FR2855969A1

FR2855969A1 - Stimulation de l'activite d'une isoforme de lysyl oxydase pour lutter contre certaines pathologies dues a une elastogenese incomplete, absente ou desorganisee

Info

Publication number: FR2855969A1
Application number: FR0307178A
Authority: FR
Inventors: Charbel Bouez; Valerie Cenizo; Pascal Sommer; Odile Baudoux Damour; Claudine Gleyzal; Valerie Andre; Corinne Reymermier; Isabelle Orly; Eric Perrier
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Coletica SA
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; BASF Beauty Care Solutions France SAS
Priority date: 2003-06-13
Filing date: 2003-06-13
Publication date: 2004-12-17
Anticipated expiration: 2023-06-13
Also published as: DE102004028300B4; DE102004028300A1; KR100787553B1; FR2855969B1; KR20070077515A; KR100844914B1; KR20040107419A; US20040258676A1

Abstract

L'invention concerne la stimulation de l'activité d'une isoforme de la lysyl oxydase, et plus particulièrement de l'isoforme LOX (lysyl oxidase).L'invention concerne notamment une méthode d'identification d'un principe actif régulant l'élastogenèse dans les cas d'élastogenèse pathologique, désorganisée et/ou non fonctionnelle, telle que dans les cas de fibrose, d'élastose solaire, de vergetures, et/ou de cicatrices dystrophiques ; et/ou dans les cas de certaines pathologies eczémateuses.L'invention a principalement pour but de fournir une telle méthode d'identification afin de réaliser des compositions permettant de réguler l'élastogenèse dans les cas cités.

Description

L'invention concerne la stimulation de l'activité d'une isoforme de la lysyl oxydase, et plus particulièrement de l'isoforme LOX (lysyl oxydase).

Etat de la technique :
Les propriétés de résistance et d'élasticité de la peau et des muqueuses sont définies essentiellement par les fibres de collagène et d'élastine du derme. L'élastine est une protéine composant les fibres élastiques qui sont également constituées d'autres molécules comme les fibrillines et les MAGP (Microfibrillar Associated Glycoproteins).

Les fibres élastiques sont formées de l'élastine déposée sur des microfibrilles.

L'élastine est synthétisée sous la forme de tropoélastine soluble qui acquiert ses propriétés physico-chimiques (insolubilité, élasticité) après sa réticulation intra- et intermoléculaire par une lysyl oxydase, puis son dépôt sur les microfibrilles. Les fibres élastiques sont responsables de la propriété élastique des organes qui les contiennent (vaisseaux, parenchyme pulmonaire, cartilages élastiques, peau...).

Les fibres élastiques sont constituées majoritairement d'élastine déposée sur les microfibrilles. Le nom élastine fut réservé à la protéine formant la portion amorphe des fibres élastiques et leur conférant leur élasticité.

Récemment, des composants de ces fibres élastiques ont été mis en évidence dans l'épiderme.

Les fibrilles de collagène sont formées par l'assemblage trimérique de chaînes de collagène. Ces fibres de collagène sont aussi réticulées par la lysyl oxydase LOX.

Les fibres de collagène sont synthétisées dans les tissus conjonctifs tout au long de la vie. Il existe 5 isoformes connues de la famille des lysyl oxydases (LO) : LOX, LOXL, LOXL2, LOXL3, LOXL4 (Csiszar, Lysyl oxidases : A novel multifunctional amine oxidase family, Nucleic Acid Research and Molecular Biology, 2001, vol 70, p2-28). LOX est impliquée dans la réticulation des fibres de collagène (Sève et al, Expression analysis of recombinant lysyl oxidase (LOX) in myofibroblast-like cells, Connective Tissue Research, 2002,43 : 613-619). LOX est aussi associée au

maintien de l'homéostasie cellulaire et peut être considérée comme un régulateur nécessaire au maintien de l'homéostasie cellulaire par le biais de la régulation de NFkB (Jeay S, Pianetti S, Kagan HM, Sonenshein GE. Lysyl oxidase inhibits rasmediated transformation by preventing activation of NF-kappaB. Mol Ce!! Biol 23 :2251-63, 2003).

La synthèse de collagène est concomitamment dérégulée dans les cas d'élastogenèse pathologique, désorganisée et/ou non fonctionnelle, telle que la fibrose ou l'élastose solaire, et dans les cas de certaines pathologies cancéreuses. La synthèse de collagène sans expression de LOX est associée à des modifications pathologiques de la matrice extracellulaire comme dans le cas des cancers. A l'inverse, la synthèse de collagène et de LOX est associée à une densification de la matrice en tant que mécanisme de défense contre l'invasion cellulaire (Decitre et al, Lab. Invest., 78,143- 151, 1998).

La synthèse d'élastine est dérégulée dans les cas d'élastogenèse pathologique, désorganisée et/ou non fonctionnelle, telle que la fibrose ou l'élastose solaire, et dans les cas de certaines pathologies cancéreuses. Cette synthèse anarchique d'élastine entraîne la formation de peptides dérivés qui sont généralement considérés comme favorables au potentiel tumoral des cellules (Brassart B, Fuchs P, Huet E, Alix AJ, Wallach J, Tamburro AM, Delacoux F, Haye B, Emonard H, Hornebeck W, Debelle L. Conformational dependence of collagenase (matrix metalloproteinase-1) up-regulation by elastin peptides in cultured fibroblasts. J. Biol. Chem. 276 (7) : 2001).

L'art antérieur ne permet pas de fournir de critères permettant d'évaluer l'impact de principes actifs en dermato-cosmétologie permettant la régulation de l'élastogenèse. Dans ce cadre, il est également très difficile d'obtenir des critères objectifs permettant de juger de l'impact de ces actifs. Les méthodes d'identification de principes actifs actuels portent sur l'évaluation de l'expression

des gènes impliqués dans la formation des fibres élastiques, comme l'élastine ou les fibrillines.

D'autre part, à ce jour l'expérimentation animale est interdite en cosmétique en Europe et l'expérimentation humaine est éthiquement discutée. Il n'est donc pas acceptable pour les inventeurs d'effectuer une méthode de criblage, pour des applications cosmétiques, mettant en #uvre des animaux ou des êtres humains.

Dans les modèles cellulaires tridimensionnels, tels que Mimeskin (Coletica, France), les kératinocytes induisent la synthèse de tropoélastine et le dépôt de tropoélastine sur les microfibrilles (Duplan-Perrat et al, Keratinocytes influence the maturation and organization of the elastin network in a skin équivalent. J. Invest. Dermatol. 114 : 365-70,1999). Dans le modèle Mimeskin, la matrice extracellulaire a montré une organisation ultrastructurale voisine de celle de la peau, avec le collagène organisé en faisceaux et des fibres élastiques constituées d'élastine déposée sur les microfibrilles. Ce modèle a aussi été utilisé pour tester l'efficacité de certaines molécules, comme les inhibiteurs des lysyl oxydases. Cela a permis de montrer que l'inhibition des lysyl oxydases induisait une désorganisation des fibres de collagène et d'élastine, mais aussi une déviation du programme de différenciation des kératinocytes, avec une réduction du niveau d'expression des marqueurs de différenciation terminale comme la filaggrine (brevet français 01. 10443, CNRS, Utilisation d'inhibiteurs des lysyl oxydases pour la culture cellulaire et le génie tissulaire). Dans ce brevet, il n'est pas fait de distinction entre les différentes isoformes de LO.

Ces études n'ont pas permis de mettre au point une méthode d'identification de principes actifs stimulant l'expression de LOX et régulant négativement l'élastogenèse dans les cas d'élastogenèse pathologique, désorganisée et/ou non fonctionnelle, telle que dans les cas de fibrose, d'élastose solaire, de vergetures, et/ou de cicatrices dystrophiques et des pathologies cancéreuses.

L'art antérieur ne permet donc pas la fourniture de principes actifs stimulant l'expression de LOX et régulant négativement l'élastogenèse dans les cas d'élastogenèse pathologique, désorganisée et/ou non fonctionnelle, telle que dans les cas de fibrose, d'élastose solaire, de vergetures, et/ou de cicatrices dystrophiques.

D'autre part, l'art antérieur ne permet pas de localiser avec précision la zone d'expression de l'isoforme de la lysyl oxydase LOX, notamment par le fait que les méthodes fournies par l'art antérieur sont imprécises et ne sont pas suffisamment spécifiques des différentes isoformes de lysyl oxydase.

Buts de l'invention :
L'invention a principalement pour but de résoudre les problèmes techniques énoncés ci-dessus et notamment le problème technique visant à fournir une méthode d'identification de principes actifs stimulant l'expression de LOX pour réguler l'élastogenèse dans les cas d'élastogenèse pathologique, désorganisée et/ou non fonctionnelle, telle que dans les cas de fibrose, d'élastose solaire, de vergetures, et/ou de cicatrices dystrophiques.

L'invention concerne également l'utilisation de l'isoforme de la lysyl oxydase LOX et d'un principe actif inhibant l'expression de la protéine élastine, notamment pour réguler l'élastogenèse dans les cas d'élastogenèse pathologique, désorganisée et/ou non fonctionnelle, telle que dans les cas de fibrose, d'élastose solaire, de vergetures, et/ou de cicatrices dystrophiques. L'effet obtenu est ainsi synergique.

L'invention concerne également l'utilisation d'un principe actif stimulant l'activité enzymatique ou l'expression de l'isoforme de la lysyl oxydase LOX, ledit principe actif inhibant l'expression de la protéine élastine, ou étant combiné à un second principe actif inhibant l'expression de la protéine élastine, notamment pour réguler l'élastogenèse dans les cas d'élastogenèse pathologique, désorganisée

et/ou non fonctionnelle, telle que dans les cas de fibrose, d'élastose solaire, de vergetures, et/ou de cicatrices dystrophiques. L'effet obtenu est ainsi synergique.

L'invention permet également de résoudre le problème technique consistant en la fourniture d'une méthode efficace de localisation de l'expression de LOX et du suivi de cette expression.

Résumé de l'invention
Dans ce texte, les inventeurs entendent par le terme LOX, ou hLOX, l'isoforme de la protéine humaine de la lysyl oxydase LOX ayant la séquence ID N 1.

Dans ce texte, les inventeurs entendent par le terme élastine, la protéine humaine de la tropoélastine ou de l'élastine ayant la séquence ID N 3.

Dans ce texte, les inventeurs entendent par le terme collagène, les différents types de collagènes présents au niveau du tissu cutané humain.

Dans ce texte, les inventeurs entendent par le terme LOXL, ou hLOXL, l'isoforme-like (L) de la protéine humaine de la lysyl oxydase LOXL ayant la séquence ID N 6.

Les inventeurs entendent par stimuler l'expression de l'isoforme de la lysyl oxydase LOX, la stimulation de l'expression du gène codant LOX, et notamment la stimulation de la synthèse de l'ARN messager codant LOX, mais aussi la stimulation de la protéine LOX synthétisée à partir de cet ARN messager. L'ADNc de LOX ayant la séquence ID N 2.

Les inventeurs entendent par inhiber l'expression de la protéine élastine, l'inhibition de l'expression du gène codant la protéine élastine, et notamment l'inhibition de la synthèse de l'ARN messager codant la protéine élastine, mais aussi l'inhibition de la synthèse de la protéine élastine ou de son précurseur tropoélastine, à partir de cet ARN messager. L'ADNc de la protéine tropoélastine ayant la séquence ID N 4.

Les inventeurs entendent par stimuler l'expression du collagène I, la stimulation de l'expression du gène codant le collagène I alphal, et notamment la stimulation de la synthèse de l'ARN messager codant le collagène I alphal, mais aussi la stimulation de la synthèse de collagène I, ou de son précurseur procollagène I, à partir de cet ARN messager.

Cette stimulation de l'expression de LOX doit être effectuée de manière suffisamment efficace pour contribuer à réguler l'élastogenèse dans les cas d'élastogenèse pathologique, désorganisée et/ou non fonctionnelle, telle que dans les cas de fibrose, d'élastose solaire, de vergetures, et/ou de cicatrices dystrophiques. Dans certaines pathologies, il est souhaitable d'inhiber l'expression de la protéine élastine afin d'obtenir un effet efficace régulant l'élastogenèse désorganisée observée notamment dans le cas de l'élastose solaire, de la fibrose.

Dans cette invention, les inventeurs visent donc à stimuler soit l'expression de LOX, soit l'activité enzymatique de LOX, et à inhiber l'expression de la protéine élastine.

Sont considérées comme efficaces les principes actifs permettant d'effectuer une augmentation d'environ 2 fois de l'expression et/ou de l'activité de LOX, et en parallèle d'effectuer une diminution d'environ 0,5 fois de l'expression de l'ARNm de l'élastine (Eln), sur un modèle, comprenant au moins un type cellulaire présentant une expression et/ou une activité de LOX, au contact de ces principes actifs par rapport au niveau d'expression et/ou d'activité de LOX dans un modèle témoin (sans mise au contact des principes actifs).

C'est ainsi que la présente invention concerne, selon un premier aspect une méthode d'identification d'une substance favorisant l'activité et/ou la formation de LOX, pour réguler l'élastogenèse dans les cas d'élastogenèse anormale ou pathologique, caractérisée en ce qu'elle comprend : - la mise en contact d'une substance potentiellement active avec au moins un type de cellules, de préférence vivantes, capables d'exprimer LOX, et

- l'analyse de l'expression de LOX, notamment dans le but d'identifier si ladite substance potentiellement active stimule l'expression de LOX.

Avantageusement, la méthode comprend la mise au contact de ladite substance potentiellement active avec au moins un type de cellules capables d'exprimer la protéine élastine, ces cellules pouvant être les mêmes que celles exprimant LOX, et comprend l'analyse de l'expression de la protéine élastine, notamment dans le but d'identifier si ladite substance potentiellement active favorise la réduction ou l'inhibition de la synthèse d'élastine.

Avantageusement, l'on recherche si ladite substance active : - stimule l'expression d'au moins une partie d'une séquence de nucléotides codant la protéine LOX, et/ou - stimule l'expression d'une séquence de peptides présente au sein de la structure de la protéine LOX ; - inhibe l'expression d'au moins une partie d'une séquence de nucléotides codant la protéine élastine, et/ou - inhibe l'expression d'une séquence de peptides présente au sein de la structure de la protéine élastine.

Avantageusement, l'analyse de l'expression de LOX et/ou de la protéine élastine est effectuée par l'analyse qualitative et/ou quantitative de l'expression d'une séquence de nucléotides codant LOX et/ou codant la tropoélastine.

Avantageusement, l'analyse de l'expression de LOX et/ou de la protéine élastine met en #uvre une étape de transcription réversée de réaction de polymérisation en chaîne (RT-PCR) comprenant l'utilisation d'amorces s'hybridant avec au moins une partie de la séquence de nucléotides de l'ADN complémentaire codant LOX (SEQ ID N 2), pour amplifier au moins une partie de la séquence de nucléotides codant la LOX, et/ou l'utilisation d'amorces s'hybridant avec au moins une partie de la séquence de nucléotides de l'ADN complémentaire codant la tropoélastine (SEQ ID N 5), pour amplifier au moins une partie de la séquence de nucléotides codant la tropoélastine.

Avantageusement, la méthode comprend également une étape de localisation de l'expression de LOX qui est effectuée sur un modèle de peau reconstruite ou sur une biopsie : - par hybridation in situ, notamment d'au moins une partie d'une séquence de nucléotides codant LOX en particulier en utilisant au moins une sonde ADN s'hybridant avec au moins une partie de la séquence de nucléotides codant LOX, et/ou notamment d'au moins une partie d'une séquence de nucléotides codant la tropoélastine, par exemple avec une sonde ADN s'hybridant avec au moins une partie de la séquence de nucléotides codant la tropoélastine, et/ou - par immunodétection, notamment d'au moins une partie d'une séquence de peptides codant LOX en particulier en utilisant au moins un anticorps capable de reconnaître tout ou partie de LOX, et/ou au moins un anticorps capable de reconnaître tout ou partie de l'élastine.

Avantageusement, l'étape d'immunodétection ou d'hybridation in situ permet d'effectuer la traçabilité de la LOX et de l'élastine, notamment dans les tissus épithéliaux et/ou dans les tissus conjonctifs, ledit tissu étant issu d'au moins un modèle de peau reconstruite ou de biopsies.

Avantageusement, la méthode d'identification comprend la comparaison de l'expression de LOX avec l'expression de LOX exprimée dans un témoin ne comprenant pas ladite substance active, et/ou la comparaison de l'expression de la protéine élastine avec l'expression de la protéine élastine exprimée dans un témoin ne comprenant pas ladite substance active.

Avantageusement, les cellules comprennent des fibroblastes, notamment issus de peau humaine normale, telle que par exemple issus de prépuce ou d'une peau d'un sujet adulte.

Avantageusement, les cellules comprennent des cellules épithéliales comme les kératinocytes, notamment issus de peau humaine normale, telle que par exemple issus de prépuce ou d'une peau d'un sujet adulte.

Avantageusement, les cellules vivantes sont issues d'au moins une peau ayant une localisation particulière, par exemple du visage, de l'abdomen, ou des seins et pouvant être caractérisée comme étant photo-âgée ou comme étant exposée ponctuellement au rayonnement solaire ou non.

Avantageusement, la méthode d'identification met en #uvre un modèle de peau reconstruite, de préférence au moins un modèle de derme comprenant des fibroblastes, ou un modèle à base de biopsie.

Avantageusement, la méthode d'identification met en #uvre un modèle de peau reconstruite, de préférence au moins un modèle d'épiderme comprenant des kératinocytes.

Le modèle de peau utilisé est avantageusement le modèle de peau reconstruite Mimeskin mais peut également être un modèle de matrice conjonctive, d'épiderme ou d'épithélium, ou de peau ou de muqueuse reconstruite : 1) Le modèle de culture tridimensionnel de matrices conjonctives (derme ou chorion), comprend un support ensemencé par des cellules stromales pour former des dermes reconstruits ou des chorions reconstruits. Ce support est choisi de préférence parmi : - un support inerte choisi parmi le groupe consistant d'une membrane synthétique semi-perméable, en particulier une membrane de nitrocellulose semi-perméable, une membrane de nylon semi-perméable, une membrane ou une éponge de téflon, une membrane de polycarbonate ou de polyéthylène, ou de polypropylène, ou de polyéthylène téréphtalate (PET) semi-perméable, une membrane inorganique Anopore semi-perméable, d'acétate ou d'ester de cellulose (HATF), une membrane Biopore-CM semi-perméable, une membrane de polyester semi-perméable, une membrane ou un film d'acide polyglycolique.

Dans ce groupe on trouve par exemple les modèles dermiques Skin 2 TM modèle ZK1100 et Dermagraft# et Transcyte (Advanced Tissue Sciences) ;

- un plastique traité culture cellulaire (formation d'un feuillet dermique : Michel
M. et al dans In Vitro Cell. Dev Biol.-Animal (1999) 35 : - un gel ou une membrane à base d'acide hyaluronique (Hyalograft 3D - Fidia
Advanced Biopolymers) et/ou de collagène et/ou de fibronectine et/ou de fibrine ; dans ce groupe on trouve par exemple modèle dermique Vitrix# (Organogenesis) ; - une matrice poreuse, surfacée ou non surfacée, réalisée à partir de collagène pouvant contenir un ou plusieurs glycosaminoglycannes et/ou éventuellement du chitosane (EP0296078A1 du CNRS, WO 01/911821 et WO 01/92322 de
Coletica).

2) Le modèle de culture tridimensionnel d'épiderme ou d'épithélium comprend un support ensemencé ou non au préalable par des cellules stromales, en particulier des fibroblastes, puis par des cellules épithéliales et en particulier des kératinocytes afin d'obtenir des épithélia ou épidermes reconstruits. Ce support est de préférence choisi parmi : - un support inerte choisi parmi le groupe consistant d'une membrane synthétique semi-perméable, en particulier une membrane de nitrocellulose semi-perméable, une membrane de nylon semi-perméable, une membrane ou une éponge de téflon, une membrane de polycarbonate ou de polyéthylène, ou de polypropylène, ou de polyéthylène téréphtalate (PET) semi-perméable, une membrane inorganique Anopore semi-perméable, d'acétate ou d'ester de cellulose (HATF), une membrane Biopore-CM semi-perméable, une membrane de polyester semi-perméable ; dans ce groupe on trouve les modèles Epiderme et Epithelia reconstruits (Skinethic) ainsi que les modèles EpiDerm# EpiAirway, EpiOccular (Mattek Corporation) ; - un film ou une membrane à base d'acide hyaluronique et/ou de collagène et/ou de fibronectine et/ou de fibrine. Dans ce groupe on peut citer

particulèrement les modèles : Episkin (L'Oréal) et Laserskin (Fidia Advanced
Biopolymers).

3) Le modèle de culture tridimensionnel de peau ou de muqueuse reconstruite comprend un support matriciel (dermique ou de chorion) ensemencé par des cellules épithéliales pour obtenir une muqueuse reconstruite ou des kératinocytes pour obtenir une peau reconstruite. Ce support est de préférence choisi parmi : - un support inerte choisi parmi le groupe consistant d'une membrane synthétique semi-perméable, en particulier une membrane de nitrocellulose semi-perméable, une membrane de nylon semi-perméable, une membrane ou une éponge de téflon, une membrane de polycarbonate ou de polyéthylène, ou de polypropylène, ou de polyéthylène téréphtalate (PET) semi-perméable, une membrane inorganique Anopore semi-perméable, d'acétate ou d'ester de cellulose (HATF), une membrane Biopore-CM semi-perméable, une membrane de polyester semi-perméable, ledit support inerte contenant des cellules stromales, en particulier des fibroblastes, - un gel à base de collagène et/ou acide hyaluronique et/ou fibronectine, et/ou de fibrine comprenant des cellules stromales en particulier des fibroblastes, - une matrice poreuse, surfacée ou non surfacée, réalisée à partir de collagène pouvant contenir un ou plusieurs glycosaminoglycannes et/ou éventuellement du chitosane, ces matrices poreuses intégrant des cellules stromales, en particulier des fibroblastes, - un derme désépidermisé ou derme mort, humain ou animal.

Dans ce groupe, on peut citer particulièrement les modèles Apligraf# (Organogenesis), ATS-2000 (CellSystems# Biotechnologie Vertrieb) ainsi que Skin 2TM (ZK1200-1300-2000 - Advanced Tissue Science).

Il existe par ailleurs des modèles dédiés à la thérapie tissulaire qui peuvent également faire l'objet de telles études. On peut citer les modèles EpidexTM (Modex Thérapeutiques), Epibase (Laboratoire Genévrier), Epicell TM (Genzyme), Autoderm TM et TransdermTM (Innogenetics).

Avantageusement, ladite substance active est choisie parmi le groupe consistant en les polyphénols végétaux ou de synthèse, un extrait de galéga ou de cardamone, un acide gras saturé, un polyol tel que le xylitol, la gomme adragante, un extrait de céréales telles l'orge ou l'avoine.

Selon un second aspect, l'invention concerne l'utilisation de la LOX ayant la Séquence ID N 1 ou d'une première substance favorisant l'activité et/ou la formation de LOX, combinée à une seconde substance favorisant la réduction ou l'inhibition de la synthèse d'élastine, pour la fabrication d'une composition notamment destinée à réguler l'élastogenèse dans les cas d'élastogenèse anormale ou pathologique. Cette composition est avantageusement destinée à stimuler l'activité enzymatique ou l'expression de l'isoforme de la lysyl oxydase LOX et inhiber la synthèse de la protéine élastine.

Avantageusement, l'élastogenèse anormale ou pathologique est en particulier rencontrée dans les cas de fibrose, d'élastose solaire, de vergetures, de cicatrices dystrophiques, d'eczémas et/ou une réaction stromale aux cancers associées à un tissu élastique désorganisé et/ou non fonctionnel.

Avantageusement, la première substance et la seconde substance sont identiques.

Avantageusement, ladite seconde substance favorise la réduction ou l'inhibition de la synthèse de tropoélastine ayant la séquence ID N 3, la protéine précurseur de l'élastine.

Avantageusement, ladite seconde substance :

i) comprend une région se fixant à au moins une partie de la séquence de nucléotides du promoteur du gène humain de l'élastine (Pr) (SEQ ID N 4), ou, ii) module l'expression d'une protéine se fixant à au moins une partie de la séquence de nucléotides du promoteur du gène humain de l'élastine (Pr) (SEQ ID N 4), afin de réduire ou d'inhiber la synthèse de tropoélastine.

Selon un troisième aspect, l'invention concerne une composition cosmétique caractérisée en ce qu'elle comprend une substance active telle que définie précédemment, éventuellement en mélange avec un excipient cosmétiquement acceptable.

Selon un quatrième aspect, l'invention concerne une composition neutraceutique caractérisée en ce qu'elle comprend une substance active telle que définie précédemment, éventuellement en mélange avec un excipient alimentairement acceptable.

Selon un cinquième aspect, l'invention concerne une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend une substance active telle que définie précédemment, éventuellement en mélange avec un excipient pharmaceutiquement acceptable.

Le principe actif, ou la combinaison de principes actifs, ou la combinaison de l'enzyme LOX, ou d'une forme dérivée, avec un principe actif inhibant la synthèse de la protéine élastine, sont avantageusement en mélange avec un excipient acceptable par le corps humain. Par exemple l'excipient contient au moins un composé choisi parmi le groupe consistant en les conservateurs, les émollients, les émulsifiants, les tensioactifs, les hydratants, les épaississants, les

conditionneurs, les agents matifiant, les stabilisants, les antioxydants, les agents de texture, les agents de brillance, les agents filmogènes, les solubilisants, les pigments, les colorants, les parfums et les filtres solaires. Ces excipients sont de préférence choisis parmi le groupe consistant en les acides aminés et leurs dérivés, les polyglycerols, les esters, les polymères et dérivés de cellulose, les dérivés de Lanoline, les phospholipides, les lactoferrines, les lactoperoxidases, les stabilisants à base de sucrose, les vitamines E et ses dérivés, les cires naturelles et synthétiques, les huiles végétales, les triglycérides, les insaponifiables, les phytosterols, les esters végétaux, les silicones et ses dérivés, les hydrolysats de protéines, l'huile de Jojoba et ses dérivés, les esters lipo/hydrosolubles, les betaines, les aminoxides, les extraits de plantes les esters de Saccharose, les dioxydes de Titane, les glycine, et les parabens, et encore de préférence parmi le groupe consistant en le butylène glycol, le stéareth-2, le stéareth-21, le glycol-15 stéaryl éther, le cétéaryl alcool, le phénoxyéthanol, le méthylparaben, l'éthylparaben, le propylparaben, le butylparaben, le butylène glycol, les tocopherols naturels, la glycérine, le sodium dihydroxycétyle, l'isopropyl hydroxycétyl éther, le glycol stéarate, le triisononaoine, l'octyl cocoate, le polyacrylamide, l'isoparaffine, le laureth-7, un carbomer, le propylène glycol, le glycérol, le bisabolol, une diméthicone, l'hydroxyde de sodium, un parfum, le PEG 30-dipolyhydroxystérate, les caprique/caprylique triglycérides, le cétéaryl octanoate, le dibutyl adipate, l'huile de pépin de raisin, l'huile de jojoba, le sulfate de magnésium, l'EDTA, une cyclométhicone, la gomme de xanthane, l'acide citrique, le lauryl sulfate de sodium, les cires et les huiles minérales, l'isostéaryl isostéarate, le dipélargonate de propylène glycol, l'isostéarate de propylène glycol, le PEG 8 Beewax, les glycérides d'huile de coeur de palme hydrogénée, les glycérides d'huile de palme hydrogénée, l'huile de lanoline, l'huile de sésame, le cétyl lactate, le lanoline alcool, l'huile de ricin, le dioxyde de titane, les colorants et les pigments, le lactose, le saccharose, le polyéthylène basse densité, une solution isotonique salée.

Avantageusement, les compositions précitées sont formulées sous une forme choisie parmi le groupe consistant en une solution, aqueuse ou huileuse, une crème ou un gel aqueux ou un gel huileux, notamment en pot ou en tube, notamment un gel douche, un shampoing ; un lait ; une émulsion, une microémulsion ou une nanoémulsion, notamment huile-dans-eau ou eau-danshuile ou multiple ou siliconée ; une lotion, notamment en flacon de verre, de plastique ou en flacon doseur ou en aérosol ; une ampoule ; un savon liquide ; un pain dermatologique ; une pommade ; une mousse ; un produit anhydre, de préférence liquide, pâteux ou solide, par exemple sous forme de bâtonnet, notamment sous forme de rouge à lèvre.

Avantageusement, les compositions suffisamment liquides peuvent être administrées, notamment par voie parentérale, oculaire, pulmonaire, orale ou nasale.

Avantageusement, les compositions pâteuses ou sèches (pâtes, poudres, comprimés, gélules, granules, suppositoires..), peuvent être introduits dans le corps notamment par voie orale, sublinguale, nasale ou rectale.

Avantageusement, quand la formulation de la composition le permet, la voie d'administration est cutanée ou transmuqueuse, notamment par application de la composition sur la peau ou sur une muqueuse.

Avantageusement, parmi ces différentes formulations et voie d'administration, l'homme de l'art choisira celle adéquate à l'efficacité recherchée.

Selon un sixième aspect l'invention concerne un procédé de soin cosmétique comprenant l'application d'une quantité efficace d'au moins un principe actif, ou d'un des types de combinaisons, tels que définis précédemment, ou d'une composition telle que définie précédemment, notamment dans les cas d'élastose solaire, de vergetures, et/ou de cicatrices dystrophiques.

Selon un septième aspect l'invention concerne une méthode de localisation de l'expression de LOX et éventuellement de la protéine élastine dans des tissus dans le but d'effectuer la traçabilité de la néo-collagénogénèse et/ou de la néo- élastogenèse, notamment dans des tissus épithéliaux et/ou dans des tissus conjonctifs, lesdits tissus étant issus d'au moins un modèle de peau reconstruite ou à base de biopsie, caractérisée en ce que la méthode comprend une étape d'immunodétection de la protéine LOX et éventuellement de la protéine élastine, par exemple par des anticorps spécifiques.

L'invention concerne également une méthode de localisation de l'expression de l'isoforme de la lysyl oxydase LOX, comprenant une étape d'immuno-détection ou d'hybridation in situ, notamment dans le but d'effectuer la traçabilité de la néo- élastogenèse, notamment dans les tissus épithéliaux et/ou dans les tissus conjonctifs.

L'invention concerne également le traitement d'une déficience de l'activité enzymatique de l'isoforme de la protéine lysyl oxydase LOX comprenant l'administration à un sujet d'une quantité thérapeutiquement efficace d'une composition comprenant un principe actif, ou d'un des types de combinaisons, tels que définis précédemment, augmentant l'activité enzymatique de la protéine lysyl oxydase LOX et inhibant la synthèse de la protéine élastine.

Avantageusement cette méthode de traitement est utilisée pour réguler l'élastogenèse dans les cas d'élastogenèse pathologique, désorganisée et/ou non fonctionnelle, telle que dans les cas de fibrose, d'élastose solaire, de vergetures, de cicatrices dystrophiques, d'eczémas et/ou une réaction stromale aux cancers associées à un tissu élastique désorganisé et/ou non fonctionnel.

Description détaillée de l'invention : Les inventeurs ont mis en évidence de façon inattendue que l'isoforme LOX de la lysyl oxydase n'était pas suffisamment stimulée localement de manière à réguler

l'élastogenèse dans les cas d'élastogenèse pathologique, désorganisée et/ou non fonctionnelle, telle que dans les cas d'élastose solaire, de vergetures, et/ou de cicatrices dystrophiques. Les inventeurs ont mis en évidence de façon inattendue, que dans les cas d'élastogenèse pathologique, désorganisée et/ou non fonctionnelle, telle que dans les cas d'élastose solaire, de vergetures, et/ou de cicatrices dystrophiques, notamment pour protéger la peau du vieillissement, des UV, ou dans les cas d'eczéma et autres dysfonctionnements comparables, il faut être capable de réinduire l'expression de LOX en réduisant la synthèse d'élastine, qui a tendance à être sur-produite et déposée de façon non fonctionnelle dans les cas cités ci-dessus.

En effet, les inventeurs ont mis en évidence que cette isoforme de la famille des lysyl oxydases (LO) est associée à l'élastogenèse dans un modèle de peau reconstruite produisant des fibres élastiques. En recherchant si cette isoforme était présente ou absente dans la peau à différents âges et lors des remaniements cutanés, les inventeurs ont constaté la présence ou l'absence simultanée de cette isoforme et de l'élastogenèse, ce qui permet d'indiquer que la réactivation de l'expression de cette isoforme de LO (LOX) ainsi que l'inhibition de la synthèse d'élastine, permet de réguler l'élastogenèse dans les cas d'élastogenèse pathologique, désorganisée et/ou non fonctionnelle, telle que dans les cas de fibrose, d'élastose solaire, de vergetures, et/ou de cicatrices dystrophiques.

Les inventeurs ont alors mis au point un modèle permettant de visualiser des expressions accrues de cette isoforme de LOX, puis ont recherché des actifs, notamment parmi des extraits végétaux ou des molécules chimiques, stimulant en particulier l'expression des ARNm codant LOX, et des actifs qui soient capables d'inhiber, simultanément ou non, l'expression de la protéine élastine. Les actifs sélectionnés, ou une combinaison de l'enzyme LOX avec un actif inhibant l'expression de la protéine élastine ont été ensuite incorporés dans des formulations cosmétiques et dermo-pharmaceutiques, pour des applications dans la réduction de l'élastogenèse pathologique, désorganisée et/ou non fonctionnelle.

Les inventeurs ont développé des anticorps spécifiques des formes matures LOX et LOXL (voir les exemples 1 et 2), et ont mis en évidence de cette manière que l'absence de l'isoforme de la lysyl oxydase LOX est principalement responsable des troubles de formation des fibres de collagène notamment lors de l'élastogenèse pathologique, désorganisée et/ou non fonctionnelle.

Les isoformes LOXL2, LOXL3 et LOXL4 ne sont pas ou peu exprimées dans le derme et ne sont pas impliquées dans l'élastogénèse (voir exemple 4). LOX est l'enzyme responsable de la maturation du collagène (par réticulation) ce qui explique que cette enzyme puisse être impliquée dans la densification du stroma.

Dans le cadre de la présente invention, les inventeurs ont mis en #uvre une méthode de localisation de l'expression de LOX. Notamment, cette méthode de localisation comprend l'immunodétection de LOX. Par cette méthode on peut également mettre en évidence l'expression de la protéine élastine. De par les études des inventeurs, il a été mis en évidence que LOX est associée aux microfibrilles et à la formation de collagène (Figure 5). L'élastine a été détectée dans les mêmes dépôts denses et dans les microfibrilles. Cette détection s'est effectuée sur des modèles de peau reconstruite, et notamment de modèles de peau reconstruite, observée 30 jours après le dépôt des kératinocytes.

L'association de LOX aux microfibrilles et aux fibres de collagène a été également confirmée au niveau de la peau de prépuce, notamment par microscopie électronique après immuno-détection. LOX est exprimée dans le derme de peau de prépuce prélevé chez de jeunes patients (quelques mois) présentant encore une synthèse forte d'élastine. LOX est toujours exprimée au niveau du derme d'adulte notamment dans le derme de la peau du cou, du sein, de l'abdomen ou du visage. Il a été également observé une forte expression de LOX au niveau de l'épiderme de peau humaine, avec cependant une extinction tardive de l'expression de cette enzyme lorsque les peaux humaines sont issues de sujets âgés (91 ans) (voir exemple 6).

Concernant les cicatrices, LOX n'a pas été observée dans ces zones, ni trois mois après la cicatrice, ni cinq ans après la formation de la cicatrice. Dans ce cadre, il faut noter que l'élastine qui est exprimée à trois mois, n'est plu présente sur cette zone cicatricielle cinq ans après la formation de la cicatrice.

Les inventeurs ont ainsi mis en évidence le rôle de LOX dans la formation des fibres de collagène et de fibres élastiques, notamment en utilisant des modèles de peau reconstruite ou des dermes de prépuce de jeunes patients.

Les inventeurs ont mis également en évidence le déficit d'expression de LOX dans les zones cicatricielles.

L'ensemble des études des inventeurs a permis de mettre au point une méthode d'identification de principe actif régulant l'élastogenèse dans les cas d'élastogenèse pathologique, désorganisée et/ou non fonctionnelle, telle que la l'élastose solaire. Cette régulation s'effectue en particulier par la réticulation du collagène et de l'élastine.

Dans le cadre de la présente invention, les inventeurs ont mis en #uvre une méthode d'hybridation in situ permettant ainsi de localiser et de vérifier la présence de l'expression des ARN messagers codant LOX en particulier. Cette hybridation in situ est notamment effectuée par des sondes d'ADN double brin marquées à la digoxigénine sur des sections de modèles de peaux reconstruites de 35 jours, inclues en paraffine. Cette hybridation in situ a été effectuée également pour vérifier l'expression des ARN messagers de la tropoélastine et du collagène lai (voir exemple 7).

L'expression des ARNm de LOX est observée dans tout le derme. Dans l'épiderme, les cellules de la couche basale n'expriment pas ou peu LOX, tandis que les cellules des couches épineuses et granuleuses l'expriment fortement.

L'expression de l'ARNm du collagène I[alpha]1 est localisée dans le derme mais pas dans l'épiderme.

Ceci a donc pour but d'être appliqué à la vérification de la stimulation des ARNm de LOX et éventuellement de l'inhibition des ARNm de l'élastine dans un

modèle de peau reconstruite, par exemple après application d'un principe actif éventuellement régulant l'élastogenèse dans les cas d'élastogenèse pathologique, désorganisée et/ou non fonctionnelle, telle que la fibrose ou l'élastose solaire.

Dans le cadre de la présente invention, le gène hLOX a été activé par l'addition de kératinocytes dans un modèle de peau reconstruite, et notamment dans le modèle de peau reconstruite Mimeskin, (Coletica, Lyon, France).

L'induction de la synthèse des ARNm de LOX est observée simultanément à celle des ARNm du collagène 1 alphal (COL1 alphal), et notamment apparaît environ 6 jours après l'adition des kératinocytes sur le derme équivalent.

L'expression des gènes d'intérêts codant LOX, codant l'élastine, codant LOXL, ainsi que de celui codant l'actine a été analysée par RT-PCR en temps réel.

Cette technique permet de quantifier précisément l'expression d'un gène en la rapportant à celle de l'actine qui est considérée comme constante. On peut donc quantifier la régulation du niveau d'expression de ces gènes et en particulier de celui codant LOX et de celui codant l'élastine.

La synthèse d'ARNm de LOX diminue en moyenne de 40% dans les fibroblastes issus de donneurs âgés par rapport aux fibroblastes issus de prépuce (voir exemple 8). La présente invention fournit une méthode permettant de quantifier l'expression de LOX, notamment dans des fibroblastes. La présente invention vise à mettre en #uvre ces différentes techniques de manière à identifier des principes actifs permettant de réguler l'élastogenèse dans les cas d'élastogenèse pathologique, désorganisée et/ou non fonctionnelle, telle que la fibrose ou l'élastose solaire.

De manière générale les méthodes de la présente invention mettent en #uvre la recherche de l'expression de la protéine LOX et de l'élastine, et notamment la recherche de l'expression des ARN messagers codant LOX et ceux codant l'élastine (voir exemple 9).

L'invention concerne également les principes actifs stimulant l'expression de LOX et inhibant l'expression de la protéine élastine pour réguler l'élastogenèse

dans les cas d'élastogenèse pathologique, désorganisée et/ou non fonctionnelle, telle que la fibrose ou l'élastose solaire (voir exemple 9 à 11).

L'invention concerne également l'utilisation de ces principes actifs pour la réalisation de compositions cosmétiques ou pharmaceutiques (voir exemples 12 à 18).

Les variations d'expression de LOX et de l'élastine peuvent être observées au niveau du gène, de l'ARN messager, ou de la protéine directement. Ces variations permettent de réguler l'élastogenèse dans les cas d'élastogenèse pathologique, désorganisée et/ou non fonctionnelle, telle que la fibrose ou l'élastose solaire, notamment grâce à la réticulation du collagène par l'enzyme LOX.

D'autres buts caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à l'homme de l'art suite à la lecture de la description explicative qui fait référence aux exemples suivants.

Les exemples font partie intégrante de la présente invention et toute caractéristique apparaissant nouvelle par rapport à un état de la technique antérieure quelconque à partir de la description prise dans son ensemble, incluant les exemples, fait partie intégrante de l'invention dans sa fonction et dans sa généralité.

Ainsi, chaque exemple a une portée générale.

D'autre part, dans les exemples, tous les pourcentages sont donnés en poids, sauf indication contraire, la température est exprimée en degré Celsius sauf indication contraire, et la pression est la pression atmosphérique, sauf indication contraire.

Exemples :

Exemple 1 : Fabrication d'anticorps spécifiques des formes matures de LOX et LOXL
L'invention a d'abord porté sur le développement de nouveaux anticorps spécifiques des formes matures de LOX et LOXL. Les anticorps ont été développés contre les régions matures de LOX et LOXL. Les régions antigéniques ont été choisies pour présenter le minimum de similarité avec les régions correspondantes sur les autres isoformes des lysyl oxydases (LO). Les anticorps obtenus contre les régions des peptides LOXV228-S280 ont été appelés anti-LOXmat et similairement pour les anticorps obtenus contre les régions des peptides LOXLR231-G368 appelés anti-LOXLpro.

Sur la figure 1 : description des séquences des LO définies pour faire les anticorps spécifiques : Cette figure représente les étapes qui ont conduit au choix des régions antigéniques pour développer les anticorps anti-LOX et antiLOXL.

Figure 1(A) : Représentation schématique de hLOX (protéine LOX humaine) et hLOXL (protéine LOXL humaine).

Les séquences d'hLOX et hLOXL sont indiquées avec des boîtes ouvertes, pointillées dans les régions C-terminales pour mettre en valeur les régions de haute similarité. La position de la coupure de la pré-région et des sites de coupure par procollagène-C-protéinase (PCP), sur les résidus A22 et D169 de hLOX respectivement, a été indiquée. La position de la coupure de la pré-région de LOXL, avant le résidu Q26, du site de maturation N-Terminal du précurseur 56 kDa (avant D135), et la position des sites de coupure par PCP du précurseur LOXL de 56 kDa (avant les résidus D338), sont indiquées. Les protéines LOXL correspondantes Q26-S574, D135- S574, et D338- 5574 afficheraient une masse moléculaire déduite d'approximativement 63 kDa, 54,6 kDa, et 26,7 kDa, respectivement. L'emplacement des peptides recombinants utilisés pour obtenir

les anticorps anti-LOX ont été indiqués : le peptide G128 - L212 pour l'antiLOXpro, le peptide V228 - S280 pour l'anti-LOXmat, et le peptide D305-N373 pour l'anti-LOXcat. L'emplacement des peptides recombinants utilisés pour développer les anticorps anti-LOXL ont été indiqués : le peptide R231-G368 pour l'antiLOXLpro et S355 - D415 pour l'anti-LOXLmat.

Figure 1(B) : Le pourcentage de similarité entre les régions antigéniques de LOX et LOXL avec leurs équivalents sur les isoformes LO a été indiqué dans ce tableau.

Dans le tableau de la figure 1(B), hLOXL représente la protéine humaine LOXL, bLOXL représente la protéine bovine LOXL, mLOXL représente la protéine de souris LOXL, hLOXL représente la protéine humaine LOX, bLOX représente la protéine bovine LOX, hLOXL2 représente la protéine humaine LOXL2, hLOXL3 représente la protéine humaine LOXL3, hLOXL4 représente la protéine humaine LOXL4.

La colonne longueur (aa) contient la valeur du nombre d'acides aminés contenus dans les régions correspondantes.

Pour obtenir les anticorps, les gènes chimériques ont été construits par l'insertion de la séquence définie de hLOXL ou hLOX en phase avec le gène de la glutathionS-transferase (GST), dans les sites BamHI-XhoI du plasmide d'expression pGEX- 4T-3 (Amersham Biosciences).

Le gène de fusion GST-LOXLS355-D415 a été construit en introduisant la séquence d'ADNc de HLOXL (cDNA hLOXL), produit par PCR avec les amorces sens 5'-TTGGATCCAGCGTAGGCAGCGTGTAC-3' (SEQ ID N 16), et antisens 5'AAACTCGAGCATCGTAGTCGGTGGC-3' (SEQ ID N 17). Le gène de fusion GST-LOX Gi28-L2i2 a été construit en introduisant l'ADNc hLOX amplifié avec les amorces sens 5'-TCGGATCCGGCTACTCGACATCTAGAGCC-3' (SEQ ID N 18) et antisens 5'GTCCTCGAGACCGTACTGGAAGTAGCC-3' (SEQ ID N 19), respectivement. Le gène de fusion GST-LOXV228-S279 a été construit en introduisant la séquence hLOX

amplifiée avec les amorces sens 5'-TTGGATCCGTGCAGAAGATGTCCATGTAC-3' (SEQ ID N 20) et antisens 5'-TTTCTCGAGGCTGGGTAAGAAATCTGATG-3' (SEQ ID N 21), respectivement. Le gène de fusion GST-LOXD306-N373 a été construit en introduisant l'ADNc hLOX amplifié avec les amorces sens 5'CACTATGGATCCCTTGATGCCAACACCC-3' (SEQ ID N 22) et antisens 5'CACGACCTTTAGGATATCGTTTCCAGG-3' (SEQ ID N 23), respectivement. Pour l'ensemble de ces amplications par PCR, la Taq polymerase High Fidelity (Roche Diagnostic, Meyman, France) a été utilisée.

Les protéines de fusion GST-LOX et GST-LOXL ainsi que les anticorps polyclonaux de lapin ont été obtenus et purifiés comme décrit précédemment pour les protéines de fusion issues de l'expression des gènes de fusion GST-LOXLS355D415 et GST LOXG128-L212 (Borel et al., J. Biol. Chem, 276 : 48944-49, 2001 ; Decitre et al, Lab. Invest., 78,143-151, 1998). Pour les expériences d'adsorption, les anticorps ont été incubés 3 h à 20 C avec les protéines de fusion adsorbées ellesmêmes sur une membrane de nitrocellulose membrane Hybond-ECL (Amersham Biosciences) avant l'immuno-détection.

Ces travaux ont d'abord permis de mettre en évidence les formes matures de LOX et LOXL, grâce à la caractérisation immunochimique et biochimique des protéines matures (voir exemple 2, figure 2). Les anticorps développés se démarquent de ceux utilisés dans l'art antérieur pour LOXL, qui ne permettent pas une reconnaissance de la forme mature de LOXL (Decitre et al., Lab Invest 78 : 143-151,1998). L'invention a consisté à utiliser l'anticorps anti-LOXLmat et antiLOXmat, ce qui a permis de mettre en évidence une protéine de 31 kDa, qui est reconnue par l'anti-LOXLmat mais pas par l'anti-LOXmat, et qui correspond à la forme mature de LOXL. Cette partie de l'invention démontre un réel progrès par rapport à l'art antérieur, notamment en référence au brevet de Csiszar et al, qui décrit toutes les protéines issues des gènes de la famille LO sans en définir les caractéristiques (brevet WO 01/83702 A2 : Novel members of the lysyl oxidase family of amine oxidases related applications).

Exemple 2 : Immuno-détection de LOX et LOXL de cellules musculaires grâce aux nouveaux anticorps anti LOX et anti-LOXL
La Figure 2 représente des photographies des électrophorèses réalisées comme indiquées ci-après. Ces électrophorèses mettent en évidence la caractérisation des protéines matures de LOX et LOXL, de cellules musculaires lisses (CML) grâce aux anticorps anti-LOX et anti-LOXL identifié à l'exemple 1.

Les protéines de la couche cellulaire (L) et du milieu de culture cellulaire (M) d'une lignée de cellules de muscle lisse de rat (développée par Jean-Marie Daniel Lamazière, Bordeaux) ont été extraites et détectées par transfert de Western (western blotting) en utilisant les anticorps anti-LOXLmat, anti-LOXmat, anti-LOXLpro et anti-LOXpro. Les cellules ont été cultivées à 37 C dans une atmosphère à 5% de C02 dans le milieu DMEM (Sigma) contenant 10% de sérum du veau foetal, 2 mM de glutamine et 50 pg/ml de gentamicine.

Les protéines des couches cellulaires, lavées deux fois avec du tampon PBS, ont été extraites 2 heures à 4 C avec agitation douce dans le tampon de lyse (16 mM tampon phosphate pH 8,0,5% NP40, des inhibiteurs de protéases (Complète Mini, Roche Diagnostics), et urée 6 M). Les lysats ont été dilués avec deux volumes de tampon 16 mM phosphate pH 8, avec des inhibiteurs de protéases (Complete Mini, Roche Diagnostics, Meylan, France), et centrifugés 20 min à 15 000 g. Les protéines solubles ont été précipitées par l'addition d'acide trichloroacétique (TCA) à 10% avant l'électrophorèse. Les protéines des milieux de culture sont récupérées de milieu de cellules cultivées 48h sans sérum, précipitées par l'addition de TCA à 10% ou de sulfate de l'ammonium à 50% de saturation.

Pour l'immuno-détection, les protéines sont séparées par électrophorèse sur gel SDS-polyacrylamide 10%. Les protéines ont été transférées sur une membrane en Fluorure de Polyvinylidène (PVDF) (Immobilon PSQ, Millipore) et immuno-détectées comme décrit précédemment (Borel et al., J. Biol. Chem, 276 : 48944-49,2001).

Les anticorps développés permettent donc de caractériser et de localiser les formes matures et immatures de LOX et LOXL dans les tissus biologiques.

Exemple 3 : Mise en évidence du rôle de LOX dans l'élastogenèse
Les inventeurs ont mis en évidence que les protéines LOX et LOXL peuvent être associées à la formation du tissu conjonctif dans le derme de modèles de peaux reconstruites par immuno-histochimie (fig 3). Cette démonstration a été obtenue sans ambiguïté grâce à l'utilisation des couples d'anticorps anti-LOX et anti-LOXL, dirigés contre les régions pro-enzymatiques et matures des 2 enzymes (LOX et LOXL).

Sur la Figure 3 il est représenté la détection immuno-histologique de LOXL et LOX dans la peau reconstruite (PR) et la peau humaine normale : - L'immuno-détection de LOXL (A, C, E, G) de peaux reconstruites aux jours 16 (A), 35 (C), et 45 (E), en utilisant l'anti-LOXLR231-G368 (A, C, E) ou l'anti-
LOXLR231-G368 adsorbé avec le peptide GST-LOXLR231-G368 correspondant avant l'immuno-détection (G).

- L'immuno-détection de LOX (B, D, F, H) de peaux recnstruites aux jours 16 (B), 35 (D), et 45 (F), en utilisant l'anti-LOXV228-S279 (B, D, F) ou l'anti-LOXV228-
S279 adsorbé avec le peptide GST-LOXV228-S279 correspondant avant l'immuno- détection (H).

- L'immunodétection de LOXL (I) et de LOX (J) dans la peau de prépuce humain, en utilisant l'anti-LOXL R231-G368 (I) et l'anti-LOXV228-S279 (J). La position de la jonction dermo-épidermique est indiquée avec une flèche ouverte, celle du substrat dermique avec une flèche, et la localisation des kératinocytes au jour
16 est indiquée avec une tête de flèche.

La peau reconstruite (Mimeskin@, Coletica, Lyon, France) a été préparée dans le fixateur de Bouin (LOX, LOXL, élastine) ou dans une solution de formol à 10% (pour l'élastine) puis incluse en paraffine. Des sections de 6 m d'épaisseur ont

été déparaffinées et blanchies en glycine-HCI (100 mmol/l). Les anticorps anti-LOX et anti-LOXL ont été décrits ci-dessus.

Les anticorps ont été utilisés à la dilution suivante : 1 :500 (anti-LOXLR231- G368), 1:100 (anti-LOX V228-S279, anti-LOXLS355-D416). Les complexes immuns sont détectés avec un anti IgG de lapin (chèvre) conjugué à la peroxydase (DAKO, Trappes, France), en utilisant la diaminobenzidine comme substrat (DAKO).

LOX et LOXL sont donc candidats pour participer à l'élastogenèse dans un modèle de peau reconstruite tel que notamment Mimeskin.

Exemple 4 : Mise en évidence du rôle de LOXL2, LOXL3, et LOXL4 dans l'élastogenèse
L'invention a aussi porté sur le développement de 2 nouveaux anticorps anti-LOXL2, un de ces anticorps reconnaissant aussi, théoriquement, LOXL3 et LOXL4. Ceci a permis de définir si ces enzymes sont exprimées avec l'élastine dans le derme d'un modèle de peau reconstruite. En fait, l'analyse par immunohistochimie en utilisant les 2 anticorps anti-LOXL2 montrent que cet antigène, ainsi que les 2 protéines antigéniquement reliées LOXL3 et LOXL4, ne sont pas ou peu exprimées dans le derme, et qu'elles ne participent donc pas à l'élastogenèse.

Sur la Figure 4 : II est représenté l'immuno-détection sur des sections de peaux reconstruites (16,35 et 45 jours) et de peau de prépuce humain avec l'anticorps anti LOXL2 517-581 (colonne de gauche) et l'anticorps anti-LOXL2 664-720 (reconnaissant théoriquement LOXL2, LOXL3, et LOXL4) (colonne de droite).

Les anticorps anti-LOXL2 ont été obtenus contre des peptides de fusion GST-LOXL2, comme décrit précédement (Decitre et al, Lab. Invest., 78,143-151,
1998). Le gène de fusion GST-LOXL2 517-581 a été construit en introduisant la séquence 1543 à 1747 du gène humain de LOXL2 (hLOXL2) dans le plasmide comme décrit précédemment.

Ce segment a été généré par PCR avec les amorces sens 5GAGCTGGGATCCGCGCACTGCC-3' et antisens 5'GGCTGAGTCGACGAGGCAGTTCTCC-3'.

Le gène de fusion GST-LOXL2 664-720 a été construit en introduisant la séquence hLOXL2 correspondante, grâce aux amorces sens 5'CACAGGATCCGAAGGAGACATCCAGAAG-3' et antisens 5'TTTCTGAGCTCCTGCATTTCATGATG-3'.

Les protéines de fusion et les anticorps anti-lapin générés contre ces protéines ont été préparés comme décrit précédemment. L'anticorps contre le peptide 517-580 a été appelé anti-LOXL2, car cette région est spécifique de LOXL2.

L'anticorps contre le peptide 664-734 a été appelé anti-LOXL-R (pour "relatif à"), car cette région de LOXL2 présente une forte similarité avec LOXL3 et LOXL4 (environ 74,6% et 60,5%, respectivement).

Les peaux reconstruites (Mimeskin, Coletica, Lyon France) à 16 jours (PRJ16), 35 jours (PR-J35) et 45 jours(PR-J45), et la peau de prépuce humain sont analysées comme précédemment par immuno-histochimie avec les anticorps antiLOXL2-R et anti-LOXL2. L'anti-LOXL2 met en évidence une expression de LOXL2 dans l'épiderme, et non dans le derme. Alors que l'anticorps dirigé contre la région commune C-terminale de LOXL2, LOXL3, et LOXL4, confirme l'expression de ces enzymes dans l'épiderme et met en évidence une faible expression dans le derme mais dans une zone qui ne correspond pas aux sites d'élastogenèse.

LOXL2, LOXL3 et LOXL4 ne sont pas impliquées dans l'élastogenèse.

Exemple 5 : Mise en évidence du rôle de LOX dans l'élastogenèse
L'association entre LOXL ou LOX d'une part, et les fibres élastiques ou les microfibrilles d'autre part, a été clairement démontrée en microscopie électronique à transmission par la présente invention.

LOX et LOXL associées aux microfibrilles constituent la trame sur laquelle se dépose l'élastine, tandis que seule LOX est associée à la formation des fibres de collagène (voir figure 5).

Sur la figure 5 : Il est représenté l'immuno-détection de LOXL, de LOX et de l'élastine par microscopie électronique à transmission dans la partie de dermique de la peau reconstruite à 45 jours et de la peau humaine normale.

Les tissus ont été fixés pendant 3h à 4 C avec 4% de paraformaldehyde dans du tampon PBS qui contient 0,1% de glutaraldehyde, puis lavés dans tampon du phosphate qui contient 0,4M de saccharose cacodylate et de lysine à 0,2 M, déshydratés dans les solutions d'éthanol, et inclus dans du LR White (Euromedex, France). La détection a été effectuée avec les anticorps primaires dilués au 1:50 en tampon Tris-HCI à pH 8,2, additionnés de 1% d'albumine bovine sérique (BSA). Les complexes immuns sont détectés avec un anticorps anti-IgG de lapin conjugué à des particules d'or colloïdal de 10 et 20 nm (Biocell, Tebu, France) dilué au 1 :40. échantillons ont été contrastés avec 3% d'acétate d'uranyle aqueux et de citrate de plomb, puis examinés sur un microscope électronique JEOL 1200 EX. L'immuno-détection a été réalisée sur la peau reconstruite (A-D) et sur la peau de prépuce humain (F-I).

Sur la peau reconstruite, elle a été réalisée avec les anticorps anti-LOXL (A, B), anti-LOX (C), anti-élastine (Elm) (D), et avec un contrôle négatif sans anticorps primaire dans le derme (control) (E). Sur la peau de prépuce humain un double marquage a été réalisé (F-I).

Références A-D : Immuno-détection de LOXL, LOX et de l'élastine par microscopie électronique dans la partie dermique de peaux reconstruites à 45 jours.

Référence E : positif avec l'anticorps anti-élastine et anti-collagène I dans le derme de peaux reconstruites à 45 jours soit 30 jours après l'ajout de kératinocytes.

Références F-I : Double immuno-détection de LOXL, LOX, élastine et collagène par microscopie électronique dans la partie dermique de prépuce humain.

Références G-H : marquage dans la partie dermique du prépuce humain avec l'anticorps de lapin anti-LOXL (l'anti-IgG de lapin est conjugué avec des particules d'or de 10 nm) et l'anticorps murin anti-élastine (l'anti-IgG de souris est conjugué avec des particules d'or de 20 nm).

Légendes de la figure : m : microfibrilles, c : fibres de collagène, e : élastine amorphe. Barre de l'échelle : 500 nm.

LOXL (A-B) est détectée en association avec les dépôts denses ou sur les microfibrilles, mais pas avec les fibres de collagène qui paraissent en blanc sur ces sections. Le marquage de LOX (C) est faible, pourtant quelques particules d'or pourraient être trouvées avec les dépôts denses, les microfibrilles et le collagène.

Les anticorps anti-élastine ont détecté les mêmes dépôts denses et les microfibrilles (D). Comme dans les observations sur les modèles de peaux reconstruites, LOXL n'est pas associée aux fibres de collagène, à l'inverse de LOX qui est très présente avec les fibres de collagène et peu présente sur les microfibrilles. Les antigènes LOXL ont été détectés en association avec les microfibrilles et autour des fibres élastiques de la peau de prépuce humain.

Le marquage de LOX n'a pas été observé avec les fibres élastiques, mais a été associé aux fibres de collagène et avec les microfibrilles de la peau (I).

Exemple 6 : Mise en évidence de la relation entre l'expression de LOX et l'élastogenèse LOXL et LOX sont exprimées dans le derme de peau de prépuce prélevée chez de jeunes patients (quelques mois) présentant encore une synthèse forte d'élastine.

LOXL n'est pas exprimé au niveau du derme de la peau du cou, du sein, de l'abdomen ou du visage, tandis que LOX est toujours exprimée dans le derme (figure 6).

Sur la Figure 6 : Il est représenté l'immuno-détection de LOX et LOXL dans la peau humaine à différentes localisations.

Les anticorps anti-LOX (A, C, E, G) et anti-LOXL (B, D, F, H) ont été utilisés pour détecter l'expression de LOX et LOXL dans des échantillons de peau de prépuce (A, B), de cou (C, D), de sein (E, F) et d'abdomen (G, H) provenant de la banque de tissus de l'hôpital Edouard Herriot (Lyon). Les tissus ont été fixés au réactif de Bouin, inclus en paraffine, et traités pour l'immuno-détection comme il a été effectué pour les immuno-détections décrites précédemment.

Sur la Figure 7 : Il est représenté l'immuno-détection de LOX et LOXL dans des peaux d'abdomen humain prélevées à différents âges.

Les anticorps anti-LOX (A, C, E, G) et anti-LOXL (B, D, F, H) ont été utilisés pour détecter l'expression de LOX et LOXL dans des échantillons de peau d'abdomen prélevés à 1,5 ans (A, B), 35 ans (C, D), 60 ans (E, F) et 91 ans (G, H) provenant de la banque de tissus de l'hôpital Edouard Herriot. Les tissus ont été fixés au réactif de Bouin, inclus en paraffine, et traités pour l'immuno-déctection comme décrit précédemment.

Au cours de cette étude, il a été observé une expression forte de LOX et LOXL au niveau de l'épiderme de peau humaine, avec une extinction tardive de l'expression de ces 2 enzymes (91 ans) (Figure 7).

Sur la Figure 8 : Il est représenté l'immuno-détection de LOX et LOXL dans des peaux cicatricielles à différentes périodes après la cicatrisation.

Les anticorps anti-LOX (A, D, G), anti-élastine (B, E, H) et anti-LOXL (C, F, I) ont été utilisés pour détecter l'expression de LOX de l'élastine et de LOXL dans des échantillons de peau de cou d'une patiente de 17 ans, autour de la cicatrice (zone "normale", A-C), 3 mois (D-F) ou 5 ans (G-H) après une cicatrisation. Les tissus ont été fixés au réactif de Bouin, inclus en paraffine, et traités pour l'immuno-déctection comme décrit précédemment.

Dans les cicatrices, ni LOXL ni LOX n'ont pu être observées dans les zones cicatricielles, 3 mois après la cicatrice et 5 ans après la cicatrice. Il faut noter que l'élastine était immuno-détectée à 3 mois et disparaissait à 5 ans dans ces cicatrices (figure 8).

Cet exemple l'invention démontre qu'il existe (i) une implication indéniable de LOX dans la formation de tissus qui ne sont pas en remodelage à différents âges mais (ii) un véritable déficit d'expression de LOX dans les cicatrices. Cet exemple démontre que LOX est présente dans les sites de formation des fibres élastiques mais qu'elle est absente dans les zones cicatricielles remodelées qui ont perdu la capacité de former de fibres élastiques fonctionnelles.

Exemple 7 : Mise en évidence de l'activation de LOX par l'introduction de kératinocvtes dans un modèle de peau reconstruite
L'activation du gène codant LOX est effectué par l'hybridation in situ de l'ARN messager de LOX avec des sondes d'ADN double brins marquées à la digoxigénine, sur des sections inclues en paraffine.

Sur la figure 9 représentant des sections de modèle de peau (Mimeskin) au jour 35 : (A) L'expression de LOXL est positive dans le derme profond et à travers tout l'épiderme.

(B) L'expression de LOX est observée à travers tout le derme. Dans l'épiderme les cellules de la couche basale n'expriment pas LOX, tandis que les couches épineuses et granuleuses l'expriment fortement.

(C) L'expression de tropoélastine (TE) est trouvée en association avec les fibroblastes dermiques et dans l'épiderme.

(D) L'expression du gène COL1A1 (collagène I[alpha]1) est détectée dans le derme mais pas dans l'épiderme.

(E) Contrôle sans sonde.

La position de la JDE est indiquée par une flèche ouverte, la position du substrat dermique poreux est indiquée avec des flèches, et les cellules positives sont indiquées avec des têtes de flèches.

Les sondes d'ADN double brins sont produites par PCR. Les amorces suivantes ont été utilisées, respectivement : pour le gène du collagène Ialphal, sens 5'-GTGGAGAGTACTGGATTG-3' (SEQ ID N 14) et antisens 5'-TCGTGCAGCCATCGACAG-3' (SEQ ID N 15), pour la tropoélastine, sens 5'-GTATATACCCAGGTGGCGTG-3' (SEQ ID N 10) et antisens 5'-CGAACTTTGCTGCTGCTTTAG-3' (SEQ ID N ll); pour hLOX, sens 5'GGTGGCCGACCCCTACTACATCC-3' (SEQ ID N 12) et antisens 5'GCAAATCGCCTCTGGTAGCCATAGTC-3' (SEQ ID N 13); pour hLOXL, sens 5'GACATAACCGACGTGCAGCC-3' (SEQ ID N 8) et antisens 5'ATCCACGTTCGCTCCCTGAG-3' (SEQ ID N 9).

Les ADN sont amplifiés avec la Taq Polymérase (Promega, Charbonnières, France) et le Dig-11-dUTP (Roche Diagnostic, Meylan, France) comme nucléotide de marquage, puis il sont purifiés après électrophorèse sur gel d'agarose en utilisant le kit d'extraction QIAquick (Qiagen, Courtaboeuf, France). L'hybridation in situ a été effectuée sur des sections inclues en paraffine. Les échantillons sont déparaffinés et traités avec la protéinase K (Roche) à 2 pg/ml pendant 15 min à 20 C. Les peroxydases endogènes sont inhibées comme indiqué dans le kit d'amplification TSA+ (NEN, Boston, USA). Une pré-hybridation est effectuée pendant 2h à 37 C en tampon phosphate 20 mM à pH 7. 4, avec 50% de formamide désionisée, 2 x SSC (sodium sait citrate), 5mM EDTA, 2,5 x solution de Denhardt, 200 pg/ml d'ADN dénaturé de hareng, 1 mg/ml ADN de sperme de saumon, et 10 mg/ml d'ARNt. L'hybridation est effectuée pendant 16 h à 37 C en tampon phosphate 20 mM, avec 50% de formamide désionisé, 2 x SSC, 5mM EDTA, 2. 5 x de solution Denhardt, 200 pg/ml d'ADN de sperme de hareng dénaturé, 10% de dextrane sulfate, avec ou sans la sonde préalablement dénaturée pendant 5 min dans un bain-marie d'eau bouillante. Après l'hybridation,

les coupes sont lavées à 20 C (ou 37 C pour le collagène) en 2 x SSC/ 50 % formamide, 1 x SSC/ 50 % formamide, 1 x SSC, et 0,5 x SSC. Après déshydratation, les hybrides marqués avec la digoxigénine sont détectés avec un anticorps anti-DIG conjugué avec la peroxydase de raifort (Roche). La détection finale des complexes est effectuée en utilisant le kit d'amplification TSA+ (NEN).

Les signaux positifs correspondent à l'activité de la phosphatase alcaline liée à la procédure d'amplification du kit TSA, après 2 h d'activité à température ambiante, et définie par la précipitation des sels de tétrazolium formés (en utilisant les substrats Nitrobleu de tetrazolium / bromochlorylindolophosphate (NBT/BCIP)).

L'invention démontre que les gènes LOXL et LOX peuvent être activés par l'addition de kératinocytes dans un modèle de peau reconstruite (Mimeskin, Coletica, Lyon, France), comme le démontre le suivi de l'expression des ARNm par hybridation in situ (figure 9).

Le gène LOX est aussi activé après l'addition des kératinocytes, en même temps que le gène du collagène 1 alphal (Collalphal).

Exemple 8 : Mise en évidence d'une baisse du niveau d'expression du gène LOX dans les fibroblastes adultes âgés
Les inventeurs ont utilisé 5 souches de fibroblastes de prépuce (FP) (issus de jeunes enfants) et 6 souches de fibroblastes adultes (FA, 3 de 20 ans en moyenne et 3 de 60 ans en moyenne) issus de chirurgie plastique au niveau de l'abdomen. L'expression des trois gènes d'intérêt ainsi que de l'actine a été analysée par RT-PCR en temps réel (reverse transcriptase polymerase chain reaction quantitative, figure 10). Cette technique permet de quantifier précisément l'expression d'un gène en la rapportant à celle de l'actine (considérée comme constante). On peut donc quantifier la régulation du niveau d'expression de ce gène.

Sur la figure 10 : La Figure 10 représente l'évolution de l'expression des gènes de l'élastine, LOX et LOXL au cours du vieillissement. Ces résultats ont été obtenus par analyse par RT-PCR en temps réel du niveau d'expression de LOX, LOXL, et de l'élastine dans des fibroblastes de prépuce et d'adulte. Les résultats représentent la moyenne de l'expression de chaque gène dans 5 souches de FP et 6 souches de FA. Les gènes testés sont hLOXL, hLOX et l'élastine humaine. Les valeurs de RT-PCR sont rapportées à l'amplification de l'actine. On constate que si l'expression du gène de l'élastine ne semble pas perturbée au cours du vieillissement, celle du gène LOX chute de 40% dès l'âge de 20 ans. Cette donnée est en accord avec la littérature sur l'élastine : si le tissu élastique se détériore et n'est pas remplacé, cela ne semble pas dû à une inhibition de l'activité du gène de l'élastine.

Les ARN totaux sont purifiés avec le kit SV 96Total RNA Isolation System (Promega, Charbonnières, France). Les ARN purifiés sont élués en 100 l d'eau RNase-free (Promega, Charbonnières, France), dosés, et répartis en plaque (96 puits, 10 l d'ARN totaux à 5ng/ l par PCR). Les amorces sélectionnées pour la réalisation de ce travail sont les suivantes et font l'objet du tableau I :
Tableau 1 :

<tb>
<tb> Gène <SEP> Nom <SEP> Taille <SEP> Séquence <SEP> humaine <SEP> Position <SEP> sur <SEP> Température
<tb> (nucléotides) <SEP> le <SEP> gène <SEP> de <SEP> fusion
<tb> humain <SEP> (TM)
<tb> ELN <SEP> 1 <SEP> Ela <SEP> 20 <SEP> GTA <SEP> TAT <SEP> ACC <SEP> CAG <SEP> Sens <SEP> : <SEP> +443 <SEP> 62 C <SEP>
<tb> GTG <SEP> GCG <SEP> TG
<tb> 2 <SEP> Ela <SEP> 21 <SEP> CGA <SEP> ACT <SEP> TTG <SEP> CTG <SEP> Antisens <SEP> : <SEP> 62 C
<tb> CTG <SEP> CTT <SEP> TAG <SEP> +799
<tb> LOX <SEP> Ox <SEP> 64 <SEP> 21 <SEP> ACG <SEP> TAC <SEP> GTG <SEP> CAG <SEP> Sens <SEP> : <SEP> +676 <SEP> 60 C <SEP>
<tb>

<tb>
<tb> AAG <SEP> ATG <SEP> TCC <SEP>
<tb> Ox <SEP> 65 <SEP> 21 <SEP> GGC <SEP> TGG <SEP> GTA <SEP> AGA <SEP> Antisens <SEP> : <SEP> 59 C
<tb> AAT <SEP> CTG <SEP> ATG <SEP> +841
<tb> LOXL* <SEP> 30 <SEP> Ll <SEP> 19 <SEP> GAC <SEP> TTC <SEP> GGC <SEP> AAC <SEP> Sens <SEP> : <SEP> +1480 <SEP> 60 C
<tb> CTC <SEP> AAC <SEP> C <SEP>
<tb> 30 <SEP> L2 <SEP> 20 <SEP> TGT <SEP> TGC <SEP> AGA <SEP> AAC <SEP> Antisens: <SEP> 60 C
<tb> GTA <SEP> GCG <SEP> AC <SEP> +1701
<tb> ACTINE <SEP> Actine <SEP> 20 <SEP> GTG <SEP> GGG <SEP> CGC <SEP> CCC <SEP> U <SEP> sens <SEP> 72 C <SEP>
<tb> AGG <SEP> CAC <SEP> CA
<tb> Actine <SEP> 24 <SEP> CTC <SEP> CTT <SEP> AAT <SEP> GTC <SEP> D <SEP> antisens <SEP> 57 C
<tb> ACG <SEP> CAC <SEP> GAT <SEP> TTC
<tb>
* Avec 30L1 étant la séquence ID N 28 et 30L2 la séquence ID N 29.

La technique de RT-PCR en temps réel est réalisée avec le kit Quanti Tect SYBR Green RT-PCR (Qiagen, France) sur les puits contenant l'ARNm, dans un thermocycleur OPTICON, qui réalise les cycles d'amplification. La rétrotranscription (RT) s'effectue 30 minutes à 50 C, suivie de 15 minutes à 95 C pour inhiber la réverse transcriptase, activer la polymérase et dénaturer l'ADN complémentaire (ADNc) obtenu. 50 cycles de polymérisation en chaîne (PCR) sont effectués (15 secondes à 94 C, 30 secondes à 60 C, 30 secondes à 72 C). A chaque fin de cycle, la fluorescence, qui est proportionnelle au nombre de fragments amplifiés est lue. Le niveau d'expression est défini par le rapport d'expression de chaque gène par rapport à l'actine.

Les exemples ci-dessus démontrent que la synthèse des produits des gènes LOXL et LOX peut être activée au niveau du gène. L'activation du gène codant LOX permet la formation des fibres de collagène réticulées. Un criblage d'actifs

permet d'aboutir à l'identification de molécules susceptibles d'induire, simultanément ou non, une augmentation de l'expression de LOX et une diminution de l'expression de l'élastine, afin de stimuler la synthèse de collagène réticulé tout en évitant la formation d'amas amorphes d'élastine et dans le but de réinduire l'expression de tissus normaux dans des tissus pathologiques.

Exemple 9 : Analyse de l'expression des ARN messagers de LOX et/ou de l'élastine, par exemple par RT-PCR qualitative avec ou sans mise en contact de principes actifs dont l'activité est à tester
Les actifs ont été testés à 1% (v/v) sur des fibroblastes de peau humaine normale (issue d'adulte "âgés" sains). La culture a été effectuée, par exemple en monocouche sur plaques de culture 24 puits, en milieu défini sans sérum (Fibroblast Basal Medium, Promocell, Allemagne). Les cellules ont été ensemencées, par exemple à 40000 par cm2. A confluence, les cellules sont mises en contact avec les actifs avantageusement pendant 24h. En parallèle, un témoin non traité (milieu seul) et 3 témoins positifs (TGF-ss à lng/ml, IL-la à 50 pg/ml et Phytokine (Coletica, France) à 2%(v/v)) sont avantageusement réalisés, par exemple sur la même plaque de culture.

Le TGF-ss à lng/ml et IIL-la à 50 pg/ml ont été testés au préalable et la stimulation de la synthèse d'ARNm de l'élastine induite par ces deux cytokines à ces concentrations a été vérifiée par une analyse des ARNm, par exemple par RTPCR quantitative (xlO pour le TGF-ss et x6 pour l'IL-1 alpha). Après le temps de mise en contact des actifs avec les cellules, par exemple 24h, les milieux sont éliminés et les cellules sont conservées par exemple par congélation à sec à -80 C après un rinçage en tampon phosphate pH 7,4. Les ARN totaux sont extraits par exemple à l'aide d'un kit d'extraction en 96 puits sur colonnes de silice et dosés sur un spectrophotomètre 96 puits à 260nm (indicateur de pureté : dosage des protéines à 280nm). Les ARN sont dilués par exemple à 5ng/ l. La RT-PCR qualitative en 1 étape est réalisée par exemple sur 50 ng d'ARN initial sur plaque

de 96 puits, sur les gènes de l'actine, de l'élastine et de LOX. Les amorces spécifiques de chaque gène sont utilisées par exemple à 0,5 M : - Gène élastine sens : 1Ela 5'-GTA TAT ACC CAG GTG GCG TG-3' ; (SEQ ID N 26) - Gène élastine antisens : 2Ela 5'-CGA ACT TTG CTG CTG CTT TAG-3' ; (SEQ ID N 27) - Gène LOX sens : Ox64 5'-ACG TAC GTG CAG AAG ATG TCC-3' ; (SEQ ID N 24) - Gène LOX antisens : Ox65 5'-GGC TGG GTA AGA AAT CTG ATG-3' ; (SEQ ID N 25) - Gène Actine sens : Actine U 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3' ; ID N 30) - Gène Actine antisens : D 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'. (SEQ ID N 31) Les paramètres d'amplification ont été avantageusement les suivants : 48 C, 30 min ; 94 C, 2 min ; (94 C, 30 s ; 60 C, 30s ; 68 C, 30s) 28 cycles pour l'actine, 32 cycles pour LOX, ou 34 cycles pour l'élastine ; 68 C, 10 min ; 14 C, infini.

Après amplification, les produits sont par exemple mélangés à raison de 3 l de produits d'amplification de l'actine + 5 l de produits d'amplification du gène de l'élastine + 5 l de produits d'amplification du gène LOX. Un tampon de charge est ajouté (2 l) et le volume total (20 l) est déposé sur un gel précoulé d'agarose par exemple à 2%. Les inventeurs ont visualisé les niveaux d'expressions par les moyens connus de l'homme de l'art et par exemple: les bandes des échantillons ont été visualisées sous UV en chambre noire après migration (15min) et photographiées numériquement. Les photos des gels ont été analysées par analyse d'images et quantification de l'intensité des bandes (PhoretixlD Quantifier, Non Linear Dynamics Ltd, USA). Les niveaux d'expression des gènes de l'élastine et de LOX ont été exprimés en pourcentage de variation par rapport à ceux obtenus pour le témoin négatif (sans traitement).

Interprétations des résultats :

On constate que les cellules âgées expriment des quantités d'ARNm codant l'élastine sensiblement identiques à celles dosées dans les cellules jeunes, alors qu'elles diminuent très fortement dans le cas de l'ARNm codant LOX (-40%). Il est donc possible d'inverser cette diminution de l'expression de LOX dans les cellules âgées, et un criblage de principes actifs dans ce sens a été réalisé.

Criblage de principes actifs :
Les quantités d'ADNc de chaque essai sont rapportées à la quantité d'ADNc de l'actine puis aux contrôles négatifs (sans actifs). Une analyse préliminaire a permis de considérer comme significatif les essais présentant une augmentation d'environ 2 fois l'ARNm de LOX et une augmentation de environ 0,5 fois l'ARNm de l'élastine (Eln). Sur plus de 900 molécules ou extraits actifs testés, 8 actifs répondent à ces critères, aux concentrations testées et dans les conditions définies. Ces actifs sont les suivants et font l'objet du tableau II
Tableau II

<tb>
<tb> Nom <SEP> Eln <SEP> LOX
<tb> Témoin <SEP> multiplié <SEP> par <SEP> : <SEP> Témoin <SEP> multiplié <SEP> par <SEP> : <SEP>
<tb> Polyphénols <SEP> 0,50 <SEP> 2,34 <SEP>
<tb> Galega <SEP> plante <SEP> 0,30 <SEP> 2,38
<tb> Acide <SEP> gras <SEP> saturé <SEP> 0,38 <SEP> 2,70
<tb> Xylitol <SEP> 0,27 <SEP> 3,10
<tb> Gomme <SEP> adragante <SEP> 0,33 <SEP> 4,10
<tb> Cardamone <SEP> 0,36 <SEP> 2,64
<tb> Orge <SEP> 0,31 <SEP> 4,65
<tb> Avoine <SEP> 0,38 <SEP> 9,69
<tb>

Les extraits végétaux sont obtenus en faisant macérer les plantes à 2-5% (p/p) dans un mélange eau/(alcool, glycol ou polyol) (tels que éthanol, glycérol,

butylène glycol et autres glycols, xylitol etc...) 100/0 à 0/100. Les extraits obtenus sont ensuite filtrés ou distillés afin de récupérer la fraction soluble qui est ensuite filtrée de façon stérile. Les molécules chimiques proviennent de Sigma (SaintLouis, USA) et sont utilisés dilués ou dispersés à 1% dans un alcool ou un glycol.

Conclusions . 8 actifs de la banque de 960 actifs sont capables, dans les conditions considérées, d'activer significativement le taux de synthèse d'ARNm des gènes codant LOX et de diminuer l'élastine dans les fibroblastes d'abdomen d'adulte âgés .

Exemple 10 : Etude d'efficacité d'un actif cosmétique ou dermopharmaceutique par exemple RT-PCR en temps réel
Les actifs sélectionnés à l'issue de la première étape de criblage ont été testés à plusieurs concentrations comprises entre 0,001% et 5%, (v/v) sur des fibroblastes de peau humaine normale (adulte). La culture a été effectuée par exemple en monocouche en plaques de culture 24 puits, en milieu défini sans sérum (Fibroblast Basal Medium, Promocell, Allemagne). Les cellules sont ensemencées par exemple à 40 000 par cm2. Après le temps de mise en contact des actifs avec les cellules (24h), les milieux ont été éliminés et les cellules ont été conservées par exemple par congélation à sec à -80 C après un rinçage au tampon phosphate à pH 7,4. En fin d'expérimentation, la teneur en ARNm de l'élastine, de LOX et de l'actine est évaluée par une technique d'analyse des ARNm, par exemple par RT-PCR en temps réel. Pour cela, les couples d'amorces permettant l'amplification de fragments spécifiques de ces gènes sont celles décrites précédemment (exemple 9).

Après extraction par exemple à l'aide d'un kit d'extraction en 96 puits sur colonnes de silice et dosage sur un spectrophotomètre 96 puits à 260nm, les ARNs sont dilués par exemple à 5ng/ l. Les réactions de RT-PCR (Reverse Polymerase Transcription Chain Reactions) ont été réalisées par RT-PCR

quantitative en temps réel à l'aide du système Opticon (MJ Research, USA). Avantageusement le mélange réactionnel (50 l) introduit dans les puits était le suivant, pour chaque échantillon : - 10 pl d'ARN à la concentration de 5ng/pl, - Les amorces spécifiques des différents marqueurs recherchés, - Mélange réactionnel (Qiagen - 25 l 2xQuantiTect SYBR Green RT-PCR master mix contenant 5mM MgCI2 + 0,5 l QuantiTect RT mix), le marqueur SYBR Green I s'intercalant dans l'ADN double brins au cours de l'étape d'élongation.

Les conditions de RT-PCR ont été avantageusement les suivantes : Transcription réversée (Reverse Transcription) : min à 50 C, puis 15 min à 95 C, Réactions de PCR : sec à 94 C, 30 sec à 60 C et 30 sec à 72 C], 50 cycles.

L'absence de contamination et la pureté des produits amplifiés ont été vérifiées par exemple via les courbes de fusion des produits de PCR amplifiés. Les produits présentant un double pic ou une température de fusion anormale ont été éliminés.

Analyse et Méthode de calcul : L'incorporation de fluorescence dans l'ADN amplifié a été évaluée en continu au cours des cycles de PCR. Ce système a permis d'obtenir des courbes de mesure de la fluorescence en fonction du nombre de cycles de PCR et ainsi d'évaluer une quantité relative d'ADN amplifié.

Afin de tenir compte de la population cellulaire présente, tous les résultats ont été rapportés au signal actine , utilisé comme gène rapporteur (Housekeeping gene). Selon l'expérimentation, le seuil de mesure du C (T) (= Cycle Threshold) a été fixé pour T compris entre 0,05 et 0,01 puis une unité arbitraire de mesure est calculée pour chaque gène selon la formule : Sgène x = 107 x (1/2) C (T)gène x C (T) gène x signifiant le nombre de cycles nécessaires pour atteindre le seuil de fluorescence de 0,01-0,05 du gène x .

Les valeurs des gènes d'intérêt ont été rapportées au signal actine par calcul du rapport : R = Sgène x / Sactine.

Ces rapports ont été comparés entre les échantillons traités et non traités,"x" étant le gène de LOX, ou de l'élastine.

Résultats : parmi les actifs sélectionnés, les résultats obtenus, à titre d'exemple pour deux d'entre eux, sont présentés dans le Tableau III
Tableau III

<tb>
<tb> Nom <SEP> LOX <SEP> Eln
<tb> Témoin <SEP> multiplié <SEP> par <SEP> : <SEP> Témoin <SEP> multiplié <SEP> par <SEP> : <SEP>
<tb> Cardamone <SEP> à <SEP> 0,001% <SEP> 1,38* <SEP> 0,67* <SEP>
<tb> Cardamone <SEP> à <SEP> 0,01% <SEP> 1,48* <SEP> 0,69* <SEP>
<tb> Cardamone <SEP> à <SEP> 0,1% <SEP> 1,63* <SEP> 0,64*
<tb> Cardamone <SEP> à <SEP> 1% <SEP> 1,64* <SEP> 0,26* <SEP>
<tb> Cardamone <SEP> à <SEP> 5% <SEP> 2,06* <SEP> 0,41* <SEP>
<tb> Avoine <SEP> à <SEP> 0,001% <SEP> 1,41 <SEP> 1,17
<tb> Avoine <SEP> à <SEP> 0,01% <SEP> 2,06 <SEP> 0,76
<tb> Avoine <SEP> à <SEP> 0,1% <SEP> 1,84* <SEP> 0,97
<tb> Avoine <SEP> à <SEP> 1% <SEP> 2,25* <SEP> 0,81
<tb> Avoine <SEP> à <SEP> 5% <SEP> 1,40 <SEP> 0,39*
<tb>
*résultats statistiquement significatifs p<0,05 (test One Way Anova/Bonferroni) Conclusions : L'extrait de cardamone STIMULE de façon significative LOX à toutes les concentrations et INHIBE de façon significative l'élastine (Eln) à toutes les concentrations. L'extrait d'avoine STIMULE de façon significative LOX à 0. 1 et 1% et INHIBE de façon significative l'élastine (Eln) à 5%.

Exemple 11 : Analyse de l'expression des ARN messagers de LOX et/ou de l'élastine, par exemple par RT-PCR qualitative avec ou sans mise en contact de principes actifs dont l'activité est à tester sur des cellules issus de zone cicatricielle
Les actifs ont été testés à 1% (v/v) sur des fibroblastes de peau humaine cicatricielle (reprise chirurgicale de cicatrice hypertrophique après césarienne) en passage précoce (inférieur à 5 passages). La culture a été effectuée, par exemple en monocouche sur plaques de culture 24 puits, en milieu défini sans sérum (Fibroblast Basal Medium, Promocell, Allemagne). Les cellules ont été ensemencées, par exemple à 40000 par cm2. A confluence, les cellules sont mises en contact avec les actifs avantageusement pendant 24h. En parallèle, un témoin non traité (milieu seul) et 3 témoins positifs (TGF-ss à lng/ml, IL-la à 50 pg/ml et Phytokine (Coletica, France) à 2%(v/v)) sont avantageusement réalisés, par exemple sur la même plaque de culture. Le TGF-(3 à lng/ml et l'IL-1[alpha] à 50 pg/ml ont été testés au préalable et la stimulation de la synthèse d'ARNm de l'élastine induite par ces deux cytokines à ces concentrations a été vérifiée par une analyse des ARNm, par exemple par RT-PCR quantitative (xlO pour le TGF-ss et x6 pour l'IL-1 alpha). Après le temps de mise en contact des actifs avec les cellules, par exemple 24h, les milieux sont éliminés et les cellules sont conservées par exemple par congélation à sec à -80 C après un rinçage en tampon phosphate pH 7,4. Les ARN totaux sont extraits par exemple à l'aide d'un kit d'extraction en 96 puits sur colonnes de silice et dosés sur un spectrophotomètre 96 puits à 260nm (indicateur de pureté : dosage des protéines à 280nm). Les ARN sont dilués par exemple à 5ng/pJ. La RT-PCR qualitative en 1 étape est réalisée par exemple sur 50 ng d'ARN initial sur plaque de 96 puits, sur les gènes de l'actine, de collagène 1 alpha et de LOX. Les amorces spécifiques de chaque gène sont utilisées par exemple à 0,5 M

COLL1 sens 5'-CAG AGG GAA GCC GCA AGA-3' COLL1 antisens 5'-CTG GCC GCC ATA CTC GAA C-3' LOX sens 5'-ACG TAC GTG CAG AAG ATG TCC-3' LOX antisens 5'-GGC TGG GTA AGA AAT CTG ATG-3' Actine sens 5'-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3' Actine antisens 5'-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3' Les paramètres d'amplification ont été avantageusement les suivants : 50 C, 30 min ; 94 C, 2 min ; (94 C, 30 sec ; 60 C, 30 sec ; 68 C, 30 sec) 28 cycles pour Tartine, 26 cycles pour COLL1,32 cycles pour LOX ; 72 C, 10 min ; 14 C, infini.

Après amplification, les produits sont par exemple mélangés à raison de 3 l de produits d'amplification de l'actine + 5 pl de produits d'amplification du gène de collagène I+ 5 # de produits d'amplification du gène LOX. Un tampon de charge est ajouté (2 pl) et le volume total (20 pl) est déposé sur un gel précoulé d'agarose par exemple à 2%. Les inventeurs ont visualisé les niveaux d'expressions par les moyens connus de l'homme de l'art et par exemple: les bandes des échantillons ont été visualisées sous UV en chambre noire après migration (15min) et photographiées numériquement. Les photos des gels ont été analysées par analyse d'images et quantification de l'intensité des bandes. Le niveau d'expression des gènes de collagène I et de LOX ont été exprimés en pourcentage de variation par rapport à ceux obtenus pour le témoin négatif (sans traitement) et comparés aux résultats obtenus pour les témoins positifs.

Les actifs sélectionnés présentent une augmentation d'environ 2 fois l'ARNm de LOX et une expression normale ou réduite de L'ARNm de COL1. Sur plus de 900 molécules ou extraits actifs testés, un extrait d'avoine répond en particulier positivement à ces critères.

Pour les exemples 12 à 16: l'homme de l'art saura tirer l'enseignement adéquat de ces exemples pour réaliser des variantes des compositions (formulations) décrites.

Exemple 12 : Utilisation des produits de l'invention dans des formulations cosmétiques ou pharmaceutiques de type émulsion huile dans eau Formulation 12a : A Eau qsp 100
Butylene Glycol 2
Glycérine 3
Sodium Dihydroxycetyl 2
Phosphate,
Isopropyl Hydroxycetyl Ether B Glycol Stearate SE 14
Triisononaoin 5
Octyl Cocoate 6 C Butylene Glycol, 2
Methylparaben,
Ethylparaben, Propylparaben, pH ajusté à 5,5 D Produits de l'invention 0,01 - 10 % Formulation 12b :

A Eau qsp 100
Butylene Glycol 2
Glycerine 3
Polyacrylamide, Isoparafin, 2,8
Laureth-7 B Butylene Glycol, 2
Methylparaben,
Ethylparaben, Propylparaben ;
2
Phenoxyethanol,
Methylparaben,
Propylparaben, Butylparaben,
Ethylparaben 0,5
Butylene Glycol
D Produits de l'invention 0,01 - 10 %
Formulation 12c :
A Carbomer 0,50
Propylene Glycol 3
Glycerol 5
Eau qsp 100
B 1 Octyl Cocoate 5

Bisabolol 0,30
Dimethicone 0,30 C Sodium Hydroxide 1,60 D Phenoxyethanol, 0,50
Methylparaben,
Propylparaben, Butylparaben,
Ethylparaben E Parfum 0,30 F Produits de l'invention 0,01- 10 % Exemple 13 : Utilisation des produits de l'invention dans une formulation de type eau dans huile A PEG 30 - 3 dipolyhydroxystearate
Capric Triglycerides 3
Cetearyl Octanoate 4
Dibutyl Adipate 3
Grape Seed Oil 1,5
Jojoba Oil 1,5
Phenoxyethanol, 0,5
Methylparaben,
Propylparaben, Butylparaben,
Ethylparaben

B Glycerine 3
Butylene Glycol 3
Magnésium Sulfate 0,5
EDTA 0,05
Eau qsp 100 C Cyclomethicone 1
Dimethicone 1
D Parfum 0,3
E Produits de l'invention 0,01 - 10 %
Exemple 14: Utilisation des produits de l'invention dans une formulation de type shampoina ou gel douche
A Xantham Gum 0,8
Eau qsp 100
B Butylene Glycol, 0,5
Methylparaben,
Ethylparaben, Propylparaben
Phenoxyethanol, 0,5
Methylparaben,
Propylparaben, Butylparaben,
Ethylparaben

C Citric acid 0,8 D Sodium Laureth Sulfate 40,0 E Produit de l'invention 0,01 - 10 % Exemple 15 : Utilisation des produits de l'invention dans une formulation de type rouge à lèvres et autres produits anhydres A Mineral Wax 17,0
Isostearyl Isostearate 31,5
Propylene Glycol Dipelargonate 2,6
Propylene Glycol Isostearate 1,7
PEG 8 Beewax 3,0
Hydrogenated Palm Kernel Oil 3,4
Glycerides,
Hydrogenated Palm Glycerides
Lanoline Oil 3,4
Sesame Oil 1,7
Cetyl Lactate 1,7
Mineral Oil, Lanolin Alcohol 3,0 B Castor Oil qsp 100
Titanium Dioxide 3,9
CI 15850 : 1 0,616
CI 45410 : 1 0,256

CI 19140 : 1 0,048
CI 77491 2,048 C Produits de l'invention 0,01- 5 % Exemple 16 : Utilisation des produits de l'invention dans une formulation de gels aqueux (contours de l'oeil, amincissants, etc.) A Eau qsp 100
Carbomer 0,5
Butylene Glycol 15
Phenoxyethanol, Methylparaben, 0,5
Propylparaben, Butylparaben,
Ethylparaben B Produits de l'invention 0,01 - 10 % Exemple 17 : Préparation de formulations pharmaceutiques contenant LOX Formulation 17a : préparation de comprimés A Excipients En g par comprimé
Lactose 0,359
Saccharose 0,240 B Extrait de LOX* 0,001-0,1 *L'extrait de LOX est obtenu, par exemple, selon le procédé d'extraction décrit à l'exemple 2 suivi d'une étape de séchage.

Formulation 17b : préparation d'une pommade A Excipients
Polyéthylène basse densité 5,5
Paraffine liquide qsp 100 B Extrait de LOX* 0,001 -0,1 *L'extrait de LOX est obtenu, par exemple, selon le procédé d'extraction décrit à l'exemple 2 éventuellement suivi d'une étape de séchage.

Formulation 17c : préparation d'une formule injectable A Excipient
Solution isotonique salée 5 ml B Extrait de LOX* 0,001-0,1 g *L'extrait de LOX est obtenu, par exemple, selon le procédé d'extraction décrit à l'exemple 2 suivi d'une étape de séchage.

La phase A et la phase B sont conditionnées en ampoules séparées et mélangées avant utilisation.

Exemple 18 : Evaluation de l'acceptation cosmétique d'une préparation contenant le sujet de l'invention Les essais de toxicologie ont été réalisés sur les composés obtenus selon les exemples 9 à 11 incorporés à 10% dans un gel de xanthane à 0,5%, par une évaluation oculaire chez le lapin, par l'étude de l'absence de toxicité anormale par administration orale unique chez le rat et par l'étude du pouvoir sensibilisant sur le cobaye.

Evaluation de l'irritation primaire cutanée chez le lapin

Les préparations décrites ci-dessus sont appliquées sans dilution à la dose de 0,5 mL sur la peau de 3 lapins selon la méthode préconisée par la directive OCDE concernant l'étude de l'effet irritant/corrosif aigu sur la peau .

Les produits sont classés selon les critères définis par l'arrêté du 1/2/1982 publié au JORF du 21/02/82.

Les résultats de ces essais, ont permis de conclure que la préparation contenant le composé obtenu selon l'exemple 11 était classée non irritante pour la peau.

Evaluation de l'irritation oculaire chez le lapin : Les préparations décrites ci-dessus ont été instillées pure en une seule fois, à raison de O,lml, dans l'oeil de 3 lapins selon la méthode préconisée par la directive de l'OCDE n 405 du 24 février 1987 concernant l'étude de l'effet irritant/corrosif aigu sur les yeux .

Les résultats de ce test permettent de conclure que les préparations peuvent être considérées comme non irritantes pour les yeux, au sens de la directive 91/326 CEE utilisée pure ou sans dilution.

Essai sur l'absence de toxicité anormale par administration orale unique chez le rat : Les préparations décrites ont été administrées en une fois par voie orale à la dose de 5g/Kg de poids corporel, à 5 rats mâles et 5 rats femelles selon un protocole inspiré de la directive de l'OCDE n 401 du 24 février 1987 et adapté aux produits cosmétiques.

Les DLO et DL50 sont trouvées supérieures à 5000 mg/Kg. Les préparations testées ne sont donc pas classées parmi les préparations dangereuses par ingestion.

Evaluation du potentiel de sensibilisation cutanée chez le cobaye:

Les préparations décrites sont soumises au test de maximisation décrit par Magnusson et Kligmann, protocole en accord avec la ligne directrice n 406 de l'OCDE.

Les préparations sont classées comme non sensibilisantes par contact avec la peau.

Précisions sur les séquences décrites :
Séquence ID N 1 : est la séquence peptidique de la protéine humaine LOX.

Séquence ID N 2 : est la séquence de nucléotides de l'ADNc codant la protéine humaine LOX décrite en séquence ID N 1.

Séquence ID N 3 : est la séquence peptidique de la protéine humaine tropoélastine.

Séquence ID N 4 : est la séquence de nucléotides de l'ADNc codant le promoteur (paires de base à partir de-2171 en amont de l'ATG) du gène humain codant la protéine humaine de l'élastine.

* Séquence ID N 5 : est la séquence de nucléotides de l'ADNc codant la protéine humaine tropoélastine décrite en séquence ID N 3.

Séquence ID N 6 : est la séquence peptidique de la protéine humaine LOXL.

Séquence ID N 7 : est la séquence de nucléotides de l'ADNc codant la protéine humaine LOXL décrite en séquence ID N 6.

Pour les sondes d'ADN double brin :
Séquence ID N 8 : est une amorce sens de l'ADN codant la protéine humaine LOXL décrite en séquence ID N 6.

Séquence ID N 9 : est une amorce antisens de l'ADN codant la protéine humaine LOXL décrite en séquence ID N 6.

Séquence ID N 10 : est une amorce sens de l'ADN codant la protéine humaine tropoélastine décrite en séquence ID N 3.

Séquence ID N 11 : est une amorce antisens de l'ADN codant la protéine humaine tropoélastine décrite en séquence ID N 3
Séquence ID N 12 : est une amorce sens de l'ADN codant la protéine humaine LOX décrite en séquence ID N 1.

Séquence ID N 13 : est une amorce antisens de l'ADN codant la protéine humaine LOX décrite en séquence ID N 1.

Séquence ID N 14 : est une amorce sens de l'ADN codant la protéine humaine collagène I alL
Séquence ID N 15 : est une amorce antisens de l'ADN codant la protéine humaine collagène I alL
Pour les gènes de fusion GST :
Séquence ID N 16 : est une amorce sens de l'ADN du gène de fusion GST S355-D415.

Séquence ID N 17 : est une amorce antisens de l'ADN du gène de fusion GST S355-D415.

Séquence ID N 18 : est une amorce sens de l'ADN du gène de fusion GST G128-L212.

Séquence ID N 19 : est une amorce antisens de l'ADN du gène de fusion GST G128-L212.

Séquence ID N 20 : est une amorce sens de l'ADN du gène de fusion GST V228-S279.

Séquence ID N 21 : est une amorce antisens de l'ADN du gène de fusion GST V228-S279.

Séquence ID N 22 : est une amorce sens de 1"ADN du gène de fusion GST D306-N373.

Séquence ID N 23 : est une amorce antisens de l'ADN du gène de fusion GST D306-N373.

Pour les amorces PCR :
Séquence ID N 24 : est une amorce sens pour la RT-PCR de l'ARNm codant la protéine humaine LOX décrite en séquence ID N 1.

Séquence ID N 25 : est une amorce antisens pour la RT-PCR de l'ARNm codant la protéine humaine LOX décrite en séquence ID N 1.

Séquence ID N 26 : est une amorce sens pour la RT-PCR de l'ARNm codant la protéine humaine tropoélastine décrite en séquence ID N 3.

Séquence ID N 27 : est une amorce antisens pour la RT-PCR de l'ARNm codant la protéine humaine tropoélastine décrite en séquence ID N 3
Séquence ID N 28 : est une amorce sens pour la RT-PCR de l'ARNm codant la protéine humaine LOXL décrite en séquence ID N 6.

Séquence ID N 29 : est une amorce antisens de la séquence de l'ARNm codant la protéine humaine LOXL décrite en séquence ID N 6.

Séquence ID N 30 : est une amorce sens pour la RT-PCR de l'ARNm codant la protéine humaine actine.

Séquence ID N 31 : est une amorce antisens pour la RT-PCR de l'ARNm codant la protéine humaine actine.

Claims

Revendications : 1. Méthode d'identification d'une substance favorisant l'activité et/ou la formation de LOX, pour réguler l'élastogenèse dans les cas d'élastogenèse anormale ou pathologique, caractérisée en ce qu'elle comprend : - la mise en contact d'une substance potentiellement active avec au moins un type de cellules, de préférence vivantes, capables d'exprimer LOX, et - l'analyse de l'expression de LOX, notamment dans le but d'identifier si ladite substance potentiellement active stimule l'expression de LOX.
2. Méthode d'identification, selon la revendication 1, caractérisée en ce que la méthode comprend la mise au contact de ladite substance potentiellement active avec au moins un type de cellules capables d'exprimer la protéine élastine, ces cellules pouvant être les mêmes que celles exprimant LOX, et comprend l'analyse de l'expression de la protéine élastine, notamment dans le but d'identifier si ladite substance potentiellement active favorise la réduction ou l'inhibition de la synthèse d'élastine.
3. Méthode d'identification, selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l'on recherche si ladite substance active : - stimule l'expression d'au moins une partie d'une séquence de nucléotides codant la protéine LOX, et/ou - stimule l'expression d'une séquence de peptides présente au sein de la structure de la protéine LOX ; - inhibe l'expression d'au moins une partie d'une séquence de nucléotides codant la protéine élastine, et/ou - inhibe l'expression d'une séquence de peptides présente au sein de la structure de la protéine élastine.

<Desc/Clms Page number 58>
4. Méthode d'identification, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'analyse de l'expression de LOX et/ou de la protéine élastine est effectuée par l'analyse qualitative et/ou quantitative de l'expression d'une séquence de nucléotides codant LOX et/ou codant la tropoélastine.
5. Méthode d'identification, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'analyse de l'expression de LOX et/ou de la protéine élastine met en #uvre une étape de transcription réversée de réaction de polymérisation en chaîne (RT-PCR) comprenant l'utilisation d'amorces s'hybridant avec au moins une partie de la séquence de nucléotides de l'ADN complémentaire codant LOX (SEQ ID N 2), pour amplifier au moins une partie de la séquence de nucléotides codant la LOX, et/ou l'utilisation d'amorces s'hybridant avec au moins une partie de la séquence de nucléotides de l'ADN complémentaire codant la tropoélastine (SEQ ID N 5), pour amplifier au moins une partie de la séquence de nucléotides codant la tropoélastine.
6. Méthode d'identification, selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la méthode comprend également une étape de localisation de l'expression de LOX qui est effectuée sur un modèle de peau reconstruite ou sur une biopsie : - par hybridation in situ, notamment d'au moins une partie d'une séquence de nucléotides codant LOX en particulier en utilisant au moins une sonde ADN s'hybridant avec au moins une partie de la séquence de nucléotides codant LOX, et/ou notamment d'au moins une partie d'une séquence de nucléotides codant la tropoélastine, par exemple avec une sonde ADN s'hybridant avec au moins une partie de la séquence de nucléotides codant la tropoélastine, et/ou - par immunodétection, notamment d'au moins une partie d'une séquence de peptides codant LOX en particulier en utilisant au moins un anticorps capable

<Desc/Clms Page number 59>

de reconnaître tout ou partie de LOX, et/ou au moins un anticorps capable de reconnaître tout ou partie de l'élastine.
7. Méthode d'identification, selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'étape d'immunodétection ou d'hybridation in situ permet d'effectuer la traçabilité de la LOX et de l'élastine, notamment dans les tissus épithéliaux et/ou dans les tissus conjonctifs, ledit tissu étant issu d'au moins un modèle de peau reconstruite ou de biopsies.
8. Méthode d'identification, selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que la méthode d'identification comprend la comparaison de l'expression de LOX avec l'expression de LOX exprimée dans un témoin ne comprenant pas ladite substance active, et/ou la comparaison de l'expression de la protéine élastine avec l'expression de la protéine élastine exprimée dans un témoin ne comprenant pas ladite substance active.
9. Méthode d'identification, selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que les cellules comprennent des fibroblastes, notamment issus de peau humaine normale, telle que par exemple issus de prépuce ou d'une peau d'un sujet adulte.
10. Méthode d'identification, selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que les cellules comprennent des cellules épithéliales comme les kératinocytes, notamment issus de peau humaine normale, telle que par exemple issus de prépuce ou d'une peau d'un sujet adulte.
11. Méthode d'identification, selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que les cellules vivantes sont issues d'au moins une peau ayant une localisation particulière, par exemple du visage, de l'abdomen,

<Desc/Clms Page number 60>

ou des seins et pouvant être caractérisée comme étant photo-âgée ou comme étant exposée ponctuellement au rayonnement solaire ou non.
12. Méthode d'identification, selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que la méthode d'identification met en #uvre un modèle de peau reconstruite, de préférence au moins un modèle de derme comprenant des fibroblastes, ou un modèle à base de biopsie.
13. Méthode d'identification, selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que la méthode d'identification met en oeuvre un modèle de peau reconstruite, de préférence au moins un modèle d'épiderme comprenant des kératinocytes.
14. Méthode d'identification, selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que ladite substance active est choisie parmi le groupe consistant en les polyphénols végétaux ou de synthèse, un extrait de galéga ou de cardamone, un acide gras saturé, un polyol tel que le xylitol, la gomme adragante, un extrait de céréales telles l'orge ou l'avoine.
15. Méthode de localisation de l'expression de LOX et éventuellement de la protéine élastine dans des tissus dans le but d'effectuer la traçabilité de la néocollagénogénèse et/ou de la néo-élastogenèse, notamment dans des tissus épithéliaux et/ou dans des tissus conjonctifs, lesdits tissus étant issus d'au moins un modèle de peau reconstruite ou de biopsies, caractérisée en ce que la méthode comprend une étape d'immunodétection de la protéine LOX et éventuellement de la protéine élastine.

<Desc/Clms Page number 61>
16. Utilisation de la LOX ayant la Séquence ID N 1 pour la fabrication d'une composition notamment destinée à réguler l'élastogenèse dans les cas d'élastogenèse anormale ou pathologique.
17. Utilisation selon la revendication 16, caractérisée en ce que ladite composition comprend en outre une seconde substance choisie parmi le groupe consistant en les polyphénols végétaux ou de synthèse, un extrait de galéga ou de cardamone, un acide gras saturé, un polyol tel que le xylitol, la gomme adragante, un extrait de céréales telles l'orge ou l'avoine, notamment pour favoriser la réduction ou l'inhibition de la synthèse d'élastine.
18. Utilisation d'une substance favorisant l'activité et/ou la formation de LOX et favorisant la réduction ou l'inhibition de la synthèse d'élastine pour la fabrication d'une composition, notamment destinée à réguler l'élastogénèse dans les cas d'élastogénèse anormale ou pathologique, ladite substance étant choisie parmi le groupe consistant en les polyphénols végétaux ou de synthèse, un extrait de galéga ou de cardamone, un acide gras saturé, un polyol tel que le xylitol, la gomme adragante, un extrait de céréales telles l'orge ou l'avoine.
19. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, caractérisée en ce que l'élastogenèse anormale ou pathologique est rencontrée dans les cas de fibrose, d'élastose solaire, de vergetures, de cicatrices dystrophiques, d'eczémas et/ou une réaction stromale aux cancers associées à un tissu élastique désorganisé et/ou non fonctionnel.
20. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 16 à 19, caractérisée en ce que ladite substance favorisant la réduction ou l'inhibition de la synthèse d'élastine, favorise également la réduction ou l'inhibition de la

<Desc/Clms Page number 62>

synthèse de tropoélastine ayant la séquence ID N 3, la protéine précurseur de l'élastine.
21. Composition cosmétique caractérisée en ce qu'elle comprend une substance active selon l'une quelconque des revendications 16 à 20, éventuellement en mélange avec un excipient cosmétiquement alimentairement acceptable.
22. Composition neutraceutique caractérisée en ce qu'elle comprend une substance active selon l'une quelconque des revendications 16 à 20, éventuellement en mélange avec un excipient neutraceutiquement alimentairement acceptable.
23. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend une substance active selon l'une quelconque des revendications 16 à 20, éventuellement en mélange avec un excipient pharmaceutiquement alimentairement acceptable.
24. Procédé de préparation d'une composition cosmétique, ou neutraceutique, ou pharmaceutique, caractérisé en ce qu'il comprend : - l'identification d'une substance active stimulant l'expression de LOX en utilisant une méthode selon les revendications 1 à 14 ; - le mélange de ladite substance avec un excipient cosmétiquement, ou alimentairement, ou pharmaceutiquement acceptable.
25. Méthode de soin cosmétique comprenant l'application d'une quantité efficace d'au moins une substance, ou d'un des types de combinaisons, tels que définis aux revendications 16 à 20, ou d'une composition telle que définie

<Desc/Clms Page number 63>

aux revendications 21 à 23, notamment dans les cas d'élastose solaire, de vergetures, et/ou de cicatrices dystrophiques.