KR20160041949A - 손상 조직의 재생 - Google Patents
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Abstract
상처의 재상피화를 가능하게 하는 시간 동안 상처 가장자리와 트로프엘라스틴의 지속적인 접촉을 가능하게 하는 조건에서 트로프엘라스틴 또는 엘라스틴 유래 펩타이드로 상처 가장자리와 접촉하는 것을 포함하는 상처 치유 방법.
Description
본 발명은 상처 치유에 관한 것으로, 특히 상처의 재상피화의 개선에 관한 것이다.
본 명세서에서 임의의 종래기술에 대한 언급은 이 종래 기술이 오스트레일리아 또는 임의의 다른 관할지역에서 흔한 일반 상식의 일부를 형성하거나, 또는 이 종래 기술이 당업자에 의해 관련 있는 것으로 확인되고, 이해되고 또 간주될 것으로 합리적으로 예상될 수 있었음을 인정하거나 또는 어떤 형태의 제시가 아니며, 그렇게 받아들여져서도 안 된다.
피부는 표피와 진피의 두 개의 층으로 구성되며, 진피는 지방질의 하부 구조체인 피하의 피하진피와 연결된다. 표피는 피부의 가장 얇고 가장 바깥쪽 성분으로 주로 각질형성세포들로 이루어진다. 진피는 콜라겐, 탄성 섬유 및 글리코스아미노글리칸(glycosaminoglycan)의 원섬유간 겔, 염분 및 물로 구성된 치밀한 결합 조직이다.
표피와 진피는 하방으로 돌출된 젖꼭지 모양의 표피 망융선과 상방으로 돌출된 진피유두에 의해 상호 연동한다. 이들은 당단백질(glycoproteins) 및 프로테오글리칸(proteoglycan)으로 구성된 세포외 기질(ECM)의 고도로 특수화된 형태인 기저막에 의해서 분리된다.
진피는 구조적으로 다른 두 개의 층으로 구성되며, 두 개의 층은: 피상적이고 얇은 유두진피와 더 깊은 망상진피이다. 유두진피는 미세 탄성 섬유를 포함하는 결합 조직으로 구성되며, 전술한 바와 같이 진피를 표피에 결합시키는, 진피유두로 알려진 작은 손가락 모양의 돌기들의 형상을 가진다. 망상진피는 망상 구조로 얽힌 콜라겐 다발과 수평으로 배열된 굵은 탄성 섬유를 포함한 치밀하고 불규칙한 연결조직으로 이루어진다.
상처 치유란 부상 후 조직이 회복되거나 스스로 재생하는 복잡한 과정이다. 어떤 조직들은 재생이 가능하지만, 적절한 조건들이 찾아지지 않으면 섬유증을 수반하는 복원 메커니즘으로 넘어가는 경향이 있다. 피부가 한 예이다. 다른 조직들은 재생될 수 없으며, 섬유증과 흉터로 이어지는 회복 메커니즘만을 거칠 수 있다.
상처 치유의 고전적 모델은 세 가지 또는 네 가지 순차적이지만 중첩되는 단계인: (1) 지혈, (2) 염증, (3) 증식 및 (4) 재형성으로 나누어질 수 있다. 증식 단계는 혈관 신생, 콜라겐 침착, 육아조직 형성 및 재상피화를 특징으로 한다.
혈관 신생은 섬유아세포의 증식과 동시에 발생한다. 섬유아세포와 상피세포의 활동에는 산소와 영양분이 필요하기 때문에 혈관 신생은 상처 치유의 다른 단계들을 위해 필수적이다. 이 과정에 의하면, 내피세포의 줄기세포 및 혈액 순환을 통해서 그리고 손상되지 않은 혈관의 일부들로부터 생긴 다른 혈관세포들은 새로운 혈관이 생성되도록 위족을 만들어 ECM을 통해 환부로 밀어 넣는다. 내피세포는 피브린(fibrin) 딱지에서 발견되는 피브로넥틴(fibronectin)에 의해서 그리고 다른 세포들에 의해 방출된, 가령 대식세포(macrophages) 및 저 산소환경의 혈소판(platelets)으로부터 방출된 혈관 신생 인자에 의해서 화학주화성으로 상처 영역으로 이끌린다. 이동을 위해서, 내피세포는 혈전과 ECM의 일부를 분해하기 위해 플라스미노겐(plasminogen) 활성제와 교원질 분해효소(collagenases)를 필요로 한다. 아연 의존 메탈로프로테이나제(metalloptroteinases)는 세포의 이동, 증식 및 혈관 신생이 허용되도록 기저막과 ECM을 소화한다. 조직이 적절히 관류되면 내피세포의 이동과 증식이 감소된다. 결국 더 이상 필요치 않은 혈관은 세포 사멸에 의해 죽는다.
콜라겐의 생성 및 침착은 피브린-피브로넥틴 혈전보다 많은 저항력을 제공함으로써 상처의 강도를 증가시키기 때문에 중요하다. 또한, 염증, 혈관 신생 및 결합 조직의 구성에 관여하는 세포들은 섬유아세포에 의해 중첩된 콜라겐 매트릭스에 달라붙어 성장하고 분화한다. III형 콜라겐과 피브로넥틴은 주로 상처의 크기에 따라 대개 약 10 시간 내지 3일 사이에 상당한 양이 생성되기 시작한다. 이들의 침착은 1주 내지 3주에 최고조에 달한다. 이들은 더 강력한 I형 콜라겐으로 교체되는 성숙 후반기에 이르기까지는 주된 인장 물질들이다. 섬유아세포가 생성하는 새로운 콜라겐은 생성되는 순간 교원질 분해효소와 다른 요소들에 의해 분해된다. 상처가 난 후 얼마 지나지 않아 합성이 분해를 능가하여 상처의 콜라겐 수준은 상승하지만, 이후 생성과 분해가 동일해지고 콜라겐의 순 증가는 없어진다. 이러한 항상성은 후반기 성숙 단계의 개시 신호를 보낸다. 전술한 바와 같이, 추후 상처 부위에 콜라겐 매트릭스를 중첩시키는 중심 세포가 되는 섬유아세포들은 손상 후 첫 2일 또는 3일 동안 주로 이동하고 증식한다. 이러한 섬유아세포들은 손상되지 않은 인접 피하 조직으로부터 유래하는 것으로 여겨진다. 초기에, 섬유아세포들은, 염증 단계가 끝날 무렵에 형성되어 상처를 가로질러 이동한 다음 피브로넥틴에 달라붙는 피브린 가교 섬유(fibrin cross-linking fibers)를 이용한다. 이후, 섬유아세포들은 기질을 상처 기저부(wound bed)에 침착 시키고, 나중에는 이동을 위해 달라붙을 수 있는 콜라겐에 침착시켜서 육아조직의 형성을 위한 토대를 만든다. 육아조직은 초보적인 조직으로 기능하며 손상 후 2일 내지 5일의 염증 단계 동안에 이미 상처에 나타나기 시작하고, 상처 기저부가 덮일 때까지 계속 자란다. 육아 조직은 새로운 혈관, 섬유아세포, 염증세포, 내피세포, 근육섬유모세포 및 새롭고 잠정적인 세포외기질(ECM)의 구성요소들로 이루어진다. 잠정적인 ECM은 정상 조직의 ECM과 조성이 다르며, 구성 요소들은 섬유아세포에서 유래한다. 이러한 구성 요소들은 피브로넥틴, 콜라겐, 글리코사미노글리칸, 엘라스틴, 글리코프로틴 및 프로테오글리칸을 포함한다. 주요 구성요소들은 매우 수화된 매트릭스를 생성하고 세포의 이동을 용이하게 하는 피브로넥틴 및 히알루로난(hyaluronan)이다. 나중에 이 잠정적인 매트릭스는 비 손상 조직에서 발견되는 것과 더 밀접하게 유사한 ECM으로 대체된다. 육아 단계의 막바지에, 섬유아세포는 세포가 풍부한 환경에서 육아조직을 주로 콜라겐으로 구성된 환경으로 변환하면서 세포사멸을 겪는다.
개방형 상처에 육아조직을 형성하는 것은 상처와 환경 사이에 장벽을 형성하기 위해 상피세포들이 새로운 조직을 가로질러 이동함에 따라 재상피화 단계가 개시되도록 한다. 상처 가장자리 및 모낭, 땀샘 및 피지선(오일)과 같은 피부 부속물들로부터 유래한 기저 각질형성세포들은 상처 치유에 있어서 상피 단계를 담당하는 주된 세포들이다. 이들은 시트 내에서 상처 부위에 가로질러 나아가고 상처의 가장자리들에서 증식하며 그들이 중간에서 만나면 움직임을 중단하게 된다.
각질형성세포는 먼저 증식하지 않고 이동한다. 이동은 부상 후 몇 시간 만에 빠르게 시작될 수 있다. 그러나, 상피세포들은 이동을 위해 생존 가능한 조직을 필요로 하므로, 만약 상처가 깊다면 육아조직으로 먼저 상처를 채워야만 한다. 따라서 이동 개시시간은 가변적이며 부상 후 하루 정도 지난 후에 발생할 수 있다. 상처 가장자리의 세포들은 더 많은 이동용 세포를 제공하기 위해 부상 후 두 번째 및 세 번째 날에 증식을 한다.
기저막이 파괴되지 않은 경우, 상피세포들은 손상되지 않은 피부에서 발생하는 것과 동일한 방식으로 기저층 내에서 세포 분열과 상방 이동에 의해 3일 이내에 대체된다. 그러나, 기저막이 상처 부위에서 파괴되는 경우, 재상피화는 반드시 상처의 경계부위로부터 발생해야 하고, 생존 가능한 각질형성세포와 정렬된 진피로 들어가는 모낭, 땀샘 및 기름샘과 같은 피부의 부속물들로부터 발생해야 한다. 상처가 매우 깊은 경우, 피부 부속물들 역시 파괴될 수 있으며, 이동은 상처 가장자리로부터만 발생할 수 있다.
상처 부위로 각질형성세포가 이동하는 것은 접촉 저지의 결여 및 산화 질소(nitric oxide)와 같은 화학 물질들에 의해 자극된다. 이동을 시작하기 전에, 세포들은 이들의 세포 골격 내의 중간 필라멘트들로 다른 세포들 및 ECM에 이 세포들을 정상적으로 고정시키는 데즈모섬(desmosomes) 및 반결합체(hemidesmosome)를 용해시켜야만 한다. 당 단백질로 이루어지고, 일반적으로 세포 골격을 통해 기저막에 세포를 고정시키는 막 관통 수용체 단백질(transmembrane receptor proteins)인 인테그린(integrins)은 세포의 중간 필라멘트로부터 방출되며, 이동 중에 위족을 위한 ECM의 부착물 역할을 하도록 액틴 필라멘트(actin filaments)로 이전한다. 따라서 각질형성세포는 기저막에서 분리되어 상처 기저부로 들어갈 수 있다.
이동을 시작하기 전에, 각질형성세포는 더 길고 더 편평해지며, 접착용 세포족(lamellipodia)과 같은 세포 과정들 및 주름처럼 보이는 넓은 과정들을 연장되면서 형태를 바꾸게 된다. 액틴 필라멘트 및 접착용 세포족이 형성된다. 이동 중에, 위족 상의 인테그린은 ECM에 달라붙고, 돌기 내의 액틴 필라멘트는 세포를 함께 잡아당긴다. 인테그린을 통한 ECM 내의 분자와의 상호작용은 액틴 필라멘트, 접착용 세포족 및 사상위족(filopodia)의 형성을 더 촉진한다.
상피세포는 이동하기 위해 서로 위로 올라간다. 상피세포의 이러한 성장 시트는 종종 상피 혀라고 불린다. 기저막에 달라붙는 제1 세포는 기저층을 형성한다. 이들 기저세포는 상처 기저부를 가로질러 이동을 계속하고, 그 위의 상피세포 역시 함께 슬라이딩한다. 이동이 빠를수록 흉터는 덜 발생하게 된다.
ECM 내의 피브린, 콜라겐 및 피브로넥틴은 세포가 분열하고 이동하도록 신호를 더 보낼 수 있다. 섬유아세포와 마찬가지로, 이동하는 각질형성세포는 느리게 이동하기 위해 염증에 부착 부위로 침착된 피브린과 가교된 피브로넥틴을 사용한다.
이동할 때, 각질형성세포들은 육아조직을 비켜가지만 딱지(하나가 형성이 된 경우) 바로 밑에서 딱지를 하부 조직으로부터 분리한다. 상피세포는 그렇지 않으면 자신의 경로를 방해할 수 있는 죽은 조직 및 세균 물질과 같은 이물질을 식균하는 능력을 가지고 있다. 각질형성세포들은 형성되는 딱지를 용해시켜야만 하고, 건조한 환경은 더 크고 거친 딱지의 형성을 유도하므로, 각질형성세포들의 이동은 습한 환경에 의해 최고로 향상된다. 조직을 따라 길을 만들고 통과하기 위해서 각질형성세포들은 혈전, 이물질 및 ECM의 일부들을 분해해야만 한다. 딱지를 분해하기 위해, 각질형성세포들은 플라스미노젠을 활성화하여 플라스민(plasmin)으로 바꾸는 플라스미노젠 활성인자(plasminogen activator)를 분비한다. 세포들은 살아있는 조직을 통해서만 이동할 수 있으므로, 경로 상에 있는, 특히 이동 시트의 정면에 있는 ECM의 손상된 부분들을 녹이기 위해 세포들은 교원질 분해효소 및 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMPs)와 같은 단백질 분해효소(proteases)를 분비해야만 한다. 각질형성세포는 느리게 이동하는 섬유아세포가 내려 놓은 새로운 ECM을 대신 사용하면서 단백질 분해(proteolytic degradation)를 통해 기저막을 개조하기도 한다.
각질형성세포가 이동을 계속함에 따라, 상처의 가장자리를 교체하고 전진 시트에 더 많은 세포를 공급하기 위해 상처의 가장자리에 새로운 상피세포가 형성되어야만 한다. 각질형성세포의 이동에 뒤이어 상처 발생 후 몇 일 동안 증식이 정상적으로 시작되며 이 상피화 단계에서 증식은 정상 조직에서보다 17배 높은 비율로 발생한다. 모든 상처 영역이 새로운 표피로 덮일 때까지, 증식하는 유일한 상피세포는 상처의 가장자리에 존재한다.
인테그린 및 MMPs에 의해 자극된 성장 인자는 상처 가장자리에서 세포가 증식하도록 한다. 각질형성세포 자신들 또한 상피화 및 치유의 다른 단계들을 돕는 성장 인자 및 기저막 단백질을 포함하는 인자들을 생성하고 분비한다. 성장 인자는 항균 펩타이드 및 각질형성세포의 호중구 화학주성 사이토카인(neutrophil chemotactic cytokines)의 생산을 자극하므로 피부 상처의 선천성 면역 방어를 위해서도 중요하다.
세포들이 어느 한 변으로부터 점접촉 저지로 이동을 멈추는 중간 지점에서 만날 때까지, 각질형성세포들은 상처 기저부를 가로질러 이동을 계속한다. 이동이 완료되면, 각질형성세포들은 새로운 기저막을 형성하는 단백질을 분비한다. 세포들은 이동을 시작하기 위해 겪었던 형태학적 변화를 역방향으로 수행하고; 데즈모섬 및 반결합체를 재형성하고, 기저막에 다시 한 번 고정된다. 기저세포들은 재상피화된 피부에서 발견되는 조직 층들을 재형성하기 위해 정상 피부에서 하는 것과 동일한 방식으로 세포분열과 분화를 시작한다.
상처 치유, 특히 조직 재생은 다양한 인자들과 조건들에 의해 영향을 받는다. 이러한 인자들 또는 조건들을 사용할 수 없는 경우, 결과는 재생 대신 조직 회복 및 섬유증, 만성 염증 및/또는 궤양이 될 수 있다. 중요 인자들은, 예를 들면 상처의 유형, 크기 및 위치와 같은 국부 인자들 및 혈관 공급의 적정성, 감염 유무, 움직임 및 대사 상태와 같은 조직 인자들을 포함한다.
Hashimoto 등. 2004, Biomaterials 25: 1407-1414에서는 상처의 재상피화에 있어서 하이브리드 펩타이드(hybrid peptides)의 사용이 논의된다. 이 연구에서는 엘라스틴 유래 펩타이드인 VGVAPG가 음성(negative) 제어와 비교했을 때 재상피화 또는 재생 조직의 체적에 있어서 증가를 보이지 않았다는 것을 보였다는 점에서 주목할만하다. 이 연구는 상처의 재상피화 및 재상피화를 지원하는데 효과적인 육아조직 형성이라는 양쪽 모두의 맥락에서, 상처 치유를 위해 라미닌(laminin) 유래 펩타이드를 선호하고 있음을 보여준다.
상처, 특히 피부의 상처 또는 진피 조직의 상처 치유의 개선 또는 대안적 접근에 대한 필요성이 남아있다.
특히, 상처의 재상피화를 개선하기 위한 필요성이 있다.
가령, 상처 치유 및, 특히, 재상피화 등을 뒷받침하는 과정들의 진행 속도를 개선하거나 가속함으로써 상처 치유 과정을 가속할 필요성도 있다.
본 발명은 위에서 언급된 하나 이상의 필요성을 다루거나 상처 치유의 개선을 제공하려고 시도하고, 일 구현예를 통해서 상처를 치유하는 방법을 제공하고, 이 치유 방법은:
- 그의 주위에 위치한 복수의 상피세포들을 포함하고, 이로써 상처 가장자리를 형성하는 상처를 가진 개인을 제공하는 단계;
- 상처의 재상피화를 가능하게 하는 시간 동안 상처 가장자리와 트로프엘라스틴의 지속적인 접촉을 가능하게 하는 조건에서 치료학적 유효량의 트로프엘라스틴을 상처 가장자리와 접촉하는 단계를 포함하고;
상처의 재상피화는 상처의 치유를 가능하게 하고;
이로써 상처를 치유한다.
다른 구현예에서, 상처의 재상피화를 개선하기 위한 방법이 제공되며, 이 방법은:
- 그의 주위에 위치한 복수의 상피세포들을 포함하고, 이로써 상처 가장자리를 형성하는 상처를 가진 개인을 제공하는 단계; 및
- 상처의 재상피화를 가능하게 하는 시간 동안 상처 가장자리와 트로프엘라스틴의 지속적인 접촉을 가능하게 하는 조건에서 치료학적 유효량의 트로프엘라스틴을 상처 가장자리와 접촉하는 단계를 포함하고;
이로써 상처의 재상피화를 개선한다.
다른 구현예에서, 흉터 조직을 최초화하는 방법이 제공되며, 이 방법은:
- 흉터 조직을 갖는 개인을 제공하는 단계;
- 그의 주위에 위치한 복수의 상피세포를 포함하는 상처를 흉터 조직 내에 형성하여 상처 가장자리를 형성하는 단계; 및
- 상처의 재상피화를 가능하게 하는 시간 동안 상처 가장자리와 트로프엘라스틴의 지속적인 접촉을 가능하게 하는 조건에서 치료학적 유효량의 트로프엘라스틴을 상처 가장자리와 접촉하는 단계를 포함하고,
상처의 재상피화는 흉터 조직을 최소화하고;
이로써 흉터 조직을 최소화한다.
다른 구현예에서, 상처의 치유하는 용도, 또는 상처의 재상피화를 개선하는 용도로 트로프엘라스틴이 제공되고, 치료학적 유효량의 트로프엘라스틴은 상처의 재상피화를 가능하게 하는 시간 동안 상처 가장자리와 트로프엘라스틴의 지속적인 접촉을 가능하게 하는 조건에서 상처 가장자리와 접촉된다.
다른 구현예에서, 상처의 치유, 또는 상처의 재상피화의 개선을 위해 트로프엘라스틴의 용도가 제공되고, 치료학적 유효량의 트로프엘라스틴은 상처의 재상피화를 가능하게 하는 시간 동안 상처 가장자리와 트로프엘라스틴의 지속적인 접촉을 가능하게 하는 조건에서 상처 가장자리와 접촉된다.
다른 구현예에서, 상처의 치유를 위한 의약의 제조 또는 상처의 재상피화의 개선을 위한 트로프엘라스틴의 용도가 제공되고, 치료학적 유효량의 트로프엘라스틴은 상처의 재상피화를 가능하게 하는 시간 동안 상처 가장자리와 트로프엘라스틴의 지속적인 접촉을 가능하게 하는 조건에서 상처 가장자리와 접촉된다.
상술한 구현예들에서, 트로프엘라스틴은 상처 가장자리와의 접촉을 위해서 제공될 수 있으나, 상처 기저부와 접촉을 위해서는 제공되지 않을 수 있다.
상술한 구현예들에서, 트로프엘라스틴은 단량체 형태로 제공되거나 가교 또는 비 가교된 형태로 제공될 수 있다.
상술한 구현예들에서, 트로프엘라스틴은 트로프엘라스틴의 지속적 방출을 가능하게 하는 제제를 형성하기 위해 가교 히알루론산 겔(hyaluronic acid gel)과 혼합될 수 있다.
도 1a는 돼지들에 대한 상처 치료의 개략도이다. 상처는 인테그라(파란색 원)로 덮여 있었거나 10% rH TE(엘라스틴화 된 인테그라; 녹색 원)를 포함하는 인테그라 진피 템플릿 또는 4% rH TE 하이드로겔(노란색 원)을 포함하는 인테그라 진피 템플릿으로 처치가 되었다. 도 1b는 상처의 생검 및 드레싱 부위의 개략도이다.
도 2는 엘라스틴화된 인테그라로 처치된 부위 중 VVG 염색된 생검 단면으로서, 섬유아세포의 존재, 새로운 콜라겐의 침착 및 엘라스틴 섬유의 존재를 도시한다.
도 3은 수술 2주 후 채취한 VVG 염색된 코어 생검 표본들에서 관찰된 진피의 다른 유형들을 비교한 것이다. a) 원래 진피; b) 정상 진피(원 내) 및 새로 형성된 진피가 반쯤씩 보이는 진피; c) 새로 형성된 진피의 모양(원 내: 호산구성 얼룩은 적고, 콜라겐 섬유는 얇고 덜 조직적으로 보이며, 정상 진피의 모양에 비해 세포는 더 많음); d) 정상 진피의 모양(원 내: 호산구성 얼룩이 더 많고, 콜라겐 섬유는 더 굵고 더 많이 조직화되고, 새로 형성된 진피에 비해 세포는 더 적은 것으로 나타남)
도 4는 수술 2주 후 인테그라 피부 템플릿 +4% rH TE 하이드로 겔로 처치한 상처 부위의 조직 단면이다. 정상적인 외관을 보이는 것의 진피 조직 내의 가시적인 rH TE 겔 아래에 있는 진피의 기저 쪽으로 엘라스틴 섬유들을 볼 수 있다. 비슷한 외형의 진피 조직도 rH TE 하이드로겔 내에서 보였다.
도 5는 수술 2주 후 채취한 코어 생검 샘플의 진피의 각층에서의 혈관의 수를 비교한 것이다. 동일한 돼지에서 두개골의(cranial)(두개골(cran)) 또는 미골부의(caudal)(미골부(caud)) 제어 인테그라 진피 템플릿 중 대응되는 것만 엘라스틴화된 인테그라와 비교하였다. VVG 염색된 코어 생검 샘플은 100배 배율로 검사하였고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 평가하였다. 현미경 사진은 진피의 여러 레벨에서 촬영되었다. 진피의 제1 레벨은(레벨 1) 피하 진피가 보이지 않을 때까지 카메라의 시야각을 움직여서 획득하였다. 다음 레벨들은 표피 쪽으로 샘플을 0.5 FOVs(현미경으로 관찰하면서) 움직여서 획득하였다. 따라서 피하 진피 위의 레벨 2는 레벨 1의 이미지로부터 0.5 FOVs(현미경으로 관찰하면서) 이격된 것이다. 진피의 각 레벨마다 3 개의 이미지들이 촬영되었다: 샘플의 양쪽 가장자리에서 하나씩 및 중간에서 하나. 현미경을 통한 각 FOV는 2.5 mm의 직경을 가지고, 카메라로 촬영된 각각의 이미지는 650 ㎛ 넓이를 가지므로, 이 방법을 통하면 진피의 다른 레벨들에서 촬영한 이미지들은 동일한 혈관을 포함하지 않을 것이 분명하였다. 혈관에 대한 기준들은: a) 루멘 크기가 10 ㎛ 이상일 것; 및 b) 루멘이 어두운 긴 핵과 함께 적어도 2개의 세포에 의해 일직선으로 배열되어야 할 것이었다. 혈관의 동일성 여부는 때때로 루멘 내 혈액세포의 존재, 및/또는 관벽의 중막 내에 평활근 세포의 존재에 의해서 명확하게 확인되었다.
도 6a는 인테그라만으로 처치된 샘플에서 진피 속으로 난 작은 표피 돌기들의 예이다. 도 6b는 엘라스틴화된 인테그라 샘플 내의 표피의 망상 융선의 예이다.
도 7은 섬유아세포와 재생 조직의 각질형성세포의 모집과 혈관 신생에 기여하는 화학주성 시그널링을 통해 상처 회복 과정에 기여하는 재조합형 인간 트로프엘라스틴이 제안된 것이다.
도 2는 엘라스틴화된 인테그라로 처치된 부위 중 VVG 염색된 생검 단면으로서, 섬유아세포의 존재, 새로운 콜라겐의 침착 및 엘라스틴 섬유의 존재를 도시한다.
도 3은 수술 2주 후 채취한 VVG 염색된 코어 생검 표본들에서 관찰된 진피의 다른 유형들을 비교한 것이다. a) 원래 진피; b) 정상 진피(원 내) 및 새로 형성된 진피가 반쯤씩 보이는 진피; c) 새로 형성된 진피의 모양(원 내: 호산구성 얼룩은 적고, 콜라겐 섬유는 얇고 덜 조직적으로 보이며, 정상 진피의 모양에 비해 세포는 더 많음); d) 정상 진피의 모양(원 내: 호산구성 얼룩이 더 많고, 콜라겐 섬유는 더 굵고 더 많이 조직화되고, 새로 형성된 진피에 비해 세포는 더 적은 것으로 나타남)
도 4는 수술 2주 후 인테그라 피부 템플릿 +4% rH TE 하이드로 겔로 처치한 상처 부위의 조직 단면이다. 정상적인 외관을 보이는 것의 진피 조직 내의 가시적인 rH TE 겔 아래에 있는 진피의 기저 쪽으로 엘라스틴 섬유들을 볼 수 있다. 비슷한 외형의 진피 조직도 rH TE 하이드로겔 내에서 보였다.
도 5는 수술 2주 후 채취한 코어 생검 샘플의 진피의 각층에서의 혈관의 수를 비교한 것이다. 동일한 돼지에서 두개골의(cranial)(두개골(cran)) 또는 미골부의(caudal)(미골부(caud)) 제어 인테그라 진피 템플릿 중 대응되는 것만 엘라스틴화된 인테그라와 비교하였다. VVG 염색된 코어 생검 샘플은 100배 배율로 검사하였고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 평가하였다. 현미경 사진은 진피의 여러 레벨에서 촬영되었다. 진피의 제1 레벨은(레벨 1) 피하 진피가 보이지 않을 때까지 카메라의 시야각을 움직여서 획득하였다. 다음 레벨들은 표피 쪽으로 샘플을 0.5 FOVs(현미경으로 관찰하면서) 움직여서 획득하였다. 따라서 피하 진피 위의 레벨 2는 레벨 1의 이미지로부터 0.5 FOVs(현미경으로 관찰하면서) 이격된 것이다. 진피의 각 레벨마다 3 개의 이미지들이 촬영되었다: 샘플의 양쪽 가장자리에서 하나씩 및 중간에서 하나. 현미경을 통한 각 FOV는 2.5 mm의 직경을 가지고, 카메라로 촬영된 각각의 이미지는 650 ㎛ 넓이를 가지므로, 이 방법을 통하면 진피의 다른 레벨들에서 촬영한 이미지들은 동일한 혈관을 포함하지 않을 것이 분명하였다. 혈관에 대한 기준들은: a) 루멘 크기가 10 ㎛ 이상일 것; 및 b) 루멘이 어두운 긴 핵과 함께 적어도 2개의 세포에 의해 일직선으로 배열되어야 할 것이었다. 혈관의 동일성 여부는 때때로 루멘 내 혈액세포의 존재, 및/또는 관벽의 중막 내에 평활근 세포의 존재에 의해서 명확하게 확인되었다.
도 6a는 인테그라만으로 처치된 샘플에서 진피 속으로 난 작은 표피 돌기들의 예이다. 도 6b는 엘라스틴화된 인테그라 샘플 내의 표피의 망상 융선의 예이다.
도 7은 섬유아세포와 재생 조직의 각질형성세포의 모집과 혈관 신생에 기여하는 화학주성 시그널링을 통해 상처 회복 과정에 기여하는 재조합형 인간 트로프엘라스틴이 제안된 것이다.
본 발명자들은 트로프엘라스틴이 전체 두께 피부에서 상처의 재상피화를 개선한다는 것을 발견하였다.
중요하게는, 본원의 실시예에 도시된 바와 같이, 발명자들은 상처를 중심으로 주변부를 형성하는 표피세포 형태의 상처 가장자리와 트로프엘라스틴을 접촉하는 것이 피부의 재상피화의 개선에 중요하다는 것을 발견하였다. 결정적으로, 트로프엘라스틴이 상처 가장자리와의 제한된 지속적 접촉을 갖는 상처 기저부로 제공되는 경우, 상처의 재상피화의 개선은 있다고 하더라도 미미하다.
가설에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 본원에서 보여진 상처 치유의 개선을 제공하는 것은 트로프엘라스틴을 상처 가장자리에 지속적 또는 끊임없이 접촉시키는 것, 또는 상처 가장자리 부근에 적어도 끊임없이 배치하는 것이라 여긴다. 다시, 가설에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 상처 치유 과정에서 설명된 다양한 프로테아제는 상처 가장자리에 접촉해서 배치되거나 상처 가장자리의 부근에 위치될 때 상처 치유 및 조직 재생의 다양한 과정들을 유리하게 하는 트로프엘라스틴의 단백질 가수분해 단편들을 생성할 수 있거나, 트로프엘라스틴의 단량체들의 방출을 촉진할 수 있는 것으로 여겨진다. 본원의 실시예들은 이러한 과정들이 혈관 신생, 세포 주화성, 이동과 증식 및 기질의 형성으로 이루어지고 있음을 보여준다.
상처가 기능적 표피 조직으로 봉합된다는 것은 치료와 미용이라는 두 가지 관점에서 매우 중요할 수 있기 때문에, 재상피화의 개선은 중요하다. 상처 봉합이 보이지 않는 경우, 조직 재생 과정은 조야한(substandard) 기능 및 외관을 갖는 조직의 형성으로 이어지는 조직 복원 및 섬유증에 더 가까워지는 경향이 있다는 우려가 있다. 만성 염증 및 궤양의 위험도 있다. 이러한 맥락에서, 재상피화의 범위 및 재상피화 할 시점의 관점에서 재상피화의 개선은 중요하다.
비록 이전에는 엘라스틴 유래 펩타이드의 생체활성에 관한 체외 데이터가 제한적이었다 하더라도, 이전의 체내 상처 모델에서 VGVAPG와 같이 엘라스틴 유래 펩타이드가 본원에서 설명된 개선을 얻기에는 효과적이지 못하다는 것이 현재까지 입증되어 왔기 때문에, 상술한 결과들은 특히 놀라운 것으로 여겨진다. 예를 들어, Hashimoto 문헌을 참고할 것. 가설에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 적어도 재상피화에 관련된 범주에서는, 본원에 설명된 상처의 구조에 따르면, 이러한 펩타이드를 처방하지 않았다는 것은 앞선 연구들에서는 본원에 기술된 개선이 발생하지 않았음을 의미하는 것으로 여겨진다.
따라서 일 구현예에서, 상처의 치유 방법을 제공한다. 본 방법은 상처를 가진 개인을 제공하는 단계를 포함한다. 상처는 피부 조직에 대한 임의의 부상으로부터 발생할 수 있다. 부상의 예는 화상, 열상, 찰과상, 절개, 천공 또는 파열을 포함한다.
일반적으로 부상은 파손, 파열 또는 표피와 진피층의 상처를 초래하는 것이다. 상처는 피하 조직, 근육 또는 뼈를 포함하는 진피 하부 조직에 상처를 초래하기도 한다. 따라서 상처는 피상적인 상처, 부분 두께 상처 또는 전체 두께 상처일 수 있다.
일반적으로 본 발명은 육아조직의 형성 및 이와 관련된 혈관 생성, 콜라겐 침착 등의 과정을 포함하는 진피 및 표피 영역에 적용되는 재생 과정 및 재상피화에 적용된다.
부상은 가령 수술로 인한 고의적인 것이거나 또는 가령 외상과 같은 우발적인 것일 수 있다.
상처는 상처 주위에 위치하여 상처 가장자리를 형성하는 복수의 상피세포들을 포함한다. 일반적으로 부상은 상처가 형성된 영역에 걸쳐 정상적으로 표피층을 형성하는 상피조직 세포의 결여를 특징으로 하는, 조직의 손상된 영역을 형성하게 된다. 실질적으로 손상되지 않고, 부상 부위의 주변에 위치한 조직은 일반적으로 표피세포들의 정상적인 표피 층을 포함한다. 상처 가장자리를 형성하는 것은 이러한 상처에 인접한 이들 세포들이다. 일반적으로 알 수 있는 바와 같이, 상처 가장자리 또는 상처 주변부는 재상피화 과정 중에 상피조직 세포 증식의 위치가 된다.
본 발명에 따르면, 상처 가장자리 또는 상처 주변부는 트로프엘라스틴과 상처 가장자리의 지속적인 접촉을 가능하게 하는 조건에서 트로프엘라스틴 또는 엘라스틴 유래 단편들과 접촉한다. 이는 본 발명에서 중요한 단계로 여겨진다. 본원의 실시예들에서 설명된 바와 같이, 재상피화는 상처 가장자리의 부근에 트로프엘라스틴이 접촉하거나 위치하는 곳에서 관찰되는 경향이 있다. 예를 들어, 재상피화는 더 완전하고 또는 자연적으로 구성될 수 있으며, 그리고 재상피화율은 가속화될 수 있다. 예를 들어, 트로프엘라스틴이 오직 상처 기저부와만 접촉하도록 배치될 때 이러한 특징들 중 일부는 보이지 않는다.
본원에 기술된 바와 같이, 상처 기저부는 일반적으로 기능적인 재생 과정에서 육아조직이 결국 형성되는, 손상으로부터 발생하는 진피 조직의 표면이다. '상처 가장자리의 부근에 위치한'이란 말은 트로프엘라스틴 또는 트로프엘라스틴의 단백질 가수분해 단편들이 상처 가장자리와 접촉을 위한 확산이 손쉽게 허용되도록 트로프엘라스틴 또는 그의 단백질 가수분해 단편들이 상처 가장자리에 아주 가깝게 위치되도록 트로프엘라스틴이 제공되는 것을 의미한다. 이러한 맥락에서, 트로프엘라스틴 또는 엘라스틴 유래 트로프엘라스틴의 단편들의 상처 기저부 위 또는 내에서만의 위치는 트로프엘라스틴이 상처 가장자리에 추가될 때 관찰될 수 있으므로 재상피화를 위해 제공되지 않는 것으로 본원에서 도시된다. 따라서, 트로프엘라스틴의 위치는 상처 가장자리 부근이므로 상처 기저부에만 트로프엘라스틴을 투여하는 것은 본 발명에 따라 보이지 않는다.
상처 가장자리에 트로프엘라스틴 또는 엘라스틴 유래 단편들의 접촉을 가능하게 하는 수많은 접근법들이 있다. 일 구현예에서, 트로프엘라스틴은 상처 가장자리와 끊임없는 접촉이 가능한 형태로 제공된다. 예를 들면, 트로프엘라스틴은 점성 또는 점착성을 갖는 겔의 형태로 제공될 수 있고, 따라서 겔, 트로프엘라스틴 또는 그 속의 단편이 상처 가장자리와 접촉을 유지하는 것을 가능하게 하도록 제공될 수 있다. 특정 겔 성분배합물의 실시예들은 WO2012068619호에서 일반적으로 논의된 것들을 포함한다.
다른 구현예에서, 트로프엘라스틴은 상처 가장자리와 고상의 접촉이 유지되기에 적합한 드레싱, 스텐트, 장치 등과 같이 고상(따라서 트로프엘라스틴은 고상 내에 또는 고상 위에 위치하는)의 내에 또는 고상의 위에 제공된다. 예를 들어, 보철물, 증량재, 또는 지지체와 같은 고상은 겔 또는 다른 형태의 트로프엘라스틴 또는 엘라스틴 유래 펩타이드가 상처 가장자리와 접촉된 보철물 등의 선단면에 제공되는 것을 가능하게 하면서 보철물의 선단면이 상처 가장자리와 정렬되도록 배치될 수 있다. 특정한 고상 배열의 실시예들은 콜라겐과 같은 다른 결합 조직 분자와 선택적으로 전기방사를 하는 트로프엘라스틴의 전기 방사와 관련된 것들, 및 콜라겐과 같은 다른 결합 조직 분자와 공침하는 것과 관련된 것들을 포함한다.
대안적인 접근법에서, 상처 가장자리와 트로프엘라스틴의 지속적인 접촉을 가능하도록 하는 것이 트로프엘라스틴이 공급되는 조건들 그 자체이다. 예를 들어, 트로프엘라스틴은 상처 가장자리에 도포되거나 발라지는 용매로 제공될 수 있고, 그런 다음 트로프엘라스틴 또는 그의 단편을 상처의 가장자리와 접촉 상태로 둔 채 상처 가장자리로부터 용매를 증발시키기 위한 조건들이 제공된다.
트로프엘라스틴 및 엘라스틴 유래 단편은 대개 치료학적 유효량만큼 제공된다. 이는 트로프엘라스틴 또는 엘라스틴 유래 단편이 그렇게 제공되지 않는 환경에서의 재상피화가 되는 범위 또는 재상피화 시간과 비교했을 때, 재상피화의 범위 또는 재상피화를 완료하는 시간 중 하나의 맥락에서 재상피화의 개선을 이끌어낼 수 있는 임의의 양이다. 비록 상술한 피부 조직의 재생과 관련된 다양한 요인들에 의존적이지만, 일반적으로 트로프엘라스틴은 약 0.1 mg/ml 내지 250 mg/ml의 농도로 제공된다. 이 범위 내에서, 1 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml 및 200 mg/ml 농도는 특히 유용할 수 있다.
따라서, 일 구현예에서는 상처 치유 방법이 제공되며, 이 방법은:
- 그의 주변에 위치한 복수의 상피세포를 포함하여 상처 가장자리를 형성하는 상처를 가진 개인을 제공하는 단계;
- 상처의 재상피화를 가능하게 하는 시간 기간 동안 트로프엘라스틴이 상처 가장자리에 지속적인 접촉을 가능하게 하는 조건에서 약 0.1 mg/ml 내지 250 mg/ml 농도의 트로프엘라스틴을 상처 가장자리에 접촉하는 단계를 포함하고; 상처의 재상피화는 상처의 치유를 가능하게 하고; 이로써 상처를 치유한다. 이 구현예에서, 트로프엘라스틴은 트로프엘라스틴이 상처 가장자리와 지속적인 접촉을 위해 상처 가장자리에 적용할 수 있는 형태로 사용되도록 제공될 수 있다. 이러한 형태는 겔일 수 있다. 바람직하게는, 이 구현예에서 트로프엘라스틴은 1 주일 미만의 기간 동안 상처 가장자리와 지속적인 접촉을 제공하며, 바람직하게는 상처 기저부와 접촉하지 않는다.
본 발명에 따르면, 트로프엘라스틴 또는 엘라스틴 유래 펩타이드는 상처의 재상피화를 가능하게 하는 기간 동안 제공된다. 이 기간은 대개 상처의 속성과 조직 재생과 관련된 상술한 다른 요인들에 따라 달라진다. 상처가 외상으로 인한 경미한 급성 상처라면, 약 1 내지 2 주 미만의 기간 동안 트로프엘라스틴을 상처 가장자리에 지속적으로 접촉하도록 제공할 필요가 있다. 이 경우 일회성 트로프엘라스틴의 처방만으로 충분할 수 있다. 비록 상처의 크기와 속성에 따라 달라질 수 있지만, 수술로 인한 깨끗한 상처에 동일하게 적용할 수 있다. 상처가 더 복잡한 경우, 예를 들어 중증 외상 또는 만성 손상에서처럼, 예를 들어 진피 조직 또는 하부 조직에 실질적인 손상을 초래하는 경우, 예를 들면 상처를 일상적으로 드레싱하고 소독하는 기간에 맞춰 정렬된 투여 스케줄에 따라 트로프엘라스틴을 제공할 필요가 있다. 이러한 상황에서는 1주 내지 3주 또는 더 이상의 기간 동안 매일 트로프엘라스틴을 상처 가장자리에 추가하거나, 1주 내지 3주 또는 그 이상의 기간 동안 치료학적 유효량만큼의 트로프엘라스틴이 상처 가장자리에 지속적인 방출이 가능한 형태로 추가할 필요가 있다.
본 발명의 상술한 구현예는 상처의 치유로 이어지는 상처 치유 과정 동안 트로프엘라스틴이 상처 가장자리와 지속적인 접촉을 통해 발생하는 상처의 개선된 재상피화이다. 이 구현예에서, 그리고 본원의 실시예들을 통해 확립된 바와 같이, 트로프엘라스틴이 상처 기저부와 실질적인 접촉 없이도 재상피화를 개선하는 것이 가능하다.
일반적으로 알 수 있는 바와 같이, 상처 기저부는 진피층 내에 일반적으로 형성되고 피하층 또는 진피층의 아래에 위치한 다른 층들까지 연장될 수 있다. 일반적으로 이해되는 상처 기저부는 손상되지 않은 정상 조직, 특히 상처 내에 위치한 진피 조직의 표면이다. 상처 기저부는 육아조직의 형성이 발생하는 상처의 일부로서 달리 정의될 수 있다. 상처 기저부는 일반적으로 표피 조직을 포함하지 않으며, 따라서 상처 기저부 자체는 본원에서 언급된 것처럼'상처 가장자리'를 포함하지 않는다. 구체적으로는, 일반적으로 알 수 있는 바와 같이, 진피층을 침투한(가령 부분 두께 또는 전체 두께로 상처 입은) 모든 피부 상처들은 상처 가장자리와 상처 기저부를 가지게 된다. 피상적 피부 상처들은 상처 가장자리를 가지지만 실질적인 상처 기저부(실제로, 피상적 상처는 단순히 노출되었을 수도 있지만, 손상되지 않은 진피 조직일 수 있다.)를 가지지 않을 것이다. 따라서, 일반적으로 알 수 있는 바와 같이 그리고 본 발명에 따르면, '상처 가장자리' 및 '상처 베드'는 두 개의 다른 개념이다.
본원에 기재된 하나의 특정 응용예는 흉터 및 이와 관련된 섬유증 조직의 개조 또는 실질적인 제거에 있다. 일반적으로 알 수 있는 바와 같이, 흉터 조직은 조직 회복의 결과로 발생한다. 마지막 결과는 흉터 또는 섬유증이 위치하는 중요한 조직의 구조 및 기능적 양상들이 부족한 조직 구조의 형성이다. 특히, 본원에서 설명된 상처 구조와 상대적인 트로프엘라스틴 또는 엘라스틴 유래 단편의 위치를 발견하는 것, 그런 다음 조직 재생의 핵심 요소를 유도하는 것이 가능하게 되고, 그런 다음 상처를 유도하고, 또 흉터 조직에서 상처 치유과정을 유도하는 것이 가능해진다. 따라서, 다른 구현예에서, 흉터 조직을 최소화하는 방법이 제공되며, 이 방법은:
- 흉터 조직을 가진 개인을 제공하는 단계;
- 그의 주변에 위치한 복수의 상피세포들을 포함하여 상처 가장자리를 형성하는 상처를 흉터 조직에 형성하는 단계;
- 상처의 재상피화가 가능한 기간 동안 트로프엘라스틴을 상처 가장자리와 지속적인 접촉이 가능하도록 하는 조건에서 치료학적인 유효량만큼의 트로프엘라스틴을 상처 가장자리에 접촉하는 단계를 포함하고; 상처의 재상피화는 흉터 조직을 최소화하고; 이로써 흉터 조직을 최소화한다.
일 구현예에서, 흉터 조직을 최소화하는 것은 흉터 조직의 제거를 의미한다. 다른 구현예에서, 피부의 주어진 영역에서 흉터 조직의 체적을 최소화하거나, 흉터 조직의 과다함을 최소화함으로써 흉터 조직은 최소화된다.
상처는 당 업계에 알려진 다양한 기술에 의해 생성될 수 있다. 특히 바람직한 한 가지 방법은 흉터에 다수의 상처를 생성하도록 흉터 조직을 따라 복수의 미세 천공을 형성하는 것을 포함한다. 그 다음, 본원에 설명된 조직 재생 과정들이 가능하도록 트로프엘라스틴 또는 엘라스틴 유래 펩타이드가 상처 가장자리 또는 상처 기저부와 지속적으로 접촉되어 제공된다.
일 구현예에서, 트로프엘라스틴은 트로프엘라스틴의 단량체들이 가교되지 않은 형태로 제공된다.
다른 구현예에서, 트로프엘라스틴은 리질옥시다제(lysyl oxidase) 또는 다른 가교 시약을 포함하지 않는 조성물의 형태로 제공된다.
다른 구현예에서, 트로프엘라스틴은 아미노산계 산화 방지제(antioxidants)를 포함하지 않는 조성물의 형태로 제공된다.
일반적으로, 본 발명에 사용하기 위한 트로프엘라스틴은 재조합형 트로프엘라스틴 또는 합성 트로프엘라스틴으로 무세포 조성물로 제공된다.
본원에 사용된 바와 같이, 문맥상 달리 요구하는 경우를 제외하고, "포함(comprise)"의 용어 및 가령 "포함하는(comprising)" "포함하다(comprises)" 및 "포함된(comprised)"과 같은 이 용어의 변화는 추가적인 첨가물, 성분, 정수 또는 단계를 배제하기 위한 의도가 아니다.
선행 문단에서 기재된 본 발명의 추가적인 양태 및 그 양태들의 추가적인 구현예들은 일례로 첨부된 도면을 참조하여 주어진 다음의 기재로부터 명백해질 것이다.
명세서에 개시되고 정의된 본 발명은 언급되거나 텍스트 또는 도면으로부터 분명한 두 가지 이상의 개별 특징들로 이루어진 모든 대안적인 조합들로 확장된다는 것이 이해될 것이다. 이러한 모든 상이한 조합들은 본 발명의 다양한 대안적인 양태들을 구성한다.
실시예들
실시예
1 전체 두께 외과적 상처의 진피 재생
본 연구는 rH TE를 사용하거나 사용하지 않는 인테그라 진피 템플릿의 응용예를 따른 돼지 모델에서, 전체 두께의 외과적 상처의 진피 재생에 재조합형 인간 트로프엘라스틴(rH TE)이 미치는 영향을 평가하였다. 2주 동안 재생된 진피를 분석한 결과 인테그라 진피 템플릿에 rH TE가 존재하는 것이 상처 회복 과정의 개선으로 이어진 것으로 나타났다. 개선은 섬유아세포 숫자의 증가, 상승된 콜라겐 침착, 재생된 진피 조직의 증가된 혈관 신생, 및 재생된 진피에서 검출된 엘라스틴 섬유의 증가된 레벨로 표시되었다. 이러한 이벤트들은 rH TE의 존재에 의해 상처의 상피화를 개선하는 결과를 도출하는 각질형성세포 증식의 증가를 동반하였다.
재료 및 방법
시험 항목
본 연구에는 세 가지 제품을 평가하였고, 세 가지 제품은:
- 대조: 인테그라 진피 템플릿
- 시험 A: 10% rH TE(엘라스틴화된 인테그라)를 통합한 인테그라 진피 템플릿
- 시험 B: 4% rH TE 하이드로겔에 배치된 인테그라 진피 템플릿
전체 두께 돼지 모델
본 연구에는 두 마리의 돼지가 이용되었으며, 각자 4 곳의 상처 부위가 있고, 아래 이미지에 도시된 바와 같이 돼지의 양 측부에 두 개씩이 있었다.
각 돼지에 있어서, 일 측부의 두 개의 상처는 인테그라로 덮였고 타 측부의 두 개의 상처는 도 1a에 표시된 바와 같이 시험 A 및 B를 처치하였다.
●
0일째
○
위의 그림에서 표시된 바와 같이 직경 5 cm의 전체 두께의 절개된 원형 상처가 각 돼지의 상부 등에 생성되었다.
○
위의 그림에서 표시된 바와 같이 각 상처에는 제어 인테그라 진피 템플릿 또는 시험 A 또는 B 중 하나를 처치하였다.
●
7일째(1주)
○
모든 상처에 드레싱을 교환함.
●
14일째(2주)
○
도 1b에 도시된 바와 같이 상처 가장자리로부터 몇 mm 떨어진 각 상처 부위로부터 4 mm의 생검을 채취함.
상처 분석
상처 부위에서의 샘플링은 수술 및 처치로부터 2주 후에 이루어졌다. 상처 부위의 생검은 전술한 바와 같이 수행되었다. 샘플들은 섬유모세포의 침윤, 콜라겐 및 엘라스틴의 침착, 재생된 조직의 혈관 신생 및 상피의 재생을 평가하기 위해 조직 병리학 및 면역 조직 화학 분석을 실시하였다.
결과
인테그라 진피 템플릿의 섬유아세포 침투:
섬유아세포의 숫자는 모든 구조에서 증가하였지만 rH TE가 존재하는 곳에서 보다 상승했다. rH TE가 전체 구조를 투과한 엘라스틴화된 인테그라에 있어서 효과는 가장 뚜렷했다.
콜라겐 및 엘라스틴 침착:
도 2에 도시된 바와 같이, 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)(H&E) 및 Verhoeff-Van Gieson(VVG) 염색에 의해 증명된 바와 같이 향상된 섬유아세포 레벨은 rH TE의 존재 하에서 콜라겐 침착으로 이어졌다.
처치된 부위로부터 채취한 생검 단면들에서 엘라스틴의 존재(즉, rH TE가 아닌)는 생검 단면의 VVG 염색에 의해 평가되었다. 내생 엘라스틴 섬유를 진피 회복 과정 동안 재생되었던 것들로부터 정확하게 구별할 수 없었기 때문에, 처치된 각 부위로부터의 조직 단면들은 회복된 진피 조직 내에 엘라스틴 섬유가 존재 또는 부재하는지를 단순히 기록하였다. 본 연구에서 인테그라 진피 템플릿, 인테그라 진피 템플릿에 4% rH TE의 하이드로겔, 및 엘라스틴화된 인테그라를 위해 분석된 총 단면의 숫자는 각각 32, 16, 및 16개였다. 결과는 하기 표 1에 요약되어 있다.
| 처치 | 신생 진피에서 엘라스틴 섬유가 검출된 단면들 |
| 인테그라 진피 템플릿 단독 | 2/32 (6.25%) |
| 인테그라 진피 템플릿 + 4% TE 겔 | 8/16 (50%) |
| 엘라스틴화된 인테그라 | 4/16 (25%) |
VVG 염색된 생검 단면들의 분석 도중에 발견된 진피 조직의 예는 도 3에 제공된다. 또한, rH TE 하이드로겔에 인접한 진피 조직에 존재하는 엘라스틴 섬유의 예는 도 4에 제공된다.
재생된 진피의 혈관 신생:
재생된 진피에서 혈관 신생의 레벨은 병리학에 의해 평가하였다. 도 5에 기재된 것처럼, 생검 단면 조직의 다른 레벨들에서의 혈관의 숫자는 피하에서 시작하여 표피쪽으로 점진적으로 이동하는 현미경으로 평가하였다. 도 5에 제시된 데이터로부터 알 수 있는 바와 같이, 인테그라 피부 템플릿(엘라스틴화된 인테그라)에서 rH TE의 존재는, 인테그라 진피 템플릿으로 처치된 부위와 비교했을 때, 재생된 조직에서 특히 표면 진피 방향으로 혈관 숫자의 증가로 귀결되었다. 유사한 경향은 4% rH TE 겔의 상부에 인테그라 진피 템플릿을 더하여 처치가 된 부위에서 나타났다.
상피 재생:
상처 부위에서 상피의 재생은 다른 시험 및 대조 항목들에 대한 엘라스틴화된 인테그라의 가장 눈에 띄는 장점 중 하나였다. 표 2에 상세하게 기술되고 도 6에 도시된 바와 같이, 엘라스틴화된 인테그라는 2주 만에 상처 부위가 거의 완전히 재상피화 되도록 하였고, 자연스러운 진피-상피 결합을 보여주는 망상융선의 존재를 수반했다.
| 처치 |
상피의 존재 | 망상융선의 존재 | ||||
| 부분적 | 완전 | 상피 일부 | 모든 상피 | 작은 돌기들만 | 현저한 돌기 | |
| 인테그라 단독 | 18.8% | 0.0% | 12.5% | 0.0% | 6.3% | 6.3% |
| 인테그라 + rH TE | 12.5% | 0.0% | 12.5% | 0.0% | 0.0% | 12.5% |
| 엘라스틴화된 인테그라 | 12.5% | 7.5% | 12.5% | 62.5% | 12.5% | 62.5% |
결론 및 논의
도 7에 도시된 바와 같이, rH TE가 엘라스틴화된 인테그라에 혼입될 때 진피 회복 과정에 생물학적 자극을 제공하는 경우, 이 데이터는 모델에 의해 설명된다. 이는 섬유모세포의 침윤, 재생된 조직의 혈관 신생 및 상처 부위의 상피화의 더 큰 레벨로 이어진다. 이러한 이점은 엘라스틴화된 인테그라의 사용이 피부 이식의 필요성을 배제할 수 있다는 것을 의미한다. 트로프엘라스틴이 단구(monocytes: 혈관 신생에 기여하고 가령 섬유로 분화하는) 및 섬유아세포를 포함하여 조직 회복 과정에 관련된 세포에 화학 주성이므로, 이러한 생물학적 자극은 조직 회복 과정에 기여하는 것으로 알려진 rH TE의 성능과 일치한다[Almine 등, 2012].
이들 효과들이 rH TE의 존재에 의한 것이라는 확인은 증가된 섬유아세포의 침윤 및 혈관 신생에 대해 유사한 경향을 보였던 인테그라 진피 템플릿 + 4% rH TE 하이드로겔로부터 나타났다. 하이드로겔의 국소 전달에 대하여 예상된 것처럼, 이들 효과들은 rH TE 함유 겔이 도포된 더 깊은 진피에 한정되었다. 이러한 효과들은 진피의 더 깊은 층에 대해서는 일차적으로 제약되므로, 상피의 재생은 보이지 않았다; 즉, rH TE 겔은 인테그라 진피 템플릿에 의해서 피부 진피 및 상피로부터 분리되었다. 재생 진피의 이러한 생검에서 더 많은 엘라스틴 섬유를 보았다. 이는 rH TE의 지속적인 방출에 의한 것이기 쉽다. rH TE 겔은 탄성 섬유를 구성하는 재생 섬유아세포에 이용될 수 있는 트로프엘라스틴을 공급하면서, 수정되지 않고 겔로부터 점진적으로 용출되는 전체 길이의 트로프엘라스틴 단량체를 함유한다. 일차적인 인간의 피부 섬유아세포는 세포의 성장을 위한 기질로서 rH TE를 활용하고, 리실 산화효소(그의 활성이 BAPN에 의해 억제되는)에 의존적이면서 엘라스틴 섬유의 성숙(엘라스틴 섬유의 탄성도 및 형광 특성의 측정에 의해 입증된 바와 같이)을 초래하는 과정을 통해서 rH TE를 엘라스틴 섬유로 개조한다[Weiss lab, 미간행 데이터].
결론적으로, 이러한 연구들이 적은 수의 동물을 대상으로 수행된 것임을 인식하더라도, rH TE를 인테그라 진피 템플릿에 혼입하는 것은 진피 및 상피의 재생을 실질적으로 촉진할 수 있다는 점이 나타날 수 있다.
실시예
2: 전기 방사, 공동 침전 및 겔 기반 제제의 사용.
본 연구에는 각각 4 개의 5 cm 직경의 원형 상처 부위를 각각의 측부에 2 개씩 가진 돼지들이 사용되었다. 각각의 돼지에 관해서는, 일 측부에 있는 2 개의 상처에는 시판되고 있는 피부 템플릿 제품을 적용하였고, 타 측부에 있는 2 개의 상처에는 검사 항목 A, B, 또는 C 중의 하나가 처치되었다.
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0일째
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위의 그림에서 언급한 바와 같이 직경 5 cm의 전체 두께의 4개의 절개된 원형 상처가 각 돼지의 상부 등에 생성되었다.
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각 상처에는 제어 피부 템플릿 또는 시험 항목 A, B 또는 C 중의 하나를 처치하였다.
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7일째(1주)
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모든 상처에 드레싱을 교환함.
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14일째(2주)
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도 1b에 도시된 바와 같이 상처 가장자리로부터 몇 mm 떨어진 각 상처 부위로부터 4 mm의 생검을 채취함.
상처 분석
상처 부위에서의 샘플링은 수술 및 처치로부터 2주 후에 처음 실시되었다. 상처 부위의 생검은 상술한 바와 같이 수행되었다. 샘플들은 섬유모세포의 침윤, 콜라겐 및 엘라스틴의 침착, 재생된 조직의 혈관 신생 및 상피의 재생을 평가를 위해 조직 병리학 및 면역 조직 화학 분석을 실시하였다.
시험 항목 A의 준비: 전기 방사 지지체
다른 비율의 트로프엘라스틴 및 콜라겐을 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올(HFP)의 20%(w/v) 단백질 용액에 혼합하였다. 이들은 100%의 트로프엘라스틴, 80% 트로프엘라스틴과 20%의 콜라겐, 60% 트로프엘라스틴과 40%의 콜라겐, 50% 트로프엘라스틴과 50%의 콜라겐, 및 100%의 콜라겐을 포함하였다. 용액은 무딘 18 게이지 바늘이 장착된 주사기에 채워졌고, 유량은 주사기 펌프를 사용하여 3 ml h1으로 조절되었다. 바늘은 20 kV의 양의 전원에 연결되었고 집전 간격이 20 cm 이격된 30 mm 직경의 원형 브라스 집전장치에 직접 접지되었다. 전기 방사 지지체는 수용성의 환경에서 구조를 안정시키기 위해 화학적으로 가교되었다. 지지체는 개방 단계의 건조기에 넣어져, 분리된 25%(v/v) 수성 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 용액의 증기로 가교된 뒤, 0.2 M 글리신(glycine) 용액에 밤새 침지하여 식혔다. 그런 다음 지지체를 PBS에서 반복하여 세척하였다. Rmjak-Kovacina, J. 등의 Acta Biomater. 2012 Oct; 8(10): 2714-22 참조. 이 항목은 아래의 시험 항목 B보다 훨씬 더 많이 가교된다. 이것은 세포의 침윤에 더 순응하는 경향이 있다.
시험 항목 B의 준비:
트로프엘라스틴을
혼합하는 콜라겐 스펀지
0.05 M 아세트산(pH 3.2) 내의 10% w/w 트로프엘라스틴과 혼합된 I 형 소 콜라겐의 백색 공침전물은 동결 건조하여 다공성 백색 막으로 변환되었다. 기공의 평균 직경의 제어는 액체 질소에 동결할 때 초기 저장온도 스냅을 조정함으로써 달성되었다. 건조한 고체를 105℃, 6 kPa의 진공에 24시간 동안 후속 노출하는 것은 콜라겐의 폴리펩타이드(polypeptide) 사슬 사이에 공유결합 가교를 유도하였다. 구조체는 0.05 M 아세트산의 0.25% 수성 글루타르알데히드 함유 조에 침지되었고, 콜라겐은 추가적인 공유결합을 겪었다. 구조체들은 탈 이온수로 24시간 동안 세정되었다. Kanematsu, A., 등 Biomaterials. 2004 Aug; 25(19): 4513-20 참조. 이는 위의 시험 항목 A보다 분해에 더 강하게 저항하는 경향이 있다.
시험 항목 C의 준비: 아래에
트로프엘라스틴을
가진 콜라겐 스펀지
WO2012068619호에 기재된 바와 같이 전체 길이의 트로프엘라스틴은 히알루론산 겔에 필수적으로 포함되었고 사용 전에 주사기에 채워졌다. 겔을 노출된 상처 기저부의 표면에 도포한 다음, 시험 항목 B에 기재된 바와 같이 만들어지되 트로프엘라스틴이 생략된 콜라겐 스폰지로 겹쳐 두었다.
실시예
3: 돼지
니들링
피부 모델에서 상피 재생의 평가
돼지는 등 전체에 걸쳐 최대 10개의 2 cm x 2 cm 부위 각각에 처치를 받았다. 각각의 부위는 세 가지 치료방법 중의 한 가지를 받았으며, 세 가지 치료 방법은 다음과 같다:
1) 부위 A: 처치되어야 할 피부 전체에 걸쳐 약 2 mm 간격마다 마이크로 코어링 니들을 사용하여 천공 상처를 받았다. 니들 처치를 받은 다음 1% 내지 5% w/v 트로프엘라스틴 단백질을 함유한 겔이 처치된 영역에 국소적으로 도포되었고 Tegaderm 드레싱에 의해 상기 겔이 잔류하고 천공된 부위들을 통과할 수 있도록 유지되었다.
2) 부위 B: 피하 주사 바늘을 이용하여 각 천공이 피부 조직의 상부 진피 내로 1% 내지 5% w/v 트로프엘라스틴 겔 0.05 ml 내지 0.5 ml의 주입을 포함하는 천공 상처들을 받았다. 이 천공/주입은 처치되어야 할 피부의 영역에 걸쳐 대략 2 mm 간격으로 적용되었고, 상처의 드레싱이 이어졌다.
3) 부위 C: 0.5 ml 내지 2 ml의 1% 내지 5% w/v 트로프엘라스틴 겔을 상부 진피 내에 크로스 해칭 주입 기술을 이용하여 주입을 받았고, 이어서 처치 영역에 걸쳐 대략 2 mm 간격으로 마이크로 코어링 바늘을 이용한 천공 상처를 적용하였다.
사진 촬영 및 천공 생검은 0일째, 7일째, 및 28일째에 수행되었다. 샘플들은 섬유모세포의 침윤, 콜라겐 및 엘라스틴의 침착, 재생된 조직의 혈관 신생 및 상피의 재생을 평가하기 위한 조직 병리학 및 면역 조직 화학 분석을 실시하였다.
실시예
4: 레이저를 이용한 돼지 피부로의
트로프엘라스틴의
전달 모델에 따른 상피 재생의 평가
미소 레이저 박피는 피부에 국소 적용 약물의 전달을 지원하는 대략 3 mm 깊이의 수직 채널을 피부에 만든다. 돼지들은 등 부위에 걸쳐 최대 10개의 2 cm x 2 cm 크기의 부위를 각각 처치 받았다. 각 부위는 Haedersdal 등의 2010 (lasers Surg Med. 42(2): 113-22)에 기재된 바와 같이, 본질적으로 미소 싱글 홀 CO2 레이저로 필수 처치되었다. 레이저 처치에 이어서, 시험 부위들은 아래 중의 하나를 받았다:
- 1% 내지 5% w/v 트로프렐라스틴을 함유한 히알루론산 겔; 또는
- 히알루론산 겔 제어
사진 촬영 및 천공 생검은 0일째, 7일째, 및 28일째에 수행되었다. 샘플들은 섬유모세포의 침윤, 콜라겐 및 엘라스틴의 침착, 혈관 신생 및 상피의 재생을 평가하기 위한 조직 병리학 및 면역 조직 화학 분석을 실시하였다.
참고
Almine 등 2012. Elastin Signaling in Wound Repair. Birth Defects Research (Part C) 96:248-257.
Claims (8)
- 그의 주위에 위치한 복수의 상피세포들을 포함함으로써 상처 가장자리를 형성하는 상처를 가진 개인을 제공하는 단계; 및
상처의 재상피화를 가능하게 하는 시간 동안 상처 가장자리와 트로프엘라스틴의 지속적인 접촉을 가능하게 하는 조건에서 치료학적 유효량의 트로프엘라스틴을 상처 가장자리와 접촉하는 단계를 포함하고서,
상처의 재상피화는 상처의 치유를 가능하게 하고;
이로써 재상피화가 상처를 치유하는 것인 상처 치유 방법.
- 제1항에 있어서, 트로프엘라스틴은 트로프엘라스틴이 상처 가장자리와 지속적인 접촉이 가능하도록 점도 또는 점착성을 갖는 겔(gel)의 형태로 제공되는 것인 상처 치유 방법.
- 제1항에 있어서, 트로프엘라스틴은 고상의 선단 표면에 제공되고, 고상의 선단 표면이 상처 가장자리와 정렬되도록 상기 고상은 상처 기저부에 배치되어, 이로써 트로프엘라스틴이 상처 가장자리와 지속적으로 접촉할 수 있도록 하는 것인 상처 치유 방법.
- 제3항에 있어서, 고상은 드레싱, 스텐트, 지지대, 증량재 또는 보철물인 것인 상처 치유 방법.
- 제1항에 있어서, 트로프엘라스틴의 용액은 상기 용액으로부터 용매의 증발을 가능하게 하는 조건에서 상처 가장자리에 분사되어, 이로써 트로프엘라스틴이 상처 가장자리와 지속적으로 접촉할 수 있도록 하는 것인 상처 치유 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 트로프엘라스틴은 약 0.1mg 내지 250mg/ml의 양으로 상처 가장자리에 제공되는 것인 상처 치유 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 트로프엘라스틴은 약 1주 내지2주를 넘지 않는 기간 동안 상처 가장자리에 지속적으로 접촉하도록 제공되는 것인 상처 치유 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 트로프엘라스틴이 상처 기저부와 지속적으로 접촉할 수 있도록 트로프엘라스틴은 상처 기저부와 접촉되지 않는 것인 상처 치유 방법.
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