KR20040107418A - 탄력섬유의 형성을 촉진하는 라이실 옥시다제유사(ｌｏｘｌ) 동종효소의 합성 및 활성 촉진 - Google Patents

탄력섬유의 형성을 촉진하는 라이실 옥시다제유사(ｌｏｘｌ) 동종효소의 합성 및 활성 촉진 Download PDF

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Abstract

본 발명은 라이실 옥시다제의 동종효소, 보다 상세하게는 LOXL(lysyl oxidase-like) 동종효소의 합성과 활성을 촉진하는 것에 관한 것이다.
본 발명은 특히 탄력섬유의 형성을 촉진하는 활성성분의 동정방법에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 특히 탄력섬유의 형성을 촉진할 수 있는 조성물을 제공하기 위한 스크리닝방법을 제공하는 것이다.

Description

탄력섬유의 형성을 촉진하는 라이실 옥시다제 유사(ＬＯＸＬ) 동종효소의 합성 및 활성 촉진{Stimulation of the synthesis and the activity of an isoform of lysyl oxidase-like LOXL for stimulating the formulation of elastic fibres}
본 발명은 라이실 옥시다제의 동종효소, 보다 상세하게는 LOXL(lysyloxidase-like) 동종효소의 활성 촉진에 관한 것이다.
피부 및 점막의 저항성 및 탄력성은 피부의 콜라겐 섬유와 엘라스틴 섬유에서 기인하고 있다. 엘라스틴은 피브릴린과 MAGPs(Microfibrillar Associated Gycoproteins)와 같은 다른 물질과 자체적으로 결합하여 탄력섬유을 형성하는 단백질이다.
탄력섬유는 미세섬유에 침착되는 엘라스틴으로 구성되어 있다. 엘라스틴은 라이실 옥시다제에 의해 그것과 물질의 세포 내, 세포 간 교차결합 후 물리화학적 특징들(불용성, 탄력성)을 얻은 수용성 트로포엘라스틴(tropoelastin) 형태로 합성되고 미세섬유에 침착된다. 탄력섬유는 그들(혈관, 폐 유조직, 탄력 연골조직, 피부 ...)을 포함하는 기관이 탄성을 갖도록 한다. 탄력섬유는 특히 미세섬유에 침착된 엘라스틴으로 구성되어 있다. <<엘라스틴>>이라는 명칭은 무정형의 탄력섬유를 형성하고 그들에게 탄력성을 부여하는 단백질을 말하는 것이었다. 최근에, 이들 탄력섬유의 성분들이 표피에서 관찰되었다. 콜라겐 세섬유는 삼량체로 조립되는 콜라겐 측쇄에 의해 형성된다. 또한 이들 콜라겐 세섬유는 라이실 옥시다제에 의해 교차결합된다.
피부와 점막의 노화는 이들 세섬유, 특히 분해되지만 정상적으로 재형성되지 않는 탄력섬유 망상조직의 변형과 연관되어 있다. 유사하게, 흉터에서, 탄력섬유의 망상조직은 정상적으로 형성되지 않는다. 라이실 옥시다제(LOs)에는 5개의 동종효소가 밝혀져 있다: LOX, LOXL, LOXL2, LOXL3, LOXL4(Csiszar, Lysyl oxidases: A novel multifunctional amine oxidase family,Nucleic acid Reserch andMolecular Biology, 2001, vol 70, p2-28). LOX는 분명 콜라겐 섬유의 교차결합과 관련되어 있다(Seve etal., Expression analysis of recombinant lysyl oxidase(LOX) in myofibroblast-like cells,Connective Tissue Research, 2002, 43:613-619).
피부, 혈관, 망막 반점 및 척추간 디스크에서 특히 발견되는 기능성 탄력섬유는 태아 발달동안 그리고 출생 후 즉시 형성된다. 피부에서, 이들 탄력섬유는 진피의 섬유아세포에 의해 형성되지만, 탄력섬유의 합성에 필수적인 어떤 성분들은 또한 표피 세포에서 발견되었다. 콜라겐 섬유는 전 생애를 거쳐 결합조직에서 합성된다.
비록 피부 엘라스틴의 전체 농도가 증가할 수 있다 해도 탄력섬유의 교체율은 성인기에서는 매우 낮다(Ashcroft et al., Age-related changes in the temporal and spatial distributions of firillin and elastin mRNAs and proteins in acute cutaneous wounds of healthy human,J. Patol., 1007, 183:80-89). 신생아의 경우, 미세섬유가 완전히 엘라스틴으로 덮혀있는 것은 아니며, 성숙기로 갈수록 그렇게 된다. 40세에, 특히 여성에서 섬유 상에 응집이 나타난 후, 진피-표피 간 결합(DEJ, dermal-epidermal junction)에 따라 탄력섬유의 분열과 소멸이 발견된다. 진피-표피 간 결합에 따라 분열 및/또는 소멸은 그 자체로 피부의 탄력성 소실과 주름 형성에 의해 나타난다. 비기능성 탄력섬유의 합성이 광-노화동안 관찰되지만, 이러한 증가현상은 진피-표피 간 결합에 따른 탄력섬유의 소실이 촉진되었기 때문이다(Watson et al., Fibrillin-rich microfibrils are reduced in photo-agedskin. Distribution at the dermal-epidermal junction,J. Invest. Dermatol., 1999, 112:782-787).
더욱이, 탄력섬유의 새로운 합성은 성인의 흉터에서 약간 일어나는 반면, 역설적으로 들리지만, 생성된 탄력섬유가 매우 분열되어 있는 70세 이상되는 노인의 경우 부분적으로 이러한 특징들이 발견된다. 그러나, 탄력섬유의 최종 물질에 관련된 주 성분들이 존재하고 있고(엘라스틴, 미세섬유), 전반적인 라이실 옥시다제 활성이 유지되고 있다(Pasquali-Ronchetti and Baccarani-Contri, Elastic fiber during development and aging,Microscopy Res. Tech., 1997, 38:428-435). 이점에 관해서는 본 발명자들이 성인에서는 기능성 탄력섬유의 형성가능성을 상실하지만, 배 발생과 태아기(first age)동안에 존재하는 한가지 이상의 인자들이 있음을 제안한 바 있다.
종래기술로는 기능적 신-엘라스틴형성과정(neoelastogenesis)동안 더마토-코스메톨로지(dermato-cosmetology)에서 활성성분의 영향을 평가할 수 있는 기준을 제공할 수 없다. 이러한 상황에서, 이들 활성성분들의 영향을 판단할 수 있는 객관적 기준을 얻기가 매우 어렵다. 실제 활성성분의 스크리닝방법은 탄력섬유 예를 들어, 엘라스틴 또는 피브릴린의 형성에 관여하는 유전자들의 발현을 평가하는 것이다.
더욱이, 현재 유럽에서 화장품 분야에서 동물 실험은 금지되어 있고 인간 실험은 윤리적 측면에서 논쟁의 소지가 있다. 따라서, 발명자들이 화장품에 적용하기 위해 동물 또는 인간을 사용하는 스크리닝방법을 실시하는 것은 허용될 수 없다.
Mimeskin®(프랑스 리옹 꼴레띠까) 같은 3차원 모델에서, 각질형성세포는 트로포엘라스틴의 합성과 미세섬유 상에 트로포엘라스틴의 침착을 유도한다(Duplan-Perrat et al., Keratinocytes influence the maturation and organization of the elastin network in a skin equivalent.J. Invest. Dermatol.114:365-70, 1999). Mimeskin®모델에서, 세포외 기질에는 선(rays)으로 조직되는 콜라겐과 미세섬유 상에 침착되는 엘라스틴으로 구성되는 탄력섬유을 갖고 있는, 피부와 유사한 미세 구조의 조직화가 보인다. 상기 모델은 또한 라이실 옥시다제의 억제제와 같은 어떤 물질의 유효성을 시험하는 데 사용되었다. 이로부터 라이실 옥시다제의 억제는 필라그린(filaggrin)과 같은 최종 분화 표지의 발현 수준을 감소시킴과 동시에 콜라겐 섬유와 엘라스틴 섬유의 분열 뿐만 아니라 각질형성세포의 분화 프로그램으로부터 이탈을 유도함을 제시할 수 있었다(Farjanel et al., French patent 01 10443, CNRS, Use of inhibitors of lysyl oxidases for cell culture and tissue engineering(<<Utilisation d'inhibiteurs des lysyl oxydases pour la culture cellulaire and le genie tissulaire>>)). 상기 특허에서, LO의 다른 동종효소 간의 차이점은 없다.
그러나, 이들 연구들로는 기능성 탄력섬유의 형성을 촉진할 수 있는 활성성분을 동정하는 방법을 개발할 수 없었다.
따라서, 종래기술로는 기능성 탄력섬유의 형성을 촉진할 수 있는 활성성분을 제공할 수 없다.
더욱이, 종래기술은 특히 종래기술이 제공하는 방법들이 불명확하다는 사실때문에 라이실 옥시다제의 동종효소 LOXL의 발현 지역을 역동적으로 추적할 수 없다.
따라서, 본 발명의 목적은 상기에서 언급한 기술적 문제점들 특히 기능성 탄력섬유의 형성을 촉진하는 활성성분을 동정하는 방법을 제공함을 목적으로 하는 기술적 문제점을 해결하고자 한다.
"기능성 탄력섬유"는 상기에서 언급한 종래기술에서 일반적인 의미로써, 특히 본 발명에서는 3차원 구조로부터 유래한 탄력 특성들을 갖고 있는 탄력섬유를 의미한다.
또한, 본 발명은 라이실 옥시다제의 동종효소 L 또는 라이실 옥시다제의 동종효소 L(LOXL)의 발현 또는 효소적 활성을 촉진하는, 특히 기능성 탄력섬유의 형성을 촉진하는 활성성분의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 LOXL의 발현을 조사하고 상기 발현을 추적하는 방법을 제공하는 것으로 구성된 기술적 문제점을 해결할 수 있다.
도 1a는 hLOX(human LOX protein) 및 hLOXL(human LOXL protein)의 개략도를 나타낸다.
도 1b는 LOX 및 LOXL의 항원 부분과 LO 동종효소에 대한 그들의 등가물 간의 유사성 비율을 표로 나타낸 것이다.
도 2는 항-LOXLmat, 항-LOXmat, 항-LOXpro 및 항-LOXpro 항체를 이용한 평활근세포(smooth muscle cell)의 LOX 및 LOXL의 성숙단백질에 대한 웨스턴 블랏팅 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 재건피부(RS) 및 정상인간피부에서 LOX 및 LOXL의 면역조직학적 탐지 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 재건피부(16, 35 및 45일째) 및 인간 포피 피부 절편에서 항체 항-LOXL2664-720및 항-LOXL2517-581를 이용한 LOXL2, LOXL3 및 LOXL4의 면역적 탐지 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 각질형성세포의 적용 후 30일째에 재건피부의 진피 부분에서, 그리고정상인간 피부의 진피 부분에서 LOXL, LOX 및 엘라스틴의 투과전자현미경 사진도를 나타낸 것이다.
도 6은 인간 피부에서 LOX 및 LOXL의 면역적 탐지 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 다양한 연령대별로 얻은 인간 복부 피부에서 LOX 및 LOXL의 면역적 탐지 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 치료 후 다양한 시기의 흉터 조직에서 LOX 및 LOXL의 면역적 탐지를 나타낸 것이다.
도 9는 프로모터 PrhLOXL의 염기서열의 루시퍼라아제/β-갈락토시다아제 활성을 나타낸 것이다.
도 10은 hLOXL 유전자의 프로모터의 개략도이며, 특히 hLOXL 유전자의 전사 조절 예상 사이트를 나타낸 것이다.
도 11은 35일째 피부모델 절편(Mimeskin®)을 나타낸 것이다.
도 12는 어린 태아의 포피에서 유래한 섬유아세포와 복부 성형수술 결과로 얻은 성인의 섬유아세포에서 액틴 및 ELN, LOX 및 LOXL 유전자의 발현에 대한 실시간 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다.
본 발명에서, "LOXL" 또는 "hLOXL"은 인간의 라이실 옥시다제 단백질의 동종효소 L(LOXL)를 의미한다.
본 발명에서, "LOX" 또는 "hLOX"는 인간의 라이실 옥시다제 단백질의 최초의 동종효소(LOX)를 의미한다.
"라이실 옥시다제의 동종효소 LOXL의 발현을 촉진하는"이란 LOXL를 코딩하는 유전자 또는 그것의 프로모터의 발현을 촉진하는, 특히 LOXL을 코딩하는 mRNA의 합성을 촉진할뿐 아니라 상기 mRNA로부터 LOXL의 합성을 촉진하는 것을 의미한다.
"엘라스틴의 발현을 촉진하는"이란 엘라스틴 단백질을 코딩하는 유전자 또는 그것의 프로모터의 발현을 촉진하는, 특히 엘라스틴 단백질을 코딩하는 mRNA의 합성을 촉진할뿐 아니라 mRNA로부터 엘라스틴 단백질 또는 그것의 전구물질, 트로포엘라스틴의 합성을 촉진하는 것을 의미한다.
따라서, 본 발명에서 발명자들은 언급된 LOXL의 발현이나 LOXL의 효소적 활성 중 어느 하나를 촉진하는 것을 목적으로 한다.
이러한 촉진은 기능성 탄력섬유의 형성을 촉진하기에 충분히 효과적이어야 한다.
접촉 시 활성성분이 없는 대조군 모델에서 LOXL의 발현 및/또는 활성 수준에서 이들 활성성분과 접촉 시 LOXL의 발현 및/또는 활성이 있는 적어도 하나의 세포 타입을 포함하고 있는 모델에서 활성성분은 LOXL의 발현 및/또는 활성을 약 1.5배 증가하거나 활성화를 얻기에 효과적인 것으로 간주된다.
일 측면에서, 본 발명은 탄력섬유의 형성을 촉진하는 조성물을 제조하기 위한 서열목록 서열 1을 갖는 라이실 옥시다제의 유사 동종효소, 소위 LOXL 또는 그것의 동종 형 또는 LOXL의 활성 및/또는 활성을 촉진하는 물질의 용도에 관한 것이다.
"그것의 동종 형"이란 여기에서 언급한 LOXL과 같거나 유사한 활성을 갖는라이실 옥시다제 동종효소 LOXL의 동종 형을 의미한다.
유리하게는, LOXL의 발현은 LOXL을 코딩하는 뉴클레오티드의 염기서열의 발현 또는 LOXL 단백질의 분획을 구성하는 펩티드 염기서열의 발현 중 어느 하나이며, 바람직하게는 상기 펩티드 염기서열은 서열목록 서열 1로부터 선택된다.
유리하게는, 상기 조성물은 화장료, 식약, 의약 또는 제약용 조성물이다.
유리하게는, 상기 조성물은 엘라스틴의 발현, 특히 탄력섬유의 형성을 촉진하는 2차 물질을 추가로 포함하며, 바람직하게는, 상기 2차 물질은 LOXL의 활성 및/또는 발현을 촉진하는 물질이다.
유리하게는, 상기 활성물질은 서열목록 서열 3에 기재된 인간의 LOXL 유전자(Pr) 또는 그것의 동종형의 프로모터의 뉴클레오티드의 염기서열의 적어도 일부분에 고정된 한 부분을 포함하거나 또는 서열목록 서열 3에 기재된 인간의 LOXL 유전자(Pr) 또는 그것의 동종형의 프로모터의 뉴클레오티드의 염기서열의 적어도 일부분에 고정된 단백질의 발현을 조절한다. 상기 염기서열은 ATG 코돈 앞의 -2630번째 뉴클레오티드로부터 제공되며, 특히 -2172번째에서 -1번째의 뉴클레오티드를 연구하였다.
유리하게는, 활성물질은 딜(dill), 카란트(currant), 카다먼(cardamon), 검정무(black radish), 루스쿠스 아쿨레아투스(box holly), 계피(cinnamon), 유산균에 의한 발효, 귀리, 감자, 실크, 아사 포에티다 검(Asa foetida gum), 에틸 헥세노에이트(ethyl hexenoate) 및 그것의 유도체, 메틸 부틸레이트(methyl butyrate) 및 그것의 유도체, 및 에틸 데카디에노에이트(ethyl decadienoate) 및 그것의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다.
유리하게는, 상기에 기재된 용도는 조직의 신-엘라스틴형성과정을 유도하기 위해, 특히 이로부터 얻은 조직의 탄력성을 촉진하고 피부 주름을 감소시키기 위해 실시된다.
유리하게는, 상기에 기재된 용도는 조직의 늘어짐 제어, 특히 노화 또는 햇빛 노출에 따른 조직의 늘어짐 제어, 세포외 기질의 치밀, 피하조직의 고정, 피부 주름 감소, 주름개선효과, 흉터 조직의 질과 흉터자국의 개선, 특히 빈영양형(dystrophic) 및 켈로이드성(keloid) 흉터의 개선, 또는 임신선 제어를 위해 실시된다.
두번째 측면에서, 본 발명은 상기에서 기재된 활성물질, 선택적으로 화장료에 적합한 부형제의 혼합물로서 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
세번째 측면에서, 본 발명은 상기에서 기재된 활성물질, 선택적으로 식품에 적합한 부형제의 혼합물로서 포함하는 식약용 조성물에 관한 것이다.
네번째 측면에서, 본 발명은 상기에서 기재된 활성물질, 선택적으로 약제용에 적합한 부형제의 혼합물로서 포함하는 약제용 조성물에 관한 것이다.
화장료 또는 약제용 조성물에 관하여, 부형제는 예를 들어, 방부제, 완화제, 위화제, 계면활성제, 가스제, 농축제, 컨디셔너, 매티파잉제(matifying agents), 안정제, 항산화제, 직조제, 증백제, 호막제(filmogenic agent), 가용제, 색소, 염료, 방향제 및 태양필터(solar filter)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함한다. 바람직하게는 이들 부형제들은 아미노산 및 그들의 유도체,폴리글리세롤, 에스테르, 세룰로우즈의 중합체 및 유도체, 라놀린 유도체, 인지질, 락토페린, 락토페록시다아제, 수크로우즈를 주 성분으로 하는 안정제, 비타민 E 및 그것의 유도체, 천연 및 합성 왁스, 식물성 오일, 트리글리세라이드, 인사포니피어블(insaponifiable), 파이토스테롤, 식물성 에스테르, 실리콘 및 그것의 유도체, 단백질 가수분해산물, 호호바 오일 및 그것의 유도체, 지질/수용성 에스테르, 비테인스, 아미녹사이드, 식물 추출물, 슈크로우즈의 에스테르, 티타늄 디옥사이드, 글리신, 및 파라벤으로 구성된 군으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는 부틸렌 글리콜, 스테아레스-2, 스테아레스-21, 글리콜-15 스테아릴 에테르, 세테아릴 알콜, 페녹시에탄올, 메틸파라벤, 에틸파라벤, 프로필파라벤, 뷜파라벤, 부틸렌 글리콜, 천연 토코페롤, 글리세롤, 소듐 디하이드록시세틸, 이소프로필 하이드록시세틸 에테르, 글리콜 스테아레이트, 트리이소노나노인, 옥틸 코코에이트, 폴리아크릴아마이드, 이소파라핀, 로레스-7, 카보머, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 비사볼롤, 디메티콘, 소듐 하이드록사이드, PEG 30-디폴리하이드록시스테아레이트, 카프릭/카프릴릭 트리글리세라이드, 세테아릴 옥타노에이트, 디부틸 아디페이트, 포도씨 오일, 호호바 오일, 마그네슘 설페이트, EDTA, 사이클로메티콘, 잔탄검, 시트르산, 소듐 로릴 설페이트, 미네랄 왁스 및 오일, 이소스테아릴 이소스테아레이트, 프로필렌 글리콜 디펠라고네이트, 프로필렌 글리콜 이소스테아레이트, 경화 팜유 글리세라이드, 라놀린 오일, 참기름, 세틸 락테이트, 라놀린 알콜, 피마자유, 티타늄 디옥사이드, 락토우즈, 슈크로우즈, 저밀도 폴리에틸렌, 및 등장식염수로 구성된 군으로부터 선택된다.
유리하게는, 상기에서 인용된 조성물들은 수용성 또는 유성, 특히 포트 또는 튜브에 넣은 수용성 크림 또는 젤 또는 유성 젤, 특히 샤워젤, 샴푸, 밀크, 에멀젼, 마이크로에멀젼 또는 나노에멀젼, 특히 마이크로에멀젼 또는 나노에멀젼을 포함하는 수중유형 또는 유중수형 또는 복합형 또는 실리콘, 로션, 특히 유리병, 플라스틱 병 또는 계량용병 또는 분무기에 담긴 로션, 앰플, 액체비누, 피부질환치료용 비누(dermatological bar), 연고, 발포체(foam), 무수물, 바람직하게는 액체, 페이스트 또는 고체 무수물, 즉, 스틱 형태 특히 립스틱 형태의 무수물 용액으로 구성된 군으로부터 선택된 폼으로 만들어 진다.
유리하게는, 충분히 액체상태의 조성물은 특히 장관외, 눈, 폐, 구강 또는 비강 루트로 투여될 수 있다.
유리하게는, 페이스트 또는 건조한 조성물들(고약, 분말, 정제, 캡슐, 과립, 좌약)은 특히 구강, 설하선, 비강 또는 직장 루트를 통해 체내에 도입될 수 있다.
유리하게는, 조성물의 제형이 허용할 경우, 투여 루트는 피부 또는 점막을 통과하는 것이며, 특히 피부 또는 점막에 조성물을 투여하는 것이다.
유리하게는, 다양한 제형 및 투여 루트에 대해, 당업자는 효과적 측면에서 적당한 것을 선택할 수 있다.
다섯번째 특징에 따르면, 본 발명은 상기 조성물의 이용을 포함함을 특징으로 하는 코스메틱 케어방법에 관한 것이다.
유리하게는, 코스메틱 케어는 조직의 늘어짐 제어, 특히 노화 또는 햇빛 노출에 따른 조직의 늘어짐 제어, 세포외 기질의 치밀, 피하조직의 고정, 피부 주름감소, 주름개선효과, 흉터 조직의 질과 흉터자국의 개선, 특히 빈영양형(dystrophic) 및 켈로이드성(keloid) 흉터의 개선, 또는 임신선 제어로 구성된 군으로부터 선택된다.
여섯번째 특징에 따르면, 본 발명은 다음을 포함함을 특징으로 하는 탄력섬유의 형성을 촉진하기 위한 LOXL 또는 그것의 동종형을 촉진하는 물질의 스크리닝방법에 관한 것이다:
LOXL 동종효소 또는 그것의 동종형을 발현할 수 있는 세포 타입 중 적어도 하나에서 활성가능물질을 LOXL과 접촉시키고,
a) 상기 활성가능물질이 LOXL 또는 그것의 동종형의 활성을 촉진하는 지를 확인하기 위해, LOXL 또는 그것의 동종형의 활성을 분석하고,
b) 상기 활성가능물질이 LOXL 또는 그것의 동종형의 발현을 촉진하는 지를 확인하기 위해, LOXL 또는 그것의 동종형의 발현을 분석함.
LOXL 또는 그것의 동종형의 발현을 분석하는 것과 관련하여,
유리하게는, 상기 활성가능물질이 다음을 촉진하는 지를 찾는다:
단백질 LOXL 또는 그것의 동종형을 코딩하는 뉴클레오티드의 염기서열 중 적어도 하나의 발현, 및/또는
단백질 LOXL 또는 그것의 동종형의 펩티드 분획을 구성하는 필수 펩티드의 염기서열의 발현.
유리하게는, LOXL의 발현 분석은 LOXL을 코딩하는 뉴클레오티드의 염기서열의 적어도 하나의 일부분의 발현을 정성적으로 및/또는 정량적으로 분석하여 실시한다.
유리하게는, 뉴클레오티드의 염기서열은 LOXL을 코딩하는 mRNA에 상보적인 cDNA 이며, 상기 LOXL cDNA는 서열목록 서열 2에 기재되어 있다.
유리하게는, LOXL의 발현 분석은 LOXL을 코딩하는 뉴클레오티드의 염기서열의 적어도 한부분을 증폭하기 위해, LOXL을 코딩하는 상보적 DNA의 뉴클레오티드의 염기서열(서열목록 서열 2)의 적어도 한부분과 프라이머를 혼성화하는 것을 포함하는 역전사중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 이용한다.
유리하게는, 또한 상기 방법은 재건 피부 모델 또는 생체검사용 모델에서 실시한 LOXL의 발현을 조사하는 단계를 포함한다:
ㆍ 특히 LOXL를 코딩하는 상보적 DNA의 뉴클레오티드의 염기서열(서열목록 서열 2)의 적어도 한부분과 적어도 하나의 DNA 프로브와의 혼성화를 이용한 LOXL을 코딩하는 뉴클레오티드의 염기서열의 적어도 한부분의in situ하이브리디제이션; 또는
ㆍ 적어도 하나의 LOXL의 특이 항체를 이용한 면역적 탐지.
특이 항체는 실시예 1에 나열되어 있다.
유리하게는, 스크리닝방법은 상기 활성가능물질을 포함하지 않는 대조군에서발현되는 LOXL의 발현과 LOXL의 발현을 비교하는 것을 포함한다.
유리하게는, 살아있는 세포는 정상 인간 피부, 예를 들어 포피 또는 성인 피부에서 유래한 섬유아세포를 포함한다.
유리하게는, 살아있는 세포는 정상 인간 피부 예를 들어 특히 포피 또는 성인 피부에서 유래하는 상피세포, 예를 들어 각질형성세포를 포함한다.
유리하게는, 살아있는 세포는 <<노화된>> 또는 태양광선에 <<노출된>> 또는 그렇지 않은 특정 위치 예를 들어 얼굴, 복부, 유방의 피부 중 적어도 하나 또는 흉터 또는 임신선이 있는 지역에서 유래한 피부로부터 유래한다.
유리하게는, 스크리닝방법은 재건 피부 모델, 바람직하게는 섬유아세포를 포함하는 진피 모델 또는 생체검사용 모델 중 적어도 하나를 이용한다.
유리하게는, 스크리닝방법은 재건 피부 모델 또는 생체검사용 모델을 이용한다. 유리하게는, 사용된 재건 피부 모델은 Mimeskin®재건 피부 모델이지만 또한 표피 또는 상피 또는 재건 피부 또는 점막의 결합기질 모델일 수 있다.
1) 3차원 결합기질(진피 또는 융모막) 배양 모델
상기 모델은 재건 진피 또는 재건 융모막을 형성하기 위해 스트로마세포가 파종된 지지체를 포함하고 있다. 바람직하게는 상기 지지체는 다음으로부터 선택된다:
- 반투과성 합성막, 특히 반투과성 니트로셀룰로우즈 멤브레인, 반투과성 나일론 멤브레인, 테프론 멤브레인 또는 테프론 스폰지, 반투과성 폴리카보네이트 또는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 또는 폴리에틸렌 테르프탈레이트(PET) 멤브레인, 반투과성 아노포어 무기 멤브레인, 셀룰로우즈 아세테이트 또는 셀룰로우즈 에스테르 멤브레인(HATF), 반투과성 바이오포어-CM 멤브레인, 반투과성 폴리에스테르 멤브레인, 폴리글리콜산 멤브레인 또는 필름으로 구성된 군으로부터 선택되는 비활성 지지체. 상기 군에서, 실시예에서는 진피 모델 Skin2TM모델 ZK1100 및 Dermagraft®및 Transcyte®(어드밴스드 티슈 사이언스)이 사용된다;
- 세포 배양 처리된 플라스틱(formation of a dermal leaf: Michel M. et al. in In Vitro Cell. Dev Biol.-Animal(1999) 35:318-326);
- 하이알루론산(Hyalograft®3D-피디아 어드밴스드 바이오폴리머스) 및/또는 콜라겐 및/또는 피브로넥틴 및/또는 피브린 기반 젤 또는 멤브레인. 상기 군에서, 실시예에서는 진피 모델 Vitrix®(올가노제네시스)이 사용된다;
- 하나 이상의 글리코스아미노글리칸 및/또는 키토산(EP 0 296 078 A1 of the CNRS, WO 01/911821 and WO 01/92322 of Coletica)을 포함할 수 있는 콜라겐으로 제조된 표면처리되거나 또는 그렇지 않은 다공성 기질.
2) 3차원 표피 또는 상피 배양 모델
상기 모델은 재건 상피 또는 표피을 얻기 위해, 스트로마세포, 특히 섬유아세포로 미리 파종한 다음 상피세포 특히 각질형성세포로 파종하거나 혹은 그렇지 않은 지지체를 포함한다. 바람직하게는 상기 지지체는 다음으로부터 선택된다:
- 반투과성 합성막, 특히 반투과성 니트로셀룰로우즈 멤브레인, 반투과성 나일론 멤브레인, 테프론 멤브레인 또는 테프론 스폰지, 반투과성 폴리카보네이트 또는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 또는 폴리에틸렌 테르프탈레이트(PET) 멤브레인, 반투과성 아노포어 무기 멤브레인, 셀룰로우즈 아세테이트 또는 셀룰로우즈 에스테르멤브레인(HATF), 반투과성 바이오포어-CM 멤브레인, 반투과성 폴리에스테르 멤브레인으로 구성된 군으로부터 선택되는 비활성 지지체. 상기 군에서, 모델 EpiDerm®, EpiAirway®, EpiOccular®(매텍 코퍼레이션)뿐만 아니라 재건 모델 표피 및 상피(Skinethic®)이 사용된다:
- 하이알루론산 및/또는 콜라겐 및/또는 피브로넥틴 및/또는 피브린 기반 필름 또는 멤브레인. 상기 군에서, 특히 모델 Episkin®(로레알) 및 Laserskin®(피디아 어드밴스드 바이오폴리머스)이 인용될 수 있다.
3) 3차원 재건 피부 또는 점막 배양 모델
상기 모델은 재건 점막을 얻기 위해 상피세포를 파종하고 또는 재건 피부를 얻기 위해 각질형성세포를 파종한 기질 지지체(진피 또는 융모막)를 포함한다. 바람직하게는 상기 지지체는 다음으로부터 선택된다:
- 반투과성 합성막, 특히 반투과성 니트로셀룰로우즈 멤브레인, 반투과성 나일론 멤브레인, 테프론 멤브레인 또는 테프론 스폰지, 반투과성 폴리카보네이트 또는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 또는 폴리에틸렌 테르프탈레이트(PET) 멤브레인, 반투과성 아노포어 무기 멤브레인, 셀룰로우즈 아세테이트 또는 셀룰로우즈 에스테르 멤브레인(HATF), 반투과성 바이오포어-CM 멤브레인, 반투과성 폴리에스테르 멤브레인으로 구성된 군으로부터 선택되는 비활성 지지체. 상기 비활성 지지체는 스트로마세포 특히 섬유아세포를 포함함;
- 콜라겐 및/또는 하이알루론산 및/또는 피브로넥틴, 및/또는 스트로마세포 특히 섬유아세포를 포함하는 피브린 기반 젤;
- 하나 이상의 글리코스아미노글리칸 및/또는 키토산을 포함할 수 있는 콜라겐으로 제조된 표면처리되거나 또는 그렇지 않은 다공성 기질. 이들 다공성 기질은 스트로마세포 특히 섬유아세포와 결합되어 있음.
- 인간 또는 동물의 표피가 제거된 진피 또는 죽은 진피
상기 군에서, Skin2TM(ZK1200-1300-2000-어드밴스드 티슈 사이언스)뿐만 아니라 모델 Apligraf®(올가노제네시스), ATS-2000(CellSystems®바이오테크놀로지 베르트리엡)이 인용될 수 있다.
더욱이, 조직 치료에 제공되고, 그러한 연구들의 주제일 수 있는 모델이 있다. 모델 EpidexTM(모덱스 테라퓨틱끄스), Epibase®(래보라토르 게네브리에), EpicellTM(겐자임), AutodermTM및 TransdermTM(인노게네틱스)이 인용될 수 있다.
유리하게는, 스크리닝방법은 재건 피부 모델, 바람직하게는 각질형성세포를 포함하는 표피 모델을 적어도 하나 이용한다.
유리하게는, 상기 방법은 상기 활성물질이 상기 살아있는 세포와 접촉할 때 단백질 엘라스틴의 발현 촉진을 탐지하기 위해 단백질 엘라스틴 및/또는 트로포엘라스틴 중 적어도 하나의 염기서열, 또는 단백질 엘라스틴을 코딩하는 뉴클레오티드의 염기서열의 발현을 분석하는 단계를 포함한다.
유리하게는, 상기 방법은 특히 상피조직 및/또는 결합조직에서 신-탄력섬유형성과정(neo-elastogenesis)을 추적하기 위해 단백질 LOXL의 발현을 면역적으로 탐지하는 단계를 포함한다. 상기 조직은 재건 피부 모델 또는 생체검사용 모델 중 적어도 하나로부터 유래한다.
유리하게는, 상기 활성물질은 딜(dill), 카란트(currant), 카다먼(cardamon), 검정무(black radish), 루스쿠스 아쿨레아투스(box holly), 계피(cinnamon), 유산균에 의한 발효, 귀리, 감자, 실크, 아사 포에티다 검(Asa foetida gum), 에틸 헥세노에이트(ethyl hexenoate) 및 그것의 유도체, 메틸 부틸레이트(methyl butyrate) 및 그것의 유도체, 및 에틸 데카디에노에이트(ethyl decadienoate) 및 그것의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다.
일곱번째 특징에 따르면, 본 발명은 특히 결합조직에서 신-탄력섬유형성과정을 추적하기 위해 조직에서 LOXL 또는 그것의 동종형의 발현을 조사하는 방법에 관한 것이다. 상기 조직은 재건 피부 모델 또는 생체검사용 모델 중 적어도 하나로부터 유래한다. 상기 방법은 단백질 LOXL 또는 그것의 동종형을 면역적 탐지 또는 LOXL 또는 그것의 동종형을 코딩하는 뉴클레오티드의 염기서열의 적어도 한부분의in situ하이브리디제이션하는 단계를 포함함을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 특히 상피조직 및/또는 결합조직에서 신-탄력섬유형성과정을 추적하기 위해 조직에서 LOXL의 발현을 조사하는 방법에 관한 것으로, 단백질 LOXL의 면역적 탐지 또는 LOXL을 코딩하는 유전자의in situ하이브리디제이션 단계를 포함함을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 탄력섬유의 형성을 촉진하기 위한 단백질 LOXL의 발현 또는 효소적 활성을 변형시키는 활성성분의 이용에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 단백질 라이실 옥시다제 LOXL을 포함하는 조성물 또는 그것의 동종형 또는 단백질 라이실 옥시다제 LOXL의 효소적 활성 또는 발현을 촉진하는 화합물의 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는 단백질 라이실 옥시다제의 동종효소 LOXL의 효소적 활성과 관련된 결핍의 치료방법에 관한 것이다.
유리하게는, 상기 치료방법은 조직의 늘어짐 제어, 특히 노화 또는 햇빛 노출에 따른 조직의 늘어짐 제어, 세포외 기질의 치밀, 피하조직의 고정, 피부 주름 감소, 주름개선효과, 흉터 조직의 질과 흉터자국의 개선, 특히 빈영양형(dystrophic) 및 켈로이드성(keloid) 흉터의 개선, 또는 임신선 제어로 구성된 군으로부터 선택된 치료를 실시할 수 있다.
본 발명자들은 LOXL의 활성이 성인의 탄력섬유형성과정에서 주요 소실 고리이며, 탄력섬유형성과정을 촉진하기 위해 라이실 옥시다제의 상기 동종효소의 합성을 재활성화할 가능성이 있음을 기대치 않게 규명하였다.
본 발명자들은 사실상 라이실 옥시다제(LO)의 패밀리의 동종효소가 탄력섬유를 생성하는 재건 피부 모델에서 탄력섬유형성과정에 연관되어 있음을 규명한 것이다. 다양한 나이의 피부에서 그리고 피부 변형동안 상기 동종효소가 있는 지 여부를 찾기 위해, 본 발명자들은 상기 동종효소와 탄력섬유형성과정이 동시에 존재하는 지 여부를 확인함으로써, LO 동종효소의 활성은 기능적 탄력섬유형성과정을 조정하기 위해 조절하는데 필수적인 합성이 소실 고리에 해당함을 지적할 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 LO 동종효소(LOXL)의 발현 증가를 볼 수 있는 방법을 개발한 다음, 특히 LOXL을 코딩하는 mRNA의 발현을 촉진할 수 있는 활성성분, 특히 식물추출물 또는 화학물질을 찾기 시작하였다. 그 후, 선별된 활성물질을 특히 흉터 조직의 질, 흉터와 임신선의 외형을 개선할 뿐만 아니라 노화동안 조직의 늘어짐 제어에 적용하기 위해 화장료, 피부-약학 및 약제학적 조성물에 적용하였다.
본 발명자들은 성숙 LOXL 형태(실시예 1 및 2 참조)의 특이 항체를 개발함으로써, 그들이 자연적이든 또는 태양광선에 의해 유도되는 것이든 피부 조직의 노화동안 라이실 옥시다제의 동종효소가 없을 경우 기능적 탄력섬유의 합성 문제와 연관됨을 규명하였다.
동종효소 LOXL2, LOXL3 및 LOXL4는 진피에서 발현되지 않거나 거의 발현되지 않으므로 탄력섬유형성과정과는 관련이 없다(실시예 4 참조). LOX 동종효소는 진피에서 발견되며 미세섬유와 결합할 수 있지만, LOX는 기능적 콜라겐의 형성에 관여하고 성인 피부에서 소실되지 않는다. 따라서, LOX의 부재는 노화동안 탄력섬유의 탄력성의 상실과 관련이 없다(실시예 3 참조).
탄력섬유형성과정에서 LOXL의 역할을 규명함으로써 본 발명의 실시를 위한 기준이 마련되었다(실시예 5 참조).
LOXL과 탄력섬유 또는 미세섬유 간의 연관성은 본 발명의 실시동안 전자현미경에 의해 명백히 규명되었다. 미세섬유와 결합되어 있는 LOXL은 엘라스틴이 침착되어 있는 구조를 이루고 있다.
LOXL은 교차결합에 의해 엘라스틴의 성숙에 관여하므로 기능적 탄력섬유를형성할 수 있다.
본 발명에서, 본 발명자들은 LOXL의 발현을 조사하는 방법을 실시하였다.
즉, 상기 조사방법은 LOXL의 면역적 탐지를 포함하고 있다. 또한, 이 방법을 통해 단백질 엘라스틴의 발현을 입증할 수 있다. 본 발명자들의 연구를 통해, LOXL은 촘촘한 침착물(dense deposits) 또는 미세섬유에 결합되어 있지만, 콜라겐 섬유에는 결합되어 있지 않음을 규명하였다. 엘라스틴은 같은 촘촘한 침착물 및 미세섬유에서 탐지되었다. 이러한 탐지는 재건 피부 모델, 특히 각질형성세포를 투여한 후 30일째 재건 피부 모델에서 이루어진다(실시예 5 참조).
또한, 미세섬유 및 탄력섬유와 LOXL의 결합은 포피 피부에서, 특히 면역적 탐지 후 투과전자현미경에 의해 확인되었다.
LOXL은 엘라스틴 합성이 큰 어린 환자(수개월)에서 얻은 포피 피부의 진피에서 발현된다. 그러나, LOXL은 성인의 피부, 목, 유방, 복부 또는 얼굴의 진피에서는 발현되지 않는다. 피부, 목, 유방, 복부 또는 얼굴의 진피에서 LOXL의 부재는 어떤 연령대의 성인에서든 확인된다. 또한, 인간 피부가 약 80세 이상의 대상에서 유래할 경우, 상기 효소 발현의 늦은 소멸이 관찰될 뿐만 아니라 인간 피부의 표피에서 LOXL의 고발현이 관찰된다(실시예 6 참조).
흉터에 있어서, LOXL은 흉터 후 3개월이든 흉터 형성 후 5년이든 이들 지역의 진피에서는 관찰되지 않았다.
본 발명에서, 3개월째에 나타나는 엘라스틴은 흉터 형성 후 5년된 흉터조직 지역에서는 더이상 나타나지 않았다.
따라서, 본 발명자들은 특히 어린 환자들의 포피의 진피 또는 재건 피부 모델을 이용하여 탄력섬유의 형성 시 LOXL의 역할을 규명하였다.
또한, 본 발명자들은 연령별로 즉 노화동안 인간 피부의 진피에서 뿐만 아니라 흉터조직 지역에서 LOXL의 발현 결핍을 규명하였다.
라이실 옥시다제의 동종효소 중에서, LOXL은 탄력섬유를 교차결합할 수 있는 동종효소 중 하나이다. 그러나, 동종효소 LOXL 만이 기능적 섬유를 얻을 수 있는 탄력섬유의 교차결합을 위해 성인에서는 소실되어 있다.
이러한 기대치 않은 발견들을 통해, 본 발명자들은 화장료 또는 약제학적 조성물을 제조하기 위한 활성성분을 동정하는 관점에서 기능적 탄력섬유의 형성을 촉진하는 활성성분의 스크리닝방법을 실시하였다.
또한, 본 발명은 LOXL을 코딩하는 인간 유전자의 프로모터의 활성화에 관한 것이다(실시예 7 참조).
이들 프로모터의 다양한 활성 부위들이 규명되었다. 상기 프로모터의 염기서열을 첨부하였으며, PrhLOXL로 명명하였다.
상기 프로모터에서, 인간 포피 피부의 섬유아세포에서 변이적 트랜스펙션(transitional transfection) 후 발현되는 리포터 유전자인 루시퍼라아제에 대해 업-레귤레이션 활성을 갖고 있는 뉴클레오티드 -712/-391 부위가 있다(hLOXL 유전자의 트랜슬레이션의 +1에서부터 넘버링 함).
본 발명자들은 핵내 인자들에 의한 예상 조절 사이트를 정할 수 있었다. 이들 인자들은 사이토카인 또는 어떤 유전자들의 전사에 작용하는 것으로 알려져 있는 인자들과 연과되어 있었다.
PrhLOXL의 다양한 부위들은 활성화 또는 억제 지역으로서 확인되었다.
즉, -2172/-2002; -1438/-968; -712/-391 부위는 활성화 부위이며, -2002/-1438; -968/--712는 억제 부위로 확인되었다. -80/-1 부위는 활성부위는 아니며 전사의 +1의 아래쪽에 위치한다. 이러한 넘버링에 있어서, 예상 전사 +1은 트랜슬레이션 개시 사이트에서 -342에 위치한다. 이러한 방식으로, 이들 부위의 몇몇 사이트들은 hLOXL 유전자를 조절할 가능성이 있는 것으로 보였다. 즉, 이들 사이트들은 레티노산에 대한 2개의 예상 반응사이트, TGF-β(Transforming Growth Factorβ)에 대한 2개의 예상 반응사이트, 오에스트로겐에 대한 3개의 예상 반응사이트 및 글루코코티코이드(GRE)에 대한 2개의 예상 반응사이트이다.
이는 활성성분들이 hLOXL의 새로운 합성 및/또는 활성을 촉진하여 hLOXL 유전자의 프로모터에 작용하고 특히 이들 지역에서 직·간접적으로 이들 사이트에 고정하여 단백질의 발현을 조절함으로써 탄력섬유의 형성을 촉진함을 암시하는 것이다. 따라서, PrhLOXL의 뉴클레오티드의 염기서열의 적어도 한부분과 결합할 수 있는 특히 상기에 기재된 예상 사이트와 결합할 수 있거나 또는 그것을 수행할 수 있는 단백질의 발현을 조절할 수 있는 부위를 포함할 때, 물질은 활성물질로서 고려될 가능성이 있다.
본 발명자들의 전반적인 연구들을 통해, 탄력섬유의 형성을 자극할 수 있는 활성성분을 확인하는 방법을 개발할 수 있었다.
본 발명에서, 본 발명자들은 특히 LOXL을 코딩하는 mRNA의 발현 여부를 조사하고 확인할 수 있는in situ하이브리디제이션을 실시하였다.in situ하이브리디제이션은 특히 각질형성세포를 첨가한 후 30일 째에서 얻은 파라핀에 싸여있는 재건 피부 모델의 절편을 다이곡시게닌으로 표지한 이중 가닥의 DNA 프로브로 실시하였다. 또한,in situ하이브리디제이션은 트로포엘라스틴 및 콜라겐 α1(I)의 mRNA의 발현을 확인하기 위해 실시하였다(실시예 8 참조).
LOXL mRNA는 진피 심층과 표피 전체에서 발현된다. 트로포엘라스틴 mRNA는 진피의 섬유아세포 근처와 표피에서 발현된다. 콜라겐 α1(I)의 mRNA는 진피에서는 발현되지만 표피에서는 발현되지 않는다. 본 발명에서, LOXL mRNA의 발현 여부는 특히 기능성 탄력섬유의 형성을 자극하는 활성성분의 투여 후 재건 피부 모델에서 조사 및 확인할 수 있었다.
본 발명에서, hLOXL 유전자는 재건 피부 모델, 특히 재건 피부 모델 Mimeskin®(프랑스 리옹 꼴레띠까)에서 각질형성세포를 첨가함에 따라 활성화되었다. LOXL mRNA의 합성 유도는 특히 트로포엘라스틴과 동시에 일어나며, 특히 진피 등가물에 각질형성세포를 첨가한 후 약 6일째에 나타난다.
또한, 본 발명은 나이가 든 기증자에서 유래한 섬유아세포에서 인간의 엘라스틴 유전자뿐만 아니라 hLOXL 유전자의 발현 수준이 감소하는 것을 규명할 수 있었다.
이에 대해, 본 발명자들은 포피 유래의 섬유아세포(FF, 어린 태아에서 유래함)의 5개의 세포주와 복부성형수술에서 얻은 성인 섬유아세포(AF, 평균 20세의 세명, 평균 60세의 세명에서 유래함)의 6개의 세포주를 사용하였다. 또한, 단백질 LOX를 코딩하는 유전자의 발현을 테스트하였다(실시예 9 참조).
한 개의 액틴뿐만 아니라 이들 3개의 목적 유전자의 발현은 실시간 RT-PCR로 분석하였다. 본 발명은 상기 분석 타입에 한정하지는 않는다. 상기 기술은 일정하게 발현되는 것으로 알려져 있는 액틴과 유전자의 발현을 비교함으로써 유전자의 발현을 실제로 정량할 수 있다. 따라서, 이 유전자의 발현 수준의 조절이 정량화될 수 있다.
도 12의 결과를 통해, LOXL mRNA의 합성은 포피의 섬유아세포와 비교하여 거의 70% 정도로 성인의 섬유아세포에서 극적으로 그리고 통계적으로 유의하게 감소하였다. 반면, 엘라스틴 mRNA는 연령별 유의한 차이가 나타나지 않았다. 탄력조직이 소실되고 교체되지 않는 경우, 엘라스틴 유전자의 활성 억제때문은 아닌 것 같기 때문에, 이 자료는 엘라스틴에 대한 문헌과 일치한다.
LOX mRNA의 합성은 FFs와 비교하여 AFs에서 평균 40% 감소하지만, 이 효소가 정상인간 피부에 항상 발현되는 것은 아니다. 이러한 변이는 생체내 현상을 따르는 것은 아니다.
또한, 탄력섬유의 형성을 촉진하기 위해 엘라스틴의 발현을 촉진하는 장점이 있다.
본 발명은 특히 섬유아세포에서 LOXL의 발현을 확인할 수 있는 방법을 제공한다.
본 발명은 탄력섬유의 형성을 촉진하는 활성성분을 확인하기 위한 방식에 있어서 이들 다양한 기술들을 실시하는 것을 목적으로 한다.
일반적으로, 본 발명의 방법들은 단백질 LOXL의 발현을 조사하고, 특히 LOXL을 코딩하는 mRNA의 발현을 조사한다(실시예 10 참조).
또한, 본 발명은 탄력섬유의 형성을 촉진하는 활성성분들에 관한 것이다(실시예 11 및 12 참조).
또한, 본 발명은 화장료 또는 약제학적 조성물을 제조하기 위한 효소 LOXL, 또는 유도체 또는 상기의 활성성분의 이용에 관한 것이다(실시예 13 내지 18 참조). LOXL의 자극은 유전자 수준, mRNA 또는 직접적으로 단백질에서 실시될 수 있다. 이러한 활성화는 효소 LOXL에 의한 엘라스틴의 교차결합으로 인해 탄력섬유를 형성할 수 있다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점들은 다음의 실시예를 참조하여 설명하고 있으므로 당업자에게는 자명한 것이다.
실시예들은 본 발명의 구성 부분을 이루고 있으며, 실시예를 포함하여 전반적인 설명을 통해 종래기술과 비교하여 신규한 것으로 보이는 어떠한 특징은 기능 및 일반성에 있어서 발명의 구성 부분을 이루고 있다.
따라서, 모든 실시예들은 일반적인 범위에 해당된다.
또한, 실시예에서, 모든 비율은 특별한 지적이 없는 한 체중별 비율을 의미하는 것이며, 온도는 특별한 지적이 없는 한 섭씨온도를 나타내며, 특별한 지적이 없는 한 압력은 대기압을 나타낸다.
[실시예]
실시예 1:
본 발명은 우선 LOX 및 LOXL의 신규한 특이 항체들의 개발을 포함하고 있지만, 그들의 성숙한 형태만을 탐지할 수 있다. LOX 및 LOXL의 성숙 부분들에 대한 항체들을 개발하였다. 항원부분들은 해당 부분과의 최소한의 유사성이 있도록 하기 위해 라이실 옥시다제의 다른 동종효소(LOs)에서 선택하였다. LOXV228-S280펩티드 부분에 대해 얻은 항체를 항-LOXmat라 부르며, LOXLR231-G368펩티드 부분에 대해 얻은 항체를 항-LOXLpro라 불렀다.
도 1은 특이 항체를 제공하기 위한 LO 염기서열에 대한 설명을 나타내며 항-LOX 및 항-LOXL 항체를 개발하기 위한 항원 부분의 선택 단계를 나타내고 있다.
도 1(a)은 hLOX(human LOX protein) 및 hLOXL(human LOXL protein)의 개략도이다.
hLOX 및 hLOXL의 염기서열은 유사성이 높은 부분을 강조하기 위해 오픈 박스(C-말단 부분에서 점으로 나타냄)로 나타냈다. hLOX의 A22 및 D169에는 pre-region의 절단 위치와 procollagen-C-proteinase(PCP)에 의한 절단 사이트를 각각 나타냈다. Q26 잔기 앞 LOXL의 pre-region의 절단 위치, 56kDa 전구체(Q135 전)의 N-말단의 성숙 사이트, 및 56kDa의 LOXL 전구체의 PCP에 의한 절단 사이트의 위치(D338 잔기 앞)가 나타나 있다. 해당 LOXL 단백질 Q26-S574, D135-S574, 및 D338-S574의 예상 분자량은 대략 63, 54.6 및 26.7 kDa 으로 표시될 것이다. 항-LOX를 얻는데 사용되는 재조합 펩티드의 위치는 다음과 같다: 항-LOXpro에 대해서는 G128-L212 펩티드, 항-LOXmat에 대해서는 V228-S280 펩티드, 및 항-LOXcat에 대해서는 D305-N373 펩티드. 항-LOXL 항체를 개발하기 위해 사용된 재조합 펩티드의 위치는 다음과 같다: 항-LOXLpro에 대해서는 R231-G368 및 항-LOXLmat에 대해서는 S355-D415 펩티드.
도 1(b)은 LOX 및 LOXL의 항원 부분과 LO 동종효소에 대한 그들의 등가물 간의 유사성 비율을 표로 나타낸 것이다.
도 1(b)의 표에서, hLOXL은 인간의 LOXL 단백질을, bLOXL은 소의 LOXL 단백질을, mLOXL은 쥐의 LOXL 단백질을, hLOX는 인간의 LOX 단백질을, bLOX는 소의 LOX 단백질을, hLOXL2는 인간의 LOXL2 단백질을, hLOXL3는 인간의 LOXL3 단백질을, hLOXL4는 인간의 LOXL4 단백질을 나타낸다.
컬럼의 길이(aa)는 해당 부분에서 포함되는 아미노산 수의 수치를 포함하고 있다.
항체를 얻기 위해, 센스 프라이머(5'-TTGGATCCAGCGTAGGCAGCGTGTAC-3', SEQ ID NO.17)와 안티센스 프라이머(5'-AAACTCGAGCATCGTAGTCGGTGGC-3', SEQ ID NO.18)를 이용한 PCR을 통해 생성된 hLOXL cDNA 염기서열(cDNA hLOXL)을 도입하여 키메라 유전자를 구축하였다.
센스 프라이머(5'-TCGGATCCGGCTACTCGACATCTAGAGCC-3', SEQ IN NO.18)와 안티센스 프라이머(5'-GTCCTCGAGACCGTACTGGAAGTAGCC-3', SEQ ID NO.19)를 이용하여 증폭한 hLOX cDNA를 도입하여 융합 유전자 GST-LOXG128-L212를 구축하였다.
센스 프라이머(5'-TTGGATCCGTGCAGAAGATGTCCATGTAC-3', SEQ ID NO.20)와 안티센스 프라이머(5'-TTTCTCGAGGCTGGGTAAGAAATCTGATG-3', SEQ ID NO.21)를 이용하여 증폭한 hLOX 염기서열을 도입하여 융합 유전자 GST-LOXV228-S279를 구축하였다.
센스 프라이머(5'-CACTATGGATCCCTTGATGCCAACACCC-3', SEQ ID NO.22)와 안티센스 프라이머(5'-CACGACCTTTAGGATATCGTTTCCAGG-3', SEQ ID NO.23)를 이용하여 증폭한 hLOX cDNA를 도입하여 융합 유전자 GST-LOXD306-N373를 구축하였다.
PCR에 의한 이들 증폭 시, Taq polymerase High Fidelity(프랑스 메이만 로쉐 다이아그노스틱)를 사용하였다.
토끼의 폴리클로날 항체뿐만 아니라 융합 단백질 GST-LOX 및 GST-LOXL은 융합 유전자 GST-LOXLS355-D415및 GST LOXG128-L212의 발현으로부터 유래하는 융합 단백질에 대해 상기에서 기재된 대로 획득하여 분리하였다(Decitre et al., Lab Invest, 78:143-151, 1998; Borel et al.,J. Biol. Chem., 276: 48944-49, 2001).
흡착 실험을 위해, 항체를 융합 단백질과 20℃에서 3시간 동안 배양한 다음 면역적 탐지 전에 니트로셀룰로우즈 멤브레인, Hybond-ECL(아머샴 바이오사이언스)에 흡착시켰다.
상기 단계들은 우선 성숙 단백질의 면역화학적 및 생화학적 특징으로 인해 LOX 및 LOXL의 성숙 형태를 입증할 수 있다(실시예 2, 도 2 참조). 현상된 항체들은 성숙한 형태의 LOXL를 인지할 수 없는 종래기술과는 다르다(Decitre et al., Lab Invest, 78:143-151, 1998; Borel et al.,J. Biol. Chem., 276: 48944-49, 2001). 본 발명은 항-LOXLmat 항체 및 항-LOXmat 항체를 사용하지 않았으며, 이는항-LOXLmat에 의해서는 인지되나 항-LOXmat에 의해서는 인지되지 않는 31 kDa의 단백질을 입증할 수 있었으며, 이는 LOXL의 성숙 형에 해당하는 것이다. 이로부터 본 발명은 종래기술, 특히 그들의 특징을 규명함 없이 LO 패밀리의 유전자로부터 유래하는 단백질을 기재하고 있는 Csiszar et al의 특허(WO 01/83702 A2 특허출원: Novel memebers of the lysyl oxidase family of amine oxidases related applications)에 비해 진보한 것임을 입증하는 것이다.
실시예 2: 신규한 항-LOX 및 항-LOXL 항체에 의한 근육세포의 LOX 및 LOXL의 면역적 탐지
도 2는 다음에 설명하고 있는 전기영동의 사진도이다. 이들 전기영동을 통해 실시예 1에 따른 신규한 항-LOX 및 항-LOXL 항체에 의한 평활근세포(smooth muscle cell)의 LOX 및 LOXL의 성숙단백질의 특징을 규명하였다.
항-LOXLmat, 항-LOXmat, 항-LOXpro 및 항-LOXpro 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅을 통해 쥐의 평활근 세포주의 세포 스트레인(L) 및 세포배양배지(M)의 단백질을 추출하고 탐지하였다. 세포는 37℃, 5%CO2대기 하에서 10% 우혈청, 2mM 글루타민 및 50 ㎍/mL 젠타마이신을 포함하는 DMEM 배지(시그마사)에서 배양하였다.
세포 스트레인 단백질은 PBS 완충액으로 두번 세척한 후 세포용해 완충액(16mM 인산염 완충액, pH 8, 0.5% NP40, 프로테아제 인히비터(Complete Mini, 로쉐 다이아그로스틱스), 및 우레아 6M)에서 4℃에서 2시간 동안 교반하면서 추출하였다. 세포용해물은 2배의 프로테아제 인히비터(Complete Mini, 프랑스 메이란 로쉐 다이아그노스틱스)를 포함한 16mM 인산염 완충액(pH8)으로 희석한 다음, 15,000 g에서 5분간 원심분리하였다. 용해성 단백질은 전기영동하기 전에 10% 트리클로로아세트산(TCA)을 첨가하여 침전시켰다.
혈청없이 48시간동안 배양한 세포배양배지의 단백질은 10% TCA 또는 50% 포화 암모늄 설페이트를 첨가하여 회복 및 침전시켰다.
면역적 탐지를 위해, 단백질은 10% 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동을 통해 분리하였다. 단백질을 폴리비닐아이덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인(Immobilon PSQ, Millipore)에 트랜스퍼한 다음, 상기에서 기재된 방법으로 면역 탐지를 하였다(Borel et al., 2001).
실시예 3: 탄력섬유형성과정에서 LOX 및 LOXL의 역할 규명
본 발명자들은 LOX 및 LOXL 단백질이 면역조직화학에 의한 재건피부모델의 진피에서 결합조직의 혈성과 관련이 있을 수 있음을 규명하였다(도 3). 이러한 규명은 2개의 효소(LOX 및 LOXL)의 pro-enzymatic 부분과 성숙 부분적 대한 항-LOX 및 항-LOXL을 이용하여 어떠한 모호함도 없이 얻었다.
도 3은 재건피부(RS) 및 정상인간피부에서 LOX 및 LOXL의 면역조직학적 탐지 결과를 나타내고 있다.
면역적 탐지(G) 전에 해당 펩티드 GST-LOXLR231-G368에 흡착된 항-LOXLR231-G368(A, C, E) 또는 항-LOXLR231-G368을 이용하여 16일(A), 35일(C) 및 45일(E)째에 재건피부에서 LOXL(A, C, E, G)의 면역적 탐지를 실시하였다. 면역적 탐지(H) 전에 해당 펩티드 GST-LOXV228-S279에 흡착된 항-LOXV228-S279(B, D, F) 또는 항-LOXV228-S279을 이용하여 16일(B), 35일(D) 및 45일(F)째에 LOX(B, D, F, H)의 면역적 탐지를 실시하였다. 항-LOXLR231-G368(I) 및 항-LOXV228-S279(J)를 이용하여 인간 포피의 피부에서 LOXL(I) 및 LOX(J)의 면역적 탐지를 실시하였다. 진피-표피의 접합 지점은 오픈 화살표로 나타냈으며, 진피 기질은 화살표로, 16일째 각질형성세포의 위치는 화살촉으로 나타내었다.
재건피부(Mimeskin®, 프랑스 리옹 꼴레띠까)는 보우인의 정착제(Bouin's fixative, LOX, LOXL, 엘라스틴) 또는 10%의 포몰용액(formol solution, 엘라스틴용)으로 제조한 다음, 파라핀으로 에워쌌다. 6 ㎛ 두께의 절편을 파라핀에서 제거하고 글리신-HCl(100 mmol/L)로 표백하였다. 항-LOX 및 항-LOXL 항체는 상기에 기재된대로 하였다.
항체들은 다음과 같이 희석하여 사용하였다: 1:500(항-LOXLR231-G368), 1:100(항-LOXV228-S279, 항-LOXLS355-D416). 면역 복합체들은 기질로서(DAKO) 디아미노벤지딘을 이용하여 토끼(염소) 항 IgG 컨쥬게이티드 페록시다아제(DAKO, 프랑스 트라페)로 탐지하였다.
따라서, LOXL은 Mimeskin®과 같은 재건피부모델에서 탄력섬유형성과정에 참여하는 뛰어난 후보물질인 것이다.
실시예 4: 탄력섬유형성과정에서 LOXL2, LOXL3 및 LOXL4의 역할 규명
본 발명은 또한 2개의 신규한 항-LOXL2 항체들의 개발을 포함하고 있으며, 이들 항체들 중 하나는 이론적으로는 LOXL3 및 LOXL4를 인지한다. 따라서, 이들 효소들이 재건피부모델의 진피에서 엘라스틴과 더불어 발현되는 지를 규명할 수 있다. 2개의 항-LOXL2 항체들을 이용한 면역조직화학적 분석 결과, 2개의 항원처럼 연결된 단백질 LOXL3 및 LOXL4 뿐만 아니라 이 항원은 진피에서 발현되지 않거나 거의 발현되지 않으므로, 탄력섬유형성과정에 참여하지 않는다.
도 4는 재건피부(16, 35 및 45일째) 및 인간 포피 피부 절편에서 LOXL2, LOXL3 및 LOXL4(오른쪽 컬럼)을 인지하는 항체 항-LOXL2517-581(왼쪽 컬럼) 및 항체 항-LOXL2664-720을 이용한 면역적 탐지 결과를 나타내고 있다.
항-LOXL2 항체는 상기에서 기재된 융합 팹티드 GST-LOXL2에 대해 얻은 것이다(Decitre et al.,Lab. Invest., 78, 143-151, 1998). 융합 유전자 GST-LOXL2517-581은 상기에 기재된 대로 플라스미드에서 인간 LOXL2 유전자(hLOXL2)의 1543 내지 1747의 염기서열을 도입함으로써 구축하였다.
상기 단편은 센스 프라이머(5'-GAGCTGGGATCCGCGCACTGCC-3') 및 안티센스 프라이머(5'-GGCTGAGTCGACGAGGCAGTTCTCC-3')를 이용한 PCR을 통해 생성하였다.
융합 유전자 GST-LOXL2664-720은 센스 프라이머(5'-CACAGGATCCGAAGGAGACATCCAGAAG-3') 및 안티센스 프라이머(5'-TTTCTGAGCTCCTGCATTTCATGATG-3')를 통해 해당 hLOXL2 염기서열을 도입함으로써 구축하였다.
이들 단백질에 대한 융합 단백질과 항-토끼 항체는 상기 기재된 대로 제조하였다. 517-580 펩티드에 대한 항체는 이 부분이 LOXL2에 대해 특이적이기 때문에 항-LOXL2라 불렀다.
664-734 펩티드에 대한 항체는 LOXL2의 이 부분이 LOXL3 및 LOXL4와 높은 유사성을 가지고 있기 때문에(각각 약 74.6%, 60.5%), 항-LOXL-R(relative to)라 불렀다.
16일(RS-D16), 35일(RS-D35) 및 45일(RS-D45)째에 재건피부(Mimeskin®, 프랑스 리옹 꼴레띠까) 및 인간 포피 피부는 항-LOXL2-R 및 항-LOXL2 항체를 이용한 면역조직화학적 연구를 통해 분석하였다. 항-LOXL2는 상피에서 LOXL2를 발현되었지만 진피에서는 발현되지 않았다. 반면, LOXL2, LOXL3 및 LOXL4의 공통 C-말단 부분에 대한 항체는 상피에서 이들 효소들의 발현을 확인하였으며 진피에서 그러나 탄력섬유형성과정 부위에 해당되지 않는 부분에서는 낮은 발현을 나타냈다.
따라서, LOXL2, LOXL3 및 LOXL4는 탄력섬유형성과정에 관여하지 않는다.
실시예 5: 탄력섬유형성과정에서 LOXL의 역할 규명
한편으로는 LOXL 및 LOX 간, 다른 한편으로는 탄력섬유 또는 미세섬유의 결합은 본 발명에서 투과전자현미경(transmission electron microscopy)에서 분명히 규명되었다.
미세섬유와 결합되어 있는 LOX 및 LOXL은 엘라스틴이 침착되어 있는 골격을 구성하는 반면, LOX 만이 콜라겐 섬유의 형성에 관련되어 있다(도 5 참조).
도 5는 각질형성세포의 적용 후 30일째에 재건피부의 진피 부분에서, 그리고 정상인간 피부의 진피 부분에서 투과전자현미경을 통해 LOXL, LOX 및 엘라스틴의 면역적 탐지 결과를 나타낸 것이다.
0.1% 글루타알데히드를 포함하는 PBS 완충액 내 4% 파라포름알데히드로 4℃에서 3시간 동안 조직을 고정한 다음, 0.4M 슈크로우즈 카코딜레이트 및 0.2M 라이신을 포함하는 인산염 완충액에서 세척하고, 에탄올 용액에서 탈수시킨 다음, LR 화이트(Euromedex, 프랑스)에 넣었다. 그 후, 1% 우혈청 알부민(BSA)이 첨가된 Tris-HCl 완충액(pH8.2)으로 1:50으로 희석시킨 일차 항체를 이용하여 탐지하였다. 면역 복합체들은 1:40으로 희석된 토끼 항-IgG 항체 컨쥬케이티드 콜로이달 골드 파티클(colloidal gold particle, 10 및 20 nm, 프랑스 테부 바이오셀)으로 탐지하였다. 시료들은 3% 수용성 우라닐 아세테이트 및 리드 시트레이트(lead citrate)로 대조한 다음, JEOL 1200 EX 투과전자현미경 하에서 시험하였다. 면역적 탐지는 재건피부(A-D) 및 인간 포피 피부(F-I)에서 실시하였다.
재건피부에서, 다음의 항체들로 실험하였다: 상품으로 판매되고 있는 항-LOXL(A, B), 항-LOX(C), 항-엘라스틴(Elm), 인간 항-엘라스틴 항체(시그마)를 1:50으로 희석하였고, 진피(대조군, E)에서 일차 항체가 없는 것을 음성대조군으로 하였다. 인간 포피 피부에 대해서는 이중 표지(F-I)하였다.
참조 A-D: LOXL, LOX 및 엘라스틴에 대한 면역적 탐지는 재건피부의 진피 부분에서 45일째에 전자현미경 하에서 실시하였다.
참조 E: 재건피부의 진피에서 45일째에 즉, 각질형성세포를 첨가한 후 30일 째에 항-엘라스틴 및 항-콜라겐 I 항체를 양성대조군으로 함.
참조 F 및 I: LOXL, LOX, 엘라스틴 및 콜라겐에 대한 이중 면역적 탐지는 인간 포피의 진피 부분에서 전자현미경 하에서 실시하였다.
참조 G-H: 토끼 항-LOXL 항체(토끼 항-IgG는 10 nm 골드 파티클과 결합되어 있음) 및 쥐의 항-엘라스틴 항체(쥐의 항-IgG는 20 nm의 골드 파티클과 결합되어 있음)로 인간 포피의 진피 부분에서 이중 표지함.
도면의 색인어: m: 미세섬유, c: 콜라겐 섬유, e: 무정형의 엘라스틴, 비율 표시: 500 nm.
LOXL(A-B)은 촘촘한 침착물 또는 미세섬유에 결합되어 있지만, 이들 부분에서 백색으로 보이는 콜라겐 섬유에는 결합되어 있지 않다. 비록 소수의 골드 파티클이 촘촘한 침착물, 미세섬유 및 콜라겐에서 발견될 수 있다고는 해도 LOX(C)의 표지는 낮다. 항-엘라스틴 항체는 같은 촘촘한 침착물과 미세섬유(D)를 탐지하였다. LOXL 및 LOX의 미세섬유 및 탄력섬유와의 결합은 면역적 탐지 후(G-H) 전자현미경 하에서 인간 포피 피부에서 확인하였다. 재건피부모델에서 관찰된 바와 같이, LOXL은 콜라겐 섬유와 결합되어 있지 않는 반면, LOX는 콜라겐 섬유에서 잘 나타나며, 미세섬유에서는 거의 나타나지 않았다. LOXL 항원은 미세섬유 및 인간 포피 피부의 탄력섬유 주변과의 결합으로 탐지되었다. LOXL은 미세섬유 주위로 확장되어 있는 무정형의 엘라스틴과는 결합하지 않지만, 특히 그들의 주변에서 발견되며 콜라겐 섬유와는 결합하지 않았다.
LOXL은 재건피부모델과 인간 포피 피부에서 탄력섬유와 결합한다.
실시예 6: LOXL의 발현 및 탄력섬유형성과정 간의 관계 규명
LOXL 및 LOX는 엘라스틴 합성이 여전히 높은 어린 환자(몇개월)로부터 얻은 포피 피부의 진피에서 발현된다. 그러나, LOXL은 성인의 피부, 목, 유방, 복부 또는 얼굴의 진피에서는 발현되지 않지만, LOX는 진피에서 항상 발현된다(도 6 참조).
도 6은 인간 피부에서 LOX 및 LOXL의 면역적 탐지 결과를 나타낸 것이다.
프랑스 리옹 에두아르드 헤리엇 병원의 조직은행에서 얻은 포피(A, B), 목(C, D), 유방(E, F) 및 복부(G, H)의 피부 시료에서 LOX 및 LOXL의 발현을 탐지하기 위해 항체 항-LOX(A, C, E, G) 및 항-LOXL(B, D, F, H)를 사용하였다. 조직은 보우인 제로 고정하고 파라핀에 끼운 다음, 상기에서 기재된 대로 면역적 탐지를 실시하였다.
목, 유방, 복부 또는 얼굴 피부의 진피에서 LOXL의 탐지 결과, 태아 및 어른에서 LOXL은 탐지되지 않았다(도 7: 복부).
도 7은 다양한 연령별로 얻은 인간 복부 피부에서 LOX 및 LOXL의 면역적 탐지 결과를 나타낸 것이다.
에두아르드 헤리엇 병원의 조직은행에서 얻은 1.5세(A,B), 35세(C, D), 60세(E, F) 및 91세(G, H)에서 얻은 복부 피부 시료에서 LOX 및 LOXL의 발현을 탐지하기 위해 항체 항-LOX(A, C, E, G) 및 항-LOXL(B, D, F, H)를 이용하였다. 보우인 제로 조직을 고정하고 파라핀에 끼운 다음, 면역적 탐지 과정에 따라 면역적 탐지를 실시하였다.
이와 같은 단계 동안, 이들 2개의 효소의 발현의 매우 늦은 정지(91세)와 더불어 인간 피부의 상피에서 LOX 및 LOXL의 고발현이 관찰되었다(도 7 참조).
흉터에서, LOX 또는 LOXL 어느 것도 흉터 후 3개월 또는 5년 된 흉터 조직에서 관찰될 수 없다. 이는 엘라스틴이 3개월째에 면역적으로 탐지되나 이 흉터에서 5년째에는 사라짐을 말해주는 것이다.
도 8은 치료 후 다양한 시기의 흉터 조직에서 LOX 및 LOXL의 면역적 탐지를 나타낸 것이다.
17세 환자의 목 피부, 흉터 주위(정상 부위, A-C), 치료 후 3개월(D-F) 또는 5년(G-H)된 시료에서 LOX, 엘라스틴 및 LOXL의 발현을 탐지하기 위해 항체 항-LOX(A, D, G), 항-엘라스틴(B, E, H) 및 항-LOXL(C, F, I)를 이용하였다. 보우인 제로 조직을 고정하고 파라핀에 끼운 다음, 면역적 탐지 과정에 따라 면역적 탐지를 실시하였다. 엘라스틴 표지는 0.2% 하이알루로니다아제(시그마)를 이용한 차폐제거(demasking)가 필요하다.
이들 실시예로부터, 본 발명은 다음을 입증하였다: i) 재건피부모델과 어린환자의 포피의 진피에서 탄력섬유의 형성 시 LOXL의 밀접한 관련성, ii) 다양한 연령대에서 인간피부의 진피에서 그리고 흉터에서 LOXL의 발현의 실질적인 결손. 따라서, LOXL은 기능적인 탄력섬유의 교차결합을 할 수 있는 한편, 기능성 섬유를 생성하기 위한 탄력섬유의 교차결합이 필수적인 상황에서 분실될 수 있는 라이실 옥시다제 동종효소이다.
실시예 7: LOXL 유전자의 전사 전 조절에 대한 연구
본 발명은 인간의 LOXL 유전자(hLOXL)가 프로모터 수준에서 활성화될 수 있는 지를 추가로 규명할 수 있었다(도 9 참조). 서열목록 서열 3은 이 프로모터의 -2730 에서 -1의 뉴클레오티드 염기서열을 나타낸 것이다. hLOXL 프로모터의 몇몇 활성 지역은 입증되어 있다. 특히, 뉴클레오티드 -712/-391(LOXL 유전자의 트랜슬레이션 +1에서부터 넘버링 함)에 해당되는 부분은 인간 포피 피부의 섬유아세포에서 트랜슬레이션 감염 후 발현되는 리포터 유전자인 루시퍼라아제에 대한 업-레귤레이션(up-regulation) 활성을 가지고 있다(도 9).
본 발명자들이 이미 hLOXL의 발현 변이는 유전자 및/또는 단백질의 수준에서 동시에 추적할 수 있음을 규명한 대로, 이 유전자의 합성 및 해당 hLOXL 단백질을 활성화시킬 수 있는 hLOXL 유전자의 전사 전 업-레귤레이션이 있다. 이는 이미 LOX에 대해서도 규명한 바 있다(Decitre et al.,Lab. Invest., 78, 143-151, 1998).
인터넷 상에서 Transfac®프로그램에 따라 핵 내 PrLOXL 염기서열의 연구를통해 핵 내 인자에 의한 조절 예상 사이트를 규명할 수 있었다. 이들 인자들은 사이토카인 또는 이들 전사 인자들에 의한 어떤 유전자들의 전사에 작용하는 것으로 알려진 다른 인자들과 연관되어 있다. 가장 주목할만한 사이트를 도 10에 나타내었다. 도 10의 도식은 이러한 분석을 요약하고 있으며, 레티노산에 대한 2개의 예상 반응사이트, TGF-β에 대해서는 2, EGF에 대해서는 1, 오에스트로겐에 대해서는 3 및 글루코코티코이드에 대해서는 2로써 나타냈다. 따라서, 조절 지역에서 연구되었기 때문에 LOXL 유전자의 전사를 조절할 수 있는 몇몇 사이트를 규명할 수 있었다. 이들은 레티노산, TGF-β, EGF 및 글루코코티코이드에 대한 반응 예상 요소들이다. 프로모터의 활성이 이들 요소들 없이는 각각 약 50% 및 60%로 떨어지기 때문에, 레티노산 및 오에스트로겐에 의한 이들 예상 조절 사이트에 해당하는 지역은 전사에 대한 실제 활성 효과를 갖는 것 같다.
따라서, hLOXL의 프로모터, 특히 예상 인지사이트에 대한 작용물질 또는 길항물질의 작용을 갖는 활성성분의 스크리닝을 위해 기재된 수단들이 이용될 수 있다.
따라서, hLOXL의 프로모터의 뉴클레오티드의 염기서열의 적어도 일부분과 혼성화하거나 또는 이 특징을 갖는 효과기(effector) 단백질을 유도하는 부분을 포함하는 활성성분을 찾는데 장점이 있다.
hLOXL 유전자의 프로모터의 기능적 분석
인간의 LOXL 유전자(PrhLOXL)의 프로모터는 데이터베이스 분석을 통해 염기서열이 규명되어 있다. 전사 개시 사이트는 알려져 있지 않았기 때문에, 발명자들은 트랜슬레이션의 +1 부터 넘버링을 하였다. 그러나, 이 부분에 해당하는 EST(Expressed Sequence Taqs) cDNA 검색 결과, hLOXL 유전자의 전사 개시가 이 부분(TATA 박스가 없음)에서 일어난다고 예상할 수 있는 -342 위치로부터 보다 위쪽의 염기서열을 제공하지는 않았다. -2172 및 +189(엑손 1)의 위치에서 이 염기서열 상에 특이 프라이머를 나타냈다. 상기 프라이머들은 피부의 섬유아세포로부터 유래하는 인간 유전체 DNA로부터 PrhLOXL를 증폭 및 분리할 수 있다. 클로닝과 시퀀싱 후, 예상한바 대로 그것의 염기서열을 제공함을 확인하였다. 그 후, 진핵세포에서 그것을 연구하기 위해, 프로모터 전장 즉 -2172 내지 -1을 pGL3-basic 벡터(프랑스 샤르본니에레스, 프로메가)에 서브클로닝할 수 있었다. 리포터 유전자인 루시퍼라아제 유전자의 위쪽에 위치한다. 따라서, 감염된 세포에 의해 루시퍼라아제는 PrhLOXL의 조절 하에서 생성되므로, 그것의 활성에 비례하게 된다. 세포는 정상적인 결과를 얻을 수 있도록 β-갈락토시다아제(β-gal)를 강하게 반복적으로 발현하는 프로모터와 함께 감염된다. 같은 조건 하에서, 루시퍼라아제 및 β-gal의 활성을 측정하였다.
떼어낸 부위의 역할을 측정하기 위해 PrhLOXL을 점차적으로 감소시켰다(5' 결실). 인간 피부의 섬유아세포에서 PrhLOXL의 조절을 연구하기 위해, 이들 세포를 형질도입하였다. 쉽게 감염하는 세포주와 대조적으로, 정상 섬유아세포는 그다지 잘 감염되지 않는다. 배양 시 약 40%의 섬유아세포의 형질도입이 가능하므로,Superfect®(프랑스 코타보우프 큐아젠)를 선택하였다.
포피 섬유아세포에서 그들의 활성뿐만 아니라 제조된 구축물은 도 9에 나타내었다. 본 발명자들은 3개의 큰 전사 활성부위와 2개의 억제부위를 지명하였다. 예를 들어, -712→-391 부위는 그것을 떼어낼 경우(-391→-1) 프로모터의 활성이 크게 떨어지기 때문에 매우 활성화되어 있다. 본 연구를 통해, PrhLOXL의 전사를 촉진하기 위해 연구될 지역을 특이화할 수 있었다.
특히, 도 9는 프로모터 PrhLOXL의 염기서열의 기능으로써 루시퍼라아제/β-갈락토시다아제 활성을 나타내고 있다. 도 9는 인간 포피 피부의 섬유아세포 내 프로모터의 활성화 부위 및 억제 부위의 규명에 대한 이해를 더 할 것이다.
5' 에서 PrhLOXL의 연속적인 감소를 통해 리포터 유전저 루시퍼라아제로부터 프로모터 위쪽의 보다 짧은 염기서열을 갖는 7개의 구조물을 생성할 수 있었다: pLL-2172, pLL-2002, pLL-1438, pLL-712, -pLL-391, -pLL-81. 인간 피부의 포피 섬유아세포에 상기 구조물들을 도입시키고 루시퍼라아제의 활성을 측정하였다. 동시에, 형질도입에 대한 대조군으로서, 프로모터 SV40의 조절 하에서, β-갈락토시다아제 유전자를 갖고 있는 플라스미드를 세포에 도입시켰다. 최종 수치는 β-갈락토시다아제 활성(형질도입의 유효성을 나타냄)에 대한 루시퍼라아제 활성(hLOXL 프로모터의 염기서열의 활성을 나타냄)을 나타낸다. 3곳의 활성화 지역을 포함하여 프로모터에서 몇몇 조절 지역을 한정할 수 있는 활성들의 발생은 +로 나타내고(-2172→-2002; -1438→-968; -712→-391), 2곳의 억제 지역은 -로 나타냈다(22002→-1438; -968→-712). -81→-1 프로모터는 활성이 없으며, 전사의 +1로부터 아래쪽에 위치하였다. 전사의 예상 +1 은 트랜슬레이션 개시 사이트에 대해 -342 위치에 자리하고 있다.
도 10은 hLOXL 유전자의 프로모터의 개략도를 나타내고 있으며, 특히 hLOXL 유전자의 전사 조절 예상 사이트를 나타내고 있다. "+" 표시는 유전자의 발현의 활성화 지역을 나타내며, "-" 표시는 이들 발현의 억제 지역에 해당한다.
실시예 8: 재건피부모델에서 각질형성세포의 도입에 의한 LOXL의 활성화 규명
LOXL을 코딩하는 유전자의 발현 탐지는 파라핀에 싸여있는 절편 상에서 다이고옥시게닌으로 표지된 이중 가닥의 DNA 프로브와 LOXL의 mRNA의in situ하이브리디제이션을 통해 규명하였다.
도 11은 35일째 피부모델 절편(Mimeskin®)을 나타내고 있다:
(A) LOXL의 발현은 진피 속과 모든 상피에 걸쳐 양성이다.
(B) LOX의 발현은 모든 진피에서 그리고 상피의 기저위(suprabasal)층에서 양성이다.
(C) 트로포엘라스틴(TE)의 발현은 진피 섬유아세포와 결합한 채 상피에서 발견된다.
(D) COL1A1(collagen α1(I)) 유전자의 발현은 진피에서는 탐지되나 상피에서는 탐지되지 않는다.
(E) 프로브없는 대조군.
DEJ의 위치는 오픈 화살표로, 다공성의 진피 기질은 화살표로, 양성 세포는 화살촉으로 나타내었다.
이중 가닥의 DNA 프로브는 PCR에 따라 생성하였다. 각각 다음 프라이머를 이용하였다:
I 알파1 콜라겐의 유전자에 대해서는,
센스 프라이머: 5'-GTGGAGAGTACTGGATTG-3'(SEQ ID NO.14)
안티센스 프라이머: 5'-TCGTGCAGCCATCGACAG-3'(SEQ ID NO.15)
트로포엘라스틴에 대해서는,
센스 프라이머: 5'-GTATATACCCAGGTGGCGTG-3'(SEQ ID NO.10)
안티센스 프라이머: 5'-CGAACTTTGCTGCTGCTTTAG-3(SEQ ID NO.11)
hLOX에 대해서는,
센스 프라이머: 5'-GGTGGCCGACCCCTACTACATCC-3'(SEQ ID NO.12)
안티센스 프라이머: 5'-GCAAATCGCCTCTGGTAGCCATAGTC-3'(SEQ ID NO.13)
hLOXL에 대해서는,
센스 프라이머: 5'-GACATAACCGACGTGCAGCC-3'(SEQ ID NO.8)
안티센스 프라이머: 5'-ATCCACGTTCGCTCCCTGAG-3'(SEQ ID NO.9)
DNAs는 Taq Polymerase(프랑스 샤르본니에레스 프로메가) 및 뉴클레오티드 표지자로서 Dig-11-dUTP(프랑스 메이란 로쉐 다이아그로틱스)을 사용하여 증폭한후, QIAquick 추출 키트(프랑스 코타보우프 큐아젠)를 이용하여 아가로우즈 젤 전기영동을 통해 분리 정제하였다. 파라핀에 고정된 절편으로in situ하이브리디제이션을 실시하였다. 시료에서 파라핀을 제거하고 2 ㎍/mL의 프로티나아제 K(로쉐)를 20℃에서 15분간 처리하였다. TSA+증폭 키트(NEN, 미국 보스톤)에서 지적한 대로 내재성 페록시다아제는 억제되었다. 하이브리디제이션 전 단계(pre-hybridization)는 50% 탈이온화된 포름아마이드, 2×SSC(소듐 솔트 시트레이트), 5mM EDTA, 2.5×덴하르츠 솔루션, 200 ㎍/mL의 변성된 청어 DNA, 1 mg/mL의 연어의 정자 DNA 및 10 mg/mL tRNA를 포함하는 20mM 인산염 완충액(pH7.4)에서 37℃에서 2시간 동안 실시하였다. 하이브리디제이션은 수조에서 끓는 물에 5분 동안 미리 변성시킨 프로브를 첨가하거나 또는 첨가하지 않고, 50% 탈이온화된 포름아마이드, 2×SSC, 5mM EDTA, 2.5×덴하르츠 솔루션, 200 ㎍/mL의 변성된 청어 DNA, 10%의 덱스트란 설페이트를 포함하는 20 mM의 인산염 완충액에서 37℃에서 16시간 동안 실시하였다. 혼성화 후, 절편을 20℃(콜라겐의 경우 37℃), 2×SSC/50% 포름알데히드, 1×SSC/50% 포름알데히드, 1×SSC, 및 0.5×SSC에서 세척하였다. 탈수 후, 다이곡시게닌으로 표지된 하이브리드는 항-DIG 항체 컨쥬케이티드 호스래디쉬 페록시다아제(로쉐)로 탐지하였다. 복합체의 최종 탐지는 TSA+증폭 키트(NEN)를 이용하여 실시하였다. 양성 시그널은 대기 온도에서 2시간 활성 후 TSA 키트의 증폭 과정과 관련되는 알칼라인 포스파타아제의 활성에 해당하며, 생성된 테트라졸리움 염의 침전으로써 밝혔다(니트로 블루 테트라졸리움/브로모클로릴인돌로포스페이트(NBT/BCIP) 기질을 이용함).
본 발명은in situ하이브리디제이션에 의한 mRNA 발현을 추적한 결과, LOXL 및 LOX 유전자가 재건피부모델(Mimeskin®, 프랑스 리옹 꼴레띠까)에서 각질형성세포를 추가함으로써 활성화될 수 있음을 규명하였다(도 11 참조).
LOXL의 합성 유도는 트로포엘라스틴의 것과 동시에 수반된다(진피 등가물에서 각질형성세포 첨가 후 6일 째).
또한, LOX 유전자는 콜라겐 Iα1 유전자(Col1A1)와 같은 시기에 각질형성세포를 첨가한 후 활성화된다.
실시예 9: 성인의 섬유아세포에서 LOX 유전자의 발현 감소의 규명
본 발명자들은 어린 태아의 포피로부터 유래한 섬유아세포(FF)의 5개의 세포주와 복부 성형수술 결과 얻은 성인의 섬유아세포(AF, 평균 20세 3명, 평균 60세 3명)의 6개의 세포주를 사용하였다. 액틴뿐만 아니라 3개의 목적 유전자의 발현을 실시간 RT-PCR(quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction, 도 12 참조)를 통해 분석하였다. 상기 기술은 액틴의 것(일정하게 발현되는 것으로 간주함)과 비교함으로써 유전자의 발현을 정량화할 수 있다. 따라서, 상기 유전자의 발현 수준의 조절이 정량화될 수 있다.
도 12에 나타난 바와 같이, LOXL mRNA의 합성은 성인의 섬유아세포에서 크게 통계적으로 유의하게 감소하였고, 20대에서는 포피의 섬유아세포와 비교하여 거의70%의 감소를 나타냈다. 반면, 엘라스틴의 mRNA는 나이에 있어서 유의한 차이를 나타내지 않았다. 상기 자료는 엘라스틴에 대한 문헌과 일치한다: 즉, 탄력섬유가 저하되어 대체되지 않는다하여도, 이는 엘라스틴 유전자의 활성이 억제되기 때문인 것 같지는 않다.
LOX mRNA의 합성은 FFs에서와 비교하여 AFs에서 평균 40% 감소하지만, 개인적 차이가 있다. 이러한 차이는 유의하지 않다.
SV 96 총 RNA 분리 시스템 키트(프랑스 샤르본니에레스, 프로메가)를 이용하여 총 RNA를 분리 정제하였다. 정제한 RNA를 100 ㎕의 RNase-free water(프랑스 샤르본니에레스, 프로메가)로 용출한 다음 플레이트(96-웰 플레이트)에 PCR 5 ng/㎕에서 총 RNA는 10 ㎕가 되도록 분주하여 측정하였다. 본 연구를 위해 선택한 프라이머는 다음 표 1과 같다:
유전자 명칭 크기(뉴클레오티드)
인간의 염기서열
인간 유전자 내 위치 녹는점(MT)
ELN 1 Ela 20
GTA TAT ACC CAG GTG GCG TG
센스: +443 62℃
2 Ela 21
CGA ACT TTG CTG CTG CTT TAG
안티센스: +799 62℃
LOX Ox64 21
ACG TAC GTG CAG AAG ATG TCC
센스: +676 60℃
Ox65
21
GGC TGG GTA AGA AAT CTG ATG
안티센스: +841 59℃
LOXL
30 L1
19
GAC TTC GGC AAC CTC AAG C
센스: +1480 60℃
30 L2
20
TGT TGC AGA AAC GTA GCG AC
안티센스: +1701 60℃
ACTIN 액틴 20
GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA
U 센스 72℃
액틴 24
CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC
D 안티센스 57℃
실시간 RT-PCR 기술은 OPTICON thermocycler에서 증폭 사이클을 실시하여 mRNA를 포함하는 웰에서 Quanti Tect SYBR Green RT-PCR 키트(프랑스 큐아젠)로 실시하였다. 역전사(RT)는 50℃에서 30분간 실시한 다음, 역전사효소를 억제하고 폴리머라아제를 활성화시키고, 얻은 상보적 DNA(cDNA)를 변성시키기 위해 95℃에서15분간 실시하였다. 50번의 연쇄중합사이클을 94℃에서 15초간, 60℃에서 30초간, 72℃에서 30초간 실시하였다. 매 사이클 끝에, 증폭된 단편의 수에 비례하여 형광이 읽힌다. 발현 수준은 액틴에 대해 각 유전자의 발현 비율로 정하였다.
본 실시예에서 탄력섬유형성과정에서 LOXL의 연관성 및 성인의 피부에서 그것의 소멸을 규명함에 따라, 연령별로 섬유아세포에서 LOXL, LOX 및 엘라스틴 유전자의 발현 수준을 조사하게 되었다.
상기 실시예에서 LOXL 및 LOX 유전자 산물의 합성은 유전자 수준에서 활성화될 수 있음이 규명되었다. LOXL 및 트로포엘라스틴의 mRNA의 합성 활성화는 재건피부에서 동시에 일어난다. LOXL 및 트로포엘라스틴의 유전자의 활성화는 탄력섬유를 형성할 수 있다. 활성성분의 스크리닝은 탄력섬유형성과정을 촉진하기 위해 엘라스틴과 LOXL 유전자의 발현을 동시에 재유도할 수 있는 물질의 동정을 유도할 수 있다.
결론적으로, 본 발명은 탄력섬유와 LOXL과의 직접적인 연관성, 재건피부에서 탄력섬유를 형성하기 위한 LOXL의 중요성, 및 기능이 있는 탄력섬유의 합성이 일어나지 않는 조직(성인 조직, 흉터)에서 LOXL의 부재를 입증할 수 있다. 본 발명은 특히 재건피부, 피부 생검, 및 인간의 피부에서 기능성 탄력섬유의 형성을 재유도하는 관점에서 LOXL 및 엘라스틴의 합성을 동시에 유도할 수 있는 신규한 물질을 탐지하기 위한 스크리닝방법에 관한 것이다.
실시예 10: 활성성분의 유무에 따른 정량적 RT-PCR에 의한 LOXL 및 엘라스틴의 mRNA 발현 분석
태아 포피 또는 성인에서 유래한 정상인간 피부의 섬유아세포에서 활성성분을 실험하였다. 배양은 혈청을 첨가하지 않은 특정 배지(Fibroblast Basal Medium)를 포함한 24-웰 배양 플레이트에서 단일층으로 실시하였다. 세포를 40,000/cm2로 파종하였다. 컨플루언스 상태에서, 세포를 유리하게는 24시간 동안 활성물질과 접촉하게 하였다. 동시에, 미처리 대조군(배지 자체)과 3개의 양성대조군(1 ng/mL의 TGF-β, 50 pg/mL의 IL-1α 및 2%(v/v)의 Phytokine®(프랑스 리옹 꼴레띠까))을 같은 배양 플레이트에서 실시하였다.
1 ng/mL의 TGF-β 및 50 pg/mL의 IL-1α를 미리 실험하였고, 이들 농도의 2개의 사이토카인에 의해 유도되는 엘라스틴 mRNA의 합성 촉진은 mRNA 분석 즉, 정량적 RT-PCR(TGF-β에 대해서는 ×10, IL-1α에 대해서는 ×6)로 확인하였다. 세포와 활성물질을 접촉시킨 후, 즉 24시간 후에 배지를 제거하고 세포는 인산염 완충액(pH7.4)으로 씻은 다음 -80℃에서 동결건조하여 보존하였다. 총 RNA는 96 웰 추출 키트를 이용하여 실리카겔 컬럼으로 추출하였고, 260 nm에서 96-웰 분광광도계상에서 측정하였다(순도 지표: 280 nm에서 단백질 측정). RNA는 5 ng/㎕로 희석하였다. 정량적 RT-PCR 제 1단계는 96-웰 플레이트에서 50 ng의 초기 RNA를 액틴, 엘라스틴, LOX 및 LOXL 유전자에 분주하는 것이다. 각 유전자의 특이 프라이머는 0.5μM을 사용하였다:
엘라스틴 유전자의 센스 프라이머: 1E1a 5'-GTA TAT ACC CAAG GTG GCG TG-3'(SEQ ID NO.24)
엘라스틴 유전자의 안티센스 프라이머: 2E1a 5'-CGA ACT TTG CTG CTG CTT TAG-3'(SEQ ID NO.25)
LOXL 유전자의 센스 프라이머: 30L1 5'-GAC TTC GGC AAC CTC AAG C-3'(SEQ ID NO.26)
LOXL 유전자의 안티센스 프라이머: 31L1 5'-TGT TGC AGA AAC GTA GCG AC-3'(SEQ ID NO.27)
LOX 유전자의 센스 프라이머: Ox64 5'-ACG TAC GTG CAG AAG ATG TCC-3'(SEQ ID NO.28)
LOX 유전자의 안티센스 프라이머: Ox65 5'-GGC TGG GTA AGA AAT CTG ATG-3'(SEQ ID NO.29)
액틴 유전자의 센스 프라이머: Actin U 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'(SEQ ID NO.30)
액틴 유전자의 안티센스 프라이머: Actin D 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'(SEQ ID NO.31).
증폭 특성은 다음과 같다: 48℃에서 30분간; 94℃에서 2분간; 94℃에서 30초간, 60℃에서 30초간, 68℃에서 30초간, 액틴에 대해서는 28 사이클, LOXL에 대해서는 30 사이클, LOX에 대해서는 32 사이클 또는 엘라스틴에 대해서는 34 사이클; 68℃에서 10분간; 14℃에서 무한. 증폭 후, 예를 들어 산물은 3 ㎕의 액틴 증폭 산물 + 5 ㎕의 엘라스틴 유전자 증폭 산물 + 5 ㎕의 LOX 유전자 증폭 산물 + 5 ㎕의 LOXL 유전자 증폭 산물의 비율로 혼합하였다. 2 ㎕의 로딩 버퍼(loading buffer)를첨가하여 총 부피 20 ㎕를 2% 아가로우즈 젤에 로딩하였다. 본 발명자들은 당업자에게 잘 알려져 있는 방법에 따라 발현 수준을 보았다. 즉, 시료의 밴드는 15분 동안 이동 후 블랙 챔버에서 UV 하에서 본 다음 디지털 방식으로 사진을 찍었다. 젤 사진은 이미지 분석과 밴드 강도의 정량화(프랑스 포레틱스1D)로 분석하였다. 엘라스틴, LOX 및 LOXL 유전자의 발현 수준은 음성대조군(무처리)에서 얻은 것에 대한 변화율로 나타내었다.
결과 해석:
"젊은"세포와 "성숙"세포:
포피세포는 성인에서 관찰되는 것과 동일한 수준으로 엘라스틴을 코딩하는 mRNA의 함량을 발현하는 것으로 알려져 있으며, 그들은 LOX를 코딩하는 mRNA의 경우에서 뿐만 아니라 LOXL을 코딩하는 mRNA의 경우보다 훨씬 더 컸다. 따라서, 노화된 세포에서 LOXL와 마침내 LOX의 발현 감소를 역전시킬 수 있으며, 이런 측면에서 활성성분의 스크리닝이 실시된 것이다.
활성성분의 스크리닝:
각 테스트의 cDNA 함량은 액틴의 cDNA 함량과 음성대조군(활성물질이 없는)의 함량과 비교하였다. 예비 분석을 통해 각 테스트는 유의한 값인 약 1.3배의 엘라스틴 mRNA의 증가, 약 2배의 LOXL의 증가를 나타냈다. 900 개 이상의 활성 추출물을 시험하였고, 13개의 활성물질이 시험된 농도와 일정 조건 하에서 이들 기준에 부합하였다. 이들 활성물질들은 표 2에 나타내었다.
명칭 Eln/대조군 LOXL/대조군
LOX/대조군
딜 2.28 2.03
3.08
카란트 4.11 2
4.55
카다먼 2.08 2
5.57
검정무 2.88 2.13
2.92
루스쿠스 아쿨레아투스 1.58 2.4
2.53
계피 1.56 2.09
5.08
유산균 발효 2.37 2.04
9.69
감자 2.4 1.88
3.55
실크 단백질 2 3.05
3.25
귀리 2.37 2.04
9.69
아사 포에티다 검 1.35 2
3.19
에틸 헥사노에이트 1.5 2.33
3.09
메틸 부틸레이트 1.43 3.24
5.08
에틸 데카디에노에이트 2.04 2.32
3.64
식물 추출물은 100/0 내지 0/100의 물/(알콜, 글리콜 또는 폴리올) 혼합액(에탄올, 글리세롤, 부틸렌 글리콜 및 다른 글리콜, 자일리톨 등등)에서 2-5%에서 식물을 침액(soaking)하여 얻었다. 용해성 분획을 얻기 위해 상기에서 얻은 추출물을 여과하거나 증류한 다음 무균 방식으로 여과하였다. 시그마(미국 세인트루이스)에서 판매하는 화학물질을 이용하여 1%의 알콜 또는 글리콜에서 희석하거나 분산시켰다.
결론: 960개의 활성물질 은행에서 13개의 활성물질이 일정 조건 하에서 성숙기의 성인(이 경우 63세의 기증자)의 복부의 섬유아세포에서 LOXL, LOX 및 엘라스틴을 코딩하는 유전자의 mRNA의 합성 수준을 유의하게 활성화시킬 수 있었다.
실시예 11: 실시간 RT-PCR에 의한 화장료 또는 피부제약적 활성물질의 유효성 연구
정상(성인) 인간 피부의 섬유아세포에서 0.1 내지 5%(v/v)의 농도에서 스크리닝 일단계 후 선택된 활성물질을 시험하였다. 배양은 혈청을 첨가하지 않은 특정 배지(Fibroblast Basal Medium)를 포함한 24-웰 배양 플레이트에서 단일층으로 실시하였다. 세포를 40,000/cm2로 파종하였다. 세포를 24시간 동안 활성물질과 접촉시킨 후, 배지를 제거하고 세포는 인산염 완충액(pH7.4)으로 씻은 다음 -80℃에서 동결건조하여 보존하였다. 실험 말에, 엘라스틴, LOXL 및 액틴의 mRNA 함량은 mRNA 분석 기술 즉, 실시간 RT-PCR에 따라 평가하였다. 이를 위해, 이들 유전자의 특이 단편을 증폭할 수 있는 프라이머 쌍들은 상기 실시예 10에 기재하였다.
추출 즉, 96-웰에서 추출 키트를 이용하여 실리카겔 컬럼에서 추출한 후, 260 nm에서 96-웰 분광강도계에서 측정하였다. RNA는 5 ng/㎕로 희석하였다. RT-PCR 반응(Reverse Polymerase Transcription Chain Reactions)은 "Opticon" 시스템(MJ 리써치)을 이용하여 정량적인 실시간 RT-PCR을 실시하였다. 유리하게는, 웰에 도입된 반응 혼합물(50㎕)은 각 시료에 대해 다음과 같다:
- 5 ng/㎕ 농도의 RNA 10 ㎕
- 탐색을 위한 다양한 표지의 특이 프라이머
- 반응 혼합물(큐아젠- 25 ㎕ 2xQuantiTect SYBR Green RT-PCR master mix containing 5mM MgCl2+ 0.5 ㎕ QuantiTect RT mix), 신장 단계 동안 이중 가닥 DNA에 삽입하는 표지 SYBR Green I.
RT-PCR 조건은 다음과 같다:
역전사: 50℃에서 30분간, 그 후 95℃에서 15분.
PCR 반응: 94℃에서 15초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초 50 사이클.
증폭된 산물의 오염 및 순도 여부는 증폭된 PCR 산물의 융합 곡선을 이용하여 확인하였다. 이중 피크 또는 이상 융합 온도를 나타내는 산물들은 제거하였다.
분석 및 계산 방법:
증폭된 DNA에서 형광은 PCR 사이클 동안 계속적으로 평가되었다. 이 시스템은 PCR 사이클 수에 따라 형광 측정곡선을 얻을 수 있으므로 증폭된 DNA의 비교 함량을 평가할 수 있다.
세포군의 여부를 고려하기 위해, 모든 결과들은 하우스키핑 유전자로서 이용되고 있는 액틴 시그널과 비교하였다. 실험에 따라, C(T)(=Cycle Threshold)의 측정 임계값을 0.05∼0.01의 T로 고정한 후, 임의의 측정단위는 다음 식에 따라 각 유전자에 대해 계산하였다:
Sgene<<x>>=107×(1/2)C(T)gene<<x>>
C(T)gene<<x>>은 유전자 <<x>>의 사이클 임계값 0.01∼0.05에 도달하는데 필요한 사이클 수를 의미한다.
목적 유전자들의 수치를 비율 계산에 의한 액틴 시그널의 수치와 비교하였다:
R=Sgene<<x>>Sactin
처리 샘플과 무처리 샘플(즉, 여기서 x는 LOXL 유전자 또는 엘라스틴 유전자임)에서 이들 비율을 서로 비교하였다.
결과: 선별한 활성물질들 중에서, 그들 중 2개에 대한 실시예에서 얻은 결과를 표 3에 나타내었다.
명칭 LOXL/대조군 LOX/대조군
EI/대조군
0.01% 메틸 부틸레이트 0.89 1.04
0.92
0.1% 메틸 부틸레이트 1.56 1.76*
0.96
1% 메틸 부틸레이트 2.10* 2.17*
1.25
5% 메틸 부틸레이트 0.91 0.91
1.70*
0.01% 실크 단백질 1.18 0.96
1.00
0.1% 실크 단백질 1.46* 0.96
1.12
1% 실크 단백질 2.39* 1.16
1.24
5% 실크 단백질 2.05 1.37
1.37
* 통계적으로 유의한 결과 p<0.05(One Way Anova test)
결론: 선별된 활성물질들은 성인(이 경우 63세의 기증자)의 복부 섬유아세포에서 LOXL, LOX 및 엘라스틴을 코딩하는 유전자들의 mRNA의 합성 수준을 활성화시킬 수 있다.
실시예 1 내지 11에 있어서, 당업자는 기재된 조성물(제형)의 변형을 제조하기 위해 이들 실시예로부터 적절한 방법을 알 수 있을 것이다.
실시예 12: 수중유형(oil in water) 유화제 타입의 화장료 또는 약제학적 제형에 있어서 본 발명 산물의 이용
제형 12a:
A 물 총 100
부틸렌 글리콜 2
글리세롤 3
소듐 디하이드록시세틸 2
포스페이트,
이소프로필 하이드록시세틸 에테르
B 글리콜 스테아레이트 SE 14
트리이소노나오인(triisononaoin) 5
옥틸 코코에이트 6
C 부틸렌 글리콜, 2
메틸파라벤,
에틸파라벤, 프로필파라벤
pH를 5.5로 조정함.
D 본 발명 산물 0.01∼10%
제형 12b:
A 물 총 100
부틸렌 글리콜 2
글리세롤 3
폴리아크릴아마이드, 이소파라핀, 2.8
로레스-7(Laureth-7)
B 부틸렌 글리콜, 2
메틸파라벤,
에틸파라벤, 프로필파라벤;
페녹시에탄올, 2
메틸파라벤,
프로필파라벤, 부틸파라벤,
에틸파라벤
부틸렌 글리콜 0.5
D 본 발명 산물 0.01∼10%
제형 12c:
A 카보머 0.50
프로필렌 글리콜 3
글리세롤 5
물 총 100
B 옥틸 코코에이트 5
비사볼롤 0.30
디메티콘 0.30
C 소듐 하이드록사이드 1.60
D 페녹시에탄올, 0.50
메틸파라벤,
프로필파라벤, 부틸파라벤,
에틸파라벤
E 퍼퓸(perfume) 0.30
F 본 발명 산물 0.01∼10%
실시예 13: 유중수형(water in oil) 타입 제형에서 본 발명 산물의 이용
A PEG30- 3
디폴리하이드록시스테아레이트
카프릭 트리글리세라이드 3
세테아릴 옥타노에이트 4
디부틸 아디페이트 3
포도씨 오일 1.5
조조바 오일 1.5
페녹시에탄올, 0.5
메틸파라벤,
프로필파라벤, 부틸파라벤,
에틸파라벤
B 글리세롤 3
부틸렌 글리콜 3
마그네슘 설페이트 0.5
EDTA 0.05
물 총 100
C 클로로메티콘 1
디메티콘 1
D 퍼퓸 0.3
E 본 발명 산물 0.01∼10%
실시예 14: 샴푸 또는 샤워젤 타입 제형에서 본 발명 산물의 이용
A 잔탄검 0.8
물 총 100
B 부틸렌 글리콜, 0.5
메틸파라벤,
에틸파라벤, 프로필파라벤
페녹시에탄올, 0.5
메틸파라벤,
프로필파라벤, 부틸파라벤,
에틸파라벤
C 시트르산 0.8
D 소듐 로레스 설페이트 40.0
E 본 발명 산물 0.01∼10%
실시예 15: 립스틱 및 다른 무수품 타입 제형에서 본 발명 산물의 이용
A 미네랄 왁스 17.0
이소스테아릴 이소스테아레이트 31.5
프로필렌 글리콜 디펠라고네이트 2.6
프로필렌 글리콜 이소스테아레이트 1.7
PEG 8 비즈왁스(Beeswax) 3.0
경화 팜핵유 3.4
글리세라이드,
경화 팜 글리세라이드
라놀린 오일 3.4
참기름 1.7
세틸 락테이트 1.7
미네랄 오일, 라놀린 알콜 3.0
B 피마자유 총 100
티타늄 디옥사이드 3.9
CI 15850:1 0.616
CI 45410:1 0.256
CI 19140:1 0.048
CI 77491 2.048
C 본 발명 산물 0.01∼5%
실시예 16: 수용성 젤(아이라이너, 슬리머 등) 제형에서 본 발명 산물의 이용
A 물 총 100
카보머 0.5
부틸렌 글리콜 15
페녹시에탄올, 메틸파라벤, 0.5
프로필파라벤, 부틸파라벤,
에틸파라벤
B 본 발명 산물 0.01∼10%
실시예 17: LOXL을 포함하는 약제학적 제형의 제조
제형 17a: 정제 제조
A 부형제 g/정제
락토오즈 0.359
슈크로우즈 0.240
B LOXL*추출물 0.001∼0.1
*: LOXL 추출물은 실시예 2에 기재된 추출방법에 따라 얻은 후 건조 단계를 거침.
제형 17b: 연고 제조
A 부형제
저 밀도의 폴리에틸렌 5.5
액상 파라핀 총 100
B LOXL*추출물 0.001∼0.1
*: LOXL 추출물은 실시예 2에 기재된 추출방법에 따라 얻은 후 건조 단계를 거침.
제형 17c: 주사 제형 제조
A 부형제
식염 등장액 5 mL
B LOXL*추출액 0.001∼0.1g
*: LOXL 추출물은 실시예 2에 기재된 추출방법에 따라 얻은 후 건조 단계를 거침.
실시예 18: 본 발명 물질을 포함하는 제조물의 화장료 적합성 평가
토끼에서 시각적 평가 및 흰쥐에서 단일 구강 투여에 따른 이상 독성 여부 연구 및 기니아 피그에서 감작성 연구를 통해 0.5% 잔탄검에서 10% 농도의 실시예 10 및 11에 따라 얻은 화합물의 독성 테스트를 실시하였다.
토끼에서 피부의 일차 자극 평가:
상기에서 기재된 제조물을 <<피부에 대한 급성 자극/부식 효과>> 연구와 관련하여 OECD에서 추천한 방법에 따라 토끼 세마리의 피부에 0.5 mL의 투여량을 희석없이 투여하였다.
1982년 2월 21일 프랑스공화국의 관보(JORF)에 공개된 1982년 2월 1일자 판결문에 따른 기준에 따라 산물들을 분류하였다.
이들 테스트 결과, 실시예 11에 따라 얻은 화합물을 포함하는 제조물은 피부에 "무자극성"으로써 분류할 수 있었다.
토끼에서 눈 자극 평가:
상기에 기재된 제조물들은 "눈에 대한 급성 자극/부식 효과" 연구와 관련하여, OECD NO. 405(1987. 2. 24)의 지시에 따른 방법에 따라 토끼 세마리의 눈에 일회에 0.1 mL이 스며들게 처리하였다.
테스트 결과, EEC 91/326 지시에 따르면, 제조물들은 눈에 대해 "무자극성"인 것으로 고려될 수 있고 순수하게 또는 희석없이 이용될 수 있다.
흰쥐에서 단일 구강 투여에 의한 이상 독성여부 테스트:
상기에 기재된 제조물들은 OECD NO.401(1987.2.24)의 지시에 따른 프로토콜에 따라 5마리의 수컷 흰쥐와 5마리의 암컷 흰쥐에 5g/체중 Kg의 투여량으로 일회 구강 투여하고 화장료로 제조하였다.
LD0 및 LD50은 5000 mg/Kg 보다 더 큰 것으로 나타났다. 따라서, 테스트된 제조물들은 섭취 시 위험한 제조물로 분류되지 않는다.
기니아 피그에서 피부 감작성 평가:
상기에서 기재된 제조물들에 대해 OECD NO.406 지시에 따른 프로토콜인 Magnusson and Kligmann의 최대화 테스트를 실시하였다.
제조물들은 피부에 접촉 시 "민감성이 없음"으로 분류되었다.
염기서열에 대한 설명은 다음과 같다:
서열목록 서열 1: 인간 단백질 LOXL의 펩티드 염기서열.
서열목록 서열 2: 서열목록 서열 1에 기재된 인간 단백질 LOXL을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 염기서열.
서열목록 서열 3: 서열목록 서열 1에 기재된 단백질 LOXL을 코딩하는 인간 유전자의 프로모터를 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 염기서열.
서열목록 서열 4: 인간 단백질 트로포엘라스틴의 펩티드 염기서열.
서열목록 서열 5: 서열목록 서열 4에 기재된 인간 단백질 트로포엘라스틴을 코딩하는 cDNA 뉴클레오티드 염기서열.
서열목록 서열 6: 인간 단백질 LOX의 펩티드 염기서열.
서열목록 서열 7: 서열목록 서열 6에 기재된 인간 단백질 LOX를 코딩하는 cDNA 뉴클레오티드의 염기서열.
이중 가닥 DNA 프로브용 프라이머:
서열목록 서열 8: 서열목록 서열 1에 기재된 인간 단백질 LOXL을 코딩하는 DNA의 센스 프라이머.
서열목록 서열 9: 서열목록 서열 1에 기재된 인간 단백질 LOXL을 코딩하는 DNA의 안티센스 프라이머.
서열목록 서열 10: 서열목록 서열 4에 기재된 인간 단백질 트로포엘라스틴을 코딩하는 DNA의 센스 프라이머.
서열목록 서열 11: 서열목록 서열 4에 기재된 인간 단백질 트로포엘라스틴을코딩하는 DNA의 안티센스 프라이머.
서열목록 서열 12: 서열목록 서열 6에 기재된 인간 단백질 LOX를 코딩하는 DNA의 센스 프라이머.
서열목록 서열 13: 서열목록 서열 6에 기재된 인간 단백질 LOX를 코딩하는 DNA의 안티센스 프라이머.
서열목록 서열 14: 인간 단백질 콜라겐 Iα1L을 코딩하는 DNA의 센스 프라이머.
서열목록 서열 15: 인간 단백질 콜라겐 Iα1L을 코딩하는 DNA의 안티센스 프라이머.
융합 유전자 GST를 위한 프라이머:
서열목록 서열 16: 융합 유전자 GST S355-D415의 DNA의 센스 프라이머.
서열목록 서열 17: 융합 유전자 GST S355-D415의 DNA의 안티센스 프라이머.
서열목록 서열 18: 융합 유전자 GST G128-L212의 DNA의 센스 프라이머.
서열목록 서열 19: 융합 유전자 GST G128-L212의 DNA의 안티센스 프라이머.
서열목록 서열 20: 융합 유전자 GST V228-S279의 DNA의 센스 프라이머.
서열목록 서열 21: 융합 유전자 GST V228-S279의 DNA의 안티센스 프라이머.
서열목록 서열 22: 융합 유전자 GST D306-N373의 DNA의 센스 프라이머.
서열목록 서열 23: 융합 유전자 GST D306-N373의 DNA의 안티센스 프라이머.
PCR 프라이머:
서열목록 서열 24: 서열목록 서열 4에 기재된 인간 단백질 트로포엘라스틴을 코딩하는 mRNA의 RT-PCR을 위한 센스 프라이머.
서열목록 서열 25: 서열목록 서열 4에 기재된 인간 단백질 트로포엘라스틴을 코딩하는 mRNA의 RT-PCR을 위한 안티센스 프라이머.
서열목록 서열 26: 서열목록 서열 1에 기재된 인간 단백질 LOXL을 코딩하는 mRNA의 RT-PCR을 위한 센스 프라이머.
서열목록 서열 27: 서열목록 서열 1에 기재된 인간 단백질 LOXL을 코딩하는 mRNA의 RT-PCR을 위한 안티센스 프라이머.
서열목록 서열 28: 서열목록 서열 6에 기재된 인간 단백질 LOX를 코딩하는 mRNA의 RT-PCR을 위한 센스 프라이머.
서열목록 서열 29: 서열목록 서열 6에 기재된 인간 단백질 LOX를 코딩하는 mRNA의 RT-PCR을 위한 안티센스 프라이머.
서열목록 서열 30: 인간 단백질 액틴을 코딩하는 mRNA의 RT-PCR을 위한 센스 프라이머.
서열목록 서열 31: 인간 단백질 액틴을 코딩하는 mRNA의 RT-PCR을 위한 안티센스 프라이머.
상기 실시예를 통해 살펴본 바와 같이, 본 발명은 라이실 옥시다제의 동종효소, 보다 상세하게는 LOXL(lysyl oxidase-like) 동종효소의 합성과 활성을 촉진하는 것에 관한 것으로, 특히 탄력섬유의 형성을 촉진하는 활성성분의 동정방법을 제공하는 효과가 있다. 또한, 본 발명은 특히 탄력섬유의 형성을 촉진할 수 있는 조성물을 제공하기 위한 스크리닝방법을 제공하는 효과가 있다. 따라서, 본 발명은 화장품, 제약 및 의약산업상 유용한 발명인 것이다.
<110> COLETICA Centre National de la Recherche Scientifique <120> Stimulation of the synthesis and of the activity of an isoform of lysyl oxidase-like LOXL for stimulating the formation of elastic fibers. <150> FR03 07177 <151> 2003-06-13 <160> 31 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 574 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Leu Ala Arg Gly Ser Arg Gln Leu Gly Ala Leu Val Trp Gly 1 5 10 15 Ala Cys Leu Cys Val Leu Val His Gly Gln Gln Ala Gln Pro Gln Gln 20 25 30 Gly Ser Asp Pro Ala Arg Trp Arg Gln Leu Ile Gln Trp Glu Asn Asn 35 40 45 Gly Gln Val Tyr Ser Leu Leu Asn Ser Gly Ser Glu Tyr Val Pro Ala 50 55 60 Gly Pro Gln Arg Ser Glu Ser Ser Ser Arg Val Leu Leu Ala Gly Ala 65 70 75 80 Pro Gln Ala Gln Gln Arg Arg Ser His Gly Ser Pro Arg Arg Arg Gln 85 90 95 Ala Pro Ser Leu Pro Leu Pro Gly Arg Val Gly Ser Asp Thr Val Arg 100 105 110 Gly Gln Ala Arg His Pro Phe Gly Phe Gly Gln Val Pro Asp Asn Trp 115 120 125 Arg Glu Val Ala Val Gly Asp Ser Thr Gly Met Ala Leu Ala Arg Thr 130 135 140 Ser Val Ser Gln Gln Arg His Gly Gly Ser Ala Ser Ser Val Ser Ala 145 150 155 160 Ser Ala Phe Ala Ser Thr Tyr Arg Gln Gln Pro Ser Tyr Pro Gln Gln 165 170 175 Phe Pro Tyr Pro Gln Ala Pro Phe Val Ser Gln Tyr Glu Asn Tyr Asp 180 185 190 Pro Ala Ser Arg Thr Tyr Asp Gln Gly Phe Val Tyr Tyr Arg Pro Ala 195 200 205 Gly Gly Gly Val Gly Ala Gly Ala Ala Ala Val Ala Ser Ala Gly Val 210 215 220 Ile Tyr Pro Tyr Gln Pro Arg Ala Arg Tyr Glu Glu Tyr Gly Gly Gly 225 230 235 240 Glu Glu Leu Pro Glu Tyr Pro Pro Gln Gly Phe Tyr Pro Ala Pro Glu 245 250 255 Arg Pro Tyr Val Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp Gly Leu Asp Arg 260 265 270 Arg Tyr Ser His Ser Leu Tyr Ser Glu Gly Thr Pro Gly Phe Glu Gln 275 280 285 Ala Tyr Pro Asp Pro Gly Pro Glu Ala Ala Gln Ala His Gly Gly Asp 290 295 300 Pro Arg Leu Gly Trp Tyr Pro Pro Tyr Ala Asn Pro Pro Pro Glu Ala 305 310 315 320 Tyr Gly Pro Pro Arg Ala Leu Glu Pro Pro Tyr Leu Pro Val Arg Ser 325 330 335 Ser Asp Thr Pro Pro Pro Gly Gly Glu Arg Asn Gly Ala Gln Gln Gly 340 345 350 Arg Leu Ser Val Gly Ser Val Tyr Arg Pro Asn Gln Asn Gly Arg Gly 355 360 365 Leu Pro Asp Leu Val Pro Asp Pro Asn Tyr Val Gln Ala Ser Thr Tyr 370 375 380 Val Gln Arg Ala His Leu Tyr Ser Leu Arg Cys Ala Ala Glu Glu Lys 385 390 395 400 Cys Leu Ala Ser Thr Ala Tyr Ala Pro Glu Ala Thr Asp Tyr Asp Val 405 410 415 Arg Val Leu Leu Arg Phe Pro Gln Arg Val Lys Asn Gln Gly Thr Ala 420 425 430 Asp Phe Leu Pro Asn Arg Pro Arg His Thr Trp Glu Trp His Ser Cys 435 440 445 His Gln His Tyr His Ser Met Asp Glu Phe Ser His Tyr Asp Leu Leu 450 455 460 Asp Ala Ala Thr Gly Lys Lys Val Ala Glu Gly His Lys Ala Ser Phe 465 470 475 480 Cys Leu Glu Asp Ser Thr Cys Asp Phe Gly Asn Leu Lys Arg Tyr Ala 485 490 495 Cys Thr Ser His Thr Gln Gly Leu Ser Pro Gly Cys Tyr Asp Thr Tyr 500 505 510 Asn Ala Asp Ile Asp Cys Gln Trp Ile Asp Ile Thr Asp Val Gln Pro 515 520 525 Gly Asn Tyr Ile Leu Lys Val His Val Asn Pro Lys Tyr Ile Val Leu 530 535 540 Glu Ser Asp Phe Thr Asn Asn Val Val Arg Cys Asn Ile His Tyr Thr 545 550 555 560 Gly Arg Tyr Val Ser Ala Thr Asn Cys Lys Ile Val Gln Ser 565 570 <210> 2 <211> 1725 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atggctctgg cccgaggcag ccggcagctg ggggccctgg tgtggggcgc ctgcctgtgc 60 gtgctggtgc acgggcagca ggcgcagccc gggcagggct cggaccccgc ccgctggcgg 120 cagctgatcc agtgggagaa caacgggcag gtgtacagct tgctcaactc gggctcagag 180 tacgtgccgg ccggacctca gcgctccgag agtagctccc gggtgctgct ggccggcgcg 240 ccccaggccc agcagcggcg cagccacggg agcccccggc gtcggcaggc gccgtccctg 300 cccctgccgg ggcgcgtggg ctcggacacc gtgcgcggcc aggcgcggca cccattcggc 360 tttggccagg tgcccgacaa ctggcgcgag gtggccgtcg gggacagcac gggcatggcc 420 ctggcccgca cctccgtctc ccagcaacgg cacgggggct ccgcctcctc ggtctcggct 480 tcggccttcg ccagcaccta ccgccagcag ccctcctacc cgcagcagtt cccctacccg 540 caggcgccct tcgtcagcca gtacgagaac tacgaccccg cgtcgcggac ctacgaccag 600 ggtttcgtgt actaccggcc cgcgggcggc ggcgtgggcg cgggggcggc ggccgtggcc 660 tcggcggggg tcatctaccc ctaccagccc cgggcgcgct acgaggagta cggcggcggc 720 gaagagctgc ccgagtaccc gcctcagggc ttctacccgg 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gaacccaaag 1620 tatattgttt tggagtctga cttcaccaac aacgtggtga gatgcaacat tcactacaca 1680 ggtcgctacg tttctgcaac aaactgcaaa attgtccaat cctga 1725 <210> 3 <211> 2731 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gtggaagtgg gggccacccc caagagataa ccccctcctt tctctcacaa gtcaagagaa 60 agaagaaaat agtggccaca tgtctggctc tgtgctgggg acttttcata atcctctcat 120 tccatcctct caaatatgcc acaagaaagg tatgattacc cccaggtcac agacgggact 180 ctgaagctct gagagcttaa aaagcttccc cggggagtgg ctgggccagg ccaggtccct 240 agctcaagtc atggtgtgga cccccaggtc tccatctcag cagggatggc tggcaggagc 300 gcagtcctgg ccaggggagt ctgtgcagag gcccaggcta tgttcagagc agagtttatt 360 caaatagagc ctaacaggaa acttggctcc tctgactcac tctgattcga ccttattaag 420 aaaaaaagag agaggagcag gagccagcat cgggtaaggt ttcacgccaa gagctggctc 480 tgaggcccgc tgagtggaat ggcatgtgcc ctgatccccc cacatccaaa gccttgaggc 540 agcccctgcc ctgctgtccg agtcaaggcg aggggtcctg ccttcacgtt agggcaactg 600 agttcccttc ctcacagcca tcctctgtcc tccctccact cctcttccct tccctccctg 660 cctaggggta ccctgaggcc tgtttccatt 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Claims (30)

  1. 탄력섬유의 형성을 촉진하는 조성물을 제조하기 위한 서열목록 서열 1에 기재된 라이실 옥시다제의 유사 동종효소(LOXL로 명명) 또는 그것의 유도체 또는 LOXL 활성 및/또는 발현을 촉진하는 물질의 용도.
  2. 제1항에 있어서, LOXL의 발현은 LOXL을 코딩하는 뉴클레오티드 염기서열의 발현 또는 LOXL 단백질의 분획을 구성하는 펩티드의 염기서열 중 어느 하나이고, 바람직하게는, 상기 펩티드의 염기서열은 서열목록 서열 1로부터 선택됨을 특징으로 하는 용도.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 화장료, 식약(neutraceutical), 의약 또는 제약용 조성물임을 특징으로 하는 용도.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 엘라스틴의 발현, 특히 탄력섬유의 형성을 촉진하는 2차 물질을 추가로 포함하고, 바람직하게는, 상기 2차 물질은 LOXL의 활성 및/또는 발현을 촉진하는 물질임을 특징으로 하는 용도.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성물질은 서열목록 서열3에 기재된 인간의 LOXL 유전자(Pr)의 프로모터의 뉴클레오티드 염기서열의 적어도 한부분에 연결된 부분을 포함하거나 또는 서열목록 서열 3에 기재된 인간의 LOXL 유전자(Pr)의 프로모터의 뉴클레오티드 염기서열의 적어도 한부분에 연결된 단백질의 발현을 조절함을 특징으로 하는 용도.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성물질은 딜(dill), 카란트(currant), 카다먼(cardamon), 검정무(black radish), 루스쿠스 아쿨레아투스(box holly), 계피(cinnamon), 유산균에 의한 발효, 귀리, 감자, 실크, 아사 포에티다 검(Asa foetida gum), 에틸 헥세노에이트(ethyl hexenoate) 및 그것의 유도체, 메틸 부틸레이트(methyl butyrate) 및 그것의 유도체, 및 에틸 데카디에노에이트(ethyl decadienoate) 및 그것의 유도체로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 용도.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 조직의 신-탄력섬유형성과정(neoelastogenesis)을 유도하고, 특히 그로부터 얻은 조직의 탄력성을 촉진하여 피부 주름을 감소시킴을 특징으로 하는 용도.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 특히 노화 또는 햇빛 노출에 따른 조직의 늘어짐 제어, 세포외 기질의 치밀, 피하조직의 고정, 피부 주름 감소, 주름개선효과, 흉터조직의 질 및 흉터의 외형, 특히 빈영양형(dystrophic) 및 켈로이드성(keloid) 흉터의 개선, 또는 임신선 제어용임을 특징으로 하는 용도.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 활성물질을 포함하고, 선택적으로 화장료에 적합한 부형제와의 혼합물로 포함함을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 활성물질을 포함하고, 선택적으로 식품용 부형제와의 혼합물로 포함함을 특징으로 하는 식약용 조성물.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 활성물질을 포함하고, 선택적으로 약제학적으로 적합한 부형제와의 혼합물로 포함함을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  12. 제9항 또는 제10항의 조성물의 용도를 포함함을 특징으로 하는 코스메틱 케어방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 코스메틱 케어는 특히 노화 또는 햇빛 노출에 따른 조직의 늘어짐 제어, 세포외 기질의 치밀, 피하조직의 고정, 피부 주름 감소, 주름개선효과, 흉터 조직의 질 및 흉터자국의 개선, 특히 빈영양형(dystrophic) 및 켈로이드성(keloid) 흉터의 개선, 또는 임신선 제어로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 코스메틱 케어방법.
  14. 다음을 포함함을 특징으로 하는 탄력섬유의 형성을 촉진하기 위한 LOXL의 활성을 촉진하는 물질의 스크리닝방법:
    a) 활성가능물질이 LOXL과 접촉하도록 하고,
    b) 특히 상기 활성가능물질이 LOXL의 활성을 촉진하는 지를 확인할 목적으로 LOXL의 활성을 분석함.
  15. 다음을 포함함을 특징으로 하는 탄력섬유의 형성을 촉진하기 위한 LOXL의 형성을 촉진하는 물질의 스크리닝방법:
    a) 활성가능물질이 적어도 한가지 타입의 세포, 바람직하게는 살아있는 세포와 접촉하게 하여 라이실 옥시다제의 동종효소 L(LOXL)을 발현할 수 있도록 하고,
    b) 특히 상기 활성가능물질이 LOXL의 발현을 촉진하는 지를 확인할 목적으로 LOXL의 발현을 분석함.
  16. 제15항에 있어서, 상기 활성가능물질이 다음을 촉진하는 지를 조사함을 특징으로 하는 스크리닝방법:
    a) 단백질 LOXL을 코딩하는 뉴클레오티드 염기서열의 적어도 하나의 발현, 및/또는
    b) 단백질 LOXL의 펩티드 분획을 구성하는 필수 펩티드의 염기서열의 발현.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, LOXL 발현 분석은 LOXL을 코딩하는 뉴클레오티드 염기서열의 적어도 일부분의 발현의 질적 및/또는 양적 분석에 따라 실시됨을 특징으로 하는 스크리닝방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드의 염기서열은 cDNA이고, LOXL 코딩 mRNA에 상보적이며, 서열목록 서열 2에 기재된 LOXL의 cDNA임을 특징으로 하는 스크리닝방법.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, LOXL의 발현 분석은 LOXL 코딩 뉴클레오티드의 염기서열의 적어도 일부분을 증폭하기 위해, 서열목록 서열 2에 기재된 LOXL을 코딩하는 상보적 DNA의 뉴클레오티드의 염기서열의 적어도 일부분과 혼성화되는 프라이머의 사용을 포함하는 역전사중합연쇄반응(RT-PCR)을 사용함을 특징으로 하는 스크리닝방법.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 재건피부모델(reconstructed skin model) 또는 다음의 생체검사용 모델에서 LOXL의 발현을 실시하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 스크리닝방법:
    a) 예를 들어 서열목록 서열 2에 기재된 LOXL을 코딩하는 상보적 DNA의 뉴클레오티드의 염기서열의 적어도 일부분과 혼성화하는 적어도 하나의 DNA 프로브를 이용한 특히 LOXL을 코딩하는 뉴클레오티드의 염기서열의 적어도 일부분의in situ하이브리디제이션, 또는
    b) 특히 적어도 하나의 LOXL 특이 항체를 이용한 면역적 탐지.
  21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스크리닝방법은 상기 활성가능물질을 포함하지 않는 대조군에서 발현되는 LOXL의 발현과 LOXL의 발현을 비교하는 것을 포함함을 특징으로 하는 스크리닝방법.
  22. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 살아있는 세포는 특히 정상인간의 피부, 예를 들어 포피 또는 성인의 피부에서 유래하는 섬유아세포를 포함함을 특징으로 하는 스크리닝방법.
  23. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 살아있는 세포는 상피세포, 예를 들어, 특히 정상인간의 피부 예를 들어 포피 또는 성인의 피부에서 유래하는 각질형성세포를 포함함을 특징으로 하는 스크리닝방법.
  24. 제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 살아있는 세포는 특정위치에 있는 적어도 하나의 피부, 예를 들어, 노화되거나 또는 태양광선에 노출되거나 혹은 노출되지 않는 얼굴, 복부 또는 유방에서 유래하는 피부, 또는 흉터 또는 임신선이 있는 부위에서 유래한 피부에서 유래함을 특징으로 하는 스크리닝방법.
  25. 제15항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스크리닝방법은 재건피부모델, 바람직하게는 섬유아세포를 포함하는 적어도 하나의 피부모델을 사용하거나 또는 생체검사용 모델을 사용함을 특징으로 하는 스크리닝방법.
  26. 제15항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스크리닝방법은 재건피부모델, 바람직하게는 각질형성세포를 포함하는 적어도 하나의 표피모델을 사용함을 특징으로 하는 스크리닝방법.
  27. 제15항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 엘라스틴의 염기서열 또는 엘라스틴을 코딩하는 뉴클레오티드의 염기서열의 발현을 분석하는 단계, 특히 상기 활성물질이 상기 살아있는 세포와 접촉할 때 예상되는 엘라스틴의 발현 촉진을 탐지하기 위한 단계를 포함함을 특징으로 하는 스크리닝방법.
  28. 제15항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스크리닝방법은 특히 상피조직 및/또는 결합조직에서 특히 신-탄력섬유형성과정을 추적하기 위해 LOXL의 발현을 면역적으로 탐지하는 단계를 포함하고, 상기 조직은 적어도 하나의 재건피부모델 또는 생체검사용 모델에서 유래함을 특징으로 하는 스크리닝방법.
  29. 제15항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성물질은 딜, 카란트, 카다먼, 검정무, 루스쿠스 아쿨레아투스, 계피, 유산균에 의한 발효, 귀리, 감자,실크, 아세아 포에티다 검, 에틸 헥세노에이트 및 그것의 유도체, 메틸 부틸레이트 및 그것의 유도체, 및 에틸 데카디에노에이트 및 그것의 유도체로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 스크리닝방법.
  30. LOXL을 면역적으로 탐지하는 단계 또는 LOXL 코딩 뉴클레오티드의 염기서열의 적어도 일부분과의in situ하이브리디제이션 단계를 포함함을 특징으로 하는 적어도 하나의 재건피부모델 또는 생체검사용 모델에서 유래한 결합조직에서 신-탄력섬유형성과정을 추적하기 위한 조직에서 LOXL의 발현 조사방법.
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