KR100787553B1 - 탄력섬유형성의 불완전, 결여 혹은 해체로 인한 질병을 제어하는 라이실 옥시다제의 동종효소의 활성 촉진 - Google Patents

탄력섬유형성의 불완전, 결여 혹은 해체로 인한 질병을 제어하는 라이실 옥시다제의 동종효소의 활성 촉진 Download PDF

Info

Publication number
KR100787553B1
KR100787553B1 KR1020040043111A KR20040043111A KR100787553B1 KR 100787553 B1 KR100787553 B1 KR 100787553B1 KR 1020040043111 A KR1020040043111 A KR 1020040043111A KR 20040043111 A KR20040043111 A KR 20040043111A KR 100787553 B1 KR100787553 B1 KR 100787553B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
lox
elastin
expression
protein
active substance
Prior art date
Application number
KR1020040043111A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20040107419A (ko
Inventor
보우에즈샤벨
세니조발레리
소머파스칼
다모우어오딜레
글레이잘클라우디네
안드레발레리
레이메르미에르코린네
올리이사벨
페리에르에릭
Original Assignee
엥겔하드 리옹
상뜨로 나쇼날 드 라 러쉐르쉐 샹띠피크
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 엥겔하드 리옹, 상뜨로 나쇼날 드 라 러쉐르쉐 샹띠피크 filed Critical 엥겔하드 리옹
Publication of KR20040107419A publication Critical patent/KR20040107419A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100787553B1 publication Critical patent/KR100787553B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/44—Oxidoreductases (1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae
    • A61K36/481—Astragalus (milkvetch)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/88—Liliopsida (monocotyledons)
    • A61K36/899—Poaceae or Gramineae (Grass family), e.g. bamboo, corn or sugar cane
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/88—Liliopsida (monocotyledons)
    • A61K36/899—Poaceae or Gramineae (Grass family), e.g. bamboo, corn or sugar cane
    • A61K36/8998—Hordeum (barley)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/88—Liliopsida (monocotyledons)
    • A61K36/906—Zingiberaceae (Ginger family)
    • A61K36/9064—Amomum, e.g. round cardamom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A61K8/66—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y104/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12Y104/03—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3)
    • C12Y104/03013—Protein-lysine 6-oxidase (1.4.3.13), i.e. lysyl-oxidase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/70—Biological properties of the composition as a whole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q1/00—Make-up preparations; Body powders; Preparations for removing make-up
    • A61Q1/02—Preparations containing skin colorants, e.g. pigments
    • A61Q1/04—Preparations containing skin colorants, e.g. pigments for lips
    • A61Q1/06—Lipsticks
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/06—Preparations for care of the skin for countering cellulitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/10—Washing or bathing preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q5/00—Preparations for care of the hair
    • A61Q5/02—Preparations for cleaning the hair

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Birds (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

본 발명은 라이실 옥시다제(lysyl oxidase)의 동종효소(isoform), 보다 상세하게는 LOX 동종효소의 활성 촉진에 관한 것이다.
본 발명은 특히 섬유증(fibrosis), 일광탄력섬유변성증(solar elastosis), 임신선(stretch marks), 및/또는 빈영양형 흉터(dystrophic scars)와 같은 병리적이고 해체된 및/또는 비기능성의 탄력섬유형성(elastogenesis)의 경우; 및/또는 몇가지 습진 질병의 경우에 탄력섬유의 형성을 조절하는 활성성분의 스크리닝방법에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 주로 상기와 같은 경우에 탄력섬유형성을 조절할 수 있는 조성물을 제공하도록 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
라이실 옥시다제(LOX), LOXL, 동종효소, 엘라스틴, 활성물질, 콜라겐, 탄력섬유형성(elastogenesis)

Description

탄력섬유형성의 불완전, 결여 혹은 해체로 인한 질병을 제어하는 라이실 옥시다제의 동종효소의 활성 촉진{Stimulation of the activity of an isoform of lysyl oxidase for combating against some pathologies due to an incomplete, absent or disorganized elastogenesis}
도 1은 특이적 항체를 제조하는데 사용된 LOs의 서열을 기재한 것이다.
도 1(a)는 hLOX(human LOX protein) 및 hLOXL(human LOXL protein)의 개략도를 나타낸 것이다.
도 1(b)는 LO 동종효소에 대해 등가(equivalents)를 가진 LOX 및 LOXL의 항원 부위간에 유사성 비율을 표로 나타낸 것이다.
도 2는 신규 항체 항-LOX 및 항-LOXL를 이용하여 평활근 세포(SMC; smooth muscle cell)의 LOX 및 LOXL의 면역 탐지를 위해 전기영동한 사진이다.
도 3은 재건피부(reconstructed skin; RS) 및 정상 인간의 피부에서 LOXL 및 LOX를 면역-조직화학적으로 탐지한 사진도이다.
도 4는 항체 항-LOX2517-581(왼쪽 컬럼) 및 이론적으로 LOXL2, LOXL3 및 LOXL4를 모두 인식하는 항체 항-LOXL2664-720(오른쪽 컬럼)를 이용하여 재건피부(16일, 35일 및 45일된) 및 인간의 포피세포 구획에서 면역 탐지한 결과를 나타낸다.
도 5는 45일된 재건피부 및 정상 인간의 피부의 진피 부분에서 투과전자현미경에 의해 LOXL, LOX 및 엘라스틴의 면역을 탐지한 결과이다.
도 6은 다양한 위치의 인간 피부에서 나타나는 LOX 및 LOXL을 면역 탐지한 결과이다.
도 7은 다양한 연령대에서 채취한 인간의 배부분의 피부에서 나타나는 LOX 및 LOXL의 면역을 탐지한 결과이다.
도 8은 치료 후 다양한 기간의 흉터조직에서 나타나는 LOX 및 LOXL의 면역을 탐지한 결과이다.
도 9는 35일된 재건피부모델, Mimeskin®에서, 각질형성세포의 도입에 의한 LOX, LOXL 및 트로포엘라스틴의 활성화를 그 mRNA의 in situ 하이브리디제이션에 의해 조사한 결과이다.
도 10은 노화하는 동안 엘라스틴, LOX 및 LOXL 유전자들의 발현 전개 모습을 나타낸 것이다.
본 발명은 라이실 옥시다제의 동종효소, 보다 상세하게는 LOX 동종효소의 활성 촉진에 관한 것이다.
피부 및 점막의 저항성 및 탄력성은 진피의 콜라겐 섬유(collagen fibers) 및 엘라스틴 섬유(elastin fibers)에 기인하고 있다. 엘라스틴은 피브릴린(fibrillins) 및 MAGPs(Microfibrillar Associated Glycoproteins)와 같은 다른 분자들과 함께 탄력섬유를 구성하는 단백질이다.
탄력섬유는 미세섬유(microfibrils)에 묻혀있는 엘라스틴으로 형성된다. 엘라스틴은 라이실 옥시다제에 의한 분자 내 및 분자 간 교차결합 후 물리화학적 성질(불용성, 탄력성)을 획득하는 가용성 트로포엘라스틴(tropoelastin)의 형태로 합성되며, 그 후 미세섬유에 침전된다. 탄력섬유는 혈관, 폐실질부(pulmonary parenchyma), 탄성연골(elastic cartilages), 피부 등을 포함하는 기관들의 탄력성을 책임진다. 탄력섬유는 주로 미세섬유(microfibrils)에 묻혀있는 엘라스틴으로 구성된다. "엘라스틴"이라는 이름은 엘라스틴 섬유의 무정형 부분(amorphous portion)을 형성하여 그에 탄력성을 부여하는 단백질에서 비롯된다.
최근, 이러한 탄력섬유의 구성성분은 표피에서 볼 수 있었다.
한편, 콜라겐 피브릴(collagen fibrils)은 콜라겐 체인의 트리메릭 어셈블리(trimeric assembly)에 의해 형성된다. 콜라겐 섬유는 또한 라이실 옥시다제 LOX에 의해 교차결합되며, 전생애를 통하여 결합조직에서 합성된다. 기존에 이미 알려진 5개의 동종효소는 라이실 옥시다제(LOs) 과에 존재한다: LOX, LOXL, LOXL2, LOXL3, LOXL4 (Csiszar, Lysyl oxidase: A novel multifunctional amine oxidase family, Nucleic Acid Research and Molecular Biology, 2001, vol 70, pp.2-28). LOX는 상기 콜라겐 섬유의 교차결합에 관여한다(Seve et al., Expression analysis of recombinant lysyl oxidase (LOX) in myofibroblast-like cells, Connective Tissue Research, 2002, 43: 613-619). LOX는 또한 세포내 항상성 유지에 관여하는데, NFkB의 조절을 통하여 세포내 항상성 유지에 필요한 조절인자의 역할을 하는 것으로 여겨진다(Jeay S, Pianetti S, Kagan HM, Sonenshein GE. Lysyl oxidase inhibits ras-mediated transformation by preventing activation of NF-kappaB. Mol Cell Biol 23: 2251-63, 2003).
동시에 콜라겐의 합성은 섬유증(fibrosis) 또는 일광탄력섬유변성증(solar elastosis)과 같은 병리적이고, 해체된, 및/또는 비기능성의 탄력섬유형성의 경우 및 몇몇 암 질병의 경우에 통제를 벗어나게 된다. LOX의 발현이 없는 콜라겐의 합성은, LOX 발현과 함께 하는 콜라겐의 합성이 세포 공격에 대한 방어 메커니즘으로서 기질의 치밀에 관여하는 것과 달리, 암의 경우와 같은 세포외 기질의 병리적 변형에 관여한다(Decitre et al., Lab. Invest., 78, 143-151, 1998).
엘라스틴의 합성 또한 섬유증(fibrosis) 또는 일광탄력섬유변성증(solar elastosis)과 같은 병리적이고, 해체된, 및/또는 비기능성의 탄력섬유형성의 경우 및 몇 가지 암 질병의 경우에 통제를 벗어나게 된다. 이러한 엘라스틴의 무질서한 합성은 일반적으로 세포의 종양 가능성을 높이는 것으로 여겨지는 유도 펩티드(derived peptides)의 형성을 이끌어낸다(Brassart B, Fuchs P, Huet E, Alix AJ, Wallach J, Tamburro AM, Delacoux F, Haye B, Emonard H, Hornbeck W, Debelle L. Conformational dependence of collagenase (matrix metalloproteinase-1) up-regulation by elastin peptides in cultured fibroblasts. J. Biol. Chem. 276(6): 5222-7, 2001).
종래 기술은 탄력섬유형성의 조절을 가능하게 하는 더마토-코스메톨로지(dermato-cosmetology)에 대한 활성물질의 충돌을 평가할 수 있는 기준을 제공하지 못한다. 이러한 의미에서, 상기 활성물질의 충돌을 판단할 수 있게 하는 객관적인 기준을 얻는 것 또한 매우 어렵다. 실제 활성물질을 확인하는 방법은 엘라스틴 또는 피브릴린과 같은 탄력섬유의 형성에 관여하는 유전자의 발현 평가와 관계가 있다.
게다가, 현재, 동물 실험은 유럽의 화장품 산업에서 금지되어 있으며, 인간 실험은 윤리적으로 분쟁의 소지가 있다. 따라서, 발명자들이 화장품의 실제 적용을 위하여 동물 또는 인간을 이용하는 스크리닝방법을 실시하는 것은 허용될 수 없다.
Mimeskin® (프랑스 꼴레띠까)와 같은 삼차원 구조의 세포 모델에서, 각질형성세포(keratinocytes)는 트로포엘라스틴의 합성 및 상기 트로포엘라스틴의 마이크로피브릴 로의 축적을 유도한다(Duplan-Perrat et al., Kerationcytes influence the maturation and organization of the elastin network in a skin equivalent. J. Invest. Dermatol. 114: 365-70, 1999). 상기 Mimeskin® 모델에서, 세포외 기질은, 방사형으로 구성된 콜라겐과 마이크로피브릴에 축적된 엘라스틴으로 구성되는 탄력섬유와 함께, 피부의 것과 유사한 미세조직(ultra-structural organization)을 보여주었다. 상기 모델은 또한 라이실 옥시다제의 저해제와 같은 일정 분자들의 유효성을 시험하는데 사용되어 왔다. 상기 모델은 라이실 옥시다제의 저해가 콜라겐 섬유 및 탄력섬유의 분열 뿐만 아니라 필라그린(filaggrin)과 같 은 말단 분화 표지(terminal differentiation label)의 발현수준 감소와 함께 각질형성세포(keratinocytes)의 분화 프로그램으로부터의 일탈 또한 유도함을 보여주었다(French patent 01 10443, CNRS, Use of inhibitors of lysyl oxidases for cell culture and tissue engineering (Utilisation d'inhibiteurs des lysyl oxydases poru la culture cellulaire and le genie tissulaire)). 상기 특허에서는 서로 다른 LO의 동종효소간에 전혀 차이가 없다.
상기 연구들은 LOX의 발현을 촉진하고, 또한 섬유증(fibrosis), 일광탄력섬유변성증(solar elastosis), 임신선(stretch marks), 및/또는 빈영양형 흉터(dystrophic scars) 및 암 질병의 경우와 같은 병리적이고, 해체된 및/또는 비기능성의 탄력섬유형성의 경우에 탄력섬유의 형성을 낮게 조절하는, 활성물질의 스크리닝방법을 개발할 수 없었다.
따라서 종래 기술은 LOX의 발현을 촉진하고, 섬유증(fibrosis), 일광탄력섬유변성증(solar elastosis), 임신선(stretch marks), 및/또는 빈영양형 흉터(dystrophic scars)와 같은 병리적이고, 해체된 및/또는 비기능성의 탄력섬유형성의 경우에 탄력섬유의 형성을 낮게 조절하는 활성물질을 제공할 수 없다.
게다가 종래 기술은 그에 의해 제공된 방법이 부정확하고 라이실 옥시다제의 다양한 동종효소에 대하여 충분히 특이적이지 않기 때문에 라이실 옥시다제 LOX의 동종효소의 발현 위치를 정확히 밝혀낼 수 없다.
따라서, 본 발명의 목적은 주로 상기에서 언급한 기술적인 문제 및 특히, 섬유증(fibrosis), 일광탄력섬유변성증(solar elastosis), 임신선(stretch marks), 및/또는 빈영양형 흉터(dystrophic scars)와 같은 병리적이고, 해체된 및/또는 비기능성의 탄력섬유형성의 경우에 탄력섬유의 형성을 조절하기 위한, LOX 또는 그것의 동종(homologous) 또는 필수 동종 형태(essentially homologous form)의 발현을 촉진하는 활성물질의 스크리닝방법을 제공하기 위한 기술적 문제를 해결하는 것이다. 이 때, "기능성의 탄력섬유(functional elastic fibers)"는 상기에서 언급한 바와 같이 종래 기술에서 일반적으로 사용되는 의미를 뜻하는 것이며, 본 발명에서는 삼차원 구조로부터 발생하는 탄력성을 가진 탄력섬유를 뜻한다.
본 발명은 또한 라이실 옥시다제 LOX의 동종효소 및 주로 섬유증(fibrosis), 일광탄력섬유변성증(solar elastosis), 임신선(stretch marks), 및/또는 빈영양형 흉터(dystrophic scars)와 같은 병리적이고, 해체된 및/또는 비기능성의 탄력섬유형성의 경우에 탄력섬유의 형성을 조절하기 위하여 단백질 엘라스틴의 발현을 저해하는 활성물질의 용도에 관한 것이다. 따라서 그로부터 얻어지는 효과는 상승적이다.
본 발명은 또한 섬유증(fibrosis), 일광탄력섬유변성증(solar elastosis), 임신선(stretch marks), 및/또는 빈영양형 흉터(dystrophic scars)와 같은 병리적이고, 해체된 및/또는 비기능성의 탄력섬유형성의 경우에 탄력섬유의 형성을 조절하기 위한, 라이실 옥시다제(LOX) 동종효소의 효소 활성 또는 발현을 촉진하는 활성물질의 용도에 관한 것으로, 상기 활성물질은 동시에 단백질 엘라스틴의 발현을 저해하거나 단백질 엘라스틴의 발현을 저해하는 활성물질과 혼합된다. 따라서 그로부터 얻어지는 효과는 상승적이다.
본 발명은 또한 LOX의 발현위치를 확인하고 상기 발현을 추적하는데 효과적인 방법을 제공하기 위하여 그 기술적인 문제를 해결할 수 있게 한다.
이하, 본 발명의 구성을 설명한다.
본 발명에서, "LOX" 또는 "hLOX"라는 용어는 서열목록 서열 1에 기재된 인간의 라이실 옥시다제 단백질 LOX의 동종효소를 의미한다.
본 발명에서, "엘라스틴"이라는 용어는 서열목록 서열 3에 기재된 인간의 트로포엘라스틴 단백질 또는 엘라스틴 단백질을 의미한다.
본 발명에서, "콜라겐"이라는 용어는 인간의 피부 조직에 존재하는 다양한 종류의 콜라겐을 의미한다.
본 발명에서, "LOXL" 또는 "hLOXL"이라는 용어는 서열목록 서열 6에 기재된 인간의 라이실 옥시다제 단백질의 유사 동종효소(isoform-like(L)) LOXL을 의미한다.
본 발명에서, "라이실 옥시다제 LOX의 동종효소의 발현 촉진"은, LOX를 코딩하는 유전자의 발현 촉진, 특히 LOX 코딩 mRNA의 합성 촉진 뿐만 아니라 상기 mRNA로부터 합성되는 단백질 LOX의 촉진을 의미한다. 상기 LOX의 cDNA는 서열목록 서열 2의 염기서열을 가지고 있다.
본 발명에서, "단백질 엘라스틴의 발현 저해"는, 단백질 엘라스틴을 코딩하는 유전자의 발현 저해, 특히 단백질 엘라스틴 코딩 mRNA의 합성 저해 뿐만 아니라 상기 mRNA로부터 단백질 엘라스틴 또는 그것의 전구체 트로포엘라스틴의 합성을 저해함을 의미한다. 상기 단백질 트로포엘라스틴의 cDNA는 서열목록 서열 4의 염기서열을 가지고 있다.
본 발명에서, "콜라겐 Ⅰ의 발현 촉진"은, 콜라겐 Ⅰα1을 코딩하는 유전자의 발현 촉진, 특히 콜라겐 Ⅰα1 코딩 mRNA의 합성 촉진 뿐만 아니라 상기 mRNA로부터 콜라겐 Ⅰ, 또는 그것의 전구체인 프로콜라겐(procollagen) Ⅰ의 합성을 촉진한다는 것을 뜻한다.
LOX 발현의 이러한 촉진은 섬유증(fibrosis), 일광탄력섬유변성증(solar elastosis), 임신선(stretch marks), 및/또는 빈영양형 흉터(dystrophic scars)와 같은 병리적이고, 해체된 및/또는 비기능성의 탄력섬유형성의 경우에 탄력섬유의 형성을 조절하는데 충분히 효과적이도록 실시되어야 한다. 몇몇 질병, 특히 일광탄력섬유변성증(solar elastosis) 또는 섬유증(fibrosis)의 경우에 관찰되는 해체된 탄력섬유형성의 조절효과를 얻기 위해서는 단백질 엘라스틴의 발현을 저해하는 것이 바람직하다.
따라서 본 발명에서, 본 발명자들은 LOX 또는 그것의 동종(homologous) 또는 필수 동종형(essentially homologous form)의 발현 또는 효소활성의 촉진 및 단백질 엘라스틴의 발현 저해를 그 목적으로 한다.
본 발명에서, "LOX의 동종 또는 필수 동종형(homologous or essentially homologous form thereof)"는 앞에서 정의한 LOXL과 동일 또는 유사한 활성을 갖는 라이실 옥시다제의 동종효소 LOXL의 동종 형태(동종 형태)를 의미한다.
본 발명의 활성물질은, 상기 활성물질과 접촉하면서 LOX의 발현 및/또는 활성에 참여하는 적어도 한가지 타입의 세포를 포함하는 모델에서, 상기와 같은 활성물질과 접촉하도록 되어 있지 않는 대조군 모델에서의 LOX 발현 및/또는 활성 수준에 비해, 상기 LOX의 발현 및/또는 활성을 약 2배 증가시킴과 동시에 엘라스틴의 mRNA 발현을 약 0.5배 감소시키는, 매우 효과적인 것이다.
첫번째 관점에 따라, 본 발명은 다음의 특징을 포함하면서, 비정상적인 또는 병리적인 탄력섬유형성의 경우에 탄력섬유의 형성을 조절하기 위하여 LOX 또는 그것의 동종 또는 필수 동종형의 활성 및/또는 형성을 촉진하는 물질의 스크리닝방법에 관한 것이다:
a) 활성물질이 적어도 한가지 타입의 세포, 바람직하게는 살아있으면서, LOX 또는 그것의 동종 또는 필수 동종형을 발현할 수 있는 세포와 접촉하도록 하고,
b) 주로 상기 활성물질이 LOX 또는 그것의 동종 또는 필수 동종형의 발현을 촉진하는지를 확인할 목적으로 LOX 또는 그것의 동종 또는 필수 동종형의 발현을 분석함.
유리하게는, 상기 스크리닝방법은 상기 활성물질이 단백질 엘라스틴을 발현할 수 있는 적어도 한가지 타입의 세포, 가능한한 LOX를 발현하는 것과 동일한 세포에 접촉하도록 하는 것을 포함하고, 주로 상기 활성물질이 엘라스틴 합성의 감소 또는 저해를 촉진하는지를 확인할 목적으로 단백질 엘라스틴의 발현을 분석함을 포함한다.
유리하게는, 상기 활성물질은 다음을 조사한다:
a) 단백질 LOX를 코딩하는 뉴클레오티드 염기서열의 적어도 일부분의 발현 촉진, 및/또는
b) 단백질 LOX의 구조 내에 존재하는 펩티드 서열의 발현 촉진; 및
c) 단백질 엘라스틴을 코딩하는 뉴클레오티드 염기서열의 적어도 일부분의 발현 저해, 및/또는
d) 단백질 엘라스틴의 구조 내에 존재하는 펩티드 서열의 발현 저해.
유리하게는, LOX 및/또는 단백질 엘라스틴의 발현 분석은 LOX 및/또는 트로포엘라스틴을 코딩하는 뉴클레오티드 염기서열 발현의 질적 및/또는 양적 분석에 의해 실시된다.
유리하게는, LOX 및/또는 단백질 엘라스틴의 발현 분석은, LOX를 코딩하는 뉴클레오티드 염기서열의 적어도 일부분을 증폭하기 위해, 서열목록 서열 2에 기재된 LOX를 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 염기서열의 적어도 일부분과 혼성화하는 프라이머의 사용, 및/또는 트로포엘라스틴을 코딩하는 염기서열의 적어도 일부분을 증폭하기 위해, 서열목록 서열 5에 기재된 트로포엘라스틴을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 염기서열의 적어도 일부분과 혼성화하는 프라이머의 사용을 포함하는 역전사중합연쇄반응(RT-PCR)을 사용한다.
유리하게는, 상기 스크리닝방법은 또한 재건피부모델(reconstructed skin model) 또는 다음의 생검(biopsy) 기반 모델에서 LOX의 발현을 실시하는 단계를 추가로 포함한다:
a) 구체적으로 LOX를 코딩하는 뉴클레오티드 염기서열의 적어도 일부분과 혼성화하는 적어도 하나의 DNA 프로브를 이용한, 주로 LOX 코딩 뉴클레오티드 염기서열의 적어도 일부분의 in situ 하이브리디제이션, 및/또는 예를 들어 트로포엘라스틴을 코딩하는 뉴클레오티드 염기서열의 적어도 일부분과 혼성화하는 DNA 프로브를 이용한, 주로 트로포엘라스틴 코딩 뉴클레오티드 염기서열의 적어도 일부분의 in situ 하이브리디제이션에 의해, 및/또는
b) 구체적으로 LOX의 전부 또는 부분을 인식할 수 있는 적어도 하나의 항체, 및/또는 엘라스틴의 전부 또는 부분을 인식할 수 있는 적어도 하나의 항체를 이용한 LOX 코딩 펩티드 서열의 적어도 일부분의 면역 탐지에 의해.
유리하게는, 상기 면역 탐지 또는 in situ 하이브리디제이션의 단계는 적어도 하나의 재건피부모델 또는 생검 기반 모델로부터 유래하는 상피조직 및/또는 결합조직에서 LOX 및 엘라스틴을 추적할 수 있다.
유리하게는, 상기 스크리닝방법은 상기 활성물질을 포함하지 않는 대조군에서 발현되는 LOX의 발현과 LOX의 발현의 비교, 및/또는 상기 활성 물질을 포함하지 않는 대조군에서 발현되는 단백질 엘라스틴의 발현과 단백질 엘라스틴의 발현의 비교를 포함한다.
유리하게는, 상기 세포는 주로 정상인간의 피부, 예를 들어 포피 또는 성인의 피부에서 유래하는 섬유아세포를 포함한다.
유리하게는, 상기 세포는 주로 정상인간의 피부, 예를 들어 포피 또는 성인의 피부에서 유래하는 각질형성세포와 같은 상피세포를 포함한다.
유리하게는, 상기 살아있는 세포는 특정위치에 있는 적어도 하나의 피부, 예를 들어 빛에 의해 노화되거나 또는 태양광선에 노출되거나 혹은 노출되지 않은 얼굴, 배 또는 유방에서 유래한다.
유리하게는, 상기 스크리닝방법은 재건피부모델, 바람직하게는, 섬유아세포를 포함하는 적어도 하나의 진피모델 또는 생검 기반 모델을 사용한다.
유리하게는, 상기 스크리닝방법은 재건피부모델, 바람직하게는, 각질형성세포를 포함하는 적어도 하나의 표피 모델을 사용한다.
본 발명에서 사용된 피부모델은 Mimeskin®의 재건피부모델이지만, 또한 결합기질, 표피, 또는 상피, 또는 재건피부 또는 점막의 모델일 수도 있다:
1) 삼차원 구조의 결합기질(진피 또는 융모막) 세포 모델
이는 재건 진피(reconstructed dermis) 또는 재건 융모막(reconstructed chorions)을 형성하기 위하여 기질세포에 심어진 지지체(support)를 포함한다. 상기 지지체는 바람직하게는 하기로부터 선택된다:
- 반투과성 합성막, 좀 더 구체적으로는 반투과성 나이트로셀룰로즈막, 반투과성 나일론막, 테플론 막(Teflon membrane) 또는 테플론 스폰지(Teflon sponge), 반투과성의 폴리카르보네이트 또는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 또는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(polyethylene terephthalate: PET) 막, 반투과성 아노포어 무기질막(Anopore inorganic membrane), 셀룰로즈 아세테이트 또는 셀룰로즈 에스테르(HATF) 막, 반투과성 Biopore-CM 막, 반투과성 폴리에스테르막, 폴리글리콜산 막 또는 필름으로 구성되는 군으로부터 선택되는 비활성 지지체(inert support). 상기 군에는, 예를 들어 진피 모델들, 즉 Skin2 TM model ZK1100 및 Dermagraft® 및 Transcyte® (어드밴스드 티슈 사이언스)가 있다;
- 세포배양이 처리된 플라스틱(cell culture-treated plastic)(formation of a dermal leaf: Michel M. et al., in In Vitro Cell. Dev Biol.-Animal(1999)35: 318-326);
- 히알루론산(hyaluronic acid)(Hyalograft®-3D - 피디아 어드밴스드 바이오폴리머스) 및/또는 콜라겐 및/또는 피브로넥틴 및/또는 피브린에 기초한 젤 또는 막. 상기 군에는 예를 들어 진피 모델 Vitrix® (올가노제네시스)이 있다;
- 표면처리된 또는 표면처리 되지 않은, 하나 또는 그 이상의 글리코사미노글리칸 및/또는 결국 키토산을 함유할 수 있는 콜라겐으로부터 만들어진 다공성 기질 (EP 0 296 078 A1 of the CNRS, WO 01/911821 및 WO 01/92322 of Coletica).
2) 3차원 구조의 표피 또는 상피 배양 모델
이는 재건상피 또는 표피를 얻도록, 기질세포, 특히 섬유아세포 및 그 다음 상피세포 및 구체적으로 각질형성세포로 파종되거나 그렇지 않은 지지체를 포함한다. 상기 지지체는 바람직하게는 하기로부터 선택된다:
- 반투과성 합성막, 좀 더 구체적으로는 반투과성 나이트로셀룰로즈막, 반투 과성 나일론막, 테플론 막(Teflon membrane) 또는 테플론 스폰지(Teflon sponge), 반투과성의 폴리카르보네이트 또는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 또는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(polyethylene terephthalate: PET) 막, 반투과성의 아노포어(Anopore) 무기질막, 셀룰로즈 아세테이트 또는 셀룰로즈 에스테르(HATF) 막, 반투과성 Biopore-CM 막, 반투과성 폴리에스테르막으로 구성되는 군으로부터 선택되는 비활성 지지체(inert support). 상기 군에는 재건 모델 표피 및 상피 (Skinethic®) 뿐만 아니라 EpiDerm®, EpiAirway®, EpiOccular®(매텍 코포레이션) 등의 모델이 있다;
- 히알루론산(hyaluronic acid)(Hyalograft®-3D - 피디아 어드밴스드 바이오폴리머스) 및/또는 콜라겐 및/또는 피브로넥틴 및/또는 피브린에 기초한 젤 또는 막. 상기 군에는 모델들: 특히 Episkin® (로레알) 및 Laserskin® (피디아 어드밴스드 바이오폴리머스)가 인용될 수 있다.
3) 3차원 구조의 재건 피부 또는 점막 배양 모델
이는 재건 피부를 얻도록 상피세포로 파종된 기질 지지체(진피 또는 융모막의)를 포함한다. 상기 지지체는 바람직하게는 하기로부터 선택된다:
- 반투과성 합성막, 좀 더 구체적으로는 반투과성 나이트로셀룰로즈막, 반투과성 나일론막, 테플론 막(Teflon membrane) 또는 테플론 스폰지(Teflon sponge), 반투과성의 폴리카르보네이트 또는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 또는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(polyethylene terephthalate: PET) 막, 반투과성의 아노포어(Anopore) 무기질막, 셀룰로즈 아세테이트 또는 셀룰로즈 에스테르(HATF) 막, 반투과성 Biopore-CM 막, 반투과성 폴리에스테르막으로 구성되는 군으로부터 선택되는 비활성 지지체, 상기 비활성 지지체는 기질세포, 특히 섬유아세포를 함유함,
- 기질세포, 특히 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 및/또는 히알루론산 및/또는 피브로넥틴 및/또는 피브린에 기초한 젤.
- 표면처리된 또는 표면처리 되지 않은, 하나 또는 그 이상의 글리코사미노글리칸 및/또는 결국 키토산을 함유할 수 있는 콜라겐으로부터 만들어진 다공성 기질, 상기 다공성 기질은 기질세포, 특히 섬유아세포를 포함함,
- 인간 또는 동물의 표피화되지 않은 진피(de-epidermisised dermis) 또는 죽은 진피.
상기 군에서, 모델들 Apligraf® (올가노제네시스), ATS-2000 (CellSystems® 바이오테크놀로지 베르트리엡) 뿐만 아니라 특히 Skin2TM (zk1200-1300-2000 - 어드밴스드 티슈 사이언스)가 인용될 수 있다.
게다가 모델은 조직 치료법(tissue therapy)에 쓰여질 수 있으며, 그러한 연구의 주제로 될 수도 있다. 상기 모델 EpidexTM (모덱스 테라퓨티끄), Epibase® (래보라토레 게네브리에), EpicellTM (겐자임), AutodermTM 및 TransdermTM (인노제네틱 스)가 인용될 수 있다.
유리하게는, 상기 활성물질은 식물 또는 합성 폴리페놀, 갈레가(galega) 또는 카르다몬(cardamon)의 추출물, 포화지방산, 자일리톨과 같은 폴리올(polyol), 아드라간트 검(adragant gum), 보리 또는 귀리와 같은 곡류 추출물로 구성되는 군으로부터 선택된다.
두번째 관점에 따르면, 본 발명은 비정상적인 또는 병리적인 탄력섬유형성의 경우에 탄력섬유의 형성조절용 조성물의 제조를 위한, 서열목록 서열 1에 기재된 라이실 옥시다제(LOX) 또는 그것의 동종 또는 필수 동종형 또는 엘라스틴 합성의 감소 또는 저해를 촉진하는 2차 물질과 결합된 LOX의 활성 및/또는 형성을 촉진하는 활성물질의 용도에 관한 것이다. 상기 조성물은 유리하게는 라이실 옥시다제 LOX 또는 그 동종 또는 필수 동종형의 효소 활성 또는 발현을 촉진하고, 단백질 엘라스틴의 합성을 저해하는 경향이 있다.
유리하게는, 상기 비정상적인 또는 병리적인 탄력섬유형성은, 특히 해체된 및/또는 비기능성의 탄력조직과 관련된 섬유증(fibrosis), 일광탄력섬유변성증(solar elastosis), 임신선(stretch marks), 빈영양형 흉터(dystrophic scars), 습진 및/또는 암에 대한 기질반응의 경우에 일어난다.
유리하게는, 상기 LOX 촉진 활성물질과 엘라스틴 억제 활성물질은 동일하다.
유리하게는, 상기 엘라스틴 억제 활성물질은 엘라스틴의 전구 단백질인 서열목록 서열 3에 기재된 트로포엘라스틴 또는 그 동종 또는 필수 동종형의 합성 감소 또는 저해를 촉진한다.
유리하게는, 상기 엘라스틴 억제 활성물질은 트로포엘라스틴의 합성을 감소 또는 저해하도록, ⅰ) 서열목록 서열 4에 기재된 인간의 엘라스틴 유전자 프로모터(Pr) 또는 그 동종 또는 필수 동종 형태의 뉴클레오티드 염기서열의 적어도 일부분에 연결된 부분을 포함하거나 또는 ⅱ) 서열목록 서열 4에 기재된 인간의 엘라스틴 유전자의 프로모터(Pr) 또는 그 동종 또는 필수 동종 형태의 뉴클레오티드 염기서열의 적어도 일부분에 연결된 단백질의 발현을 조절한다.
유리하게는, 상기 활성물질은 식물 또는 합성 폴리페놀, 갈레가(galega) 또는 카르다몬(cardamon)의 추출물, 포화지방산, 자일리톨과 같은 폴리올(polyol), 검 아드라간트(gum adragant), 보리 또는 귀리와 같은 곡류 추출물로 구성되는 군으로부터 선택된다.
세번째 관점에 따르면, 본 발명은 상기와 같은 활성물질을 포함하고, 선택적으로 화장료에 적합한 부형제와의 혼합물로 포함함을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
네번째 관점에 따르면, 본 발명은 상기와 같은 활성물질을 포함하고, 선택적으로 식품용 부형제와의 혼합물로 포함함을 특징으로 하는 식약용(neutraceutical) 조성물에 관한 것이다.
다섯번째 관점에 따르면, 본 발명은 상기와 같은 활성물질을 포함하고, 선택적으로 약제학적으로 적합한 부형제와의 혼합물로 포함함을 특징으로 하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
상기 활성물질, 또는 활성물질들의 혼합물, 또는 단백질 엘라스틴의 합성을 저해하는 활성물질과 효소 LOX 또는 유도 동종효소와의 혼합물은 인체에 적합한 부형제와 혼합된다. 예를 들어, 상기 부형제는 방부제, 완화제, 유화제, 계면활성제, 보습제, 농축제(thickner), 조절제, 매티파잉제(matifying agents), 안정제, 항산화제, 직조제(texture agents), 증백제, 호막제(filmogenic agents), 용해제, 색소, 염료, 향료 및 태양관측필터(solar filter)로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 함유한다. 이러한 부형제는 바람직하게는 아미노산 및 그 유도체, 폴리그리세롤, 에스테르, 폴리머 및 셀룰로즈의 유도체, 라놀린 유도체(lanolin derivatives), 포스포리피드(phospholipids), 락토페린, 락토페록시다제, 수크로즈에 기초한 안정제(sucrose-based stabilizers), 비타민 E 및 그 유도체, 천연 및 합성 왁스, 식물 오일, 트리글리세라이드, 인사포니피아블(insaponifiables), 피토스테롤(phytosterols), 식물의 에스테르, 실리콘 및 그 유도체, 단백질 가수분해물, 호호바 오일 및 그 유도체, 지/수용성 에스테르(lipo/hydrosoluble esters), 베타인(betaines), 아미녹사이드(aminoxides), 식물 추출물, 수크로즈 에스테르(ester of sucrose), 이산화 티타늄(titanium dioxides), 글리신 및 파라벤(parabens)으로 구성되는 군으로부터 선택되며, 더욱 바람직하게는 부틸렌 글리콜, 스티레드-2(steareth-2), 스티레드-21(steareth-21), 글리콜-15 스티릴 에테르(stearyl ether), 세터릴 알콜(cetearyl alcohol), 페녹시에탄올(phenoxyethanol), 메틸파라벤(methylparaben), 에틸파라벤(ethylparaben), 프로필파라벤(propylparaben), 부틸파라벤(butylparaben), 부틸렌 글리콜, 천연 토코페롤, 글리세롤, 소듐 디하이드록시세틸(sodium dihydroxycetyl), 이소프로필 하이드록시세틸 에테르(isopropyl hydroxycetyl ether), 글리콜 스티레이트(glycol stearate), 트리이소노나오인(triisononaoine), 옥틸 코코에이트(octyl cocoate), 폴리아크릴아마이드, 이소파라핀, 라우레드-7(laureth-7), 카보머(carbomer), 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 비사볼롤(bisabolol), 디메티콘(dimethicone), 수산화나트륨(sodium hydroxide), 향료, PEG 30-디폴리하이드록시스티레이트(dipolyhydroxysterate), 카프릭/카프릴릭 트리글리세라이드(capric/caprylic triglycerides), 세터릴 옥타노에이트(cetearyl octanoate), 디부틸 아디페이트(dibutyl adipate), 포도씨 오일, 호호바 오일, 황산 마그네슘, EDTA, 사이클로메티콘(cyclomethicone), 산탄검(xanthan gum), 시트르산, 라우릴 유산 소다, 미네랄 왁스 및 오일, 이소스티릴 이소스티레이트(isostearyl isostearate), 프로필렌 글리콜 디펠라르고네이트(propylene glycol dipelargonate), 프로필렌 글리콜 이소스티레이트(propylene glycol isostearate), PEG 8 비즈왁스(Beeswax), 하이드로지네이티드 야자나무 허트 오일 글리세라이드(hydrogenated palm tree heart oil glycerides), 하이드로지네이티드 야자 오일 글리세라이드(hydrogenated palm oil glycerides), 라놀린 오일, 세사메 오일(sesame oil), 세틸 락테이트(cetyl lactate), 라놀린 알콜, 카스토르 오일, 이산화 티타늄, 콜로란트(colorants) 및 색소, 락토즈, 수크로즈, 낮은 밀도의 폴리에틸렌 및 등장식염수(isotonic saline solution)로 구성되는 군으로부터 선택된다.
유리하게는, 상기 조성물들은 수용성 또는 지용성 용액, 특히 용기 또는 튜브에 주입한 수용성 크림 또는 젤 또는 지용성 젤, 특히 샤워젤, 샴푸; 밀크; 에멀 젼, 마이크로에멀젼 또는 나노에멀젼, 수중유형(oil-in-water) 또는 유중수형(water-in-oil) 또는 멀티플 또는 실리콘-함유 마이크로에멀젼 또는 나노에멀젼; 특히 유리병, 플라스틱병, 또는 계량용 병(measure bottle) 또는 분무기에 함유된 로션; 앰플; 물비누; 피부질환치료용 비누(dermatological bar); 연고; 폼(foam); 무수 제품(anhydrous product), 바람직하게는 액체, 반죽 또는 고체상태의 무수제품, 예를 들어 막대, 특히 립스틱 형태의 제품으로 구성되는 군으로부터 선택되는 형태로 제제할 수 있다.
유리하게는, 상기 조성물들 중 충분히 액체상태인 조성물들은 특히, 비경구, 눈, 폐, 경구 또는 코 등 여러 경로를 통하여 투여될 수 있다.
유리하게는 상기 조성물 중 반죽 또는 건조상태의 조성물(고약, 분말, 정제, 캡슐, 입자, 좌약)은 경구, 혀밑, 코 또는 직장 등의 경로를 통해 인체로 투여될 수 있다.
유리하게는 상기 조성물이 제형화되면, 그 투여경로는 피부 또는 점막을 통해 가능하다.
유리하게는, 당업자는 그 목적하는 바에 따라 상기의 다양한 제제 및 투여경로로부터 가장 적절한 것을 선택할 수 있다.
여섯번째 관점에 따르면, 본 발명은 특히 일광탄력섬유변성증(solar elastosis), 임신선(stretch marks) 및/또는 빈영양형 흉터(dystrophic scars)의 경우에, 상기에 기재한 적어도 하나의 활성물질 또는 한가지 타입의 혼합물 또는 상기에 기재한 조성물의 유효량을 적용하는 것을 포함하는 코스메틱 케어방법에 관한 것이다.
일곱번째 관점에 따르면, 본 발명은 예를 들어 특이적 항체에 의한 단백질 LOX 및 선택적으로 단백질 엘라스틴의 면역 탐지 단계를 포함함을 특징으로 하는, 적어도 하나의 재건피부모델 또는 생검 기반 모델로부터 유래하는 상피조직 및/또는 결합조직에서 신-결합섬유형성(neo-collagenogenesis) 및/또는 신-탄력섬유형성(neo-elastogenesis)을 추적하기 위해 조직에서 LOX 또는 그 동종 또는 필수 동종 형태 및 선택적으로 단백질 엘라스틴의 발현을 조사하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 특히 상피조직 및/또는 결합조직에서 신-탄력섬유형성(neo-elastogenesis)을 추적하기 위해 면역-탐지(immuno-detection) 또는 in situ 하이브리디제이션의 단계를 포함하는, 라이실 옥시다제 LOX 또는 그것의 동종 또는 필수 동종 형태의 발현 조사방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기에서 기재한 바와 같은, 단백질 라이실 옥시다제 LOX 또는 그것의 동종 또는 필수 동종 형태의 효소활성을 증가시키고 단백질 엘라스틴의 합성을 저해하는 활성물질 또는 한가지 타입의 혼합물을 포함하는 조성물의 치료학적인 유효량을 인체에 투여하는 것을 포함하는, 단백질 라이실 옥시다제 LOX 또는 그것의 동종 또는 필수 동종 형태의 동종효소의 효소활성 결핍에 대한 치료에 관한 것이다.
유리하게는 상기 치료방법은 해체된 및/또는 비기능성의 탄력조직과 관련된 섬유증(fibrosis), 일광탄력섬유변성증(solar elastosis), 임신선(stretch marks), 빈영양형 흉터(dystrophic scars), 습진 및/또는 암에 대한 기질반응의 경우와 같은 병리적이고, 해체된 및/또는 비기능성의 탄력섬유형성의 경우에 탄력섬유의 형성을 조절하는데 사용된다.
이하, 본 발명의 구성을 보다 상세히 설명한다.
본 발명자들은 우연히 라이실 옥시다제의 동종효소 LOX가 위치상으로 일광탄력섬유변성증(solar elastosis), 임신선(stretch marks), 및/또는 빈영양형 흉터(dystrophic scars)의 경우와 같은 병리적이고, 해체된 및/또는 비기능성의 탄력섬유형성의 경우에 탄력섬유의 형성을 조절하기 위해 충분히 촉진되지 못함을 발견하게 되었다. 본 발명자들은 또한 우연히, 노화, 자외선으로부터 피부를 보호하기 위한 일광탄력섬유변성증(solar elastosis), 임신선(stretch marks), 및/또는 빈영양형 흉터(dystrophic scars)의 경우, 또는 습진(eczema) 및 다른 비슷한 기능장애의 경우와 같은 병리적이고, 해체된 및/또는 비기능성의 탄력섬유형성의 경우에, 과생산되어 상기와 같은 비기능성의 방식으로 축적되는 경향이 있는 엘라스틴의 합성을 감소시키는데 있어 LOX의 발현을 재유도할 필요가 있다는 사실을 발견하게 되었다.
본 발명자들은 사실 라이실 옥시다제(LO) 과의 상기 동종효소가 탄력섬유를 생산하는 재건피부모델에서의 탄력섬유형성과 관련된다는 사실을 발견하였다. 상기 동종효소가 다양한 연령의 피부 및 피부 변형(skin alterations) 중에 존재하는지 아니면 결여되는지 여부를 조사하던 중, 본 발명자들은 상기 동종효소과 탄력섬유형성이 동시에 존재하거나 동시에 결여되며, 이로부터 상기 라이실 옥시다제 동종효소 발현의 재활성 뿐만 아니라 엘라스틴의 합성 저해가 섬유증(fibrosis), 일광탄력섬유변성증(solar elastosis), 임신선(stretch marks), 및/또는 빈영양형 흉터(dystrophic scars)의 경우와 같은 병리적이고, 해체된 및/또는 비기능성의 탄력섬유형성을 조절할 수 있게 함을 알게 되었다.
이에 본 발명자들은 이러한 LOX 동종효소의 증가된 발현을 시각화할 수 있는 방법을 개발한 다음, 특히 식물 추출물 또는 화학적 분자물질 중에서 LOX 코딩 mRNA의 발현을 촉진하는 활성물질 및 그와 동시에 또는 그렇지 않더라도 단백질 엘라스틴의 발현을 저해할 수 있는 활성물질을 탐색하였다. 그 다음 선택된 상기 활성물질, 또는 효소 LOX와 단백질 엘라스틴의 발현을 저해하는 활성물질과의 혼합물을 병리적이고, 해체된 및/또는 비기능성의 탄력섬유형성을 감소시키는데 적용하기 위하여, 화장품 및 피부약(dermo-pharmaceutical) 제제에 삽입하였다.
본 발명자들은 성숙한 LOX 및 LOXL 형태(실시예 1 및 2 참조)에 대한 특이적 항체를 개발하였으며, 이를 이용하여 라이실 옥시다제 LOX의 동종효소의 결여가, 특히 병리적이고 해체된 및/또는 비기능성의 탄력섬유형성 동안 콜라겐 섬유의 형성에 문제를 초래함을 알게 되었다.
상기 동종효소들 LOXL2, LOXL3 및 LOXL4는 진피에서 전혀 또는 거의 발현되지 않으며 탄력섬유형성에 관여하지 않는다(실시예 4 참조). LOX는 (교차결합에 의해) 콜라겐의 성숙을 담당하는 효소이며, 이러한 사실은 상기 효소가 기질의 치밀에 관여할 수도 있음을 설명해준다.
본 발명에서, 본 발명자들은 LOX의 발현 위치를 조사하는 방법을 수행하였 다. 특히, 상기 방법은 LOX의 면역 탐지를 포함한다. 단백질 엘라스틴의 발현 또한 상기 방법에 의해 조사될 수 있다. LOX가 마이크로피브릴 및 콜라겐 형성에 관여한다는 사실은 본 발명자들의 연구에 의해 이미 입증된 바 있다(도 5). 엘라스틴은 동일한 치밀도의 축적물(same dense deposits) 및 마이크로피브릴에서 탐지되었다. 이러한 탐지는 재건피부모델, 특히 각질형성세포의 축적 후 30일째의 재건피부모델에서 이루어진다. 또한 LOX의 마이크로피브릴 및 콜라겐 섬유에 대한 관련은 포피의 피부에서, 특히 면역 탐지 후 전자 현미경에 의해 확인되었다. LOX는 여전히 엘라스틴의 광범위한 합성이 일어나는 어린 환자(생후 몇 달된)로부터 채취한 포피의 진피에서 발현된다. LOX는 항상 성인의 진피, 특히 목, 가슴, 배 또는 얼굴 피부의 진피에서 발현된다. 또한 인간 피부의 표피에서도 LOX의 높은 발현이 관찰되었으나, 상기 인간의 피부를 91세의 나이든 환자로부터 채취한 경우에는 상기 효소의 발현이 관찰되지 않았다(실시예 6 참조).
흉터에 관해서, LOX는 흉터형성 후 3개월 경과 및 5년 경과시 모두 상기 흉터 부위에서 관찰되지 않았다. 이 때, 3개월째에 발현된 엘라스틴은 상처 형성 후 5년이 경과한 상기 흉터 조직에는 더 이상 존재하지 않음을 주목해야 한다.
따라서 본 발명자들은 특히 재건피부모델 또는 어린 환자의 포피의 진피를 이용하여 콜라겐 섬유 및 탄력섬유의 형성에서의 LOX의 역할을 입증하였다.
본 발명자들은 또한 상기 흉터 조직 부위에서 LOX 발현의 결핍을 입증하였다.
본 발명자들은 상기 모든 연구를 통해 일광탄력섬유변성증(solar elastosis)과 같은 병리적이고, 해체된 및/또는 비기능성의 탄력섬유형성의 경우에 탄력섬유의 형성을 조절하는 활성물질의 스크리닝방법을 개발하였다. 이러한 조절은 특히 콜라겐 및 엘라스틴의 교차결합에 의해 명백하게 나타난다.
본 발명에서, 본 발명자들은 구체적으로 LOX 코딩 mRNA의 발현 존재를 조사 및 입증할 수 있는 in situ 하이브리디제이션 방법을 수행하였다. 이러한 in situ 하이브리디제이션은 특히 파라핀에 포함된 35일째의 재건피부모델 구획에서 디곡시게닌(digoxigenin)으로 표지된 이중가닥 DNA 프로브에 의해 실시되었으며, 또한 트로포엘라스틴 및 콜라겐 Ⅰα1의 mRNA의 발현을 입증하기 위하여 수행되었다(실시예 7 참조).
LOX의 mRNAs의 발현은 진피 전체를 통하여 관찰된다. 표피에서, 기저층(basal layer)의 세포는 LOX를 전혀 또는 거의 발현하지 않는 반면, 유극층 및 과립층의 세포는 상기 LOX를 강하게 발현한다. 콜라겐 Ⅰα1의 mRNA의 발현은 표피가 아닌 진피에서 발견된다.
따라서, 이것의 목적은, 예를 들어 섬유증(fibrosis) 또는 일광탄력섬유변성증(solar elastosis)과 같은 병리적이고 해체된 및/또는 비기능성의 탄력섬유형성의 경우에 탄력섬유의 형성을 조절하는 활성물질의 적용 후 재건피부모델에서 LOX mRNA의 촉진 및 마침내는 엘라스틴 mRNA의 저해를 확인하는데 적용되는 것이다.
본 발명에서, 상기 hLOX 유전자는 재건피부모델, 특히 Mimeskin®(프랑스 리 옹 꼴레띠까) 재건피부모델에서 각질형성세포의 첨가에 의해 활성화되었다. LOX mRNA의 합성 유도는 콜라겐 Ⅰα1(COL1 alpha1) mRNA의 것과 동시에 관찰되는데, 특히 진피 등가물(dermis equivalent)에 각질형성세포가 첨가된 후 약 6일째에 나타난다.
액틴 뿐만 아니라 LOX, 엘라스틴, LOXL를 코딩하는 목적 유전자들의 발현은 실시간 RT-PCR(real time RT-PCR)에 의해 분석되었다. 상기 기술은 유전자의 발현을 일정한 것으로 생각되는 액틴의 발현과 비교하여 정확히 정량하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 이러한 유전자들의 발현수준의 조절은 정량될 수 있으며, 구체적으로 LOX 및 엘라스틴을 코딩하는 유전자 발현의 정량이 가능하다.
LOX의 mRNA의 합성은 포피에서 유래하는 섬유아세포에 대하여 나이든 환자 유래의 섬유아세포에서는 평균 40%까지 감소된다(실시예 8 참조). 본 발명은 특히 섬유아세포에서 LOX의 발현을 정량할 수 있게 하는 방법을 제공한다. 본 발명은 섬유증(fibrosis) 또는 일광탄력섬유변성증(solar elastosis)과 같은 병리적이고, 해체된 및/또는 비기능성의 탄력섬유형성의 경우에 탄력섬유의 형성을 조절할 수 있게 하는 활성물질을 확인하도록 이러한 다양한 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.
일반적으로, 본 발명의 상기 방법들은 단백질 LOX 및 엘라스틴, 특히 LOX 및 엘라스틴을 코딩하는 mRNAs의 발현조사를 수행한다(실시예 9 참조).
본 발명은 또한 섬유증(fibrosis) 또는 일광탄력섬유변성증(solar elastosis)과 같은 병리적이고 해체된 및/또는 비기능성의 탄력섬유형성의 경우에 탄력섬유의 형성조절을 위하여 LOX의 발현을 촉진하고 단백질 엘라스틴의 발현을 저해하는 활성물질에 관한 것이다(실시예 9 내지 11 참조). 본 발명은 또한 화장료 또는 약제학적 조성물의 제조를 위한 상기 활성물질의 용도에 관한 것이다(실시예 12 내지 18 참조).
LOX 및 엘라스틴 발현의 다양성은 상기 유전자, 또는 그 mRNA 또는 그 단백질에서 직접적으로 관찰될 수 있다. 이러한 다양성은 섬유증(fibrosis) 또는 일광탄력섬유변성증(solar elastosis)과 같은 병리적이고 해체된 및/또는 비기능성의 탄력섬유형성의 경우에 탄력섬유의 형성을, 특히 상기 효소 LOX에 의한 콜라겐의 교차결합에 의해 조절가능하게 한다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점들은 하기 실시예에 따른 자세한 설명에 의하여 당업자에게 자명할 것이다.
하기 실시예들은 본 발명의 필수 구성요소를 이루며, 이를 포함한 본 발명 전체로부터 종래 기술에 대해 신규한 것으로 나타나는 특징 또한 본 발명의 기능 및 보편성에 있어서 본 발명의 필수 구성요소를 이룬다.
따라서 모든 실시예는 일반적인 범위이다.
또한, 모든 실시예에서 다른 특별한 언급이 없는 한 퍼센티지는 무게로, 온도는 섭씨로 표시되며, 압력은 대기압을 나타낸다.
[실시예]
실시예 1: LOX 및 LOXL의 성숙한 형태에 대한 특이적 항체의 제조
본 발명은 제일 먼저 LOX 및 LOXL의 성숙한 형태(mature form)에 대해 신규한 특이적 항체를 개발하였다. 상기 항체는 LOX 및 LOXL의 성숙부위(mature regions)에 대하여 개발되었으며, 상기 항원 부위는 라이실 옥시다제(LOs)의 다른 동종효소의 대응부위와 최소한의 유사성을 나타내도록 선택되었다. 펩티드 LOXV228-S280 부위에 대해 얻어진 항체는 항-LOXmat(anti-LOXmat)라 명명하였으며, 펩티드 LOXLR231-G368 부위에 대해 얻어진 항체에 대해서는 그와 유사하게 항-LOXLpro(anti-LOXLpro)라 명명하였다.
도 1에 LOX 및 LOXL에 대한 상기 항체를 개발하기 위하여 그 항원 부위를 선택한 단계를 표시하였다.
먼저 도 1(a)에서, hLOX(human LOX protein) 및 hLOXL(human LOXL protein)의 서열 중 유사성이 높은 부위를 강조하기 위하여 이를 C-말단부위에 점점으로 표시된 오픈 박스로 표시하였다. pre-region의 절단위치 및 프로콜라겐-C-프로티네이즈(PCP)에 의한 절단부위의 위치를 각각 hLOX의 A22 및 D169 잔기에 표시하였다. LOXL의 pre-region 절단위치를 hLOXL의 Q26 잔기에, 56 kDa 전구체의 N-말단 성숙 부위의 위치를 D135 잔기에, 그리고 56 kDa의 상기 LOXL 전구체의 PCP에 의한 절단부위의 위치를 D338 잔기에 표시하였다. 상기 대응하는 LOXL 단백질들 Q26-S574, D135-S574 및 D338-S574는 각각 대략 63 kDa, 54.6 kDa 및 26.7 kDa의 분자질량을 보여준다. 상기 항-LOX 항체를 얻는데 사용된 재조합 펩티드의 위치는 다음과 같다: 항 -LOXpro에 대해서는 G128-L212 펩티드, 항-LOXmat에 대해서는 V228-S280 펩티드, 항-LOXcat에 대해서는 D305-N373 펩티드. 항-LOXL 항체를 개발하는데 사용된 재조합 펩티드의 위치는 다음과 같다: 항-LOXLpro에 대해서는 R231-G368 펩티드 및 항-LOXLmat에 대해서는 S355-K415 펩티드.
도 1(b)의 표에서, hLOX는 인간의 LOXL 단백질을, bLOXL은 소의 LOXL 단백질을, mLOXL은 쥐의 LOXL 단백질을, hLOX는 인간의 LOX 단백질을, bLOX는 소의 LOX 단백질을, hLOXL2는 인간의 LOXL2 단백질을, hLOXL3는 인간의 LOXL3 단백질을 hLOXL4는 인간의 LOXL4 단백질을 나타낸다.
컬럼 길이 (aa)는 상기 대응 부위(corresponding regions)를 함유하는 아미노산의 수를 함유한다.
상기 항체를 얻기 위하여, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 유전자와 함께 hLOXL 또는 hLOX의 상기 지정 서열을 발현 플라스미드인 pGET-4T-3(Amersham Biosciences)의 BamHⅠ-XhoⅠ위치에 삽입함으로써 융합 유전자(chimeric gene)를 구축하였다.
상기 융합 유전자 GST-LOXLS355-D415는, 센스 프라이머로 5'-TTGGATCCAGCGTAGGCAGCGTGTAC-3' (서열목록 서열 16) 및 안티센스 프라이머로 5'-AAACTCGAGCATCGTAGTCGGTGGC-3' (서열목록 서열 17)를 이용한 PCR에 의해 생산된 HLOXL(hLOXL의 cDNA)의 상기 cDNA 서열을 도입함으로써 구축되었다. 상기 융합 유전자 GST-LOXG128-L212는 센스 프라이머로 5'-TCGGATCCGGCTACTCGACATCTAGAGCC-3' (서열 목록 서열 18) 및 안티센스 프라이머로 5'-GTCCTCGAGACCGTACTGGAAGTAGCC-3' (서열목록 서열 19)를 이용하여 증폭된 hLOX cDNA를 도입함으로써 구축되었다. 상기 융합 유전자 GST-LOXV228-S279는 센스 프라이머로 5'-TTGGATCCGTGCAGAAGATGTCCATGTAC-3' (서열목록 서열 20) 및 안티센스 프라이머로 5'-TTTCTCGAGGCTGGGTAAGAAATCTGATG-3' (서열목록 서열 21)를 이용하여 증폭된 상기 hLOX 서열을 도입함으로써 구축되었다. 상기 융합 유전자 GST-LOXD306-N373은 센스 프라이머로 5'-CACTATGGATCCCTTGATGCAACACCC-3' (서열목록 서열 22) 및 안티센스 프라이머로 5'-CACGACCTTTAGGATATCGTTTCCAGG-3' (서열목록 서열 23)를 이용하여 증폭된 hLOX cDNA를 도입함으로써 구축되었다. 상기 PCR에 의한 모든 증폭을 위하여, Taq polymerase High Fidelity(프랑스 메이만 로쉐 다이아그노스틱스)가 사용되었다.
토끼 다클로날 항체 뿐만 아니라 상기의 융합 단백질들 GST-LOX 및 GST-LOXL은 상기 융합 유전자 GST-LOXLS355-D415 및 GST-LOXG128-L212 의 발현으로부터 유래하는 융합 단백질들에 대해 상기한 바와 같이 얻어지고 정제되었다(Borel et al., J. Biol. Chem, 276: 48944-49, 2001; Decitre et al., Lab. Invest., 78, 143-151, 1998). 흡착실험(absorption experiments)을 위하여, 상기 항체를 상기 융합 단백질과 함께 20℃에서 3시간 동안 배양한 후 면역 탐지 전에 Hybond-ECL 막(아머샴 바이오사이언스)과 같은 나이트로셀룰로즈 막에 흡착시켰다.
이러한 작업은 무엇보다도 상기 성숙 단백질의 면역화학적 및 생화학적 특성에 의해 LOX 및 LOXL의 성숙한 형태(mature form)의 동정을 가능하게 하였으며(실 시예 2, 도 2 참조), 이런 면에서 본 발명에서 개발한 상기 항체는 LOXL의 성숙한 형태(mature form)를 인식하지 못하는 LOXL에 대한 기존의 항체와 구별된다(Decitre et al., Lab Invest 78: 143-15, 1998). 본 발명은 상기의 항-LOXLmat 항체 및 항-LOXmat 항체를 이용하여 구성되었으며, 이로 인해 상기 항-LOXLmat에 의해서는 인식되지만 항-LOXmat에 의해서는 인식되지 않는, 상기 LOXL의 성숙한 형태에 대응하는 31 kDa의 단백질의 입증이 가능하게 된다. 본 발명의 이러한 부분은 종래 기술, 특히 그 특징에 대한 정의 없이 LO 과의 유전자로부터 유래하는 모든 단백질에 대해 개시한 Csiszar 등의 특허(WO 01/83702 A2 특허: Novel members of the lysyl oxidase family of amine oxidase related application)보다 훨씬 더 진보한 부분이다.
실시예 2: 신규 항체 항-LOX 및 항-LOXL에 의한 근육 세포에서의 LOX 및 LOXL의 면역 탐지(immuno-detection)
도 2는 다음과 같이 실시된 전기영동 사진을 나타낸다. 상기 전기영동은 상기 실시예 1에서 동정된 항체 항-LOX 및 항-LOXL을 이용하여 평활근세포(smooth muscle cell: SMC)의 LOX 및 LOXL의 성숙 단백질의 특징을 입증한다.
쥐 평활근 셀라인(cell line)의 세포주(cell strain: L) 및 세포배양배지(cell culture medium: M)의 단백질은 추출된 후 항체 항-LOXLmat, 항-LOXmat, 항-LOXLpro 및 항-LOXpro를 이용한 웨스턴 블랏팅에 의해 탐지되었다. 상기 세포는 10% 우태아혈청(foetal calf serum), 2mM 글루타민 및 50㎍/mL 젠타마이신을 함유 한 DMEM 배지(시그마)에서 37℃, 5% CO2 대기조건하에 배양되었다. 상기 세포주 단백질은 PBS 버퍼로 2번 세척한 후 4℃의 라이시스 버퍼(lysis buffer; 16mM 포스페이트 버퍼, pH 8, 0.5% NP40, 프로테아제 저해제(Complete Mini, 로쉐 다이아그노스틱스), 및 유레아 6 M)에서 2시간 동안 천천히 교반하여 추출되었다. 그 상등액을 프로테아제 저해제(protease inhibitors; Complete Mini, 프랑스 메이란 로쉐 다이아그노스틱스)와 함께 pH 8의 16mM 포스페이트 버퍼 2 볼륨으로 희석한 다음 ×15,000g로 20분간 원심분리하였다. 상기 가용성 단백질은 전기영동하기 전에 10% 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid: TCA)를 가하여 침전시켰다. 상기 배지의 단백질은 혈청없이 48시간 동안 배양된 세포 배지에서 복구되었으며, 그 후 10% TCA 또는 50% 포화 암모늄 설페이트(saturated ammonium sulphate)를 가하여 침전시켰다.
면역 탐지를 위하여, 상기 단백질들을 10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해 분리시킨 다음 PVDF(polyvinylidene fluoride; Immobilon PSQ, Millipore) 막으로 전이시키고 상기한 바와 같이 면역 탐지시켰다(Borel et al, J. Biol. Chem, 276: 48944-49, 2001).
따라서, 상기 개발된 항체는 생물 조직에서 LOX 및 LOXL의 성숙 및 미성숙 형태의 특징 규명 및 위치 조사를 가능하게 한다.
실시예 3: 탄력섬유형성(elastogenesis)에서의 LOX의 역할 입증
본 발명자들은 면역 조직화학(immuno-histochemistry)에 의해 재건피부모델의 진피에서 LOX 및 LOXL 단백질이 결합조직의 형성에 관련할 수 있다는 사실을 입증하였다(도 3). 이러한 입증은 상기 두 효소, LOX 및 LOXL의 전효소 부위(pro-enzymatic regions) 및 성숙 부위(mature regions)에 대한 항-LOX 및 항-LOXL 항체 커플을 이용하여 별 문제 없이 가능하였다.
도 3은 재건 피부(reconstructed skin; RS) 및 정상 인간의 피부에서 LOXL 및 LOX를 면역-조직화학적 탐지한 결과이다:
a) 항-LOXLR231-G368(A, C, E) 또는 면역 탐지 전에 그 대응 펩티드 GST-LOXLR231-G368로 흡착된 항-LOXLR231-G368(G)를 이용하여 16일(A), 35일(C) 및 45일(E)째에 재건 피부의 LOXL(A, C, E, G)를 면역 탐지하였다.
b) 항-LOXV228-S279 (B, D, F)또는 면역 탐지 전에 그 대응 펩티드 GST-LOXV228-S279로 흡착된 항-LOXV228-S279(H)를 이용하여 16일(B), 35일(D) 및 45일(F)째에 재건 피부의 LOX(B, D, F, H)를 면역 탐지하였다.
c) 항-LOXLR231-G368(I) 및 항-LOXV228-S279(J)를 이용하여 인간의 포피에서 LOXL(I) 및 LOX(J)를 면역 탐지하였다. 진피-표피 접합부(dermal-epidermal junction) 위치는 흰색 화살로, 진피 기질의 위치는 검은색 화살로, 그리고 16일째에 각질형성세포의 위치는 검은색 화살표 머리로 표시하였다.
재건피부모델(Mimeskin®, 프랑스 리옹 꼴레띠까)은 LOX, LOXL 및 엘라스틴에 대해서는 보우인의 정착제(Bouin's fixative)에서, 또는 엘라스틴에 대해서는 10% 포르몰 용액(formol solution)에서 제조한 다음 파라핀으로 에워쌌다. 6㎛의 두꺼운 부위는 파라핀을 제거한 다음 글리신-HCl(100mmol/L)로 표백하였다. 본 실시예에서 사용된 항-LOX 및 항-LOXL 항체들은 상기와 같다.
상기 항체들은 1:500(항-LOXLR231-G368), 1:100(항-LOXV228-S279, 항-LOXLS355-D416 )의 희석액에서 사용되었다. 상기 면역 복합체는 기질로 디아미노벤지딘(diaminobenzidine; DAKO)를 사용하여 페록시다제(DAKO, Trappes, France)가 결합된 토끼(염소)의 항 IgG로 탐지되었다.
따라서 LOX 및 LOXL은 특히 Mimeskin®과 같은 재건피부모델에서 탄력섬유형성에 참여하는 후보자이다.
실시예 4: 탄력섬유형성에서 LOXL2, LOXL3 및 LOXL4의 역할 입증
본 발명은 또한 2개의 신규한 항-LOXL2 항체를 개발하였는데, 상기 항체들 중 하나는 이론적으로 LOXL3 및 LOXL4 또한 인식하는 항체이다. 이것은 재건피부모델의 진피에서 이러한 효소들이 엘라스틴과 함께 발현되는지 여부를 알 수 있게 한다. 상기 2개의 항-LOXL2 항체를 이용한 면역-조직화학적 분석은 실제로 상기 항원 뿐만 아니라 항원적으로 연결된 2개의 단백질 LOXL3 및 LOXL4가 상기 진피에서 전혀 또는 거의 발현되지 않으며, 따라서 상기 효소들이 탄력섬유형성에 참여하지 않음을 보여준다.
도 4는 항체 항-LOX2517-581(왼쪽 컬럼) 및 이론적으로 LOXL2, LOXL3 및 LOXL4를 모두 인식하는 항체 항-LOXL2664-720(오른쪽 컬럼)를 이용하여 재건피부(16일, 35일 및 45일된) 및 인간의 포피 피부 구획에서 면역 탐지한 결과를 나타낸다. 상기 항-LOXL2 항체들은 상기한 바와 같이, 융합 펩티드 GST-LOXL2에 대하여 얻어졌다(Decitre et al., Lab. Invest., 78, 143-151, 1998). 상기 융합 유전자 GST-LOXL2517-581은 상기에서 언급한 바와 같이, 상기 플라스미드에 인간의 LOXL2 유전자(hLOXL2)의 1543번 내지 1747번 서열을 도입함으로써 구축되었다.
상기 단편은 센스 프라이머로 5'-GAGCTGGGATCCGCGCACTGCC-3' 및 안티센스 프라이머로 5'-GGCTGAGTCGACGAGGCAGTTCTCC-3'를 이용하여 PCR에 의해 생산되었다.
상기 융합 유전자 GST-LOXL2664-720은 센스 프라이머 5'-CACAGGATCCGAAGGAGACATCCAGAAG-3' 및 안티센스 프라이머 5'-TTTCTGAGCTCCTGCATTTCATGATG-3'에 의해 상기 대응 hLOXL2 서열을 도입함으로써 구축되었다.
상기 융합 단백질들 및 이에 대하여 생산된 상기 항-토끼 항체들(anti-rabbit antibody)은 상기와 동일한 방법으로 제조되었다. 상기 517-580 펩티드에 대한 항체는, 상기 부위가 LOXL2에 특이적이기 때문에 항-LOXL2(anti-LOXL2)라 명명하였다.
상기 664-734 펩티드에 대한 항체는 LOXL2의 상기 부위가 LOXL3 및 LOXL4와 높은 유사성(각각 약 74.6% 및 60.5%)을 갖기 때문에 항-LOXL-R(for <<relative to>>)이라 명명하였다.
상기 16일(RS-D16), 35일(RS-D35) 및 45(RS-D45)일째의 재건피부(Mimeskin®, 프랑스 리옹 꼴레띠까) 및 인간 포피의 피부는 상기 항-LOXL2-R 및 항-LOXL2 항체를 이용한 면역조직화학에 의해 상기와 같이 분석되었다. 항-LOXL2는 표피에서는 LOXL2의 발현을 보여주었으나, 진피에서는 그렇지 않았다. 반면, LOXL2, LOXL3 및 LOXL4의 일반적인 C-말단부위에 대한 항체는 그 표피에서 이러한 효소들의 발현을 확인시켜 주었으며, 진피에서도 낮은 발현을 보여주었다. 다만, 상기 진피에서의 발현 부위는 탄력섬유형성 부위와 일치하지 않았다.
따라서, LOXL2, LOXL3 및 LOXL4는 탄력섬유형성에 관여하지 않음을 알 수 있었다.
실시예 5: 탄력섬유형성에서 LOX의 역할 입증
한편 LOXL과 LOX 간의 관계 및 다른 한편으로 LOXL 및 LOX와 탄력섬유 또는 섬유아세포 간의 관계는, 본 발명에서 투과 전자 현미경을 이용하여 명확히 입증되었다.
섬유아세포와 관련한 LOX 및 LOXL은 둘 다 엘라스틴이 축적되는 뼈대를 구성하는 반면, 콜라겐 섬유의 형성에는 오직 LOX만이 관련한다(도 5 참조).
도 5는 45일째의 재건피부 및 정상 인간의 피부의 진피 부분에서 투과 전자 현미경에 의해 LOXL, LOX 및 엘라스틴의 면역을 탐지한 결과이다.
상기 조직은 0.1% 글루타르알데히드를 함유한 PBS 버퍼에서 4% 파라포름알데히드로 4℃, 3시간 동안 고정한 다음, 0.4M 수크로즈 카코딜레이트(sucrose cacodylate) 및 0.2M 라이신을 함유한 포스페이트 버퍼로 세척하고, 에탄올 용액으로 탈수한 후, LR White(프랑스 유로메덱스)에 포함시켰다. 면역 탐지는 pH 8.2의 1% BSA(bovine serum albumin)이 첨가된 Tris-HCl 버퍼에서 1:50으로 희석된 1차 항체를 이용하여 실시되었다. 상기 면역 복합체는 1:40으로 희석된 10 및 20 nm의 콜로이드 황금 입자(colloidal gold particles; Biocell, Tebu, France)가 결합되어 있는 토끼의 항-IgG 항체를 이용하여 탐지되었다. 상기 샘플은 3% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate) 및 리드 시트레이트(lead citrate)로 염색한 후 JEOL 1200 EX 전자현미경으로 관찰되었다. 상기 면역 탐지는 재건피부(A-D) 및 인간 포피의 피부(F-I)에서 실시되었다.
재건피부에서, 이는 다음과 같은 항체: 항-LOXL(A,B), 항-LOX(C), 항-엘라스틴(Elm)(D) 및 1차 항체가 없는 음성 대조군을 이용하여 진피에서 실시되었다. 이중 라벨링(F-I)은 인간 포피의 피부에서 실시되었다.
도 5에서, A-D는 45일째의 재건피부의 진피 부분에서 전자현미경에 의해 LOXL, LOX 및 엘라스틴을 면역 탐지한 것이며, E는 45일째의, 즉 각질형성세포의 첨가 후 30일된 재건피부의 진피에서 항-엘라스틴 및 항-콜라겐 Ⅰ 항체를 이용한 양성 대조군이다. F-I는 인간 포피의 진피 부분에서 전자현미경에 의해 LOXL, LOX, 엘라스틴 및 콜라겐을 이중 면역 탐지한 것이다. 또한, G-H는 상기 토끼의 항-LOXL 항체(10nm 황금입자와 접합된) 및 쥐의 항-엘라스틴 항체(20nm 황금입자와 접합된)로 인간 포피의 진피부분에서 이중 라벨링한 것이다. 이 때, m은 섬유아세포, c는 콜라겐 섬유, e는 무정형 엘라스틴을 의미하며, 스케일 바(scale bar)는 500nm이다.
LOXL(A-B)는 치밀한 축적물(dense deposits)과 관련하여 또는 섬유아세포에서 탐지되며, 이러한 구획에서 하얗게 나타나는 콜라겐 섬유와 관련해서는 탐지되지 않는다. LOX(C)의 라벨링은, 비록 몇 개의 황금 입자가 치밀한 축적물, 섬유아세포 및 콜라겐과 함께 발견되기도 하지만, 낮게 나타난다. 상기 항-엘라스틴 항체는 동일한 치밀 축적물 및 섬유아세포에서 탐지되었다(D). 상기 재건피부모델에서 관찰한 바와 같이, LOXL은, 콜라겐 섬유와 함께 자주 나타나고 섬유아세포에서는 거의 나타나지 않는 LOX와 반대로, 콜라겐 섬유와는 관련하여 나타나지 않는다. 상기 LOXL 항원은 섬유아세포와 관련하여 또한, 인간의 포피 피부의 탄력섬유 주변에서 탐지되었다.
LOX의 라벨링은 탄력섬유에서 관찰되진 않았지만, 콜라겐 섬유 및 인간의 포피 피부의 섬유아세포(I)와 관련하여 관찰되었다.
실시예 6: LOX 발현 및 탄력섬유형성 간의 관계 입증
LOXL 및 LOX는 여전히 엘라스틴 합성이 높게 나타나는 생후 몇개월의 어린 환자로부터 채취한 포피 피부의 진피에서 발현된다. LOXL은 목, 가슴, 배 또는 얼 굴 피부의 진피에서 발현되지 않는 반면, LOX는 진피에서 항상 발현된다(도 6).
도 6은 인간의 다양한 위치의 피부에서 나타나는 LOX 및 LOXL을 면역 탐지한 결과이다.
상기 항-LOX(A, C, E, G) 및 항-LOXL(B, D, F, H) 항체들은 에두아르드 헤리엇 병원(프랑스 리옹)의 조직은행으로부터 제공받은 포피(A, B), 목(C, D) 가슴(E, F) 및 배(G, H) 피부의 샘플에서 LOX 및 LOXL의 발현을 탐지하는데 사용되었다. 상기 조직은 보우인제(Bouin's reagent)로 고정된 후, 파라핀에 포함되었으며, 상기한 바와 같이 면역 탐지를 위해 처리되었다.
도 7은 다양한 연령대에서 채취한 인간의 배부위 피부에서 나타나는 LOX 및 LOXL의 면역을 탐지한 결과이다.
그 항-LOX(A, C, E, G) 및 항-LOXL(B, D, F, H) 항체들은 에두아르드 헤리엇 병원의 조직은행으로부터 제공받은 1.5살(A, B), 35살(C, D), 60살(E, F) 및 91살(G, H)의 환자로부터 채취한 배부위 피부의 샘플에서 LOX 및 LOXL의 발현을 탐지하는데 사용되었다. 상기 조직은 보우인제(Bouin's reagent)로 고정된 후, 파라핀에 포함되었으며, 상기한 바와 같이 면역 탐지를 위해 처리되었다.
본 실험 동안, LOX 및 LOXL의 발현은 상기 인간 피부의 표피에서 높게 관찰되었으나, 91살 환자의 표피에서는 전혀 관찰되지 않아 늦은 소멸양상(late extinction)을 보여주었다(도 7).
도 8은 치료 후 다양한 기간 경과시의 흉터조직 피부에서 나타나는 LOX 및 LOXL의 면역을 탐지한 결과이다.
그 항-LOX(A, D, G), 항-엘라스틴(B, E, H) 및 항-LOXL(C, F, I) 항체들은 17살 환자의 흉터를 치료한 후 3달(D-F) 또는 5년(G-H)이 경과한 뒤 상기 흉터 주변의 목 피부 샘플에서 LOX, 엘라스틴 및 LOXL의 발현을 탐지하는데 사용되었다(정상부위 A-C). 상기 조직은 보우인제로 고정된 후, 파라핀에 포함되었으며, 상기한 바와 같이 면역 탐지를 위해 처리되었다.
상기 흉터 치료후 3달 및 5년이 경과한 경우 모두, LOXL와 LOX 둘 다 전혀 관찰할 수 없었다. 반면, 엘라스틴은 3달 경과 후에는 면역 탐지되었으며, 5년 경과후에는 탐지되지 않았다(도 8).
본 발명의 상기 실시예는 LOX가 다양한 연령대에서의 재건되지 않은 조직의 형성에는 관여하나, 흉터에서는 그 발현이 결여됨을 입증한다. 결론적으로 이는 LOX가 탄력섬유의 형성부위에 존재하며, 기능성 탄력섬유의 형성능력을 잃어버린 재건된 흉터 조직 부위에는 결여됨을 입증한다.
실시예 7: 재건피부모델에서 각질형성세포의 도입에 의한 LOX의 활성화 입증
LOX 코딩 유전자의 활성화는, 파라핀에 포함된 구획에서, 디곡시게닌으로 라벨된 이중나선 DNA 프로브를 이용한 LOX의 mRNA의 in situ 하이브리디제이션에 의해 실시된다.
도 9는 35일째의 재건피부모델, Mimeskin®을 나타낸다:
(A) LOXL의 발현은 진피 심층(deep dermis)에서, 그리고 모든 표피를 통하여 양성이다.
(B) LOX의 발현은 진피 전체를 통하여 관찰된다. 표피에서, 기저층의 세포는 LOX를 발현하지 않는 반면, 유극층 및 과립층의 세포는 이를 강하게 발현한다.
(C) 트로포엘라스틴(TE)의 발현은 진피의 섬유아세포와 관련하여 그리고 표피에서 발견된다.
(D) 유전자 COL1A1(collagen Ⅰα1)의 발현은 진피에서는 탐지되나 표피에서는 탐지되지 않는다.
(E) 프로브 없는 대조군의 결과이다.
상기 DEJ의 위치는 흰색 화살표로, 다공질의 진피 기질의 위치는 검은색 화살표로, 그리고 양성 세포는 검은색 화살표 머리로 표시하였다.
상기 이중가닥 DNA 프로브는 다음과 같은 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 생산되었다:
콜라겐 Ⅰα1 유전자에 대해서는 센스 프라이머로 5'-GTGGAGAGTACTGGATTG-3' (서열목록 서열 14) 및 안티센스 프라이머로 5'-TCGTGCAGCCATCGACAG-3' (서열목록 서열 15)를;
트로포엘라스틴에 대해서는 센스 프라이머로 5'-GTATATACCCAGGTGGCGTG-3' (서열목록 서열 10) 및 안티센스 프라이머로 5'-CGAACTTTGCTGCTGCTTTAG-3' (서열목록 서열 11)를;
hLOX에 대해서는 센스 프라이머로 5'-GGTGGCCGACCCCTACTACATCC-3' (서열목록 서열 12) 및 안티센스 프라이머로 5'-GCAAATCGCCTCTGGTAGCCATAGTC-3' (서열목록 서 열 13);
hLOXL에 대해서는 센스 프라이머로 5'-GACATAACCGACGTGCAGCC-3' (서열목록 서열 8) 및 안티센스 프라이머로 5'-ATCCACGTTCGCTCCCTGAG-3' (서열목록 서열 9)를 사용하였다.
상기 DNAs는 뉴클레오티드 표지자(labeller nucleotide)로 Taq 폴리머라제(프랑스 샤르본니에 프로메가) 및 Dig-11-dUTP(프랑스 메일란 로쉐 다이아그노스틱스)를 이용하여 증폭되었으며, QIAquick 추출 키트(프랑스 코타보우프 큐아젠)를 이용하여 아가로스 겔 전기영동 후 정제되었다. 상기 in situ 하이브리디제이션은 파라핀에 포함된 구획에서 실시되었다. 상기 샘플은 파라핀을 제거한 후 프로티네이즈(proteinase) K(Roche) 2㎍/㎖를 20℃에서 15분간 처리하였으며, 세포내 페록시다제(endogenous peroxidases)는 TSA+ 증폭 키트(NEN, Boston, USA)에 지시된 바에 따라 저해되었다. 하이브리디제이션 전 단계(pre-hybridization)는 50% Denhardt's 용액, 2×SSC(sodium salt citrate), 5mM EDTA, 2.5×Denhardt's 용액, 200㎍/㎖ 디네이쳐드 헤링 DNA(denatured herring DNA), 1㎎/㎖ 살몬 스펌 DNA(salmon sperm DNA), 및 10㎎/㎖ tRNA와 함께 pH 7.4의 20mM 포스페이트 버퍼에서 37℃, 2시간 동안 수행되었다. 하이브리디제이션은 50% 데이오니세드 포름아마이드(deionised formamide), 2×SSC, 5mM EDTA, 2.5×Denhardt's 용액, 200㎍/㎖ 디네이쳐드 헤링 스펌 DNA(denatured herring sperm DNA), 10% 덱스트란 설페이트(dextran sulfate)와 함께, 그리고 보일링 워터 배스(boiling water bath)에서 5분 간 미리 변성시킨 프로브를 첨가 또는 첨가없이, 20mM 포스페이트 버퍼에서 37℃, 16시간 동안 수행되었다. 하이브리디제이션 후, 상기 구획은 2×SSC/50% 포름아마이드, 1×SSC/50% 포름아마이드, 1×SSC, 및 0.5×SSC로 20℃에서(또는 콜라겐에 대해서는 37℃에서) 세척되었다. 탈수 후, 디곡시게닌으로 라벨된 하이브리드는 호르세라디쉬 페록시다제(horseradish peroxidase; 로쉐)와 접합된 항-DIG 항체를 이용하여 탐지되었으며, 상기 복합체의 마지막 탐지는 TSA+ 증폭 키트(NEN)을 이용하여 수행되었다. 그 양성 시그널(positive signals)는 대기온도(ambient temperature)에서 2시간의 활성화 후, 상기 TSA 키트의 증폭과정에 연결된 알칼린 포스페테이즈(alkaline phosphatase)의 활성화와 상응하며, 니트로 블루 테트라졸리움/브로모클로릴린돌로포스페이트(Nitro Blue Tetrazolium/bromochlorylindolophosphate:NBT/BCIP) 기질을 이용하여 형성된 테트라졸리움 염 침전에 의해 밝혀졌다.
본 발명은 in situ 하이브리디제이션에 의해 상기 LOXL 및 LOX 유전자의 mRNA 발현을 추적함으로써, 상기 유전자들이 재건피부모델(Mimkskin®, 프랑스 리옹 꼴레띠까)에서 각질형성세포의 첨가에 의해 활성화될 수 있음을 입증한다(도 9).
또한, 상기 LOX 유전자는 상기 각질형성세포의 첨가 후 상기 콜라겐 Ⅰα1 유전자와 동시에 활성화된다.
실시예 8: 나이든 성인의 섬유아세포에서 LOX 유전자 발현수준의 하락 입증
본 발명자들은 본 실험을 위하여 어린 유아 유래의 포피(FF)로부터 5개의 섬유아세포주를, 그리고 성형외과로부터 제공받은 성인(AF, 평균 20살 3명, 평균 60살 3명) 유래의 배부위로부터 6개의 섬유아세포주를 사용하였다.
상기 3 종류의 목적 유전자의 발현 뿐만 아니라 액틴의 발현 또한 실시간 RT-PCR(역전사효소연쇄중합반응, 도 10)에 의해 분석되었다. 상기 기술은 유전자의 발현을 항상 일정한 것으로 여겨지는 액틴의 발현과 비교하여 정확히 정량하는 것을 가능하게 한다. 따라서 상기 유전자 발현수준의 조절을 정량할 수 있다.
도 10은 노화하는 동안 엘라스틴, LOX 및 LOXL 유전자들의 발현 전개 모습을 보여준다. 이는 상기 포피 및 성인의 섬유아세포에서 LOX, LOXL 및 엘라스틴의 발현수준을 리얼 타임 RT-PCR 분석하여 얻은 결과이다. 상기 결과는 5개의 FF 및 6개의 AF에서 각 유전자의 발현 평균치를 나타낸다. 상기 RT-PCR 수치는 액틴의 증폭수치와 비교되었다. 만약 엘라스틴 유전자의 발현이 노화하는 동안 저해되지 않더라도, LOX의 발현은 20세 때에 비하여 40% 까지 떨어진다는 점을 주목해야 한다. 이러한 데이터 결과는 엘라스틴에 대한 문헌 내용, 즉 만약 탄력조직이 악화된 후 교체되지 않더라도, 이는 엘라스틴 유전자의 활성저해 때문이 아니라는 내용과 일치하는 것이다.
총 RNA는 SV 96Total RNA 분리 시스템 키트(프랑스 샤르본니에 프로메가)를 이용하여 정제되었다. 상기 정제된 RNAs는 100㎕의 RNase-free water(프랑스 샤르본니에 프로메가)에서 용해되며, 96 웰 플레이트에서 결정되고 배치된다(10㎕ 총 RNA at 5ng/㎕ by PCR). 상기 작업을 수행하기 위하여 선택된 프라이머는 다음과 같으며, 이를 하기 표 1에 나타내었다.
유전자 이름 크기(뉴클레오티드) 인간의 염기서열 인간 유전자에서의 위치 녹는점(MT)
ELN 1 Ela 2 Ela 20 21 GTA TAT ACC CAT GTG GCG TG CGA ACT TTG CTG CTG CTT TAG 센스:+443 안티센스:+799 62℃ 62℃
LOX Ox 64 Ox 65 21 21 ACG TAC GTG CAG AAG ATG TCC GGC TGG GTA AGA AAT CTG ATG 센스:+676 안티센스:+841 60℃ 59℃
LOXL* 30 L1 30 L2 19 20 GAC TTC GGC AAC CTC AAG C TGT TGC AGA AAC GTA GCG AC 센스:+1480 안티센스: +1701 60℃ 60℃
ACTIN Actin Actin 20 24 GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC U 센스 D 안티센스 72℃ 57℃
*서열목록 서열 28에 기재된 30L1 및 서열목록 서열 29에 기재된 30L2와 함께.
상기 실시간 RT-PCR 기술은, DNA 증폭기기인 OPTICON thermocycler에서, mRNA를 함유하는 웰에 대해 Quanti Tect SYBR Green RT-PCR 키트(프랑스 큐아젠)를 이용하여 수행되었다. 역전사(RT)는 50℃에서 30분간 수행되었으며, 역전사 효소를 저해하고, 폴리머라제를 활성화하고, 얻어진 상보적 DNA(cDNA)를 변성시키기 위해 95℃에서 15분간 연속되었다. 중합반응 사이클은 94℃에서 15초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초로 50회 실시되었다. 모든 사이클의 끝에서, 증폭된 단편 수에 비례하는 형광값이 나타난다. 발현수준은 액틴에 대한 각 유전자의 발현율에 의해 정해진다.
상기 실시예는 유전자 LOXL 및 LOX의 생산물이 유전자 수준에서 활성화될 수 있음을 보여준다. LOX를 코딩하는 유전자의 활성화는 교차결합된 콜라겐 섬유의 형성을 가능하게 한다. 활성물질의 스크리닝은 교차결합된 콜라겐의 합성을 촉진함과 동시에 엘라스틴의 무정형적인 축적의 형성을 방지하고 병리적인 조직에서 정상 조직의 발현을 재유도할 수 있도록, LOX의 발현 증가 및 이와 동시에 또는 그렇지 않더라도 엘라스틴의 발현 감소 또한 유도할 수 있는 물질의 동정을 가능하게 한다.
실시예 9: 실험대상인 활성물질의 접촉 또는 접촉없이 양적 RT-PCR에 의한 LOX 및/또는 엘라스틴의 mRNAs 발현 분석.
상기 활성물질은 정상 인간의 피부(건강한 나이든 성인으로부터 유래한)의 섬유아세포에 대해 1%(v/v)에서 테스트되었다. 배양은 예를 들어, 혈청이 포함되지 않은 단순배지(Fibroblast Basal Medium, 독일 프로모셀), 24-웰 세포배양판의 단층(monolayer)에서 수행되었다. 상기 세포는 예를 들어 40,000개/cm2로 접종하였다. 컨플루언스(confluence)에서, 상기 세포는 24시간 동안 상기 활성물질과 접촉하도록 한다. 동시에, 처리되지 않은 대조군(단독 배지) 및 3개의 양성 대조군(1ng/mL로 접종한 TGF-β, 50pg/mL로 접종한 IL-1α, 및 2%(v/v)로 접종한 Phytokine®(프랑스 꼴레띠까))도 같은 세포배양판에서 실시한다.
상기 1ng/mL로 접종한 TGF-β 및 50pg/mL로 접종한 IL-1α는 미리 테스트되었고, 상기 농도에서 상기 2개의 사이토카인에 의해 유도된 엘라스틴 mRNA의 합성 촉진은 예를 들어 양적 RT-PCR(×10 for TGF-β 및 ×6 for IL-1α)에 의한 상기 mRNAs의 분석에 의해 확인되었다. 상기 활성물질 및 세포와의 접촉시간, 예를 들어 24시간의 접촉 후, 상기 배지는 제거하였으며, 상기 세포는 pH 7.4의 포스페이트 버퍼에서 린스한 다음 -80℃에서 동결건조하였다. 상기 총 RNAs는 실리카 컬럼의 96-웰에서 추출 키트를 이용하여 추출하였고, 260nm에서 96-웰 분광광도계를 이용하여 확인하였다(순도 표준: 단백질 확인은 280nm). 상기 RNAs는 5ng/㎕로 희석되었다. 첫번째 단계에서의 정량적 RT-PCR은 96-웰 플레이트에서, 액틴, 엘라스틴 및 LOX의 유전자에 대해 initial RNA 50ng로 수행되었다. 각 유전자에 대한 특이적 프라이머는 다음과 같고, 0.5μM에서 사용되었다:
a) 엘라스틴 유전자
- 센스: 1Ela 5'-GTA TAT ACC CAG GTG GCG TG-3' (서열목록 서열 26),
- 안티센스: 2Ela 5'-CTA ACT TTG CTG CTG CTT TAG-3' (서열목록 서열 27);
b) LOX 유전자
- 센스: Ox64 5'-ACG TAC GTG CAG AAG ATG TCC-3' (서열목록 서열 24),
- 안티센스: Ox65 5'-GGC TGG GTA AGA AAT CTG ATG-3' (서열목록 서열 25);
c) 액틴 유전자
- 센스: Actin U 5'-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3' (서열목록 서열 30),
- 안티센스: Actin D 5'-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3' (서열목록 서열 31).
증폭 조건은 다음과 같다: a) 액틴에 대해서는 48℃, 30분; 94℃, 2분; (94℃, 30초; 60℃, 30초; 68℃, 30초) 조건으로 28회, b) LOX 에 대해서는 32회, 또는 c) 엘라스틴에 대해서는 68℃, 10분; 14℃, 무한정의 조건으로 34회.
증폭 후, 그 산물은 예를 들어 액틴 증폭 산물 3㎕ + 엘라스틴 유전자 증폭 산물 5㎕ + LOX 유전자 증폭 산물 5㎕의 비율로 혼합하였다. 로딩 버퍼를 2㎕ 첨가한 후, 총부피 20㎕를 미리 부어놓은 아가로스 겔에, 예를 들어 2% 수준으로 침전시켰다. 본 발명자들은 당업계에서 이미 알려져 있는 수단을 이용하여 그 발현수준을 시각화하였는데, 예를 들어, 상기 샘플의 밴드를 이동시킨 후 블랙 챔버에서 UV에 노출시켜 디지털 사진을 찍었다. 상기 겔 사진은 이미지 분석하였으며, 그 밴드의 세기를 정량분석하였다(Phoretix1D Quantifier, Non Linear Dynamics Ltd, USA). 엘라스틴 유전자 및 LOX 유전자의 발현수준은 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군에서의 발현수준을 기준으로 하여 그 변화량을 퍼센티지로 표시하였다.
결과의 해석:
노화된 세포가, 엘라스틴을 코딩하는 mRNA는 어린 세포에서 발현되는 것과 대체로 동일한 양을 발현하는 것과 달리, LOX를 코딩하는 mRNA는 현저히 적게 발현(-40%)한다는 사실은 주목되어야 한다. 따라서 노화된 세포에서 이러한 LOX의 발현 감소를 역전시키는 것이 가능하며, 이러한 관점에서 활성물질의 스크리닝이 수행되었다.
활성물질의 스크리닝:
각 실험의 cDNA 양은 액틴 cDNA의 양과 비교되었고, 그 후 활성물질이 없는 음성 대조군과 비교되었다. 예비 분석은 LOX mRNA의 약 2배 증가 및 엘라스틴(Eln) mRNA의 약 0.5배 증가를 나타내는 상기 실험들이 유의한 것이라고 생각하게 한다. 실험대상이 된 900개 이상의 분자물질 또는 활성 추출물 중, 8개의 활성물질이 실 험 농도 및 제한된 조건 하에서 이러한 기준을 만족시킨다. 상기 활성물질들은 다음과 같고, 이를 하기 표 2에 나타내었다.
이름 엘라스틴(Eln)/대조군 LOX/대조군
폴리페놀(polyphenols) 0.50 2.34
갈레가 식물(Galega plant) 0.30 2.38
포화지방산 0.38 2.70
자일리톨(Xylitol) 0.27 3.10
검 아드라간트(Gum adragant) 0.33 4.10
카르다몬(Cardamon) 0.36 2.64
보리 0.31 4.65
귀리 0.38 9.69
상기 식물 추출물들은 에탄올, 글리세롤, 부틸렌 글리콜 및 다른 글리콜들, 자일리톨 등과 같은 물/(알콜, 글리콜 또는 폴리올)의 100/0 내지 0/100 혼합물에 상기 식물들을 2-5%(w/w)로 흠뻑 적셔 추출한 다음, 그 추출물을 여과하거나, 가용성 부분을 회복하도록 증류한 후 무균 여과함으로써 제조하였다. 상기 화학 분자물질들은 Sigma 사(Saint-Louis, USA)에서 구입하였으며, 이를 알콜 또는 글리콜에 1%로 희석하여 사용하였다.
결론: 960개의 후보 활성물질 중 8개의 활성물질이, 나이든 성인의 배 부위의 섬유아세포에서 일정 조건 하에 유의하게 LOX 코딩 유전자의 mRNA의 합성 수준을 활성화시키고 엘라스틴 코딩 유전자의 mRNA의 합성을 감소시킬 수 있다.
실시예 10: 예를 들어 리얼 타임 RT-PCR(real time RT-PCR)에 의한 화장료 또는 피부약제용(dermopharmaceutical) 활성물질의 유효성 연구
스크리닝의 첫번째 단계 후 선택된 상기 활성물질들을 정상 인간, 즉 성인 피부의 섬유아세포에서 0.001%(v/v) 내지 5%(v/v) 사이의 다양한 농도로 실험하였다. 배양은 예를 들어, 혈청이 포함되지 않은 단순배지(Fibroblast Basal Medium, 독일 프로모셀), 24-웰 세포배양판의 단일층에서 수행되었다. 상기 세포는 예를 들어 40,000개/cm2로 접종하였다. 상기 활성물질을 상기 배양세포와 24시간 접촉시킨 후, 상기 배지를 제거하고, 상기 세포는 pH 7.4의 포스페이트 버퍼에서 린스한 다음 -80℃에서 동결건조하였다. 실험 끝부분에서, 엘라스틴, LOX 및 액틴의 mRNAs 함량을 예를 들어 리얼 타임 RT-PCR(real time RT-PCR)과 같은 mRNA 분석 기술에 의해 확인하였다. 이 때, 상기 유전자들의 특이적 단편의 증폭을 가능하게 하는 프라이머의 조합은 상기 실시예 9에 기재한 것과 동일한 것을 사용하였다.
그 총 RNAs를 실리카 컬럼의 96-웰에서 추출 키트를 이용하여 추출하고, 260nm에서 96-웰 분광광도계를 이용하여 확인한 후, 5ng/㎕로 희석하였다. RT-PCR(Reverse Polymerase Transcription Chain Reactions) 반응은 "Opticon" 시스템(MJ Research, USA)의 도움을 받아 양적 실시간 RT-PCR(quantitative real time RT-PCR)에 의해 실시하였다. 이 때, 상기 웰에 도입된 반응 혼합물(50㎕)은 각 샘플에 대하여 다음과 같다:
- 5 ng/㎕의 농도에서 RNA 10㎕,
- 얻고자 하는 다양한 라벨의 특이적 프라이머,
- 반응 혼합물(Qiagen - 25㎕ 2×QuantiTect SYBR Green RT-PCR master mix containing 5mM MgCl2 + 0.5㎕ QuantiTect RT mix), 신장 단계(elongation step)에 서 이중나선 DNA에 삽입하는 label SYBR Green Ⅰ.
상기 RT-PCR 조건은 다음과 같다:
역전사: 50℃에서 30분, 그 다음 95℃에서 15분,
PCR 반응: [94℃ 15초, 60℃ 30초 및 72℃ 30초, 50 사이클].
오염 여부 및 상기 증폭 산물의 순도는 상기 증폭 PCR 산물의 융합 커브(fusion curve)에 의해 확인하였으며, 그 결과 더블 피크 또는 비정상적인 융합 온도를 나타내는 산물은 제거하였다.
분석 및 계산방법:
상기 증폭된 DNA 안으로의 형광물질의 혼합을 상기 PCR 사이클 동안 계속해서 평가하였다. 이러한 시스템은 PCR 사이클의 횟수에 따라 형광성 측정 곡선을 얻을 수 있게 하고, 그로 인해 증폭된 DNA의 상대적인 양을 평가할 수 있게 한다.
현존하는 세포군집을 고려하기 위하여, 상기의 모든 결과는 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)로 사용된 액틴 시그널과 비교하였다. 상기 실험에 따라, C(T)(=Cycle Threshold) 측정의 임계값은 0.05와 0.01 사이에 고정되었으며, 임의 측정 단위(arbitrary measurement unit)는 하기 공식에 따라 각 유전자에 대해 계산되었다:
S유전자 (×) = 107×(1/2)C(T)유전자 (×)
상기 유전자 (×)의 0.01-0.05의 형광 임계값(fluorescence threshold)를 얻는데 필요한 사이클의 횟수를 인식하는 C (T)유전자 (×).
목적 유전자의 수치는 비율 계산에 의해 액틴 시그널의 것과 비교되었다:
R = S유전자 (×) / S액틴.
이러한 비율은 처리된 샘플과 처리되지 않은 샘플간에 비교되었으며, 상기 (×)는 LOX 유전자 또는 엘라스틴 유전자이다.
결과: 상기 선택된 활성물질 가운데 2개의 물질에 대해 얻은 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
이름 LOX/대조군 Eln/대조군
카르다몬 0.001% 1.38* 0.67*
카르다몬 0.01% 1.48* 0.69*
카르다몬 0.1% 1.63* 0.64*
카르다몬 1% 1.64* 0.26*
카르다몬 5% 2.06* 0.41*
귀리 0.001% 1.41 1.17
귀리 0.01% 2.06 0.76
귀리 0.1% 1.84* 0.97
귀리 1% 2.25* 0.81
귀리 5% 1.40 0.39*
* p<0.05수준에서 통계학적으로 유의한 결과(One Way test Anova/Bonferroni)
결론: 카르다몬 추출물은 모든 농도에서 유의적으로 LOX를 촉진하며 모든 농도에서 엘라스틴(Eln)을 저해한다. 반면, 귀리 추출물은 0.1% 및 1% 농도에서 LOX를 유의적으로 촉진하며, 5% 농도에서 엘라스틴(Eln)을 유의적으로 저해한다.
실시예 11: 흉터 조직 부위 유래의 세포에서 활성물질들을 상기 세포와 접촉 또는 접촉하게 함이 없이 양적 RT-PCR에 의한 LOX 및/또는 엘라스틴의 mRNAs의 발현 분석
상기 활성물질들을 1% 농도로 덜 성숙한 때(premature passage: lower than 5 passages)의 인간 흉터조직 피부의 섬유아세포(제왕절개 후 이상발달한 흉터의 외과적 회복)에서 실험하였다. 배양은 예를 들어, 혈청이 포함되지 않은 단순배지(Fibroblast Basal Medium, 독일 프로모셀), 24-웰 세포배양판의 단층(monolayer)에서 수행되었다. 상기 세포는 예를 들어 40,000개/cm2로 접종하였다. 컨플루언스에서, 상기 세포는 24시간 동안 상기 활성물질과 접촉하도록 하였다. 동시에, 처리되지 않은 대조군(단독 배지) 및 3개의 양성 대조군(1ng/mL로 접종한 TGF-β, 50pg/mL로 접종한 IL-1α, 및 2%(v/v)로 접종한 Phytokine®(프랑스 꼴레띠까))도 같은 세포배양판에서 실시하였다. 상기 1ng/mL로 접종한 TGF-β 및 50pg/mL로 접종한 IL-1α는 미리 테스트되었고, 상기 농도에서 상기 2개의 사이토카인에 의해 유도된 엘라스틴 mRNA의 합성 촉진은 예를 들어 양적 RT-PCR(×10 for TGF-β 및 ×6 for IL-1α)에 의한 상기 mRNAs의 분석에 의해 확인되었다. 상기 활성물질 및 세포와의 접촉시간, 예를 들어 24시간의 접촉 후, 상기 배지는 제거하였으며, 상기 세포는 pH 7.4의 포스페이트 버퍼에서 린스한 다음 -80℃에서 동결건조하였다. 상기 총 RNAs는 실리카 컬럼의 96-웰에서 추출 키트를 이용하여 추출하였고, 260nm에서 96-웰 분광광도계를 이용하여 확인하였다(순도 표준: 단백질 확인은 280nm). 상기 RNAs는 5ng/㎕로 희석되었다. 첫번째 단계에서의 양적 RT-PCR은 96-웰 플레이트에 서, 액틴, 엘라스틴 및 LOX의 유전자에 대해 initial RNA 50ng로 수행되었다. 각 유전자에 대한 특이적 프라이머는 다음과 같고, 0.5μM에서 사용되었다:
COLL1 센스: 5'-CAG AGG GAA GCC GCA AGA-3'
COLL1 안티센스: 5'-CTG GCC GCC ATA CTC GAA C-3'
LOX 센스: 5'-ACG TAC GTG CAG AAG ATG TCC-3'
LOX 안티센스: 5'-GGC TGG GTA AGA AAT CTG ATG-3'
Actin 센스: 5'-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3'
Actin 안티센스: 5'-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3'
증폭 조건은 다음과 같다: a) 액틴에 대해서는 50℃, 30분; 94℃, 2분; (94℃, 30초; 60℃, 30초; 68℃, 30초) 조건으로 28 사이클, b) COLL1 에 대해서는 26사이클, c) LOX에 대해서는 32사이클:72℃, 10분; 14℃에서 무한정
증폭 후, 그 산물은 예를 들어 액틴 증폭 산물 3㎕ + 콜라겐 Ⅰ 유전자 증폭 산물 5㎕ + LOX 유전자 증폭 산물 5㎕의 비율로 혼합하였다. 로딩 버퍼를 2㎕ 첨가한 후, 총부피 20㎕를 미리 부어놓은 아가로우즈 젤에, 예를 들어 2% 수준으로 침전시켰다. 본 발명자들은 당업계에서 이미 알려져 있는 수단을 이용하여 그 발현수준을 시각화하였는데, 예를 들어, 상기 샘플의 밴드를 이동시킨 후 블랙 챔버에서 UV에 노출시켜 디지털 사진을 찍었다. 상기 겔 사진은 이미지 분석하였으며, 그 밴 드의 세기를 정량분석하였다(Phoretix1D Quantifier, Non Linear Dynamics Ltd, USA). 콜라겐 Ⅰ 유전자 및 LOX 유전자의 발현수준은 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군에서의 발현수준을 기준으로 하여 그 변화량을 퍼센티지로 표시하였고, 양성 대조군에서 얻은 결과와 비교하였다.
상기 선택된 활성물질은 LOX mRNA의 발현은 약 2배로 증가시키고, COLL1 mRNA의 발현은 정상적이거나 감소된 모습을 보여준다. 900개 이상의 활성분자 또는 추출물 중, 귀리의 추출물이 특히 이러한 조건을 양성적으로 만족시킨다.
당업자는 상기 실시예 12 내지 16으로부터 본 발명의 다양한 조성물(제제)을 제조하기 위한 적절한 방법을 알 수 있을 것이다.
실시예 12: 수중유형(oil-in water) 에멀젼 타입의 화장료 또는 약제학적 제제를 위한 본 발명의 생산물의 이용
제제 12a:
(A) 물 qsp 10
부틸렌 글리콜 2
글리세린 3
소듐 디하이드록시세틸(Sodium Dihydroxycetyl) 2
포스페이트,
이소프로필 하이드록시세틸 에테르(Isopropyl Hydroxycetyl Ether)
(B) 글리콜 스티레이트(Glycol Sterate) SE 14
트리이소노나오인(Triisononaoin) 5
옥틸 코코에이트(Octyl Cocoate) 6
(C) 부틸렌 글리콜, 2
메틸파라벤(Methylparaben),
에틸파라벤(Ethylparaben), 프로필파라벤(Propylparaben),
pH 5.5로 조정
(D) 본 발명의 생산물 0.01-10%
제제 12b:
(A) 물 qsp 100
부틸렌 글리콜 2
글리세린 3
폴리아크릴아마이드, 이소파라핀, 2.8
라우레드-7
(B) 부틸렌 글리콜, 2
메틸파라벤,
에틸파라벤, 프로필파라벤; 2
페녹시에탄올,
메틸파라벤,
프로필파라벤, 부틸파라벤,
에틸파라벤 0.5
부틸렌 글리콜
(D) 본 발명의 생산물 0.01-10%
제제 12c:
(A) 카르보머(Carbomer) 0.50
프로필렌 글리콜 3
글리세롤 5
물 qsp 100
(B) 옥틸 코코에이트(Octyl Cocoate) 5
비사볼롤(Bisabolol) 0.30
디메티콘(Dimethicone) 0.30
(C) 수산화 나트륨(Sodium Hydroxide) 1.60
(D) 페녹시에탄올(Phenoxyethanol), 0.50
메틸파라벤,
프로필파라벤, 부틸파라벤,
에틸파라벤
(E) 향료 0.30
(F) 본 발명의 생산물 0.01-10%
실시예 13: 유중수형(water-in-oil) 타입의 제제를 위한 본 발명 생산물의 이용
(A) PEG 30- 3
디폴리하이드록시스티레이트(Dipolyhydroxystearate)
카프릭 트리글리세라이드(Capric Triglycerides) 3
세터릴 옥타노에이트(Cetearyl Octanoate) 4
디부틸 아디페이트(Dibutyl Adipate) 3
포도씨 오일(Grape seed oil) 1.5
호호바 오일(Jojoba oil) 1.5
페녹시에탄올(phenoxyethanol), 0.5
메틸파라벤,
프로필파라벤, 부틸파라벤,
에틸파라벤
(B) 글리세린 3
부틸렌 글리콜 3
황산 마그네슘 0.5
EDTA 0.05
물 qsp 100
(C) 사이클로메티콘(Cyclomethicone) 1
디메티콘(Dimethicone) 1
(D) 향료 0.3
(E) 본 발명의 생산물 0.01-10%
실시예 14: 샴푸 또는 샤워 젤 타입의 제제를 위한 본 발명 생산물의 이용
(A) 잔탄검(Xantham Gum) 0.8
물 qsp 100
(B) 부틸렌 글리콜, 0.5
메틸파라벤,
에틸파라벤, 프로필파라벤
페녹시에탄올, 0.5
메틸파라벤,
프로필파라벤, 부틸파라벤,
에틸파라벤
(C) 시트르산 0.8
(D) 소듐 라우레드 설페이트(Sodium Laureth Sulphate) 40.0
(E) 본 발명 생산물 0.01-10%
실시예 15: 립스틱 및 다른 무수제품(anhydrous product) 타입의 제제를 위한 본 발명 생산물의 이용
(A) 미네랄 왁스 17.0
이소스티릴 이소스티레이트 31.5
(Isostearyl Isostearate)
프로필렌 글리콜 디펠라르고네이트 2.6
(Propylene Glycol Dipelargenate)
프로필렌 글리콜 이소스티레이트 1.7
(Propylene Glycol Isostearate)
PEG 8 비즈왁스(Beeswax) 3.0
하이드로지네이티드 야자 커넬 오일 3.4
(Hydrogenated Palm Kernel Oil),
하이드로지네이티드 야자 글리세라이드
(Hydrogenated Palm Glycerides)
라놀린 오일(lanolin oil) 3.4
세사메 오일(sesame oil) 1.7
세틸 락테이트(cetyl lactate) 1.7
미네랄 오일, 라놀린 알콜 3.0
(B) 카스토르 오일(Castor Oil) qsp 100
이산화 티타늄(Titanium Dioxide) 3.9
CI 15850:1 0.616
CI 45410:1 0.256
CI 19140:1 0.048
CI 77491 2.048
(C) 본 발명 생산물 0.01-5%
실시예 16: 수성 젤(aqueous gels; 아이라이너, 슬리머 등)의 제제를 위한 본 발명 생산물의 이용
(A) 물 qsp 100
카르보머(Carbomer) 0.5
부틸렌 글리콜 15
페녹시에탄올, 메틸파라벤, 0.5
프로필파라벤, 부틸파라벤, 에틸파라벤
(B) 본 발명 생산물 0.01-10%
실시예 17: LOX를 함유하는 약제학적 제제의 제조
제제 17a: 정제(tablet)의 제조
(A) 부형제(Excipient) In g, per tablet
락토즈 0.359
수크로즈 0.240
(B) LOX* 추출물 0.001-0.1
* 실시예 2에 기재된 추출방법에 따라 추출된 후 건조의 단계를 거친 LOX 추출물
제제 17b: 연고의 제조
(A) 부형제(Excipient)
저밀도 폴리에틸렌(Low density polyethylene) 5.5
파라핀 용액(Liquid paraffin) qsp 100
(B) LOX* 추출물 0.001-1.0
* 실시예 2에 기재된 추출방법에 따라 추출된 후, 선택적으로 건조의 단계를 거친 LOX 추출물
제제 17c: 주입가능한 제제(injectable formula)의 제조
(A) 부형제(Excipient)
등장식염수(Saline isotonic solution) 5 mL
(B) LOX* 추출물 0.001-0.1g
* 실시예 2에 기재된 추출방법에 따라 추출된 후, 건조의 단계를 거친 LOX 추출물
A 상태(phase) 및 B 상태는 각각의 앰플에 포장되고 사용전에 혼합된다.
실시예 18: 본 발명의 목적물을 함유하는 조제물의 화장품 적합여부 평가
독성 테스트는 0.5% 잔탄검(xanthan gum) 안에 상기 실시예 9 내지 11에 따라 얻어진 혼합물을 10% 농도로 혼합한 후, 토끼에서의 눈자극 평가(ocular evaluation), 쥐에서의 1회 경구투여에 의한 이상 독성의 발생 연구, 그리고 기니 피그(guinea pig)에서의 감작성(sensitizing power) 연구에 의해 수행되었다.
토끼에서 피부의 1차 자극 평가
상기에서 제조한 조제물을 희석하지 않은 채 "the acute irritant/corrosive effect on the skin" 연구와 관련하여 OECD에 의해 권장되는 방법에 따라 3마리 토끼의 피부에 0.5 mL씩 적용하였다.
상기 제품은 JORF(Official Journal of the French Republic)의 21/02/82에서 발행된 Decision 1/2/1982에서 정한 기준에 따라 분류된다.
상기 실험 결과, 상기 실시예 11에 따라 얻어진 혼합물을 함유하는 조제물이 피부에 무자극적인(non-irritant) 것으로 분류되었다.
토끼에서의 눈자극 평가
상기에서 제조한 조제물을, "the acute irritant/corrosive effect on the eyes" 연구와 관련하여 1987년 2월 24일자로 공개된 OECD NO. 405의 지침에 의해 권장되는 방법에 따라, 3마리 토끼의 눈에 그 자체로(희석하지 않고) 0.1 mL 정도씩 1회 떨어뜨렸다.
실험 결과, 상기 조제물은 희석하지 않고 사용하더라도 지침 91/326 EEC의 관점에서 비자극적인 것으로 판단되었다.
쥐에서의 1회 경구투여에 의한 이상독성 여부의 발생실험
상기에서 제조한 조제물을 1987년 2월 24일자로 공개된 OECD NO. 401의 지침에서 권장되는 프로토콜에 따라 5마리의 수컷 쥐와 5마리의 암컷 쥐에게 5g/Kg의 양으로 1회 경구투여하였으며, 화장품에 적용시켰다.
LD0 및 LD50을 측정한 결과, 그 값이 5,000mg/Kg 이상으로 관찰되었다. 따라서, 상기 실험 조제물은 섭취하더라도 위험하지 않은 것으로 분류되었다.
기니피그(guinea pig)에서의 피부 감작성 측정
상기에서 제조한 조제물을 이용하여 OECD의 NO. 406의 지침라인과 일치하는 Magnusson 및 Kligmann의 프로토콜에 따라 감작성 시험(maximization test)을 실시하였다.
그 결과, 상기 조제물은 피부와의 접촉에 대해 민감성이 없는 것으로 분류되었다.
본 발명에서 사용된 서열에 대해 자세히 설명하면 다음과 같다:
서열목록 서열 1: 인간의 LOX 단백질의 펩티드 서열이다.
서열목록 서열 2: 서열목록 서열 1로 표시되는 인간의 LOX 단백질을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 염기서열이다.
서열목록 서열 3: 인간의 트로포엘라스틴 단백질의 펩티드 서열이다.
서열목록 서열 4: 인간의 엘라스틴 단백질을 코딩하는 인간 유전자의 프로모터(ATG로부터 -2171 위쪽으로부터의 염기쌍)를 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드의 염기서열이다.
서열목록 서열 5: 서열목록 서열 3으로표시되는 인간의 트로포엘라스틴 단백질을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 염기서열이다.
서열목록 서열 6: 인간의 LOXL 단백질의 펩티드 서열이다.
서열목록 서열 7: 서열목록 서열 6으로 표시되는 인간 LOXL 단백질을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 염기서열이다.
이중가닥 DNA 프로브를 위하여:
서열목록 서열 8: 서열목록 서열 6으로 표시되는 인간의 LOXL 단백질을 코딩하는 DNA의 센스 프라이머이다.
서열목록 서열 9: 서열목록 서열 6으로 표시되는 인간의 LOXL 단백질을 코딩하는 DNA의 안티센스 프라이머이다.
서열목록 서열 10: 서열목록 서열 3으로 표시되는 인간의 트로포엘라스틴 단백질을 코딩하는 DNA의 센스 프라이머이다.
서열목록 서열 11: 서열목록 서열 3으로 표시되는 인간의 트로포엘라스틴 단백질을 코딩하는 DNA의 안티센스 프라이머이다.
서열목록 서열 12: 서열목록 서열 1로 표시되는 인간의 LOX 단백질을 코딩하는 DNA의 센스 프라이머이다.
서열목록 서열 13: 서열목록 서열 1로 표시되는 인간의 LOX 단백질을 코딩하는 DNA의 안티센스 프라이머이다.
서열목록 서열 14: 인간의 콜라겐Ⅰα1L 단백질을 코딩하는 DNA의 센스 프라 이머이다.
서열목록 서열 15: 인간의 콜라겐Ⅰα1L 단백질을 코딩하는 DNA의 안티센스 프라이머이다.
GST 융합 유전자를 위하여:
서열목록 서열 16: 융합 유전자 GST S355-D415의 DNA의 센스 프라이머이다.
서열목록 서열 17: 융합 유전자 GST S355-D415의 DNA의 안티센스 프라이머이다.
서열목록 서열 18: 융합 유전자 GST G128-L212의 DNA의 센스 프라이머이다.
서열목록 서열 19: 융합 유전자 GST G128-L212의 DNA의 안티센스 프라이머이다.
서열목록 서열 20: 융합 유전자 GST V228-S279의 DNA의 센스 프라이머이다.
서열목록 서열 21: 융합 유전자 GST V228-S279의 DNA의 안티센스 프라이머이다.
서열목록 서열 22: 융합 유전자 GST D306-N373의 DNA의 센스 프라이머이다.
서열목록 서열 23: 융합 유전자 GST D306-N373의 DNA의 안티센스 프라이머이다.
PCR 프라이머를 위하여:
서열목록 서열 24: 서열목록 서열 1로 표시되는 인간의 LOX 단백질을 코딩하는 mRNA의 RT-PCR을 위한 센스 프라이머이다.
서열목록 서열 25: 서열목록 서열 1로 표시되는 인간의 LOX 단백질을 코딩하는 mRNA의 RT-PCR을 위한 안티센스 프라이머이다.
서열목록 서열 26: 서열목록 서열 3으로 표시되는 인간의 트로포엘라스틴 단백질을 코딩하는 mRNA의 RT-PCR을 위한 센스 프라이머이다.
서열목록 서열 27: 서열목록 서열 3으로 표시되는 인간의 트로포엘라스틴 단백질을 코딩하는 mRNA의 RT-PCR을 위한 안티센스 프라이머이다.
서열목록 서열 28: 서열목록 서열 6으로 표시되는 인간의 LOXL 단백질을 코딩하는 mRNA의 RT-PCR을 위한 센스 프라이머이다.
서열목록 서열 29: 서열목록 서열 6으로 표시되는 인간의 LOXL 단백질을 코딩하는 mRNA의 RT-PCR을 위한 안티센스 프라이머이다.
서열목록 서열 30: 인간의 액틴 단백질을 코딩하는 mRNA의 RT-PCR을 위한 센스 프라이머이다.
서열목록 서열 31: 인간의 액틴 단백질을 코딩하는 mRNA의 RT-PCR을 위한 안티센스 프라이머이다.
이상 상기 실시예를 통하여 명백한 바와 같이, 본 발명은 라이실 옥시다제 LOX의 동종효소의 활성 촉진에 관한 것으로, 특히 섬유증(fibrosis), 일광탄력섬유변성증(solar elastosis), 임신선(stretch marks), 및/또는 빈영양형 흉터(dystrophic scars)와 같은 병리적이고 해체된 및/또는 비기능성의 탄력섬유형성(elastogenesis)의 경우; 및/또는 몇가지 습진 질병의 경우에, 탄력섬유의 형성을 조절하도록, 라이실 옥시다제(LOX)의 활성 및/또는 형성을 촉진하며, 동시에 또는 그렇지 않더라도 엘라스틴의 합성 감소 또는 저해 또한 촉진하는 활성물질 및 그 스크리닝 방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 더 나아가 본 발명은, 상기 활성물질을 함유하는 화장료 조성물, 식약용 조성물 및 약제학적 조성물 등의 각종 조성물, 상기 활성물질을 이용한 단백질 LOX, 선택적으로 단백질 엘라스틴의 발현위치 조사방법 및 상기와 같은 병리적이고 해체된 및/또는 비기능성의 탄력섬유형성의 경우의 코스메틱 케어 방법에 대해서도 제공하는 탁월한 효과가 있으므로 화장품 산업 및 의약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (27)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 다음의 단계를 포함함을 특징으로 하는 해체되거나 비정상적이거나 병리적인 탄력섬유형성의 경우 탄력섬유형성을 조절하는 활성물질의 스크리닝 방법:
    a) LOX를 발현할 수 있는 살아있는 세포와 단백질 엘라스틴을 발현할 수 있는 살아있는 세포에 활성물질을 접촉시키는 단계
    b) LOX 및 엘라스틴의 발현을 분석하는 단계, 및
    c) 상기 활성물질이 LOX의 발현을 촉진하는지 및 엘라스틴 합성을 감소 또는 저해하는지를 확인하는 단계.
  12. 다음의 단계를 포함함을 특징으로 하는 해체되거나 비정상적이거나 병리적인 탄력섬유형성의 경우 탄력섬유형성을 조절하는, LOX를 촉진하는 활성물질과 엘라스틴을 억제하는 활성물질의 혼합물을 스크리닝하는 방법:
    a) LOX를 발현할 수 있는 살아있는 세포와 LOX를 촉진하는 활성물질을 접촉시키는 단계,
    b) LOX의 발현을 분석하는 단계,
    c) 상기 활성물질이 LOX의 발현을 촉진하는지를 확인하는 단계,
    d) 단백질 엘라스틴을 발현할 수 있는 세포와 엘라스틴을 억제하는 활성물질을 접촉시키는 단계,
    e) 단백질 엘라스틴의 발현을 분석하는 단계, 및
    f) 상기 d)단계의 활성물질이 엘라스틴 합성을 감소 또는 저해하는지를 확인하는 단계.
  13. 다음의 단계를 포함함을 특징으로 하는 해체되거나 비정상적이거나 병리적인 탄력섬유형성의 경우에 탄력섬유형성을 조절하는 활성물질의 스크리닝 방법:
    a) LOX와 엘라스틴 둘 다를 발현할 수 있는 살아있는 세포에 활성물질을 접촉시키는 단계,
    b) LOX와 엘라스틴의 발현을 분석하는 단계, 및
    c) 상기 활성물질이 LOX의 발현을 촉진시키는지 그리고 엘라스틴 합성을 감소 또는 저해하는지를 확인하는 단계.
  14. 제13항에 있어서, 상기 b) 단계에서, 상기 활성물질이 LOX 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 일부분인 LOX 단백질의 구조 내에 있는 펩티드 서열의 발현을 촉진하는지를 조사하고, c) 단계에서는 상기 활성물질이 엘라스틴 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 일부분인 엘라스틴 단백질의 구조 내에 있는 펩티드 서열의 발현을 억제하는지를 조사함을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  15. 제13항에 있어서, LOX 또는 단백질 엘라스틴의 발현 분석은 LOX 또는 트로포엘라스틴을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 정성적 또는 정량적으로 분석하여 이루어짐을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  16. 제13항에 있어서, LOX 또는 단백질 엘라스틴의 발현 분석은 LOX를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 일부분을 증폭하기 위해 서열목록 서열 2에 기재된 LOX를 코딩하는 상보적 DNA의 뉴클레오티드 서열의 일부분과 혼성화되는 프라이머를 이용하거나, 또는 트로포엘라스틴을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 일부분을 증폭하기 위해 서열목록 서열 5에 기재된 트로포엘라스틴을 코딩하는 상보적 DNA의 뉴클레오티드 서열의 일부분과 혼성화되는 프라이머를 이용한 RT-PCR을 이용함을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 방법은 하기에 기재된 기술에 따라 재건피부모델 또는 생검 기반 모델에서 실시하는 LOX의 발현 위치 선정 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 스크리닝 방법:
    in situ 하이브리디제이션: LOX를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 일부분과 혼성화되는 DNA 프로브와 LOX를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 일부분의 in situ 하이브리디제이션, 또는 트로포엘라스틴을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 일부분과 혼성화되는 DNA 프로브와 트로포엘라스틴을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 일부분의 in situ 하이브리디제이션, 또는
    면역적 탐지: LOX의 전체 또는 일부분을 인지할 수 있는 항체 또는 단백질 엘라스틴의 전체 또는 일부분을 인지할 수 있는 항체를 이용하여 LOX를 코딩하는 펩티드 서열의 일부분의 면역적 탐지.
  18. 제17항에 있어서, 상기 면역적 탐지 또는 in situ 하이브리디제이션은 재건피부모델 또는 생검 유래의 상피조직 또는 결합조직에서 LOX와 엘라스틴을 추적할 수 있음을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  19. 제13항에 있어서, 상기 스크리닝 방법은 상기 활성물질을 포함하지 않는 대조군에서 LOX의 발현과 활성물질을 포함하는 실험군에서 LOX의 발현을 비교하거나, 상기 활성물질을 포함하지 않는 대조군에서 단백질 엘라스틴의 발현과 활성물질을 포함하는 실험군에서 단백질 엘라스틴의 발현을 비교하는 것을 포함함을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  20. 제13항에 있어서, 상기 세포는 정상 인간 피부 유래의 섬유아세포를 포함함을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  21. 제13항에 있어서, 상기 세포는 정상 인간 피부 유래의 상피세포 또는 각질형성세포(keratinocytes)를 포함함을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  22. 제13항에 있어서, 상기 살아있는 세포는 빛에 의해 노화되거나 또는 태양 광선에 노출되거나 혹은 노출되지 않은 얼굴, 배 또는 유방에서 유래함을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  23. 제13항에 있어서, 상기 스크리닝 방법은 재건피부모델 또는 섬유아세포를 포함하는 진피모델 또는 생검 기반 모델을 이용함을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  24. 제13항에 있어서, 상기 스크리닝 방법은 재건피부모델 또는 각질형성세포를 포함하는 표피모델을 이용함을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  25. 제13항에 있어서, 상기 활성물질은 식물 또는 합성 폴리페놀, 갈레가 또는 카르다몬 추출물, 포화지방산, 자일리톨, 검 아드라간트, 보리 추출물 또는 귀리 추출물로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  26. 단백질 LOX와 단백질 엘라스틴의 면역적 탐지 단계를 포함함을 특징으로 하는 상피조직 또는 결합조직에서 신-결합섬유형성(neo-collagenogenesis) 또는 신-탄력섬유형성(neo-elastogenesis)을 추적하기 위해 조직에서 LOX와 단백질 엘라스틴의 발현 위치를 선정하는 방법.
  27. 삭제
KR1020040043111A 2003-06-13 2004-06-11 탄력섬유형성의 불완전, 결여 혹은 해체로 인한 질병을 제어하는 라이실 옥시다제의 동종효소의 활성 촉진 KR100787553B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0307178A FR2855969B1 (fr) 2003-06-13 2003-06-13 Stimulation de l'activite d'une isoforme de lysyl oxydase pour lutter contre certaines pathologies dues a une elastogenese incomplete, absente ou desorganisee
FR0307178 2003-06-13

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020070070286A Division KR100844914B1 (ko) 2003-06-13 2007-07-12 탄력섬유형성의 불완전, 결여 혹은 해체로 인한 질병을제어하는 라이실 옥시다제의 동종효소의 활성 촉진

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20040107419A KR20040107419A (ko) 2004-12-20
KR100787553B1 true KR100787553B1 (ko) 2007-12-21

Family

ID=33484438

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020040043111A KR100787553B1 (ko) 2003-06-13 2004-06-11 탄력섬유형성의 불완전, 결여 혹은 해체로 인한 질병을 제어하는 라이실 옥시다제의 동종효소의 활성 촉진
KR1020070070286A KR100844914B1 (ko) 2003-06-13 2007-07-12 탄력섬유형성의 불완전, 결여 혹은 해체로 인한 질병을제어하는 라이실 옥시다제의 동종효소의 활성 촉진

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020070070286A KR100844914B1 (ko) 2003-06-13 2007-07-12 탄력섬유형성의 불완전, 결여 혹은 해체로 인한 질병을제어하는 라이실 옥시다제의 동종효소의 활성 촉진

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20040258676A1 (ko)
KR (2) KR100787553B1 (ko)
DE (1) DE102004028300B4 (ko)
FR (1) FR2855969B1 (ko)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030114410A1 (en) 2000-08-08 2003-06-19 Technion Research And Development Foundation Ltd. Pharmaceutical compositions and methods useful for modulating angiogenesis and inhibiting metastasis and tumor fibrosis
WO2005069975A2 (en) 2004-01-23 2005-08-04 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Lysyl oxidase-like 1 (loxl1) and elastogenesis
FR2892635B1 (fr) * 2005-10-28 2012-11-09 Engelhard Lyon Substance pour restaurer une co-expression et une interaction normales entre les proteines lox et nrage
SI2185198T1 (sl) 2007-08-02 2015-04-30 Gilead Biologics, Inc. Inhibitorji LOX in LOXL2 ter njihova uporaba
WO2010080769A2 (en) 2009-01-06 2010-07-15 Arresto Biosciences, Inc. Chemotherapeutic methods and compositions
SG2014004816A (en) 2009-08-21 2014-03-28 Gilead Biologics Inc Catalytic domains from lysyl oxidase and loxl2
FR2954702B1 (fr) 2009-12-31 2013-07-05 Basf Beauty Care Solutions F Agent stimulant l'expression de loxl
CA2789022A1 (en) 2010-02-04 2011-08-11 Gilead Biologics, Inc. Antibodies that bind to lysyl oxidase-like 2 (loxl2) and methods of use therefor
CA2850384C (en) 2011-09-30 2023-08-15 The University Of Sydney In vivo synthesis of elastic fiber
WO2014063194A1 (en) 2012-10-23 2014-05-01 The University Of Sydney Elastic hydrogel
EP3821918A1 (en) 2012-12-10 2021-05-19 Allergan Pharmaceuticals International Limited Scalable three-dimensional elastic construct manufacturing
ES2965893T3 (es) 2013-08-13 2024-04-17 Allergan Pharmaceuticals Int Ltd Regeneración de tejido dañado con tropoelastina
FR3010313A1 (fr) 2013-09-09 2015-03-13 Natura Cosmeticos Sa Composition comprenant un extrait de guacatonga et un extrait d'aroeira, son utilisation et methode pour empecher et/ou traiter les signes causes par le vieillissement de la peau
CN104491599A (zh) * 2014-12-11 2015-04-08 吴燕 一种治疗渗出性皮肤病的中药组合物
KR102534261B1 (ko) * 2023-02-27 2023-05-30 주식회사 바이오코스 몰로키아 추출물과 민들레 및 보리 복합 추출물을 포함하는 팽창선조 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001092322A1 (fr) * 2000-05-26 2001-12-06 Coletica Utilisation de collagene d'origine aquatique pour la realisation de supports destines a l'ingenierie tissulaire, et supports et biomateriaux obtenus
KR20020019594A (ko) * 2000-05-30 2002-03-12 뷜르 로망 엘. 친유성 생리활성 화합물을 함유하는 예비 조성물

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5120764A (en) * 1988-11-01 1992-06-09 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. Inhibitors of lysyl oxidase
US6277622B1 (en) * 1997-08-11 2001-08-21 The University Of Sydney Synthetic polynucleotides
US6808707B2 (en) * 2000-02-04 2004-10-26 Matrix Design Wound healing compositions and methods using tropoelastin and lysyl oxidase
WO2001083702A2 (en) * 2000-05-03 2001-11-08 University Of Hawaii Novel members of the lysyl oxidases family of amine oxidases related applications
WO2002061092A2 (en) * 2001-01-29 2002-08-08 Bayer Aktiengesellschaft Regulation of human lysyl oxidase

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001092322A1 (fr) * 2000-05-26 2001-12-06 Coletica Utilisation de collagene d'origine aquatique pour la realisation de supports destines a l'ingenierie tissulaire, et supports et biomateriaux obtenus
KR20020019594A (ko) * 2000-05-30 2002-03-12 뷜르 로망 엘. 친유성 생리활성 화합물을 함유하는 예비 조성물

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. Biol. Chem., Vol. 276(6), pp. 5222-5227 (2001)

Also Published As

Publication number Publication date
US20040258676A1 (en) 2004-12-23
DE102004028300B4 (de) 2005-11-24
DE102004028300A1 (de) 2005-03-24
FR2855969A1 (fr) 2004-12-17
FR2855969B1 (fr) 2012-11-30
KR100844914B1 (ko) 2008-07-09
KR20070077515A (ko) 2007-07-26
KR20040107419A (ko) 2004-12-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100844914B1 (ko) 탄력섬유형성의 불완전, 결여 혹은 해체로 인한 질병을제어하는 라이실 옥시다제의 동종효소의 활성 촉진
KR100637934B1 (ko) 탄력섬유의 형성을 촉진하는 라이실 옥시다제유사(ｌｏｘｌ) 동종효소의 합성 및 활성 촉진
JP6215364B2 (ja) ＭＣ−１Ｒ、ＭＣ−２Ｒ、およびμオピオイド受容体調節
US20160095815A1 (en) Substance for restoring normal co-expression and interaction between the lox and nrage proteins
JP2017536803A (ja) 皮膚の老化の防止および／または緩和、および／または皮膚の保湿、および／または皮膚色素沈着の抑制のためのセストリン（ｓｅｓｔｒｉｎ）アクチベーター
JP6059859B2 (ja) 弾性繊維の形成を刺激するための、ｌｏｘｌ（リシルオキシダーゼ類似）アイソフォームの合成及び活性の刺激
JP4527451B2 (ja) 弾性繊維の形成を刺激するための、ｌｏｘｌ（リシルオキシダーゼ類似）アイソフォームの合成及び活性の刺激
GB2438999A (en) Screening for substances that promote the activity or formation of LOXL
JP4954450B2 (ja) 弾性繊維形成の不全、欠損又は無秩序による病状に対処するための、リシルオキシダーゼのアイソフォームの活性の誘導
JP6244595B2 (ja) 角質層内で発現されるポリペプチドおよびその使用
WO2008012476A2 (fr) Utilisation de carboxypeptidases dans le domaine cosmetique et therapeutique
JP2015147798A (ja) 弾性繊維の形成を刺激するための、ｌｏｘｌ（リシルオキシダーゼ類似）アイソフォームの合成及び活性の刺激
FR2904223A1 (fr) Utilisation de carboxypeptidases dans le domaine cosmetique et therapeutique

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
J201 Request for trial against refusal decision
AMND Amendment
E801 Decision on dismissal of amendment
E902 Notification of reason for refusal
A107 Divisional application of patent
B701 Decision to grant
GRNT Written decision to grant
G170 Publication of correction
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20121129

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20131127

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20141126

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161206

Year of fee payment: 10

LAPS Lapse due to unpaid annual fee