ma'orana 0,1% 1.37 0.06 EXEMPLE 3: Evaluation du niveau de méthvlation de l'ADN (promoteur LOXL) par la technique HRM - CULTURE DES CELLULES Les fibroblastes dermiques d'un donneur de 62 ans ont été cultivés en plaque 6 puits en FGM complet (PromocellTm). A sous-confluence, ils ont été traités avec l'extrait de plante préparé comme indiqué ci-dessus à 1% vol/vol en FGM complet (PrornocellTM) puis les cellules ont été stoppées à 24h post-confluence. Les tapis cellulaires on été séchés et conservés à -80°C avant analyse. EXTRACTIO1V D'ADNG (QIAAmp DNA MINI KIT REF. 51304, QIAGENO) Pour extraire l'ADN génornique de ces tapis cellulaires, une étape de lyse des cellules a été réalisée avec le tampon de lyse du kit QIAamp (ref 51304) et de la protéinase K à 56°C sur la nuit. La purification sur mini-colonnes des ADNg est réalisée le lendemain. Les ADNg sont élués avec 30p1 d'eau ultrapure pour un puits de plaque 6 puits puis, ils sont dosés au spectrophotomètre nanodrop (Thermo scientific). - CONVERSION AU BISULFITE DE SODIUM (EPTTECT PLUS DNA BISULF1 lt KIT REF.59124, QIAGENT el) Le principe de la conversion est de transformer toutes les Cytosines non méthylées en Uracils. Les Cytosines méthylées sont protégées de la conversion. On utilise 1pg d'ADNg extraits pour réaliser la conversion au bisulfite de sodium. Après la conversion, les ADNg convertis sont dosés au Origanum ma'orana 0 01% Origanum ma'orana 0 05% 21 2 99992 6 22 nanodrop de manière approximative car l'ADNg est simple brin et le ratio en base est modifié par la conversion. On dilue en eau versai les ADNg convertis de façon à avoir 1Ong/p1 et on utilise 1pl pour un essai en HRM. - ESSAI HRM (EprrecT HRM PCR MX REF.59445, QIAGENTM) 5 Pour analyser le niveau de méthylation d'un promoteur des amorces spécifiques de ce promoteur sont utilisées. Pour cela, un logiciel a été utilisé pour dessiner les amorces (Methprimer (http://www.urogene.orgimethprinnertindexl.html). Les amorces encadrent Illot CpG sans se situer sur des Cytosines capables 10 d'être méthylées mais elles sont spécifiques de la séquence promotrice convertie au bisulfite. Chaque lot d'amorces doit être validé avec des contrôles (Epitect PCR Control DNA Set ref.59695, QIAGEN"). En effet, ces amorces ne doivent pas être capables d'amplifier un ADNg non convertis puisque les séquences des amorces sont spécifiques d'une séquence 15 convertie au bisulfite. De plus, les amorces doivent amplifier de la même façon un ADNg méthylé converti et un ADNg non méthylé converti. La seule différence doit être observée dans les températures de fusion TM qui traduisent directement la composition en Cytosines méthylées. Plus la Tm est élevée, plus le nombre de Cytosines méthylées est important. Pour analyser 20 le résultat, il est donc essentiel de regarder que les Ct obtenus pour les échantillons ne soient pas différents de plus de 3 Ct et il faut regarder précisément la Tm de chaque échantillon de façon indépendante après avoir normalisé la fluorescence, ce qui a été obtenu. Les courbes d'amplification et de dénaturation effectuées ont validé la qualité des échantillons, ANALYSE DES RESULTATS Les résultats obtenus sont regroupés dans le tableau 4 suivant : Tableau 4 Nom Moyenne des Tm LOXL (en°C) Ecarts types 78.85 0,17 Non traité 5-azadC Origanum majorana 1% 78.45 0,045 78.7 0,12 La PCR HRM effectuée sur la séquence promotrice du gène LOXL donne une température de fusion de 78,85°C lorsqu'elle est effectuée sur l'ADN génomique des fibroblastes âgés (62 ans) cultivés sans traitement.

Lorsqu'elle est effectuée à partir de l'ADN génomique des mêmes fibroblastes traités par l'extrait d'Origanum majorana à 1%, la température de fusion de l'amplicon obtenu est plus basse de 0.1°C (contre 0.4°C avec le témoin positif 5-azadC). Cela signifie que le contenu en G et en C de l'amplicon est plus faible et donc qu'il contenait moins de Cytosines méthylées au départ.

Seules les Cytosines méthylées sont conservées après traitement de l'ADN au bisulfite de sodium. Les Cytosines méthylées sont transformées en Uracile par ce traitement et donne une Thymine après le premier cycle de PCR. Ainsi, le traitement par Onyanum majorana a entraîné une baisse du niveau de méthylation du promoteur du gène LOXL pouvant expliquer en partie l'augmentation de son expression après traitement. EXEMPLE 4: Validation de l'action directe via la DNMT3a par un système de co-transfection du promoteur LOXL en amont d'un gène rapporteur (luciférase) et du gène de la DNMT3a - LES CELLULES Les cellules HEK 293 EBNA (Human Embryonic edney 293) capables de maintenir les plasmides exprimant le gène EBNA (Epstein Barr Nuclear Antigen) en épisomal ont été utilisées, ce qui permet d'empêcher que le plasmide ne s'intègre au noyau de la cellule transfectée. De plus, ces cellules ont la particularité de très bien supporter la transfection d'ADN. - LES PLASMIDES Ont été utilisés un plasmide codant pour la DNMT3A étiquetée FLAG permettant l'expression de la protéine en système eucaryote : Pcep4- DNMT3A (Figure 1) et son contrôle le plasmide Pcep4 ne permettant pas 30 l'expression de la protéine DNMT3A. L'effet de la transfection de la DNMT3a a été testé sur l'activité du promoteur dont la séquence génomique a été clonée dans le plasmide pGL3, en amont d'un gène rapporteur luciférase qui nous a permis par la suite de mesurer l'activité du promoteur. Cette construction, pLL 32 a déjà été décrite comme le promoteur minimal (de -712 à l'ATG, site d'initiation de la transcription du gène LOXL). Le plasmide pRL-TK a été utilisé comme contrôle interne de 5 transfection et le plasmide pGL3 comme contrôle de bruit de fond pour la normalisation des activités luciférase mesurées. Le jour avant la transfection, les cellules sont trypsinées et ensemencées en plaque 24 puits à raison de 200 000 cellules par puits dans 1 ml de DMEM 10% SVF ZS (Zell Shield, antibiotique à 0,1mg/m1). Les cellules HEK 293 10 EBNA ont été transfectées avec la lipofectamine 2000 (Invitrogen0). Le ratio optimal quantité d'ADN/ lipofectamine donnant le minimum de mort cellulaire est de 1pg d'ADN/3,5pg de lipofectamine. Les mesures d'activité luciférase ont été réalisées grâce au kit Dual luciferase assay de Promega0. L'analyse des résultats tient compte du taux de 15 transfection grâce à la mesure de l'activité renilla relative à la transfection du plasmide pRL-TK. On compare des ratios d'activité : activité luciférase (promoteur 10)(11) sur activité renilla (pRL-TK). De plus, les résultats ont été normalisés par rapport à la condition de transfection du plasmide pGL3 vide, bruit de fond de l'expérience. 20 D a ainsi été démontré que l'expression de la DNMT3a induit une inhibition de l'activité luciférase de 50% en moyenne pour les promoteurs complets (pLL28) et minimal (pLL32). Il n'a pas été observé de différence pour le pLL34 ce qui suggère que l'inhibition observée en présence de DNMT3a n'est pas due à une méthylation du gène luciférase lui-même. Lorsque que l'on 25 traite les cellules transfectées avec un inhibiteur contrôles des DNMTs (5 azadC 5pM), on restaure l'activité des promoteurs complet et minimal. L'inhibition se fait donc via une méthylation. - RESULTATS L'analyse des résultats d'activité luciférase obtenus pour le promoteur pLL32 30 suite à un traitement avec l'extrait d'Onganum majorana sont regroupés dans le tableau 5 ci-dessous : 2 99992 6 25 Tableau 5 Test préliminaire vecteur vide Inhibition de l'activité du promoteur LOXL par la DNMT3A pas d'inhibition de l'activité luciférase 68% DNMT3a Moyenne de 2 expérimentati ns Induction de l'activité Origanum majorana 1% promotrice de 10X11 en présence de DNMT3a vs contrôle non traité 21.50% azadC 5pM 108.46% recouvrement total de l'activité promotrice de LOXL1 5 L'activité luciférase relative au promoteur du gène LOXL est diminuée de 68% lorsque la DNMT3A est surexprimée dans les cellules HEK 293 EBNA. Les résultats obtenus avec le traitement à l'extrait d'Origanum majorana montrent une stimulation de l'activité du promoteur du gène LOXL par rapport à la condition non traitée. Ceci suggère que le recouvrement d'activité est lié à l'inhibition de l'activité DNMTA3a sur le promoteur. En effet, avec le traitement (marjolaine 1010 ou avec le témoin positif), cette activité est restaurée partiellement pour la marjolaine et totalement pour le 5 azadC. Ceci constitue la preuve que l'effet de l'extrait d'Origanum majorana passe par une inhibition de l'activité de la DNMT3a.

EXEMPLE 5: Observation de l'effet de l'extrait de O. majorana sur la formation in vitro des fibres d'élastine Les fibroblastes en P8 ont été ensemencées à 25 000 cell/crn2 en labteks 8 puits, (pour chaque condition N=4), en milieu spécifique à la croissance des 20 fibroblastes (FGM, Promocell). A pré-confluence, les labteks 8 puits (500pL/puits) ont été traitées en FGM complet par l'extrait d'Origanum majorana à 1% et les témoins positifs (5-azadC à 5 pM et du TGR31 à 1 ng/ml). Le milieu a été changé tous les 2 jours et la durée de traitement a été de 6 jours. Le traitement a été arrêté par un rinçage en PBS contenant du Ca++ et du Mg++. - IMMUNOMARQUAGE DES CELLULES Les cellules ont été fixées au méthanol froid (-20°C) pendant 10 min. Après 3 rinçages en PBS, les labtecks ont été incubées 1h en PBS-BSA 1010 en chambre humide à température ambiante (TA), permettant de saturer les sites non spécifiques. Après cette étape de saturation, les anticorps primaires polyclonaux de lapin anti-LOXL (IBCP) dilué au 1/500ème et anti-élastine dilué au 1/100ème (Novotec Ref 25011) ont été appliqués pendant 1h à TA en chambre humide. Chaque dilution a été réalisée en PBS-BSA 1%. Après 3 rinçages de 5 min en PBS, l'anticorps secondaire chèvre anti-lapin commun dilué au 1/1000ème a été appliqué 45 min à TA en chambre humide à l'obscurité. Celui-ci est couplé à l'Alexa fluor 488 (Invitrogen réf. A11034). Une fois rincées 3x5 min en PBS, les chambres ont ensuite été retirées des labtecks. Les lames ont été montées entre une lame en milieu Prolong0 Gold antifade Reagent avec Dapi (USA, Invitrogen) et stockées en chambre froide jusqu'à visualisation au confocal. Des puits contrôles ont été réalisés afin de s'assurer de la spécificité des anticorps primaires et secondaires. - VISUALISATION AU MICROSCOPE CONFOCAL L'immunofluorescence des cellules a été observée au grossissement x40 en huile à immersion en détection vert et bleu : visualisation de l'ADN en bleu par le DAN qui est excité à 405 nm et émis à 456 nm et visualisation de l'élastine ou LOXL en vert par l'Alexa Fluor 488, qui comme son nom l'indique est excité à la longueur d'onde de 488 nm et émet sa fluorescence dans le vert, à 519 nm (figures 2 et 3). Les marquages ont pu être visualisés à l'aide du logiciel Zen, après avoir fait les réglages optimaux de saturation, de bruit de fond et de l'épaisseur de la zone d'observation (en unité d'airy).

Les résultats sont regroupés sur les Figures 2 et 3 et montrent que l'extrait d'Organum majorana induite une amélioration de la formation des fibres élastiques sur fibroblastes en monocouche.

EXEMPLE 6: Exemple de compositions selon l'invention On procède selon les méthodes connues de l'homme de l'art pour mélanger ensemble les différentes parties A, B, C, D, E, ou F pour préparer une composition selon la présente invention. Les « produits de l'invention » représentent un extrait de Onganum 10 majorana et de préférence obtenu selon l'exemple 1. a). Les produits de l'invention peuvent également se présenter sous une forme de liposomes contenant 5% de lécithine de soja et incorporant une solution de soja quaternisé (600 g en final) obtenus selon le mode de réalisation suivant : 15 30 g de lécithine de soja, 12 g de solution de soja quaternisé, 1.5 g d'extrait diOnganum majorana préparé selon l'exemple 1 a) sont introduits dans un pilulier et dilué dans 447 g d'eau pure de laboratoire. Après agitation magnétique pendant 10 minutes à température ambiante, le mélange est homogénéisé violemment pendant 10 minutes, en obtenant 20 ainsi une solution liposomale dans laquelle les liposomes ont une dimension moyenne pouvant varier entre 100 et 800 nanomètres selon les conditions exactes de l'homogénéisation. La suspension est ensuite laissée sous agitation douce pendant 1 heure. 90 g de butylène glycol, 6 g de phenoxyethanol et 6 g d'hydroxyéthylcellulose 25 (agent de gélification) sont ensuite ajoutés. Formulation cosmétique 5a - Eau qsp 100 Butylene Glycol 2 Glyceri ne 3 Sodium Dihydroxycetyl 2 A 2 99992 6 28 Phosphate, Isopropyl Hydroxycetyl Ether Glycol Stearate SE 14 Triisononaoin 5 Octyl Cocoate 6 Butylene Glycol, 2 Methylparaben, Ethylparaben, Propylparaben, pH ajusté à 5,5 Produits de l'invention 0,01 - 10 % Formulation cosmétique 5b: A Eau qsp 100 Butylene Glycol 2 Glycerine 3 Poiyacrylamide, Isoparafin, 2,8 Laureth-7 B Butylene Glycol, 2 Methylparaben, Ethylparaben, Propylparaben ; 2 Phenoxyethanol, Methylparaben, Propylparaben, Butylparaben, Ethylparaben 0,5 B C D Butylene Glycol D Produits de l'invention 0,01 - 10 % Formulation cosmétique 5c: Carbomer 0,50 A 2 99992 6 Propylene Glycol Glycerol 29 Eau 3 5 qsp 100 Octyl Cocoate 5 Bisabolol 0,30 Dimethicone 0,30 C Sodium Hydroxide 1,60 D Phenoxyethanol, Methylparaben, 0,50 Propylparaben, Butylparaben, Ethylparaben E Parfum 0,30 F Produits de l'invention 0,01 - 10 % Formulation pharmaceutique 5d sous forme de comprimés : Excipients En g par comprimé Lactose 0,359 Saccharose 0,240 Produit de l'invention* 0,001 -0,1 *L'extrait de marjolaine est celui decrit en exemple 1 suivi d'une étape de stérilisation et de séchage.

5 Formulation dermatologique 5E sous forme d'une pommade A Excipients 5,5 B Polyéthylène basse densité Paraffine liquide qsp 100 Produit de l'invention* 0,001 -0,1 Formulation pharmaceutique 5F sous la forme d'une solution injectable A Excipient Solution isotonique salée 5 ml A B 30 2999926 B Produit de l'invention* 0,001 -0,1 g *L'extrait de marjolaine est celui decrit en exemple 1 suivi d'une étape de stérilisation et de séchage. Diverses autres caractéristiques ressortent de la description faite ci-dessous en référence aux dessins annexés qui montrent, à titre d'exemples non 5 limitatifs, des formes de réalisation de l'objet de l'invention. L'invention n'est pas limitée aux exemples décrits et représentés car diverses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre.

Claims (14)

1. REVENDICATIONS1. Utilisation cosmétique d'une substance inhibitrice de la méthylation non pathologique de l'ADN, pour stimuler la formation de fibres élastiques afin de réduire les rides cutanées, lutter contre le relâchement des tissus, notamment lorsque le relâchement des tissus est observé au cours du vieillissement ou au cours des expositions solaires, densifier la matrice extracellulaire, raffermir les tissus sous-cutanés, exercer un effet anti-rides, ou pour lutter contre les vergetures.
2. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la stimulation de la formation de fibres élastiques consiste à améliorer le dépôt et/ou l'organisation des fibres élastiques et/ou à réactiver l'expression des gènes, préférentiellement choisis parmi le gène codant LOXL (lysyl oxydaselike 1), le gène codant MAGP-1 (microfibril associated glycoprotein 1), le gène codant la fibuline 5.
3. 3. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisée en ce que ladite substance inhibitrice inhibe l'action de la DNMT3, préférentiellement l'action de la DNMT3a.
4. 4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite substance inhibitrice inhibe la méthylation d'un ou de plusieurs gènes choisis parmi le gène codant LOXL (lysyl oxydase-like 1), le gène codant MAGP-1 (microfibril associated glycoprotein 1), le gène codant la fibuline 5, et particulier inhibe la méthylation d'un ou de plusieurs de ces gènes au niveau de leur région promotrice.
5. 5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la substance inhibitrice est un extrait d'une plante du genre Origanum.
6. 6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que la plante du genre Origanum est Origanum majorana
7. 7. Utilisation selon la revendication 5 ou 6, caractérisée en ce que l'extrait de plante est un extrait aqueux obtenu à partir des parties aériennes de la plante.
8. 8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'extrait aqueux est obtenu par macération des parties aériennes de la plante à FR 12 62708 Réponse notification avant rejet du 15 mars 2013température ambiante pendant au moins 2 heures, de préférence pendant 4h, ou à 4°C pendant une nuit.
9. 9. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que ladite substance inhibitrice est incluse dans une composition cosmétique, notamment en combinaison avec un véhicule cosmétique approprié.
10. 10. Procédé de soin cosmétique caractérisé en ce qu'il comprend l'application sur la peau de la substance inhibitrice telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 9 ou d'une composition la comprenant, ledit le soin cosmétique étant choisi parmi le groupe consistant en la réduction des rides cutanées, la lutte contre le relâchement des tissus, notamment lorsque le relâchement des tissus est observé au cours du vieillissement ou au cours des expositions solaires, la densification de la matrice extracellulaire, le raffermissement des tissus sous-cutanés, les effets anti-rides, et la lutte contre les vergetures.
11. 11. Substance inhibitrice de la méthylation de l'ADN pour son utilisation pharmaceutique pour stimuler la formation de fibres élastiques.
12. 12. Substance selon la revendication 11 caractérisée en ce que la substance inhibitrice est un extrait d'une plante du genre Onganum, préférentiellement Onganum majorana.
13. 13. Substance selon l'une des revendications 11 ou 12, caractérisée en ce qu'elle est incluse dans une composition pharmaceutique, notamment en combinaison avec un véhicule pharmaceutique approprié.
14. 14. Substance selon l'une des revendications 11 à 13, pour son utilisation pour induire une néo-élastogenèse des tissus, et notamment stimuler l'élasticité des tissus ainsi obtenus, pour améliorer l'aspect, la souplesse et la qualité du tissu cicatriciel, notamment des cicatrices dystrophiques et kéloïdes et pour la prévention et/ou traitement thérapeutique de la pathologie cutis laxa. FR 12 62708 Réponse notification avant rejet du 15 mars 2013