JP6316943B2 - 鼓膜治癒のためのヘパリン結合性上皮成長因子活性の調節法 - Google Patents

Description

鼓膜（ＴＭ）の穿孔は、最も一般的には、中耳炎または外傷のいずれかの結果として生じる。臨床的に、ＴＭ穿孔の最も一般的な症状は、伝音難聴及び慢性感染である。ＴＭ穿孔の最も一般的な原因は、感染である。合併症のない急性中耳炎に伴う穿孔は、通常小さく、大半は一旦感染が寛解すると自然に治癒する。さらに、大きな穿孔は、壊死を引き起こす生物による感染から生じ得る。耳への外傷は、ＴＭ穿孔の他の主要な原因である。損傷の一般的な原因は、鈍的かつ穿通性の傷害、急速な気圧変化（気圧外傷）、及び過剰な音圧である。

傷害の後に、組織がいくつかの治癒段階を経ることは知られている。鼓膜の創傷治癒は、通常の皮膚治癒に類似する初期止血及び炎症段階を伴うが、鼓膜の増殖及び移行期は、他の組織のそれとは明らかに異なる。ほとんどの創傷治癒状況においては、肉芽組織層が形成し、再上皮形成が起こるプラットフォームとして機能する。鼓膜の治癒においては、これらの事象は逆の様式で起こる。扁平上皮層は、最初に創傷を横切る橋を形成し、そうすることで初めて、線維性成分の再形成が続く。ＴＭは、上皮層が移行において重要な初期役割を果たすということにおいて固有であり、基底増殖層がこの過程を制御する。

ほとんどの鼓膜穿孔は自然に治癒するが、いくつかの因子が閉鎖を遅延または阻止する可能性があり、慢性穿孔をもたらす。持続性穿孔は一般に、修復過程を損なう持続性感染の状況下で生じる。これらの状況において、膜の再生治癒過程は妨害され、創傷にわたる走化作用及び後次の上皮移動を妨げる。組織学的に、慢性穿孔において、扁平上皮は穿孔の縁部を越えて成長し、ＴＭの内側粘膜層に達する。

慢性ＴＭ穿孔のための治療は、目標として慢性中耳炎の治療または予防、及び聴力の回復を含む。従来の治療として、組織移植片の使用を含み、例えば、鼓室形成術において用いられる自家移植片は、側頭筋膜を自家移植片として使用し得る。コラーゲンマトリックス中の線維芽細胞で構成された浅側頭筋膜を使用することができる。自家結合組織移植を用いる鼓室形成術は、持続性ＴＭ穿孔の修復のための成功率の高い方法であるが、顕微手術の技術を必要とせず、安価であり、診察所状況で適用可能である処置を開発することが有益であろう。本発明は、この必要性に取り組む。

刊行物
Ｓａｎｔａ Ｍａｒｉａ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ Ｍｏｌ Ｈｉｓｔｏｌ．２０１０ Ｄｅｃ；４１（６）：３０９−１４（非特許文献1）。Ｓａｎｔａ Ｍａｒｉａ（２０１１）Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ａｕｓｔｒａｌｉａ（非特許文献2）。Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｗａｎｇ（２０１３）Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ １６６（２）：１２４−９（非特許文献3）。Ｉｓｈｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ Ａ．６４（３）：５５１−９（非特許文献4）。Ｔｏｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１８１０（９）：８７５−８（非特許文献5）、Ｓｈｉｒａｋａｔａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１８（Ｐｔ １１）：２３６３−７０（非特許文献6）、Ｈuｔｔｅｎｂｒｉｎｋ（２００５）ＨＮＯ ５３（６）：５１５−６（非特許文献7）、Ｍａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ａｃｔａ Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．１２２（６）：５８６−９９（非特許文献8）。ＷＯ ２００７／０３７５１４（特許文献1）。ＵＳ ２０１０／０２２２２６５（特許文献2）。

ＷＯ ２００７／０３７５１４ ＵＳ ２０１０／０２２２２６５

Ｓａｎｔａ Ｍａｒｉａ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ Ｍｏｌ Ｈｉｓｔｏｌ．２０１０ Ｄｅｃ；４１（６）：３０９−１４ Ｓａｎｔａ Ｍａｒｉａ（２０１１）Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｗａｎｇ（２０１３）Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ １６６（２）：１２４−９ Ｉｓｈｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ Ａ．６４（３）：５５１−９ Ｔｏｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１８１０（９）：８７５−８ Ｓｈｉｒａｋａｔａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１８（Ｐｔ １１）：２３６３−７０ Ｈuｔｔｅｎｂｒｉｎｋ（２００５）ＨＮＯ ５３（６）：５１５−６ Ｍａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ａｃｔａ Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．１２２（６）：５８６−９９

慢性鼓膜穿孔の治療のための組成物及び方法が提供される。本発明の方法において、慢性的に穿孔した鼓膜は、膜穿孔の改善された治癒を提供するのに十分な期間にわたって、有効量のヘパリン結合性上皮成長因子、すなわちＨＢ−ＥＧＦ、またはＨＢ−ＥＧＦ活性を有する薬剤と、局所的に接触させられる。いくつかの実施形態において、ＨＢ−ＥＧＦの用量は、持続放出製剤中に提供され、他の実施形態においては、非持続放出製剤の定期投与が提供される。いくつかの実施形態において、持続放出製剤は、生体分解性である。他の実施形態において、持続放出は、デバイス、例えば、ポンプまたは他の放出デバイスによって提供される。

治療されるＴＭは、ＴＭ穿孔の治癒を改善するため、すなわち、穿孔の実質的な閉鎖をもたらすため、例えば、穿孔の面積を約０．１ｍｍ^２未満にするのに十分な期間にわたって、ＨＢ−ＥＧＦと接触させられる。閉鎖は、視覚的に（微視的を含む）、機能的に（例えば、聴力損失の低減）、及びその他で監視することができる。ＨＢ−ＥＧＦと接触させる期間は、少なくとも１日、少なくとも３日、少なくとも５日、少なくとも７日、少なくとも１０日、少なくとも２週間、少なくとも３週間であり得、また個体の必要性によって最大１日、最大３日、最大５日、最大７日、最大１０日、最大２週間、最大３週間、またはそれよりも長い期間であり得る。

ある特定の実施形態において、有効量のＨＢ−ＥＧＦは、耳毒性のない持続放出製剤中、例えば、ゲル、発泡体、挿入体等、好ましくは生体分解性製剤中に提供される。そのような一実施形態において、有効量のＨＢ−ＥＧＦは、キトサン、ポリ乳酸、及びフィブリノゲンを含むゲル中に製剤化される。

一実施形態において、本発明は、（ｉ）ＴＭの慢性穿孔を有する患者を特定し、（ｉｉ）罹患したＴＭを有効量のＨＢ−ＥＧＦと接触させ（例えば、適切な間隔で投与される液滴の形態で、ＨＢ−ＥＧＦの持続放出のためのデバイスにおいて、または持続放出製剤等において、提供される）、（ｉｉｉ）穿孔の有効な閉鎖を判定するために個体を監視する、方法を含む。

本発明の別の態様は、ＴＭの慢性穿孔の治療のための医薬の製造における、ＨＢ−ＥＧＦ活性を有する薬剤の使用に関し、その医薬は、穿孔の閉鎖をもたらすために十分な期間及び用量で、ＴＭの慢性穿孔を有する患者に投与される。

本発明のさらに別の態様は、ＴＭの慢性穿孔の治療のためのキットを提供する。このキットは、有効量のＨＢ−ＥＧＦを提供する製剤を、例えば、液滴、デバイス、製剤等の形態で含む。キットは、例えば、点耳剤分注器、製剤の送達のためのシリンジ、二成分製剤を送達するための二重バレルシリンジ等の送達デバイスも含み得る。キットは、使用説明書も含み得る。

他の実施形態において、例えば、管の挿入等のための、鼓膜の一時的開口のための方法が提供される。そのような実施形態において、ＴＭは、ＴＭに小さな穿孔を創出するのに十分な期間にわたって、限定的ではないが、ＥＧＦＲリガンドシェディング（Ｌｉｇａｎｄ ｓｈｅｄｄｉｎｇ）の阻害剤を含む、有効量のＨＢ−ＥＧＦ阻害剤と接触させられる。いくつかのそのような実施形態において、小さな穿孔は、阻害剤と接触させられる前に機械的に開けることができる。
[本発明1001]
慢性鼓膜穿孔の部位を、該穿孔を実質的に閉鎖するのに十分な期間にわたって、ヘパリン結合性上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）活性を提供する有効量の薬剤を含む製剤と接触させる工程
を含む、個体における慢性鼓膜穿孔の治癒を改善する方法。
[本発明1002]
ＨＢ−ＥＧＦ活性を提供する前記薬剤が、可溶形態のＨＢ−ＥＧＦタンパク質である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記個体がヒトであり、前記ＨＢ−ＥＧＦがヒトＨＢ−ＥＧＦである、本発明1002の方法。
[本発明1004]
有効量のＨＢ−ＥＧＦを含む前記製剤が、前記罹患した鼓膜と少なくとも7日間接触させられる、本発明1001の方法。
[本発明1005]
有効量のＨＢ−ＥＧＦを含む前記製剤が、前記罹患した鼓膜と少なくとも2週間接触させられる、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記製剤が、少なくとも毎日投与される、本発明1004または1005の方法。
[本発明1007]
前記製剤が、前記ＨＢ−ＥＧＦの持続放出を提供する、本発明1004または1005の方法。
[本発明1008]
前記製剤が、水溶液、ゲル、ローション、バーム、ペースト、または他の媒体として提供される、本発明1001の方法。
[本発明1009]
組成物が、スプレーによって投与される、本発明1001の方法。
[本発明1010]
組成物が、液体として投与され、それが次いで凝固して前記鼓膜に隣接して留まる、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記製剤が、キトサン及びポリラクチドの架橋共重合体を含む持続放出ゲルである、本発明1001の方法。
[本発明1012]
前記持続放出ゲルが、フィブリノゲンをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1013]
前記製剤が、前記ＨＢ−ＥＧＦの持続放出を提供するデバイスによって送達される、本発明1001の方法。
[本発明1014]
前記製剤が、少なくとも1つの追加の活性剤をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1015]
本発明1001〜1014のいずれかの方法における使用のための有効量のＨＢ−ＥＧＦを含む、薬学的製剤。
[本発明1016]
鼓膜の慢性穿孔の治療のための医薬の製造における、ＨＢ−ＥＧＦ活性を有する薬剤の使用であって、前記医薬が、前記穿孔の閉鎖をもたらすために十分な期間及び用量で、前記鼓膜の慢性穿孔を有する患者に投与される、前記使用。
[本発明1017]
鼓膜穿孔の部位を、ＨＢ−ＥＧＦ活性を阻害する有効量の薬剤を含む製剤と接触させる工程
を含む、個体における鼓膜穿孔の治癒を阻害する方法。
[本発明1018]
前記接触させる工程の前に、前記鼓膜に穿孔を形成する工程を含む、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記個体がヒトである、本発明1017の方法。
[本発明1020]
前記製剤が、水溶液、ゲル、ローション、バーム、ペースト、または他の媒体として提供される、本発明1017の方法。
[本発明1021]
組成物が、液体として投与され、それが次いで凝固して前記鼓膜に隣接して留まる、本発明1017の方法。
[本発明1022]
前記製剤が、キトサン及びポリラクチドの架橋共重合体を含む持続放出ゲルである、本発明1017の方法。
[本発明1023]
前記持続放出ゲルが、フィブリノゲンをさらに含む、本発明1017の方法。
[本発明1024]
前記製剤が、前記ＨＢ−ＥＧＦ阻害剤の持続放出を提供するデバイスによって送達される、本発明1001の方法。

（ａ）２日目、（ｂ）１４日目、（ｃ）４４日目、（ｄ）９０日目（３ヶ月）に、ＯＳＵ８−１（ＥＧＦＲリガンドシェディングの阻害剤）で治療された穿孔後のＴＭの代表的な画像。穿孔は青色で縁取られている。 ９匹のマウスにおいて両方の鼓膜が外科的に穿孔された後６０日目に、ＡＢＲ及びＤＰＯＡＥ閾値を測定した。片方の耳には注入しなかったが（対照）、反対側の耳にはキトサン、フィブリノゲン、及びポリラクチドのポリマー送達媒体を満たした。 ガッタパーチャによる閉塞前（ａ）及び閉塞後（ｂ）のＥＴ。ラットにおける処置は、０．５ｍｍバールの彫刻デバイスを使用して耳骨胞（ｂｕｌｌａ）を開けることによって適応させた。耳骨胞を横方向に開けることは、ガッタパーチャがＥＴの下部に供給されるのを可能にし、空気の通り道の縮小が少ない。ＥＴを死後検査し、完全な閉塞を確認した。 ＥＴ閉塞のマウスモデルにおける慢性穿孔のＧＦ治療。上列（ａ）は、治癒した穿孔を示す治療群の代表的な画像である。下列（ｂ）は、穿孔の持続（青色の縁取り）を示す対照（ポリマーのみ）群の代表的な画像である。注記：上列のいくつかのＴＭは、鼓膜硬化によって治癒した。 経鼓膜成長因子送達。 経鼓膜成長因子送達。 経鼓膜成長因子送達。 鼓膜内成長因子送達。 鼓膜に隣接した薬物送達媒体。 流動性薬物送達製剤。

本発明の特徴及び多くの他の利点は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を参照することによって、より良く理解されるであろう。

発明の詳細な説明
主題の発明をさらに説明する前に、添付の特許請求の範囲内に該当しつつも特定の実施形態の変形形態が可能であることから、本発明は、下記の本発明の特定の実施形態に限定されないことを理解すべきである。用いられる用語は、特定の実施形態の説明を目的とするものであり、限定することを意図するものではないことも理解すべきである。本明細書及び添付の特許請求の範囲において、文脈が別途明確に指示しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、複数の場合を含む。

ある範囲の値が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、下限の単位の１０分の１までの、その範囲の上限から下限の間の範囲内の各値、及び表示範囲内の任意の表示値または範囲内の値が本発明に包含されることが理解される。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、独立して、より小さな範囲に含まれ得、表示範囲内の任意の明確な排除限界を条件として本発明にも包含される。表示範囲が限界の一方または両方を含む場合、そのような包含限界のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に含まれる。

特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または同等の任意の方法、デバイス、及び材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法、デバイス、及び材料がここで記載される。

本明細書で述べられる全ての刊行物は、それらの刊行物に記載される本発明の対象となる構成要素を説明及び開示する目的で、参照により本明細書に組み込まれ、それらの構成要素は、ここに記載される発明に関連して使用され得る。

本発明は、本発明の実施のための好ましい様態を含むように、本発明者によって見出されるか、または提案される特定の実施形態に関して説明された。本開示に照らして、本発明の意図される範囲から逸脱することなく、例示された特定の実施形態において多くの修正及び変更が行われ得ることは、当業者によって理解されるであろう。例えば、生物学的機能等価を考慮して、生物学的作用の種類または量に影響を及ぼすことなく、タンパク質構造に変更を行うことができる。全てのそのような修正は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。

定義
本明細書で使用される用語は、一般に、当該技術分野、本発明の文脈内、及び各用語が使用される特定の文脈における、それらの通常の意味を有する。ある特定の用語は、本発明の組成物及び方法、ならびにそれらを作製し、使用する方法を説明する際に追加のガイダンスを提供するために、下記または本明細書の別の場所で述べられる。

対象。本発明の方法による治療のための個体は、ヒトを含む任意の哺乳類または鳥類種であり得る。非ヒト動物として、制限なしに、哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、チンチラ等の実験動物；イヌ及びネコ等の飼育動物；ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、及びウシ等の農場動物を含む。本発明の非ヒト動物は、哺乳類または非哺乳類動物、脊椎動物または無脊椎動物であり得る。

疾患または状態に対して、対象の「治療」または対象を「治療する」とは、本明細書において慢性ＴＭ穿孔等の疾患または状態の臨床症状を低減または緩和することを意味する。

鼓膜または創傷の治癒を「促進する」、「強化する」、または「改善する」とは、一般に、その創傷もしくは穿孔が治癒する速度を増加させること、またはその創傷もしくは穿孔の治癒中もしくは治癒後の残留瘢痕もしくはケロイドもしくは壊死組織の程度を低減することを意味する。

「創傷」は、上皮、結合組織、及び筋肉組織を含む、臓器または組織の構造における破壊または断続である。創傷の例として、皮膚創傷、打撲、潰瘍、褥瘡、擦傷、裂傷、切り傷、穿刺、乾癬創傷、鼓膜穿孔、角膜剥離及び破壊、ならびに火傷を含むがこれらに限定されない。

「局所」適用は、創傷の表面への活性成分の非全身性局所投与を指す。

鼓膜。鼓膜は、ヒト及び他の哺乳動物における中耳から外耳を分離する薄い円錐形の膜である。その機能は、空気から中耳内の耳小骨に、次に液体で満たされた蝸牛内の卵円窓に音を伝達することである。したがって、最終的には空気中の振動を液体中の振動に変換し、増幅させる。槌骨は、鼓膜と他の耳小骨との間のギャップを橋絡する。

鼓膜には２つの一般的な領域、弛緩部及び緊張部が存在する。弛緩部は２つの層からなり、比較的脆弱であって、耳管不全及びコレステリン腫と関連する。より大きな緊張部は、皮膚、線維組織、及び粘膜の３層からなる。それは比較的頑丈であり、最も一般的に穿孔と関連する領域である。

ＴＭの破裂または穿孔は、様々な外傷、感染等から生じ得る。ＴＭの穿孔は、微小から５０ｄＢの範囲の伝音難聴（ＣＨＬ）をもたらし得る。穿孔は、領域及び場所（例えば、前方、後方、または両方）、及び約０．１〜約６０ｍｍ^２の面積、一般に約２．５〜１０ｍｍ^２の範囲で異なり得る（Ｍｅｈｔａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｏｔｏｌ Ｎｅｕｒｏｔｏｌ．２７（２）：１３６−１４３を参照）。穿孔は、急性または慢性であり得る。通常、ＴＭは自己治癒するため、急性穿孔は一般に治療されない。しかしながら、いくつかの個体において、ＴＭは治癒せず、慢性穿孔につながる。

鼓膜の慢性穿孔。治療しない場合、または従来の方法によって、例えば抗生物質治療によって治療される場合に治癒しない穿孔は、慢性穿孔と見なされ得る。個体間で治癒に必要な時間の長さに差があり得るが、一般に最大約３ヶ月後、最大約２ヶ月後、最大約１ヶ月後に治癒しない穿孔が慢性状態として分類され得ることは、当業者によって理解されるであろう。

慢性または非治癒創傷は、適度な時間内に上皮化及び閉鎖することに失敗した開放性創傷である。これらの創傷は、臨床的に不活発であり、さらなる閉鎖の徴候がない。慢性創傷は、適切な「開始」シグナルを欠いていると考えられ得る。（例えば、Ｌｏｒｅｎｚ ａｎｄ Ｌｏｎｇａｋｅｒ，ｉｎ Ｗｏｕｎｄｓ：Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，Ｃｈａｐｔｅｒ ７，ｐｐ ７７−８８を参照）。

「ヘパリン結合性上皮成長因子」は、本明細書で使用される場合、内因的に存在する哺乳類（例えば、ヒト）のヘパリン結合性上皮成長因子、対立遺伝子ヘパリン結合性上皮成長因子、ヘパリン結合性上皮成長因子の機能保存的誘導体、機能的に活性なヘパリン結合性成長因子断片、及びヘパリン結合性上皮成長因子類似体、例えば、ヘパリン結合性成長因子様成長因子を指す。ＨＢ−ＥＧＦは、例えば、強化された活性、増加した安定性、より高い収率、またはより良い溶解度を提供するＨＢ−ＥＧＦの変異型にも関する。本発明の方法における使用のための組成物は、例えば、複数の異なるＨＢ−ＥＧＦ分子を含む、ＨＢ−ＥＧＦ活性のうちの１つまたはカクテルを含み得る。一般に、ＨＢ−ＥＧＦの活性は、本明細書で使用される場合、同源受容体への結合、受容体の活性化、受容体の結合及び活性化の結果として起こる生物学的活性等を指す。

ＨＢ−ＥＧＦは、皮膚創傷の治癒に必要な上皮形成における最も重要な成長因子である。ケラチノサイト及び線維芽細胞に対するＨＢ−ＥＧＦの分裂促進及び移行効果は、創傷治癒に必須の上皮修復及び血管形成を促進し、創傷流体の主成分である。ヘパラン硫酸塩プロテオグリカンに結合するＨＢ−ＥＧＦ細胞表面は、皮膚創傷治癒の速度を増加し、ヒト皮膚移植片の治癒時間を減少させるマイトジェン促進能力を強化し、潰瘍、火傷、及び上皮分層創傷の急速な治癒を促進する。

ＨＢ−ＥＧＦは、膜アンカー型の分裂促進性及び走化性糖タンパク質として合成される。ＨＢ−ＥＧＦは、高度に調節された遺伝子発現を示す８７−アミノ酸糖タンパク質である。外部ドメインシェディングは、可溶性成熟形態のＨＢ−ＥＧＦをもたらし、平滑筋細胞及び線維芽細胞に対する分裂促進性及び走化性因子に影響を及ぼす。膜貫通形態のＨＢ−ＥＧＦは、ジフテリア毒素に固有の受容体であり、細胞中のジャクスタクリンシグナル伝達において機能する。両形態のＨＢ−ＥＧＦは、腫瘍の進行及び転移、臓器の過形成、及びアテローム硬化性疾患を含む正常な生理学的過程及び病理過程に関与している。本発明の目的で、一般に可溶性成熟形態のタンパク質が使用される。タンパク質または薬剤は、実質的に純粋、例えば、他のタンパク質を含まない、細胞性質を含まない等、通常少なくとも約５０％純粋、少なくとも約７５％純粋、少なくとも約８０％純粋、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、少なくとも約９９％純粋であり得る。

好ましい実施形態において、ヒトＨＢ−ＥＧＦの実質的に純粋な調製物が使用される。ＨＢ−ＥＧＦは、精製された形態で購入され得るか、またはサッカロマイセス・セレヴィシエもしくは大腸菌等の原核宿主細胞、及びより好ましくはＣＨＯ細胞等の哺乳動物宿主細胞を含む、ヒトまたは他の動物からの成分を精製することによって、もしくは宿主細胞中の組換え産生によって産生され得る。ＨＢ−ＥＧＦは、野生型ヒトもしくは哺乳動物の相同体であり得るか、または修飾／変異され得る。特に、全長成分の所望の活性の少なくとも一部を保持する成分の断片が使用され得る。

いくつかの実施形態において、ＨＢ−ＥＧＦは、ヒトＨＢ−ＥＧＦであり、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｌ１７０３２．１ ＧＩ ３４８１７５、またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｌ１７０３３．１ ＧＩ ３４８１７、またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｌ１７０３２．１ ＧＩ ３４８１７５のアミノ酸配列を含み、特にそこに記載されるタンパク質の可溶性成熟形態を含む。

「機能保存的変異体」は、所与のアミノ酸残基が、タンパク質の全体構造及び機能を変えることなく変更されたタンパク質であり、類似の特性を有するもの（例えば、酸性、塩基性、疎水性等）によるアミノ酸の置換を含むがこれに限定されない。類似の特性を持つアミノ酸は、当該技術分野において周知である。例えば、アルギニン、ヒスチジン、及びリジンは、親水性塩基性アミノ酸であり、交換可能であり得る。同様に、イソロイシン、疎水性アミノ酸は、ロイシン、メチオニン、またはバリンで置換され得る。保存されたとして示されるもの以外のアミノ酸は、類似機能の任意の２つのタンパク質間のタンパク質またはアミノ酸配列の類似性のパーセントが異なり得、例えば、類似性がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づいているクラスター法による等、アラインメントスキームにより決定される通り７０％〜９９％であり得るように、タンパク質または酵素が異なり得る。「機能保存的変異体」は、２０ ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムによって決定される通り少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、及びさらにより好ましくは９５％のアミノ酸同一性を有し、またそれが相当する天然もしくは親タンパク質もしくは酵素と同じか、または実質的に同様の特性もしくは機能を有するポリペプチドもしくは酵素も含む。

本明細書で使用される場合、ＨＢ−ＥＧＦという用語は、提供される配列の変異体、相同体、及びオルソログを含み得る。変異体は、天然配列と実質的に類似であり得、すなわち、少なくとも１つのアミノ酸が異なり、そして少なくとも２つであるが通常は約１０以下のアミノ酸が異なり得る（相違の数は天然配列のサイズに依存する）。配列変化は、置換、挿入、または欠失であり得る。アラニンまたは他の残基を組織的に導入する突然変異走査を使用し、変異体配列中に維持される重要なアミノ酸を決定することができる。本発明の変異体配列を提供するために使用され得る保存的アミノ酸置換基は、典型的に、以下のグループ内の置換基を含む。（グリシン、アラニン）、（バリン、イソロイシン、ロイシン）、（アスパラギン酸、グルタミン酸）、（アスパラギン、グルタミン）、（セリン、トレオニン）、（リジン、アルギニン）、及び（フェニルアラニン、チロシン）。

天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列は、当該技術分野において既知の様々な方法で改変され、配列中に目的の変更を生成することができるため、本発明の変異体配列を提供する。そのような変異体は、典型的に、対応する天然または親タンパク質とは通常は配列が異なるが、依然として所望の生物活性及び／または機能を保持するか、またはそれらの強化を呈する、機能的に保存された変異体であろう。当該技術分野において既知の様々な方法を使用して、例えば、ランダム及び標的突然変異と組み合わせたファージディスプレイ、突然変異走査の導入等の目的の変更を生成し、本発明の変異体配列を提供することができる。本明細書に例示されるように、精製を助けるＨｉｓまたはエピトープタグの付加が含まれる。関心対象とする特定の特徴を提供するために修飾された酵素は、当該技術分野において既知のように、例えば、突然変異誘発、エキソンシャッフリング等によって、その後、酵素の活性を、例えば野生型レベルに最適化または回復するように、スクリーニングまたは選択によってさらに修飾され得、それ故に本発明の他の変異体配列を提供し得る。

「ＨＢ−ＥＧＦ」という用語は、生物活性断片も含む。関心対象の断片は、少なくとも約２０個の連続したアミノ酸、より通常は少なくとも約５０個の連続したアミノ酸の断片を含み、１００個以上のアミノ酸、最大で完全なタンパク質を含むことができ、追加の配列を含むようにさらに伸長し得る。

一次配列を改変しないが、本発明の他の変異体タンパク質を提供する、タンパク質に対する関心対象の修飾は、タンパク質の誘導体化を含み、例えば、アシル化（例えば、ラウリル、ステアリル、ミルシチル、デシル等の基）、ＰＥＧ化、エステル化、またはアミド化を含む。そのような修飾は、例えば、ＰＥＧ側鎖またはラウリル基の表面リジンへの結合によって、タンパク質分解に対する酵素の抵抗性を高めるために使用され得る。グリコシル化の修飾、例えば、タンパク質のグリコシル化パターンを、その合成及び処理中、またはさらなる処理ステップにおいて修飾することによって、例えば、哺乳動物グリコシル化または脱グリコシル化酵素等のグリコシル化に影響する酵素にタンパク質を曝露することによって行われるものも含まれる。リン酸化アミノ酸残基、例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホトレオニンを有する配列も包含される。

また、タンパク質分解的分解、酸化等に対する抵抗性を高め、溶解特性を最適化するか、またはそれらを治療薬としてより適切にするように、分子生物学的技術及び／または化学反応を使用して修飾されたタンパク質も本発明の実施において有用であり、本発明によって提供される。例えば、タンパク質の骨格は、安定性を強化するために環化され得る（Ｆｒｉｅｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２３７８３−２３７８９を参照）。そのようなタンパク質の類似体として、天然に存在するＬ−アミノ酸以外の残基、例えば、Ｄ−アミノ酸または非天然に存在する合成アミノ酸を含有するものを含む。

ＨＢ−ＥＧＦ模倣体。関心対象のＨＢ−ＥＧＦ剤は、ＨＢ−ＥＧＦの生物活性を提供する模倣体、例えば、小分子、タンパク質、アプタマー等も含む。そのような活性は、細胞表面上のＥＧＦ受容体及びヘパリン硫酸プロテオグリカンへのＨＢ−ＥＧＦの結合を含む。

プロＨＢ−ＥＧＦは、Ｉ型単一膜貫通前駆体タンパク質として合成され、次に外部ドメインシェディングと呼ばれる大規模なタンパク質分解処理を受ける（例えば、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００２；１５８（２）：２２１−６、Ａｓａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００２；８（１）：３５−４０、Ｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ．Ｅｍｂｏ Ｊ．１９９８；１７（２４）：７２６０−７２、Ｎａｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９６；２７１（４８）：３０８５８−６３を参照）。これは、可溶性成熟形態のＨＢ−ＥＧＦを放出する。プロＨＢ−ＥＧＦの外部ドメインシェディングに関与するメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ ９、１０、１２、１７を含む）は、成熟ＨＢ−ＥＧＦの結合を優先的に調節し、ＥＧＦＲの活性を調節する（Ｃｉｓｓｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００５；２８０（４９）：４０６２４−３１、Ｐｅｓｃｈｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９８；２８２（５３９２）：１２８１−４、Ｓａｈｉｎ ａｎｄ Ｂｌｏｂｅｌ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２００７；５８１（１）：４１−４、Ｓａｈｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００４；１６４（５）：７６９−７９を参照）。次にＨＢ−ＥＧＦは、ＥＧＦＲ依存的機構及びＥＧＦＲ非依存的機構の両方によって作用する。ＨＢ−ＥＧＦは、ＥＧＦファミリーメンバーがＥＧＦＲに結合し、活性化するために必要であると考えられるＥＧＦ様ドメインを含有する（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９４；２６９（４）：２５４１−９）。

ＥＧＦファミリーメンバーは、メタロプロテイナーゼによって膜から切断されて成熟可溶性成長因子を形成するため、細胞環境に応じてジャクスタクリン、オートクリン、パラクリン、またはエンドクリンシグナル伝達を誘発することができる（Ｓｉｎｇｈ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ．２００５；１７（１０）：１１８３−９３）。ＥＧＦＲファミリーの４つの特定されたメンバーが存在する（ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びＨＥＲ４）。それらは、単一膜貫通ドメイン及び細胞質内のドメインと構造的に関連するチロシンキナーゼである（Ｐｌｏｗｍａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９３；９０（５）：１７４６−５０、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｍｉｎ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．２０１４）。ＥＧＦファミリーのメンバーは、ＥＧＦＲファミリーに対して異なる結合活性を有する。ＥＧＦとは異なり、ＨＢ−ＥＧＦは、ベタセルリン及びニューレグリン２と同様に、ＨＥＲ１及びＨＥＲ４の両方に結合する。Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９１；２５１（４９９６）：９３６−９、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９７；３８７（６６３２）：５０９−１２、Ｃａｒｒａｗａｙ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９７；３８７（６６３２）：５１２−６、Ｓｈｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９３；２５９（５１０１）：１６０４−７を参照されたい。ＨＢ−ＥＧＦはまた、ケラチン１、５、１０、及び１４等の上皮マーカーを減少させる一方、ＳＮＡ１、ＺＥＢ１、ＣＯＸ−２、及びＭＭＰ１等の細胞運動性遺伝子を増加させる（Ｓｔｏｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１２；１３２（９）：２１４８−５７を参照）。

ＨＢ−ＥＧＦまたはＨＢ−ＥＧＦ活性を提供する薬剤の「有効量」または「治療上有効な量」は、ある期間にわたって適用された場合、慢性ＴＭ穿孔の治癒を強化する用量である。

製剤、すなわち、液滴、持続放出ゲル等は、ＨＢ−ＥＧＦ、または同等活性のＨＢ−ＥＧＦ活性を提供する薬剤を、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１μｇ／ｍｌ、少なくとも約１０μｇ／ｍｌ、少なくとも約１００μｇ／ｍｌ、少なくとも約２００μｇ／ｍｌ、少なくとも約５００μｇ／ｍｌ、少なくとも約７５０μｇ／ｍｌ、少なくとも約１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｍｇ／ｍｌ、及び最大約１０ｍｇ／ｍｌ、最大約２５ｍｇ／ｍｌ、最大約５０ｍｇ／ｍｌ、最大約１００ｍｇ／ｍｌ、最大約５００ｍｇ／ｍｌの濃度で含み得る。持続放出のための製剤は、反復投与のための製剤より高い初期濃度で提供され得る。

製剤の量は、典型的に、鼓膜との有用な接触を提供するために必要な量、例えば、最大約５μｌ、最大約１０μｌ、最大約２５μｌ、最大約３５μｌ、最大約５０μｌ、最大約７５μｌ、最大約１００μｌ、最大約２５０μｌ、最大約３７５μｌ、最大約５００μｌである。あるいは、用量が１滴、２滴、３滴であるスポイトを提供することができ、当該技術分野において既知であるように、液滴は、およそ約５０μｌの量である。

治療上有効な量は、対象において臨床的に有意な反応を提供し、つまり、例えば鼓膜穿孔の治癒が促進される。あるいは、治療上有効な量は、宿主における臨床的に有意な創傷治癒状態を改善するのに十分である。

持続または長期放出製剤またはデバイスは、薬物放出のｔ１／２、すなわち、開始用量及び所望の局所濃度に適切な活性剤の半分を放出するための時間の長さ、例えば、約２４時間、約４８時間、約３日、約４日、約５日、約１週間、約１０日、約２週間、約３週間等のｔ１／２、を有するように設計され得る。

持続または長期放出以外の製剤、例えば、点耳液等は、有効量の維持に適切な間隔で、例えば、約３時間毎、約４時間毎、約６時間毎、約１２時間毎、約１８時間毎、約２４時間毎、約４８時間毎等に投与され得る。

あるいは、有効量のＨＢ−ＥＧＦ、またはＨＢ−ＥＧＦ活性を提供する薬剤は、薬剤の非存在下での治癒と比較して、穿孔または創傷のより速い治癒をもたらす量である。有効量は、ＨＢ−ＥＧＦの局所及び／または全身レベルを、例えば、活性剤または薬剤の投与前に見出されるレベルの約１０パーセント、好ましくは約５０パーセント、より好ましくは約１００パーセント増加させるのに十分な量または用量も意味し得る。

ＨＢ−ＥＧＦと接触させる期間は、個体の必要性によって最大１日、最大２日、最大３日、最大５日、最大７日、最大１０日、最大１２日、最大２週間、最大３週間、またはそれよりも長い期間であり得る。

アッセイにおける「対照」、「対照値」、または「基準値」は、例えば、穿孔した鼓膜もしくは皮膚創傷の治癒、または本明細書に記載される任意の他のアッセイにおける変化を検出するために使用される値である。例えば、鼓膜穿孔の治癒を研究する場合、薬剤の阻害的／刺激的効果は、創傷または穿孔の治癒を対照のそれと比較することによって評価され得る。対照または基準は、例えば、既定の基準値であり得るか、または実験的に決定され得る。例えば、そのようなアッセイにおいて、対照または基準は、薬物もしくは活性剤に曝露されていない動物、または創傷治癒能力を障害しない同じ薬物もしくは活性剤で治療された動物における類似の創傷または穿孔の治癒であり得る。

「阻害剤」は、ＨＢ−ＥＧＦの作用を防止する天然または合成組成物または物質を含み、例えば、ＨＢ−ＥＧＦがその同源受容体等を誘起する場合に細胞内シグナル伝達を遮断する、またはＨＢ−ＥＧＦもしくはその受容体のレベルを低下させる。阻害剤として、核酸、例えば、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、リボザイム等；ＨＢ−ＥＧＦに特異的な抗体またはその同源受容体、小分子阻害剤等を含む。いくつかの実施形態において、阻害剤は、ＯＳＵ８−１／ＫＢ−Ｒ７７８５（Ｔｏｋｏｍａｒｕ ｅｔ ａｌ．（２０００）ＪＣＢ １５１：２０９−２１９を参照、参照により本明細書に明確に組み込まれる）である。ＨＢ−ＥＧＦに特異的な抗体、及びｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ試薬は、当該技術分野において既知であり、市販されている（例えば、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、またはＢｅｒｔｒａｍ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｍｅｃｈ．Ａｇｅｉｎｇ Ｄｅｖ．１３０：６５７−６６９を参照）。

あるいは、モノクローナル抗体は、モノクローナル抗体の調製のための従来方法によって生成することができ、連続細胞培養系によって産生された抗体を提供する任意の技術を使用することができる。例として、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５））、トリオーマ技術、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３））、及びヒトモノクローナル抗体を産生するＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６（１９８５））を含む。一本鎖抗体の産生について記載される技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を、本発明の免疫原性ポリペプチド産生物に対する一本鎖抗体を産生するために適合することができる。またトランスジェニックマウスを使用し、本発明の免疫原性産生物に対するヒト化抗体を発現させることができる。

ＨＢ−ＥＧＦまたはＨＢ−ＥＧＦの阻害剤の送達について言及する場合、「構造」は、任意の足場、ポリマー、構築、加工、載置、支持、ディスク、ブロック、コーティング、層、支台、裏当て、デバイス、発泡体を含むがこれらに限定されない。患者自身の組織、残屑、または移植片を使用して送達方法として作用することも含む。構造は、その形成された状態で適用され得るか、または次に固体状態を形成するか、もしくは液体形態で維持する粘性液体として適用され得るかのいずれかである。

「媒体」は、ＨＢ−ＥＧＦまたはＨＢ−ＥＧＦの阻害剤の送達について言及する場合、任意のポリマー、薬剤、担体、器具、操作、媒質、装置、電器、機械、ガジェット、ツール、ウィジェット、用具、または道具を含むがこれらに限定されない。「媒体」という用語は、任意の可溶性担体または賦形剤も指し、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、及びそれらの組合せを含むがこれらに限定されない。製剤は、投与形態に適合すべきである。当該技術分野において既知の適切な製剤の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，ａｎｄ Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａに見出され得る。

本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」は、所与の値または範囲の５０パーセント以内、好ましくは２０パーセント以内、より好ましくは５パーセント以内を意味するものとする。

別の値とは「実質的に異なる」値は、２つの値間に統計的に有意な差があることを意味し得る。当該技術分野において既知の任意の適切な統計方法を使用し、差が有意であるか否かを評価することができる。

「統計的に有意な」差は、有意性が少なくとも９０％の信頼区域、より好ましくは９５％の信頼区域で決定されることを意味する。

本発明に従って、当該技術分野の技術の範囲内の従来の分子生物学、微生物学、及び組換えＤＮＡ技術が用いられ得る。そのような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、Ｇｌｏｖｅｒ（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ，１９８５）、Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，１９８５）、Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，１９８４）、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９８６）、Ｐｅｒｂａｌ（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，１９８４）、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９４）を参照されたい。

薬学的製剤
ＨＢ−ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ剤もしくはＨＢ−ＥＧＦ阻害剤、または本発明による他の組成物を送達する際に使用され得る製剤として、注入剤形、注入液、ゲル、ペースト、バーム、ワックス、ローション、皮膚クリーム、及び当該技術分野において既知の局所投与のための種々な他の形式を含むがこれらに限定されない。組成物は、創傷の上に噴霧される粉末または溶液の形態で局所送達されてもよい。あるいは、本発明の組成物は、創傷包帯、パッド、バンドエイド、ガーゼ、または創傷の上に適用される他の手段で存在することができ、それらは創傷領域に移される。そのようなデバイスは、徐放デバイスも含み、ＨＢ−ＥＧＦもしくはＨＢ−ＥＧＦ阻害剤、または他の成分を長期間にわたって連続放出する。鼓膜の治癒に関して、外耳管を介してゲル、スプレー、または滴下適用を使用する組成物の投与は、１つの好ましい実施形態である。注入剤形または注入液は、例えば、等張生理食塩水、滅菌水、または水性緩衝液系等の薬学的に許容される液体中のＨＢ−ＥＧＦまたはＨＢ−ＥＧＦ阻害剤を含む。送達媒体は、創傷を通過する任意の構造を含むこともできる。鼓膜の場合、鼓膜換気管またはカテーテルを含むがこれらに限定されない。

薬学的組成物として、所望される製剤に応じて、薬学的に許容される非毒性の担体または希釈剤を含むことができ、それらは、動物またはヒトへの投与のための薬学的組成物を製剤化するために一般に使用される媒体として定義される。希釈剤は、活性剤の生物学的活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、緩衝水、生理学的食塩水、ＰＢＳ、リンガー溶液、デキストロース溶液、及びハンクス溶液である。さらに、薬学的組成物または製剤として、他の担体、アジュバント、または非毒性、非治療的、非免疫原性安定剤、賦形剤等を含むことができる。組成物は、生理学的状態に近似するように追加の物質、例えばｐＨ調整及び緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤、及び界面活性剤を含むこともできる。

組成物は、例えば抗酸化剤等の様々な安定剤のうちのいずれかを含むこともできる。薬学的組成物がポリペプチドを含む場合、ポリペプチドは、ポリペプチドのインビボ安定性を強化するか、またはその薬理学的特性を強化する（例えば、ポリペプチドの半減期を増加させる、その毒性を低減する、溶解度または取り込みを強化する）、様々な周知の化合物と複合され得る。そのような修飾剤または複合剤の例として、硫酸塩、グルコン酸塩、クエン酸塩、及びリン酸塩を含む。組成物のポリペプチドは、それらのインビボ属性を強化する分子と複合することもできる。そのような分子として、例えば、炭水化物、ポリアミン、アミノ酸、他のペプチド、イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガネーゼ）、及び脂質を含む。

様々な種類の投与に適した製剤に関するさらなるガイダンスは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ ｅｄ．（１９８５）に見出され得る。薬物送達のための方法に関する簡潔な説明については、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）を参照されたい。

薬学的組成物は、治療的処置のために投与され得る。活性成分の毒性及び治療有効性は、細胞培養物及び／または実験動物における標準製薬手順により決定することができ、例えば、ＬＤ_５０（集団の５０％に対して致死的な用量）及びＥＤ_５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定することを含む。毒性と治療的効果との間の用量比は、治療指数であり、比率ＬＤ_５０／ＥＤ_５０として表すことができる。大きな治療指数を呈する化合物が好ましい。

細胞培養及び／または動物研究から得られたデータは、ヒトに対する様々な投薬量を配合する際に使用され得る。活性成分の投薬量は、典型的に、低い毒性を伴うＥＤ_５０を含む様々な循環濃度内である。投薬量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。

本明細書に記載される薬学的組成物は、様々な異なる方法で投与され得る。例として、薬学的に許容される担体を含有する組成物を局所経路、例えば、ＴＭの表面上、鼓膜内、経鼓膜的等に投与することを含む。

適切な製剤として、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤を等張にする溶質を含有することができる水性及び非水性等張滅菌注射溶液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び保存剤を含むことができる水性及び非水性滅菌懸濁剤を含む。

薬学的組成物を製剤化するために使用される成分は、好ましくは高純度であり、潜在的に有害な汚染物質を実質的に含まない（例えば、少なくともナショナルフード（ＮＦ）グレード、一般的に少なくとも分析グレード、及びより典型的には少なくとも薬学的グレード）。さらに、インビボ使用に意図された組成物は、通常無菌である。所与の化合物を使用前に合成しなければならないという点で、得られた産生物は、典型的に、合成または精製過程中に存在し得るいかなる潜在的に毒性の薬剤、特に任意の内毒素も実質的に含まない。非経口投与のための組成物も無菌であり、実質的に等張であって、ＧＭＰ条件下で作製される。

特定の患者に投与される治療組成物の有効量は、様々な因子に依存し、それらのうちのいくつかは患者毎に異なる。十分な能力を有する医師であれば、慢性ＴＭ穿孔の治癒を促進するために患者に投与する治療薬の有効量を決定することができるであろう。ＥＤ_５０動物データ、及び入手可能な他の情報を利用し、医師は、投与経路に応じて、個体に対する安全用量を決定することができる。身体から急速に除去される組成物は、治療濃度を維持するために、より高い用量で、または反復用量で投与され得る。通常技術を利用して、十分な能力を有する医師であれば、ルーチンの臨床治験の過程における特定の治療または撮像組成物の投薬量を最適化することができるであろう。典型的に、投薬量は、対象の体重１キログラム当たり０．００１〜１００ミリグラムの薬剤である。

製剤、すなわち、液滴、持続放出ゲル等は、ＨＢ−ＥＧＦ、または同等活性のＨＢ−ＥＧＦ活性を提供する薬剤を、少なくとも約１μｇ／ｍｌ、少なくとも約１０μｇ／ｍｌ、少なくとも約１００μｇ／ｍｌ、少なくとも約２００μｇ／ｍｌ、少なくとも約５００μｇ／ｍｌ、少なくとも約７５０μｇ／ｍｌ、少なくとも約１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｍｇ／ｍｌ、及び最大約１０ｍｇ／ｍｌ、最大約２５ｍｇ／ｍｌ、最大約５０ｍｇ／ｍｌ、最大約１００ｍｇ／ｍｌ、最大約５００ｍｇ／ｍｌの濃度で含み得る。持続放出のための製剤は、反復投与のための製剤より高い初期濃度で提供され得る。治療活性量は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重等の因子によって異なり得る。投薬計画は、最適な治療反応を提供するように調整され得る。例えば、複数の分割用量を毎日投与することができるか、または急迫した治療状況によって示されるように比例的に低減され得る。

量は、約１〜３滴として提供され得るか、または固体もしくは半固体形態で投与される場合、設定量、例えば、最大約５μｌ〜最大約５００μｌの調製組成物であり得る。デバイスは、治癒を促進または阻害するために標的領域におけるその使用を促進するであろう任意の形状または構成に形成され得る。固体または半固体形態の幾何形状は、鼓膜への送達に適切な任意の形状、例えば、球体、扁平球体、薄膜、パッチ、均一または非均一厚さのディスク等である。

製剤は、一連の複数投与において対象に投与され得る。治療組成物の場合、定期投与（例えば、４時間毎、６時間毎、１２時間毎、２４時間毎等）が必要とされるときがあり、例えば、製剤が局所投与のために液体として提供される場合である。

局所、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、及び経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）投与に適した製剤は、適切な懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び保存剤の使用によって調製され得る。局所製剤は、連続投与、例えば、徐放ペレットまたは制御放出パッチへの組込みを提供する手段で用いることもできる。

活性剤は、生体適合性ゲル中に製剤化することもでき、そのゲルは、局所的に適用され得るか、または埋め込まれ得る（例えば、治療部位において持続放出を提供する）。ゲルを使用する送達のための所望の化合物を製剤化するための適切なゲル及び方法は、当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第５，８０１，０３３号、同第５，８２７，９３７号、同第５，７００，８４８号、及びＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）を参照）。本実施形態の例は、次に鼓膜に隣接する耳管内で固体化し、媒体が経時的に溶解するにつれてＨＢ−ＥＧＦまたはＨＢ−ＥＧＦ阻害剤を送達する、生体適合性液体またはデバイスを介した耳管によるＨＢ−ＥＧＦまたはＨＢ−ＥＧＦの阻害剤の送達である。媒体は、管内、鼓膜内、または中耳内に置かれ得る。

製剤は、単位剤形で提供されることができ、「単位剤形」という用語は、ヒト対象に対する単一投薬として適切な物理的に別個の単位を指し、各単位は、既定量のプロテアーゼを、薬学的に許容される希釈剤、担体、または媒体と関連する所望の効果を産生するために計算された量で含有する。本発明の単位剤形の仕様は、用いられる特定の複合体及び達成される効果、ならびに宿主における各複合体と関連する薬力学に依存する。

本発明の態様は、上記のように、有効量の吸収ＨＢ−ＥＧＦを含む架橋共重合体ヒドロゲル組成物を含む。ある特定の実施形態による本発明の架橋共重合体ヒドロゲル組成物は、キトサンの共重合体、及びポリエステル、及び加水分解性架橋剤を含む。ある特定の実施形態において、架橋ヒドロゲルは、フィブリノゲンをさらに含む。いくつかのそのような実施形態において、架橋共重合体ヒドロゲルは、キトサンの共重合体、及びポリエステル、及び加水分解性架橋剤、例えば、ポリラクチドを含む。架橋キトサン−ポリラクチドヒドロゲルは、１：１〜１０：１、例えば、１：１〜８：１の範囲のキトサン対ポリラクチドの比を有し得、ある特定の例において、架橋キトサン−ポリラクチドヒドロゲルは、８：１のキトサン対ポリラクチドの比を有する。関心対象の架橋共重合体ヒドロゲル中のキトサンの重量パーセンテージは、１％〜９９％の範囲であり得、ポリエステルの重量パーセンテージも、１％〜９９％の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、共重合体ヒドロゲルは、キトサンとポリエステル成分との間に１つ以上のエステル及びアミド結合を含む。関心対象の架橋共重合体ヒドロゲルは、架橋剤も含む。いくつかの実施形態において、架橋剤は、生理学的条件下で加水分解するように構成される。いくつかの実施形態において、架橋剤は、メタクリレート架橋剤等のアクリレート架橋剤であり得る。加水分解性架橋剤は、０．０５％〜１０％ｗ／ｗ架橋剤、例えば０．１％〜９％ｗ／ｗ、例えば０．５％〜８％ｗ／ｗ、例えば０．７５％〜７％ｗ／ｗ、及び１％〜５％ｗ／ｗを含む範囲の量で架橋共重合体ヒドロゲル中に存在し得る。対象ヒドロゲルを架橋するために用いられるプロトコルに応じて、架橋密度は異なり得る。ある特定の例において、ヒドロゲルは、化学架橋によって架橋される。そのようにして、架橋密度は、用いられる化学架橋剤の種類及び濃度に応じて異なり得る。あるいは、ヒドロゲルは、光架橋され得、架橋密度は、ヒドロゲル組成物と接触した電磁放射線の密度、ならびに照射期間に応じて異なり得る。本発明のいくつかの実施形態において、対象架橋共重合ヒドロゲルの架橋密度は、例えば、１×１０^−１５モル／ｃｍ^３〜１×１０^−３モル／ｃｍ^３の範囲であり得る。したがって、架橋の量に応じて、対象ヒドロゲルの膨張率は、例えば１〜３５の範囲で異なり得る。同様に、ヒドロゲルの圧縮率は、例えば１ｋＰａ〜３５ｋＰａの範囲で異なり得る。例えば、同時係属の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３３５１２号を参照されたい（参照により本明細書に明確に組み込まれる）。

ヒドロゲル製剤は、任意にフィブリノゲンを含む。フィブリノゲンは、ヒドロゲルが架橋される前または後にヒドロゲル組成物に組み込まれ得る。例えば、いくつかの例において、フィブリノゲンは、ヒドロゲル前駆体組成物に添加される。フィブリノゲンは、０．０５％〜５０％ｗ／ｗフィブリノゲン、例えば０．１％〜４５％ｗ／ｗ、例えば０．５％〜４０％ｗ／ｗ、例えば０．７５％〜３５％ｗ／ｗ、例えば１％〜３０％、例えば２％〜２０％、例えば５％〜１５％、及び１０％ｗ／ｗを含む範囲の量で架橋共重合体ヒドロゲル中に存在し得る。

ヒドロゲルは、ある特定の放出プロフィールを達成するために合成され得る。いくつかの実施形態において、本発明によって提供される架橋共重合体ヒドロゲルは、実質的にゼロ次放出速度で生理学的条件下、ＨＢ−ＥＧＦまたはＨＢ−ＥＧＦを放出するように構成される。他の実施形態において、対象の架橋共重合体ヒドロゲルは、実質的に１次放出速度で生理学的条件下、ＨＢ−ＥＧＦまたはＨＢ−ＥＧＦを放出するように構成される。さらに他の実施形態において、対象の架橋共重合体ヒドロゲルは、実質的に２次放出速度で生理学的条件下、ＨＢ−ＥＧＦまたはＨＢ−ＥＧＦを放出するように構成される。ある特定の実施形態において、対象の架橋共重合体ヒドロゲルは、次を含む放出プロフィールを有するように構成される。１）ＨＢ−ＥＧＦまたはＨＢ−ＥＧＦ剤が第１の既定速度でヒドロゲルから放出される第１の期間、及び２）ＨＢ−ＥＧＦまたはＨＢ−ＥＧＦ剤が第２の既定速度でヒドロゲルから放出される第２の期間。

本発明のいくつかの実施形態において、ヒドロゲル中のキトサン対ポリエステルの比は異なり得、いくつかの実施形態において、１０：１〜９．５：１、９．５：１〜９：１、９：１〜８．５：１、８．５：１〜８：１、８：１〜７．５：１、７．５：１〜７：１、７：１〜６．５：１、６．５：１〜６：１、６：１〜５．５：１、５．５：１〜５：１、５：１〜４．５：１、４．５：１〜４：１、４：１〜３．５：１、３．５：１〜３：１、３：１〜２．５：１、２．５：１〜２：１、２：１〜１．５：１、１．５：１〜１：１の範囲、またはそれらの範囲である。例えば、キトサン成分対ポリエステル成分の質量比は、１０：１〜１：１、例えば８：１〜１：１、例えば５：１〜１：１、例えば４：１〜１：１、及び２：１〜１：１を含む範囲であり得る。ある特定の例において、キトサン対ポリエステルの比は１：１である。他のいくつかの実施形態において、キトサン対ポリエステルの比は異なり得、いくつかの実施形態において、１：１〜１：１．５、１：１．５〜１：２、１：２〜１：２．５、１：２．５〜１：３、１：３〜１：３．５、１：３．５〜１：４、１：４〜１：４．５、１：４．５〜１：５、１：５〜１：５．５、１：５．５〜１：６、１：６〜１：６．５、１：６．５〜１：７、１：７〜１：７．５、１：７．５〜１：８、１：８〜１：８．５、１：８．５〜１：９、１：９〜１：９．５、１：９．５〜１：１０の範囲、またはそれらの範囲である。例えば、キトサン対ポリエステルの比は、１：１〜１：１０、例えば１：１〜１：８、例えば１：１〜１：５、例えば１：１〜１：４、及び１：１〜１：２を含む範囲であり得る。

架橋共重合ヒドロゲルは、１ｋＤａ以上、例えば２ｋＤａ以上、例えば３ｋＤａ以上、例えば５ｋＤａ以上、例えば１０ｋＤａ以上、例えば１５ｋＤａ以上、例えば２０ｋＤａ以上、例えば２５ｋＤａ以上、例えば３０ｋＤａ以上、例えば４０ｋＤａ以上、例えば５０ｋＤａ以上、例えば６０ｋＤａ以上であり得、７５ｋＤａ以上を含む。

薬学的組成物が調製された後、それらを適切な容器内に入れ、表示された状態の治療のためにラベル付けすることができる。本発明の組成物の投与の場合、そのようなラベル付けは、投与の量、頻度、及び方法を含む。

複合製剤
本発明の製剤は、有効量のＨＢ−ＥＧＦを、第２の活性剤、特に他の抗菌剤と組み合わせて含み得る。例えば、関心対象となる他の薬剤は、当該技術分野において既知の多様な抗生物質を含む。抗生物質の群として、ペニシリン、例えば、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、メチシリン、オキサシリン、カルベニシリン、ナフシリン、アンピシリン等；β−ラクタマーゼ阻害剤と組み合わせたペニシリン、セファロスポリン、例えば、セファクロール、セファゾリン、セフロキシム、モキサラクタム等；カルバペネム；モノバクタム；アミノグリコシド；テトラシクリン；マクロリド；リンコマイシン；ポリミキシン；スルホンアミド；キノロン；クロラムフェニカル；メトロニダゾール；スペクチノマイシン；トリメトプリム；バンコマイシン等を含む。抗菌剤、例えば、アシクロビル、ガンシクロビル等が含まれ得る。

サイトカイン及び成長因子は、ＨＢ−ＥＧＦとの併用において有用である。例えば、形質転換成長因子（ＴＧＦ）−β、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、及び上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＶＥＧＦ、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、エンドセリン−１、ケラチノサイト成長因子等の成長因子。例えば、Ｓｔｅｅｄ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃａｌｌ．Ｓｕｒｇ．１８３：６１−６４（１９９６）、Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｊ． ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ １８：６４−６９（１９９５）、Ｓｔｅｅｄ，Ｄ．，Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．２１：７１−７８（１９９５）、Ｋｅｌｌｅｙ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．１９４：３２０−３２６（１９９０）を参照されたい。

使用方法
本発明に従い、鼓膜の慢性穿孔の創傷治癒は、ＨＢ−ＥＧＦを提供するまたはそのレベル高めることによって改善される。これは、いくつかの異なる方法で達成され得る。例えば、患者は、有効量の活性剤、例えば、薬物、ホルモン、サイトカイン、抗体、またはＨＢ−ＥＧＦの発現を上方調節するか、ＨＢ−ＥＧＦの分解を低減するか、またはＨＢ−ＥＧＦもしくはＨＢ−ＥＧＦ相同体もしくは誘導体の局所もしくは全身レベルを増加させる別の化合物等で治療され得る。ＨＢ−ＥＧＦをコードする核酸を、治療目的で投与することもできる。

典型的に、ＨＢ−ＥＧＦタンパク質を含む製剤、例えば、ヒトＨＢ−ＥＧＦの可溶性形態は、穿孔を実質的に閉鎖するのに十分な期間にわたって、外耳管を介して慢性ＴＭ穿孔に罹患する個体に局所的に投与される。ヒトまたは非ヒト対象は、鼓膜穿孔の治癒を障害するまたは遅延させる状態に罹患している場合も罹患していない場合もある。

本発明は、有効量で投与された場合、対象の創傷領域のＨＢ−ＥＧＦレベルの増加または減少をもたらすＨＢ−ＥＧＦ組成物またはＨＢ−ＥＧＦ阻害剤組成物を提供する。例えば、鼓膜治癒の加速のために、ＨＢ−ＥＧＦを含む組成物は、鼓膜穿孔を取り囲む領域に適用され得る。ＨＢ−ＥＧＦ阻害剤は、正常または過剰な創傷治癒を阻害するために適用することもできる。ＨＢ−ＥＧＦ組成物の場合において、鼓膜治癒の加速のために、組成物を鼓膜穿孔に隣接する領域または局所領域に適用され得る。それらは、任意の生体分解性または非生体分解性の供給源または構造を介して適用され得る。

別の実施形態において、本発明の方法は、対象における穿孔された鼓膜の治癒を阻害するために適用される。ヒトまたは非ヒト対象は、鼓膜穿孔の治癒を障害するまたは遅延させる状態に罹患している場合も罹患していない場合もある。例えば、そのような方法は、鼓膜切開術、及び慢性中耳炎、耳管またはエウスタキオ管の奇形、ダウン症候群、口蓋裂、及び気圧外傷（気圧の低下によって引き起こされる中耳傷害）等に対して一般に処方される中耳腔換気用チューブの挿入の代わりとして適用することができる。通常、中耳腔換気用チューブは、ＴＭに挿入され、長期間、例えば最大１ヶ月、最大２ヶ月、最大３ヶ月、最大４ヶ月、最大６ヶ月、またはそれよりも長い期間にわたって維持される。

これらの方法は、ヒト穿孔鼓膜状態の臨床的に関連するモデルを提供する動物モデルの作製における使用も見出す。そのようなモデルにおいて、動物は、任意の好都合な実験動物、例えば、齧歯類、ウサギ目等であり得、無制限にマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、非ヒト霊長類等を含む。

そのような実施形態において、有効量のＥＧＦＲリガンドシェディングの阻害剤は、ＴＭの穿孔を創出するために、通常は鼓膜への局所接触によって投与される。いくつかのそのような実施形態において、例えば、約０．１〜１０ｍｍ^２、約０．１〜約５ｍｍ^２、約０．１〜２．５ｍｍ^２、約０．１〜約１ｍｍ^２の面積の小さな穿孔が最初に開けられ得る。初期穿孔の後に、創傷は、有効量のＨＢ−ＥＧＦ阻害剤と、本明細書に提供される製剤中で及び期間、接触させられる。活性用量の阻害剤は、穿孔が所望される時間の長さにわたって、維持され得る。

キット
本発明の別の態様は、ＴＭの慢性穿孔の治療のためのキットを提供する。このキットは、有効量のＨＢ−ＥＧＦを提供する製剤を、例えば、液滴、デバイス、製剤等の形態で含む。キットは、例えば、点耳剤分注器、製剤の送達のためのシリンジ、二成分製剤を送達するための二重バレルシリンジ等の送達デバイスも含み得る。キットは、使用説明書も含み得る。

あるいは、ＴＭの慢性穿孔を形成するためのキットが提供され得る。このキットは、有効量のＨＢ−ＥＧＦ阻害剤を提供する製剤を、例えば、液滴、デバイス、製剤等の形態で含む。キットは、例えば、点耳剤分注器、製剤の送達のためのシリンジ、二成分製剤を送達するための二重バレルシリンジ等の送達デバイスも含み得る。キットは、使用説明書も含み得る。キットは、ＴＭに初期穿孔を形成するための滅菌針またはランセットをさらに含み得る。

実施例１
ＨＢ−ＥＧＦの阻害
ＨＢ−ＥＧＦは、鼓膜モデルにおける上皮創傷治癒に重要である。ラットにおける鼓膜の穿孔後のＨＢ−ＥＧＦ様成長因子の正規化シグナル強度は、ＨＢ−ＥＧＦ様成長因子の８．５倍上方調節を示す。ＨＢ−ＥＧＦ活性の実験的阻害は、本明細書において、鼓膜穿孔が治癒するのを阻止することが示される。

ＥＧＦＲリガンドシェディングを阻害して、慢性鼓膜穿孔モデルを創出することができる。
湾曲した針を使用し、２０匹のマウスのＴＭの緊張部に亜全穿孔を創出した。選択的ＨＢ−ＥＧＦ阻害剤であるＯＳＵ８．１（１０ｍＭ）（Ｔｏｋｕｍａｒｕ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．を参照）を、（穿孔を貫通して、及び穿孔の上に置かれた）ゲル発泡体の上に７日間注入した。（２日目、７日目、１４日目、３０日目、４４日目、６０日目、及び９０日目）の時点でマウスを屠殺し、ケラチノサイト遊走に対する効果を観察した。反対側の耳を、ゲル発泡体の上に生理食塩水を置いて対照として使用した。これらの全てを２週間以内に閉鎖した。３ヶ月目に、処理耳７つのうちの５つ（７１％）が開いていた。慢性ＴＭ穿孔の代表的な画像を図５に示す。穿孔サイズは、３ヶ月にわたって安定していた（ＩｍａｇｅＪを使用し、穿孔面積を緊張部面積のパーセンテージとして計算した）。より大きなコホートでは、８７．９％（ｎ＝５８）が３ヶ月で慢性穿孔を有した。本発明者らの予備研究は、確立された再現性のある成長因子ベースの慢性ＴＭ動物モデルを初めて示唆した。

表１は、ＨＢ−ＥＧＦ阻害剤（ＯＳＵ８−１）をマウスの急性鼓膜穿孔に適用した結果を示す。対照の５％と比較して、ＨＢ−ＥＧＦ阻害剤処理した穿孔の１００％が２ヶ月目に存在し、対照の５％と比較して、７１％が３ヶ月目に存在した。

慢性化膿性中耳炎の動物モデルを創出する。
ＥＴ閉塞を伴う慢性穿孔モデルを創出した後、既存の慢性穿孔を通じて２種類の細菌を中耳に接種した。２週間目に耳液を回収し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に送って細菌の存在について試験した。選択された細菌は、慢性耳疾患に関与する最も一般的なもののうちの２つ、ＩＩＩ型肺炎連鎖球菌（１ｍｌ当たり６×１０^６コロニー形成単位の用量）及び緑膿菌（１ｍｌあたり６×１０^９コロニー形成単位の用量）であった。

実施例２
慢性鼓膜穿孔の治療
慢性ＴＭ穿孔に対するＨＢ−ＥＧＦ治療の有効性が証明される。

外耳道内への成長因子送達のための生体適合性吸収性注入ポリマー。
慢性ＴＭ穿孔を治療するために、耳に滴下され得、次に硬化し、指定された時間枠にわたってゆっくり再吸収する一方で薬剤を溶出する液体が望まれる。ポリマーの分解速度及び薬物溶出速度は、関心対象の標的に従って容易に調整可能である。

成長因子を送達するための生分解性キトサン系ヒドロゲルは、選択薬を輸送することができ、外耳道内に注入され得る、生体適合性で生体再吸収性の注入ポリマーを提供するように開発された。ゲルは、２つの液体成分を有し、２つの成分を混合した後数分以内に凝固し得る。これは、二重ボアシリンジによって容易に投与され得る。あるいは、これらの溶液は、送達前に架橋剤と混合され、単一ボアシリンジで注入され得る。

新たに開発されたキトサン系ヒドロゲルは、親水性キトサン骨格分子及び疎水性ポリラクチド側鎖を構成する。フィブリノゲンは、共重合体ネットワークに組み込まれて結合親和性を改善し、細胞結合を強化し、タンパク質分解性の分解位置を提供することができる。ポリマーヒドロゲルからの薬物放出は、ポリマーの親水性親和性、膨潤挙動、分解性、架橋密度等の特徴によって異なる。キトサン系ヒドロゲルからのｒｈＢＭＰ−２の薬物放出プロフィール、及びポリマーヒドロゲルの分解挙動を様々な条件で測定した。

本実施例で使用されたゲルのキトサン対ポリラクチドの特定の比は、８：１である。さらに、１０％ ｗ／ｗのフィブリノゲンがプレポリマー溶液に組み込まれる。ヒドロゲル製剤は、化学的架橋のために触媒と混合した後数分以内に凝固し得る。これは、二重ボアシリンジによって、または単一ボアシリンジで容易に投与され得る。

ヒドロゲルは、耳毒性がない。
ヒドロゲルを、穿孔の後にマウスの鼓膜に注入した。一方の耳にポリマーを満たし、反対の耳には注入しなかった（対照）。９匹のマウスにおいて両方の鼓膜が外科的に穿孔された後６０日目に、聴性脳幹反応（ＡＢＲ）及び歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）閾値を測定した。鼓膜が自然に治癒するまで、両側間の聴覚閾値に差はなかった（図２）。このデータは、ヒドロゲルが耳毒性のないことを示す。

ＨＢ−ＥＧＦは、慢性鼓膜穿孔を治癒する。
マウスの耳における慢性穿孔のコホートを、５μｇ／ｍｌの濃度（生体吸収性キトサン系ポリマーによる持続放出用量）で組換えＨＢ−ＥＧＦを含有する４０μｌのゲルで治療した場合、４週間目に対照（ポリマーのみ）の３８％（２６匹中１０匹）と比較して、９２％（２４匹中２２匹）が治癒した（ｐ＜０．０１）。ＧＦを使用してＧＦＲ外部ドメインリガンドシェディングを活性化するＴＭ慢性創傷治癒におけるこの重要なステップを克服する能力は、生物学的療法を使用する介入に対するその適合性を証明する。これは、慢性穿孔の動物モデルにおいて試験された初めての成長因子治療であり、対照を超える著しい利益を示した。

ＨＢ−ＥＧＦは、耳管閉塞を伴う慢性鼓膜穿孔を治癒する。
図３に示されるように、慢性ＴＭ穿孔及びＥＴ閉塞の動物モデルを創出した。ＥＴ閉塞の既存のラットモデル（Ｈｅｒｄａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ １１２：１６５７−６２を参照）をマウスに適合させ、８０匹の生きたマウスにおいて成功した。上記の慢性穿孔モデルでＥＴ閉塞を行った。これは、３ヶ月目に湿潤滅菌吐出穿孔を創出した。このモデルは、ＥＴ不全を合併した慢性穿孔のヒト状態を模倣する。

このモデル（慢性穿孔及びＥＴ閉塞）を持つマウスコホートを、５μｇ／ｍｌの濃度（生体吸収性キトサン系ポリマーによる持続放出用量）の組換えＨＢ−ＥＧＦ４０μｌで治療した場合、６週間目に対照（ポリマーのみ）の９％（２３匹中２匹）と比較して、９４％（１９匹中１８匹）が治癒した（ｐ＜０．０１）。治癒した、または非治癒慢性ＴＭ穿孔の代表的な画像を図４に示す。組織学的に、対照では、閉鎖が起こったわずかな症例においてもケラチノサイト層を欠失しているのに比べ、穿孔はケラチノサイトの厚い層により閉鎖する。中耳滲出及びＥＴ閉塞の存在下でＨＢ−ＥＧＦを使用してＥＧＦＲ外部ドメインリガンドシェディングを活性化するＴＭ慢性創傷治癒におけるこの重要なステップを克服する能力は、慢性鼓膜穿孔を持つ患者を治療する際に有用である。

慢性化膿性中耳炎の動物モデルにおける試験。
ＥＴ閉塞を伴う慢性穿孔モデルを創出した後、緑膿菌（１ｍｌあたり６×１０^９コロニー形成単位の用量）を、既存の慢性穿孔を通じて中耳に接種した。２週間目に耳液を回収し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に送って細菌の存在について確認した。この陽性ＰＣＲは、慢性化膿性中耳炎（ＣＳＯＭ）モデルの正当性を確認した。

次に、マウスを２つのコホートに分けた。一方はポリマーのみを与えられた。もう一方は、ポリマー及びＨＢ−ＥＧＦを５μｇ／ｍｌ（上記モデルで使用されるものと同じ用量）与えられた。対照群における４１％（１７匹中７匹）と比較して、ＨＢ−ＥＧＦ群の１００％（１６匹中１６匹）が治癒した（ｐ＜０．０１）。対照群において、治癒は、それがいつ起こったかも異なっていた。ＴＭは多くの場合、わずかに不透明の正常ＴＭと比較して非常に薄く、半透明であった。ＨＢ−ＥＧＦ群における治癒は、正常であると思われた。ヒトＣＳＯＭに最も近いモデルにおいてＨＢ−ＥＧＦを使用してＥＧＦＲ外部ドメインリガンドを活性化するＴＭ慢性創傷治癒におけるこの重要なステップをさらに克服する能力は、治療の方法の有効性を証明する。

実施例３
送達の経鼓膜方法（図５、６、及び７）
ＨＢ−ＥＧＦまたはＨＢ−ＥＧＦ送達のための媒体は、経耳道またはエウスタキオ管経由のいずれかで挿入され、鼓膜に対して、または鼓膜を貫通して置かれる。ある期間後に除去され得るか、または生体分解性であり得る。媒体は、それを鼓膜内に拘束するための設計を含み得る。これは、カラー、カフ、フランジ、溝、または幅もしくは高さの任意の変化であり得る。それを固定するためにこれらのうちの複数を有し得る。媒体は、穿孔され得るか、または任意の適切な寸法の管腔を有し得る。媒体が鼓膜内に保持されるのに十分であると見なされる、またはそれに必要とされるものを超えると見なされる、任意の数のフランジもしくは任意の幅及び寸法があり得る。

耳管１００、外耳１１０、及び鼓膜１２０を図５に描く。幅１３０及び長さ１４０を有する経膜薬物送達デバイス１２５も描かれる。

経鼓膜送達デバイス１２６の代替実施形態を図６に描く。デバイスは、幅１３１及び長さ１４１を有する。デバイス１２６は、外部拘束部１５０及び内部拘束部１５５の一方または両方を含み、拘束部は幅１６０を有する。

経鼓膜送達デバイス１２７の別の実施形態を図７Ａ〜７Ｂに描く。図７Ａは、耳管１００及び鼓膜１２０を示す上面図である。送達デバイス１２７は、幅１３２及び長さ１４２を有する。デバイスは、そのデバイスに沿って長さ方向に配列された複数のフランジ１７０を含み、それらのフランジは、長さ１７１及び幅１７２を有する。図７Ｂは、デバイスの断面を描く。

実施例４
鼓膜内送達デバイス
成長因子送達デバイスは、鼓膜の層間に置くことができる。固体媒体の場合、１つ以上の層をフラップとして引き上げることによって置くことができ、次いで配置後にそのフラップを元に戻す。液体の場合は注入され得る。

鼓膜内送達デバイス１２８を図８に描く。このデバイスは、鼓膜１２０内に挿入される。デバイスは、幅１３３及び長さ１４３を有する。

実施例５
鼓膜に隣接した固体物体としての媒体の配置（図９）
媒体は、鼓膜に対して置かれ、ＨＢ−ＥＧＦまたはＨＢ−ＥＧＦ阻害剤の局所供給源を提供する。媒体は、鼓膜を貫通して一部または全てが内側または外側に置かれ得る。鼓膜を貫通する部分は、存在する場合、穿孔より小さいか、大きいか、または同じサイズであり得る。

鼓膜１２０に隣接した成長因子送達デバイス１２８を図９に描く。デバイスは、幅１３４及び長さ１４４を有する。

実施例６
成長因子適用の注入方法を図１０に示す。成長因子２００を含む製剤は、耳管１００に送達され、鼓膜１２０とその外側及び／または内側表面で接触することができ、さらに鼓膜穿孔１２１の領域に流入し得る。製剤は、送達管２２０を通じてシリンジ２１０から分注され得る。製剤は、単一溶液として、または送達時に混合される２つの溶液として提供され得る。

二重室シリンジは、当該技術分野において周知かつ容易に入手可能であり、例えば、中でもＬｙｏ−Ｊｅｃｔ（登録商標）二重室シリンジ、または米国特許第５，９７１，９５３号、米国特許出願第２００３００４０７０１号、同第２０１４００１２１９６号、同第２０１３００６０２３２号、国際出願第１９９９０１７８２０Ａ１号等のうちのいずれか１つを参照されたい。

そのような製剤として、混合するとより粘性または固体状態に変化する組成物が含まれる。粘度生成剤として、制限なしに、ゲラン、アクリル酸ナトリウムを持つＮ−イソプロピルアクリルアミド及びｎ−Ｎ−アルキルアクリルアミド、ポリエチレングリコールを持つポリアクリル酸、ポリエチレングリコールを持つポリメタクリル酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロースを持つＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）、酢酸セルロースフタル酸水素ラテックス、アルギニン酸ナトリウム、またはポロキサマーもしくはポロキサミン等の逆熱硬化性ゲルを含む。

そのような製剤は、液体様状態、すなわち流動性形態で鼓膜の外上皮表面に送達され得る。しかしながら投与後、組成物が鼓膜と接触したままであるように、組成物は固体様状態に変化する。結果として、組成物は、鼓膜に対して局在化したままであり、薬理学的剤は、鼓膜に移動することができる。粘性または固体組成物は、生体分解性または非生体分解性であり得る。

Claims (28)

1. 慢性鼓膜穿孔を治療するための、有効量のヘパリン結合性上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）タンパク質を含む薬学的製剤。
2. 前記ＨＢ−ＥＧＦタンパク質がヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質である、請求項１に記載の薬学的製剤。
3. 前記ＨＢ−ＥＧＦタンパク質が、可溶形態のＨＢ−ＥＧＦタンパク質である、請求項２に記載の薬学的製剤。
4. 慢性鼓膜穿孔の部位に、該穿孔を実質的に閉鎖するのに十分な期間にわたって接触させられる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬学的製剤。
5. 慢性鼓膜穿孔の部位に、少なくとも７日間接触させられる、請求項４に記載の薬学的製剤。
6. 慢性鼓膜穿孔の部位に、少なくとも２週間接触させられる、請求項４に記載の薬学的製剤。
7. 少なくとも毎日投与される、請求項４に記載の薬学的製剤。
8. 前記ＨＢ−ＥＧＦタンパク質の持続放出を提供する、請求項４に記載の薬学的製剤。
9. 水溶液、ゲル、ローション、バーム、ペースト、または他の媒体として提供される、請求項１に記載の薬学的製剤。
10. スプレーによって投与される、請求項１に記載の薬学的製剤。
11. 液体として投与され、それが次いで凝固して前記鼓膜に隣接して留まる、請求項１に記載の薬学的製剤。
12. キトサン及びポリラクチドの架橋共重合体を含む持続放出ゲルとして提供される、請求項１に記載の薬学的製剤。
13. 前記持続放出ゲルが、フィブリノゲンをさらに含む、請求項１２に記載の薬学的製剤。
14. 前記ＨＢ−ＥＧＦタンパク質の持続放出を提供するデバイスによって送達される、請求項１に記載の薬学的製剤。
15. 慢性鼓膜穿孔の治療のための医薬の製造における、ヘパリン結合性上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）タンパク質の使用。
16. 前記ＨＢ−ＥＧＦタンパク質がヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質である、請求項１５に記載の使用。
17. 前記ＨＢ−ＥＧＦタンパク質が、可溶形態のＨＢ−ＥＧＦタンパク質である、請求項１６に記載の使用。
18. 前記医薬が、慢性鼓膜穿孔の部位に、該穿孔を実質的に閉鎖するのに十分な期間にわたって接触させられる、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の使用。
19. 前記医薬が、慢性鼓膜穿孔の部位に、少なくとも７日間接触させられる、請求項１８に記載の使用。
20. 前記医薬が、慢性鼓膜穿孔の部位に、少なくとも２週間接触させられる、請求項１８に記載の使用。
21. 前記医薬が、少なくとも毎日投与される、請求項１８に記載の使用。
22. 前記医薬が、前記ＨＢ−ＥＧＦタンパク質の持続放出を提供する、請求項１８に記載の使用。
23. 前記医薬が、水溶液、ゲル、ローション、バーム、ペースト、または他の媒体として提供される、請求項１５に記載の使用。
24. 前記医薬が、スプレーによって投与される、請求項１５に記載の使用。
25. 前記医薬が、液体として投与され、それが次いで凝固して前記鼓膜に隣接して留まる、請求項１５に記載の使用。
26. 前記医薬が、キトサン及びポリラクチドの架橋共重合体を含む持続放出ゲルとして提供される、請求項１５に記載の使用。
27. 前記持続放出ゲルが、フィブリノゲンをさらに含む、請求項２６に記載の使用。
28. 前記医薬が、前記ＨＢ−ＥＧＦタンパク質の持続放出を提供するデバイスによって送達される、請求項１５に記載の使用。

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