CN105555296A - 用于鼓膜愈合的肝素结合表皮生长因子活性的调节 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于通过调节HB-EGF活性产生或治疗慢性鼓膜穿孔的组合物和方法。在本发明的方法中，将慢性穿孔的鼓膜与有效剂量的肝素结合表皮生长因子HB-EGF或具有HB-EGF活性的试剂局部接触足以提供改善的膜穿孔的愈合的一段时间。在一些实施方案中，在持续释放制剂中提供HBEGF的剂量；在其它实施方案中，提供非持续释放制剂的定期施用。在一些实施方案中，持续释放制剂是可生物降解的。在其它实施方案中，通过装置例如泵或其它释放装置提供持续释放。

Description

用于鼓膜愈合的肝素结合表皮生长因子活性的调节

发明背景

鼓膜(TM)穿孔最常见地因中耳炎或创伤而产生。临床上，TM穿孔的最常见表现是传导性听觉丧失和慢性感染。TM穿孔的最常见原因是感染。与非复杂型急性中耳炎相关的穿孔通常很小；一旦感染消退后大部分自行愈合。另外，大的穿孔可由引起坏死的生物体感染引起。耳的创伤是TM穿孔的其它主要原因。损伤的常见原因为钝性与穿透性创伤、快速气压变化(气压伤)和过度声压。

损伤后，已知组织经历愈合的几个阶段。虽然鼓膜的伤口愈合包括与常规皮肤愈合相似的最初的止血和发炎阶段，但鼓膜增殖和移行阶段与其它组织的增殖和移行阶段截然不同。在大多数伤口愈合情形中，肉芽组织床形成，其用作在其上发生上皮再形成的平台。在鼓膜的愈合中，这些事件以相反的方式发生。鳞状上皮层最初形成横跨伤口的桥，只有这样随后才进行纤维组分的再形成。TM是独特的，因为表皮层在移行中起着至关重要的起始作用，基底增殖层控制该过程。

大多数鼓膜穿孔自发愈合；然而，许多因素可延缓或阻止闭合，从而导致慢性穿孔。持久性穿孔通常在削弱修复过程的持续感染的背景中发生。在这些情况下，膜的再生性愈合过程被阻挠，从而阻止趋化作用和随后横跨伤口的上皮移行。在组织学上，在慢性穿孔中，鳞状上皮在穿孔边缘之上生长至接触TM的中间粘膜层。

用于慢性TM穿孔的治疗将慢性中耳炎的治疗或预防以及听力的恢复包括作为目标。常规疗法包括组织移植瓣的使用，例如用于鼓室成形术的自体移植可使用颞肌膜作为自体移植物。可使用由胶原基质中的成纤维细胞组成的颞浅筋膜。尽管利用自体结缔组织移植物的鼓室成形术是用于持久性TM穿孔的修复的高度成功的方法，但可有益地开发不需要显微手术技能，不太昂贵并且可在诊室环境中应用的方法。本发明解决了此需求。

出版物

SantaMaria等(2010)JMolHistol.2010年12月；41(6):309-14.SantaMaria(2011)Thesis,UniversityofWesternAustralia。Johnson和Wang(2013)JControlRelease166(2):124-9。Ishihara等(2003)JBiomedMaterResA.64(3):551-9。Tolino等(2011)BiochimBiophysActa.1810(9):875-8；Shirakata等(2005)JCellSci.118(Pt11):2363-70；Hüttenbrink(2005)HNO53(6):515-6；Ma等(2002)ActaOtolaryngol.122(6):586-99。WO2007/037514。US2010/0222265

发明概述

提供了用于治疗慢性鼓膜穿孔的组合物和方法。在本发明的方法中，将慢性穿孔的鼓膜与有效剂量的肝素结合表皮生长因子HB-EGF或具有HB-EGF活性的试剂局部接触足以提供改善的膜穿孔的愈合的一段时间。在一些实施方案中，在持续释放制剂中提供HB-EGF的剂量；在其它实施方案中，提供非持续释放制剂的定期施用。在一些实施方案中，持续释放制剂是可生物降解的。在其它实施方案中，通过装置例如泵或其它释放装置提供持续释放。

将待处理的TM与HB-EGF接触足以改善TM穿孔的愈合(即导致穿孔的基本上闭合，例如达到面积小于约0.1mm²的穿孔)的一段时间。闭合可通过目视(包括利用显微)、通过功能(例如听力损失的减少)等来监测；与HB-EGF接触的时期可以是至少1天、至少3天、至少5天、至少7天、至少10天、至少2周、至少3周；并且可根据个体的需要达到1天、达到3天、达到5天、达到7天、达到10天、达到2周、达到3周或更长时间。

在某些具体实施方案中，在无耳毒性持续释放制剂例如凝胶、泡沫、插入物等，优选地可生物降解制剂中提供有效剂量的HB-EGF。在一个此类实施方案中，在包含壳聚糖、聚乳酸和血纤蛋白原的凝胶中配制有效剂量的HB-EGF。

在一个实施方案中，本发明包括这样的方法，该方法(i)鉴定具有TM的慢性穿孔的患者；(ii)将受累TM与有效剂量的HB-EGF(例如，以液滴的一些(以合适的间隔施用的)、以用于HB-EGF的持续释放的装置、以持续释放制剂等提供的)接触；和(iii)监测个体以确定穿孔的有效闭合的方法。

本发明的另一个方面涉及具有HB-EGF活性的试剂在制造用于治疗TM的慢性穿孔的药物中的用途，其中以足以实现穿孔闭合的一段时间和剂量向具有TM的慢性穿孔的患者施用该药物。

本发明的另一个方面提供了用于治疗TM的慢性穿孔的试剂盒。试剂盒包括例如以滴剂、装置、制剂等形式提供有效剂量的HB-EGF的制剂。试剂盒还包括递送装置，例如用于制剂的递送的滴耳器、注射器、用于递送两部分制剂的双筒注射器等。试剂盒还可包括使用说明书。

在其它实施方案中，提供了用于鼓膜的临时打开，例如以进行管的插入等的方法。在此类实施方案中，将TM与有效剂量的HB-EGF抑制剂，包括但不限于EGFR配体脱落的抑制剂接触，进行足以在TM中产生小穿孔的一段时间。在一些此类实施方案中，可机械地产生小穿孔，随后与抑制剂接触。

附图简述

图1.在(a)第2天、(b)第14天、(c)第44天、(d)第90天(3个月)利用OSU8-1(EGFR配体脱落的抑制剂)处理的穿孔后TM的代表性图像。以蓝色描画穿孔的轮廓。

图2.在于9只小鼠中对两个鼓膜进行手术穿孔后60天测量ABR和DPOAE阈值。一只耳朵未进行注射(对照)，然而将相对的耳朵充满壳聚糖、血纤蛋白原和聚交酯的聚合物递送媒介物。

图3.在利用杜仲胶阻塞之前(a)和之后(b)的ET。通过使用具有0.5mm的钻孔器的雕刻装置打开大疱(bulla)来适应大鼠中的操作。侧边打开大疱允许杜仲胶在较少气道收缩的情况下下供ET。死后检查ET，从而确认完全阻塞。

图4.ET阻塞的小鼠模型中的慢性穿孔的GF治疗。顶行(a)是显示愈合的穿孔的处理组的代表性图像。底行(b)是显示持久性穿孔(蓝色轮廓)的对照(仅聚合物)的代表性图像。注意：顶图中的一些TM已愈合且具有鼓室硬化。

图5.经鼓膜生长因子递送。

图6.经鼓膜生长因子递送。

图7.经鼓膜生长因子递送。

图8.鼓室内生长因子递送。

图9.邻近鼓膜的药物递送媒介物。

图10.可流动的药物递送制剂。

当与附图结合起来时，通过参考下列详细描述将更好地理解本发明的特性和许多其它有利方面。

实施方案的详述

在进一步描述主题发明之前，应理解本发明不限于下述发明的特定实施方案，如可产生特定实施方案的变型并且其仍然落在所附权利要求的范围内。应理解，所使用的术语是为了描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制。在本说明书和所附权利要求书中，除非上下文另外清楚地指明，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述/该(the)”包括复数指示物。

当提供数值范围时，要理解的是，该范围的上限和下限之间的每个居间数值(至下限单位的十分之一，除非本文另外清楚地规定)以及该范围内的任意其它所述或居间的数值都包括在本发明中。这些较小范围的上限和下限可被独立地包含在该较小的范围内，并也被涵盖在本发明内，受制于在规定范围中明确排除的限值。在该规定的范围包含该限值中的一个或二个的情况下，排除所包含的限值中的任一个或两个的范围也包括在本发明内。

除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在实践或测试本发明中能使用与本文描述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料，但是现在描述举例说明性方法、装置和材料。

本文中提及的所有出版物为了描述和公开在出版物中描述的本发明的主题组分的目的通过引用并入本文，可将组分与现在描述的发明结合使用。

本发明已根据由本发明人发现或提出的包含用于实践本发明的优选模式的特定实施方案进行了描述。本领域技术人员应理解，根据本公开，可在不背离本发明的预期范围的情况下在例举的实施方案中进行许多修改和变化。例如，由于出于生物功能等同性考虑，可在种类或量上在不影响生物作用的情况下对蛋白质结构进行改变。所有此类修改旨在包含在所附权利要求书的范围内。

定义

本说明书中使用的术语通常具有它们在本领域中，本发明的上下文中和在其中使用每一个术语的具体上下文中的普通含义。在下文中或本说明书中的其它地方面描述了某些术语，以在描述本发明的组合物和方法以及如何产生和使用它们中提供另外的指导。

受试者。利用本发明的方法进行治疗的个体可来自任何哺乳动物或禽类物种，包括人。非人动物包括，但不限于，哺乳动物、实验室动物诸如小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠、南美栗鼠等；家养动物诸如狗和猫；和农场动物诸如绵羊、山羊、猪、马和牛。本发明的非人类动物可以是哺乳动物或非哺乳动物的动物；脊椎动物或无脊椎动物。

本文中的受试者的"治疗(Treatment)"或"治疗(treating)"受试者的疾病或病状意指减少或减轻疾病或病状诸如慢性TM穿孔的临床症状。

"促进"、"增强"或"改善"鼓膜或伤口愈合通常意指增加伤口或穿孔愈合的速度或在伤口或穿孔愈合过程中或之后减小残留疤痕或瘢痕疙瘩或坏死组织的程度。

“伤口”是器官或组织，包括上皮、结缔组织和肌肉组织的结构的断裂或中断。伤口的实例包括，但不限于，皮肤创伤、跌打损伤、溃疡、褥疮、擦伤、撕裂、割伤、刺伤、牛皮癣伤口、鼓膜穿孔、角膜擦伤以及断裂和烧伤。

“局部”施用是指对伤口表面进行的活性成分的非全身性局部给药。

鼓膜。鼓膜是在人和其他哺乳动物中将外耳与中耳隔开的薄的锥形膜。其功能是将声音从空气传递至中耳内的听小骨，随后传递至充满液体的耳蜗中的卵圆窗。因此，其最终将空气中的振动转换成液体中的振动并将其放大。锤骨桥接鼓膜与其它听小骨之间的间隙。

鼓膜有两个普遍区域：松驰部和紧张部。松弛部由两层组成，是相对脆的，并且与咽鼓管功能障碍和胆脂瘤相关联。较大的紧张部区域由皮肤、纤维组织和粘膜三层组成。其是比较结实的，并且是最常见地与穿孔相关联的区域。

TM的破裂或穿孔可由多种创伤、感染等造成。TM的穿孔可导致范围从可忽略不计至50分贝的传导性听觉丧失(CHL)。穿孔可以在面积和位置(例如前部、后部或两者)上变化；并且在面积上从约0.1mm²变化至约60mm²，通常在约2.5mm²至10mm²的范围内(见Mehta等(2006)OtolNeurotol.27(2):136–143)。穿孔可以是急性或慢性的。通常不治疗急性穿孔，因为TM通常自愈。然而，在一些个体中，TM不愈合，从而导致慢性穿孔。

鼓膜的慢性穿孔。在治疗不存在的情况下或当通过常规方法(例如，利用抗生素治疗)治疗时不愈合的穿孔，可被认为是慢性穿孔。本领域技术人员应理解，个体间愈合所需的时间长度可以不同，但通常地在达到约3个月后，在达到约2个月后，在达到约1个月后不愈合的穿孔可被分类为慢性病状。

慢性或非愈合伤口是在合理时间量内未能形成上皮和闭合的开放性创伤。这些伤口在临床上停滞，并且没有进一步闭合的证据。慢性伤口可被认为缺乏适当的“起始”信号。(参见，例如，Lorenz和Longaker，在Wounds:Biology,Pathology,andManagement，第7章，第77-88页中)。

如本文所使用的，“肝素结合表皮生长因子”是指内源地存在于哺乳动物，例如人中的肝素结合表皮生长因子、等位基因肝素结合表皮生长因子、肝素结合表皮生长因子的功能保守衍生物、具有功能活性的肝素结合生长因子片段和肝素结合表皮生长因子同源物，诸如肝素结合生长因子样生长因子。HB-EGF还涉及例如提供增强的活性、提高的稳定性、更高的产量或更好溶解度的HB-EGF的变体形式。用于本发明的方法的组合物可包含一种HB-EGF活性或HB-EGF活性的混合物，例如包含多种不同的HB-EGF分子。通常地，如本文中所使用，HB＝-EGF的活性是指对同源受体的结合、受体的激活、作为受体结合和激活的结果发生的生物活性等。

HB-EGF是皮肤伤口愈合所需的上皮形成中的主要生长因子。HB-EGF对角质形成细胞和成纤维细胞的促有丝分裂和迁移作用促进对于伤口愈合是必需的皮肤修复和血管生成，并且是伤口液体的主要成分。针对硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的HB-EGF细胞表面结合增强增加皮肤伤口愈合的速度，减少人皮肤移植愈合时间的促细胞分裂原促进能力，并促进溃疡、烧伤和表皮裂开厚度伤口的快速愈合。

将HB-EGF合成为膜锚定促有丝分裂和趋化糖蛋白。HB-EGF是展示受高度调控的基因表达的87个氨基酸的糖蛋白。胞外结构域脱落导致儿童HB-EGF的可溶性成熟形式，其影响用于平滑肌细胞和成纤维细胞的促有丝分裂因子和趋化因子。HB-EGF的跨膜形式是白喉毒素的唯一受体并且在细胞的邻分泌信号传导中起作用。HB-EGF的两种形式都参与正常的生理过程和病理过程，包括肿瘤进展和转移、器官增生和动脉粥样硬化疾病。为了本发明的目的，通过使用蛋白的可溶性成熟形式。蛋白或试剂可以是基本上纯的，例如不含其它蛋白质，不含细胞物质等，通常具有至少约50％的纯度，至少约75％的纯度，至少约80％的纯度，至少约90％的纯度，至少约95％的纯度，至少约99％的纯度。

在优选实施方案中，使用基本上纯的人HB-EGF制剂。可以以纯的形式购买HB-EGF，或其通过从人或其它动物纯化组分，或通过在宿主细胞(包括原核宿主细胞诸如酿酒酵母或大肠杆菌，以及更优选，哺乳动物宿主细胞诸如CHO细胞)中重组产生来产生。HB-EGF可以是野生型人、哺乳动物同源物，或是经修饰的/突变的。具体地，可使用保留至少一部分全长组分的所需活性的组分的片段。

在一些实施方案中，HB-EGF是人HB-EGF，并且包含基因库登录号：L17032.1GI348175或基因库登录号：L17033.1GI34817或基因库登录号：L17032.1GI348175的氨基酸序列，特别地包括其中描述的蛋白质的可溶性成熟一些。

“功能保守变体”是其中给定的氨基酸残基已被改变但不改变蛋白质的总体构象和功能的蛋白质，包括，但不限于，具有相似特性(诸如，例如，酸性、碱性、疏水性等)的氨基酸对氨基酸的取代。具有相似性质的氨基酸在本领域中是公知的。例如，精氨酸、组氨酸和赖氨酸是亲水碱性氨基酸并且是可互换的。类似地，异亮氨酸、疏水氨基酸可被亮氨酸、甲硫氨酸或缬氨酸替换。除指定为保守的那些氨基酸外的氨基酸在蛋白质或酶中可以不同，以使得具有相似功能的任何两个蛋白质之间的百分比蛋白质或氨基酸序列相似性可变化，并且可以是例如70％至99％，如根据比对方案，例如通过聚类方法测定的，其中相似性基于MEGALIGN算法。“功能保守变体”还包括具有如通过20个BLAST或FASTA算法测定的至少60％氨基酸同一性，优选至少75％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，以及更优选95％的氨基酸同一性，并且具有与和其相比较的天然或亲代蛋白质或酶相同或大体上相似的性质或功能的多肽或酶。

如本文中所用，术语HB-EGF可包括所提供的序列的变体、同源物和直向同源物。变体可与天然序列大体上相似，即相异于至少一个氨基酸，以及可相异于至少两个，但通常不超过约10个氨基酸(相异的数目取决于天然序列的大小)。序列变化可以是取代、插入或缺失。系统地引入丙氨酸或其他残基的扫描突变可用于确定被保持在变体序列中的关键氨基酸。可用于提供本发明的变体序列的保守氨基酸取代通常包括以下组内的取代：(甘氨酸、丙氨酸)；(缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸)；(天冬氨酸、谷氨酸)；(天冬酰胺、谷氨酰胺)；(丝氨酸、苏氨酸)；(赖氨酸、精氨酸)；和(苯丙氨酸、酪氨酸)。

可以以本领域中已知的各种方式改变天然存在的蛋白质的氨基酸序列，以产生序列的靶向变化，并从而提供本发明的变体序列。此类变体将通常是功能上保守的变体，其通常在序列上与对应的天然或亲代蛋白质相异，但仍然保留所需的生物活性和/或功能或显示增强的生物活性和/或功能。本领域中已知的各种方法可用于产生靶向变化，例如与随机和靶向突变组合的噬菌体展示、扫描突变的引入等，以及提供本发明的变体序列。包括的是His或表位标签的添加(以帮助纯化)，如本文中所例举的。可以例如通过诱变、外显子改组等(如本领域中已知的)，随后通过筛选或选择来进一步修饰经修饰以提供特定目标特征的酶，以最优化或恢复酶的活性，例如恢复至野生型水平，从而提供本发明的其它变体序列。

术语“HB-EGF”还包括生物活性片段。目标片段包括具有至少约20个连续氨基酸，更通常地至少约50个连续的氨基酸的片段，并且可包含100个或更多个氨基酸，达到完全蛋白质，并且可进一步延伸以包含另外的序列。

不改变一级序列但提供本发明的其它变体蛋白质的对蛋白质的目标修饰包括蛋白质的化学衍生，包括例如，酰化(例如月桂基、硬脂基、肉豆寇基、癸基等基团)、PEG化、酯化或酰胺化。此类修饰可用于例如通过将PEG侧链或月桂基基团附接于表面赖氨酸来增加酶对蛋白水解的抗性。还包括的是糖基化修饰，例如在其合成和加工过程中或在进一步加工步骤中通过修饰蛋白质的糖基化模式产生的那些糖基化修饰；例如通过使蛋白质暴露于实现糖基化的酶，诸如哺乳动物糖基化或去糖基化酶。还包括的是具有磷酸化氨基酸残基，例如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸的序列。

在本发明的实践中也是有用的和由本发明提供的是已使用分子生物学技术和/或化学修饰以提高它们对蛋白水解降解、氧化等的抗性，和最优化溶解性或使它们更适合作为治疗剂的蛋白质。例如，蛋白质的主链可被环化以增强稳定性(参见Friedler等(2000)J.Biol.Chem.275:23783-23789)。此类蛋白质的类似物包括含有除天然存在的L-氨基酸外的残基，例如D-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸的那些蛋白质。

HB-EGF模拟物。目标HB-EGF试剂还包括模拟物，例如小分子、蛋白质、适体等，其提供HB-EGF的生物活性。此类活性包括HB-EGF对细胞表面上的EGF受体和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合。

原HB-EGF被合成为I型单次跨膜前体蛋白，随后其经历广泛的蛋白酶解加工，称为胞外结构域脱落(参见，例如，Yan等JCellBiol.2002；158(2):221-6；Asakura等NatMed.2002；8(1):35-40；Izumi等EmboJ.1998；17(24):7260-72；Nakagawa等JBiolChem.1996；271(48):30858-63)。这释放了HB-EGF的可溶性成熟一些。主要负责原HB-EGF的胞外结构域脱落的金属蛋白酶(包括ADAM9、10、12、17)调节成熟HB-EGF的结合以及调节EGFR的激活(参见Cisse等JBiolChem.2005；280(49):40624-31；Peschon等Science.1998；282(5392):1281-4；Sahin和BlobelFEBSLett.2007；581(1):41-4；Sahin等JCellBiol.2004；164(5):769-79)。HB-EGF随后通过EGFR依赖性机制和不依赖于EGFR的机制起作用。HB-EGF含有据认为是EGF家族成员键合和激活EGFR所需的EGF样结构域(Thompson等JBiolChem.1994；269(4):2541-9)。

取决于细胞环境，EGF家族成员可诱导邻分泌、自分泌、旁分泌或内分泌信号传导，因为可通过金属蛋白酶从膜切割它们，以形成成熟的可溶性生长因子(Singh和Harris,CellSignal.2005；17(10):1183-93)。存在4个鉴定的EGFR家族成员(HER1、HER2、HER3和HER4)。它们是具有单个跨膜结构域和细胞质内的结构域的结构相关的酪氨酸激酶(Plowman等ProcNatlAcadSciUSA.1993；90(5):1746-50；Taylor等SeminCellDevBiol.2014)。EGF家族的成员具有不同的对EGFR家族的结合活性。与EGF不同，HB-EGF结合HER1和HER4，对于β动物纤维素和神经调节蛋白2亦如此。参见Higashiyama等Science.1991；251(4996):936-9；Chang等Nature.1997；387(6632):509-12；Carraway等Nature.1997；387(6632):512-6；Shing等Science.1993；259(5101):1604-7。HB-EGF还减少上皮标志物诸如角蛋白1、5、10和14，然而增加细胞运动性基因诸如SNA1、ZEB1、COX-2和MMP1(参见Stoll等JInvestDermatol.2012；132(9):2148-57)。

HB-EGF或提供HB-EGF活性的试剂的“有效量”或“治疗有效量"是当在一段时间中施用时增强慢性TM穿孔的愈合的那个剂量。

制剂，即液体滴剂、持续释放凝胶等可以以至少约1ng/ml、至少约10ng/ml、至少约100ng/ml、至少约1μg/ml、至少约10μg/ml、至少约100μg/ml、至少约200μg/ml、至少约500μg/ml、至少约750μg/ml、至少约1mg/ml、至少约5mg/ml、至少约10mg/ml、至少约50mg/ml、至少约100mg/ml和达到约10mg/ml、高达约25mg/ml、高达约50mg/ml、高达约100mg/ml、高达约500mg/ml的浓度包含HB-EGF或等同活性的提供HB-EGF活性的试剂。可以以比用于重复施用的制剂高的初始浓度提供用于持续释放的制剂。

制剂的体积通常为提供与鼓膜的有用接触所需的体积，例如高达约5μl、高达约10μl、高达约25μl、高达约35μl、高达约50μl、高达约75μl、高达约100μl、高达约250μl、高达约375μl、高达约500μl。或者，可提供其中剂量为1滴、2滴、3滴的点滴器，其中，如在本领域中是已知的，一滴为约50μl。体积。

治疗有效量在受试者中提供临床上显著的反应，即，例如，促进鼓膜穿孔愈合。或者，治疗有效量足以在宿主中促进临床上显著的伤口愈合状况。

持续或处长释放制剂或装置可被设计来具有适合用于起始剂量和所需局部浓度的用于药物释放的t1/2，即一半活性试剂释放的时间长度，例如约24小时、约48小时、约3天、约4天、约5天、约1周、约10天、约2周、约3周等的t1/2。

可以以适合用于有效剂量的维持的间隔，例如约每3小时、约每4小时、约每6小时、约每12小时、约每18小时、约每24小时、约每48小时等，施用除持续或处长释放外的制剂，例如液体滴耳剂等。

或者，HB-EGF或提供HB-EGF活性的试剂的有效量是导致相对于试剂不存在的情况下的愈合更快的穿孔或伤口的愈合的量。有效量还可意指足以使HB-EGF的局部和/或全身性水平升高例如约10％，优选地约50％，更优选地约100％的在施用活性剂或药物之前发现的水平的量或剂量。

根据个体的需要，用于与HB-EGF接触的时间段可长达1天、长达2天、长达3天、长达5天、长达7天、长达10天、长达12天、长达2周、长达3周，或更长时间。

测定中的"对照"、"对照值"或"参照值"是用于检测例如穿孔的鼓膜或皮肤伤口的愈合的变化或本文所述的任何其它测定的值。例如，当研究鼓膜穿孔的愈合时，可通过将伤口或穿孔的愈合与对照的伤口或穿孔的愈合相比较来评估试剂的抑制/刺激作用。对照或参照可以是例如预定的参照值，或可通过实验来测定。例如，在此类测定中，对照或参照可以是未暴露于药物或活性剂的动物，或利用不具有削弱的伤口愈合能力的相同药物或活性剂治疗的动物中的相似伤口或穿孔的愈合。

“抑制剂”包括阻止HB-EGF的作用，降低HB-EGF或其受体的水平，当HB-EGF触发其同源受体时阻断细胞内信号传导等的天然或合成组合物或物质。抑制剂包括核酸，例如反义siRNA、核酶等；对于HB-EGF或其同源受体是特异的抗体，小分子抑制剂等。在一些实施方案中，抑制剂为OSU8-1/KB-R7785(参见Tokomaru等(2000)JCB151:209-219，通过引用明确地并入本文)。对于HB-EGF是特异的抗体以及siRNA、shRNA试剂在本领域中是已知的并且是商购可得的(例如，参见SantaCruzBiotechnology，或Bertram等(2009)Mech.AgeingDev.130:657-669。

或者，可通过用于制备单克隆抗体的常规方法产生单克隆抗体，可使用提供通过连续细胞系培养产生的抗体的任何技术。实例包括杂交瘤技术(Kohler&Milstein,Nature,256:495-497(1975))、三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等,ImmunologyToday4:72(1983))和产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole,等,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,Inc.，第77-96页(1985))。可改造针对单链抗体的产生所描述的技术(美国专利No.4,946,778)以适应产生针对本发明的免疫原性多肽产物的单链抗体。同样地，还可将转基因小鼠用于表达针对本发明的免疫原性多肽产物的人源化抗体。

“结构”，当提及HB-EGF或HB-EGF的抑制剂的递送时，包括，但不限于任何支架、聚合物、构造物、制造物、衬托纸、支持物、盘、块、涂层、层、桥基、衬背、装置、泡沫。它还包括使用患者自身的组织、碎片或移植物充当递送方法。该结构可以以其形成的状态施用或作为粘稠的液体施用，液体随后形成固态或保持液体形式。

“媒介物”，当指HB-EGF或HB-EGF的抑制剂时，包括，但不限于，任何聚合物、试剂、载体、仪器、操作、介质、设备、器械、奇妙的装置、小工具、工具、小部件、器具或器皿。术语“媒介物”还指任何可溶性载体或赋形剂，包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油及其组合。制剂应当适合施用模式。本领域中已知的合适的制剂的实例可见于Remington'sPharmaceuticalSciences(最新版本),MackPublishingCompany,和Easton,Pa。

如本文中所用，“约”或“近似”应指在给定的值或范围的50％以内，优选地20％以内，更优选地5％以内。

与另一个值“显着不同”的值可意指两个值之间的统计上显著的差异。本领域中已知的任何合适的统计方法可用于评估差异是显著的还是不显著的。

“统计上显著的”差异意指在至少90％的置信区间，更优选在95％的置信区间测定显著性。

根据本发明，可应用在本领域技术人员的能力之内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中进行了充分解释。参见，例如，Sambrook等(MolecularCloning-ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)；Glover(DNACloning:APracticalApproach，第I和II卷,1985)；Hames和Higgins(NucleicAcidHybridization,1985)；Hames和Higgins(TranscriptionAndTranslation,1984)；Freshney(AnimalCellCulture,1986)；Perbal(APracticalGuideToMolecularCloning,1984)；和Ausubel等(CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Inc.,1994)。

药物制剂

可用于递送HB-EGF和HB-EGF试剂，或HB-EGF抑制剂或根据本发明的其它组合物的制剂包括，但不限于，可注射剂型、浸剂、凝胶、糊剂、香膏、蜡剂、洗剂、皮肤乳剂和本领域中已知的用于局部施用的各种其它形式。组合物还可以以喷洒至伤口上的粉剂或溶液的一些来进行局部递送。或者，本发明的组合物可以存在于伤口敷料、衬垫、创可贴、纱布或施加至伤口上的其它装置中，可从该装置将它们转移至伤口区域。此类装置还包括缓释装置，持续长时间地不断释放HB-EGF或HB-EGF抑制剂或其它组分。对于鼓膜的愈合，使用凝胶、喷雾剂或通过外耳道逐滴施用的组合物的施用是优选的实施方案。可注射剂型或浸剂包含HB-EGF或HB-EGF抑制剂在药学上可接受的溶液(诸如，例如，等渗盐水、无菌水或含水缓冲系统)中的溶液。递送媒介物还可包括穿过伤口的任何结构。在鼓膜的情况下，其包括，但不限于，通风管或导管。

取决于所需制剂，药物组合物可包括药学上可接受的无毒载体或稀释剂，其被定义为通常用于配制用于动物或人施用的药物组合物的媒介物。选择稀释剂以便不影响活性剂的生物活性。此类稀释剂的实例是蒸馏水、缓冲水、生理盐水、PBS、林格溶液、葡萄糖溶液和Hank's溶液。另外，药物组合物或制剂可包括其它载体、佐剂或无毒的、非治疗性的非免疫原性稳定剂、赋形剂等。组合物还可包括另外的物质，以接近生理条件，诸如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂、润湿剂和去垢剂。

组合物还可包括各种稳定剂的任何一种，诸如例如抗氧化剂。当药物组合物包括多肽时，可将多肽与各种公知的化合物复合，该化合物增强多肽的体内稳定性，或另外地提高其药理学特性(例如，增加多肽的半衰期，降低其毒性，提高溶解度或吸收)。此类修饰或复合剂的实例包括硫酸盐、葡糖酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐。还可将组合物的多肽与增强其体内属性的分子复合。此类分子包括，例如，碳水化合物、聚胺、氨基酸、其它肽、离子(例如，钠、钾、钙、镁、锰)和脂类。

关于适合用于各种类型的施用的制剂的其它指导可见于Remington'sPharmaceuticalSciences,MacePublishingCompany,Philadelphia,Pa.，第17版(1985)中。关于用于药物递送的方法的简要综述，参见，Langer,Science249:1527-1533(1990)。

可施用药物组合物以进行治疗性治疗。活性成分的毒性和治疗功效可在细胞培养物和/或实验动物中按照标准药学方法来测定，包括例如，测定LD₅₀(对50％的群体是致死的剂量)和ED₅₀(在50％的群体中是治疗上有效的剂量)。毒性与疗效之间的剂量比是治疗指数，其可表示为比率LD₅₀/ED₅₀。显示大的治疗指数的化合物是优选的。

从细胞培养和/或动物研究获得的数据可用于配制一系列用于人的剂量。活性成分的剂量通常在一系列包括具有低毒性的ED₅₀的循环浓度内。取决于所使用的剂型和使用的施用途径，该剂量可在此范围内变化。

可以以多种不同的方式施用本文所述的药物组合物。实例包括经由局部途径，例如在TM的表面上、鼓膜内、经鼓膜施用包含药学上可接受的载体的组合物。

合适的制剂包括水性和非水性的等渗无菌注射液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂等渗的溶质，以及水性和非水性无菌混悬剂，其可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。

用于配制药物组合物的组分优选具有高纯度并且基本上不含潜在有害的污染物(例如至少国家食品(NF)级，一般至少分析级，以及更典型地至少药用级)。此外，期望用于体内使用的组合物通常是无菌的。在必须在使用前合成给定的化合物的情况下，所得产物通常是基本上不含任何潜在毒性剂，特别是任何内毒素，毒性剂可在合成或纯化过程中存在。用于胃肠外施用的组合物也无菌的，基本上等渗的和在GMP条件下产生的。

待给予特定患者的治疗组合物的有效量将取决于多种因素，其中几个因素在患者间是不同的。主管临床医生将能够确定向患者施用以促进慢性TM穿孔的愈合的治疗剂的有效量。通过使用ED₅₀动物数据和其它可获得的信息，临床医生能够，取决于施用途径，确定用于个体的安全剂量。可以以更高的剂量或以重复剂量施用被从体内快速清除的组合物，以维持治疗浓度。通过利用普通技术人员，主管临床医生将能够地常规临床试验的过程中优化特定治疗或成像组合物的剂量。通常地，剂量将为0.001至100毫克试剂/千克受试者体重。

制剂，即液体滴剂、持续释放凝胶等可以以1μg/ml、至少约10μg/ml、至少约100μg/ml、至少约200μg/ml、至少约500μg/ml、至少约750μg/ml、至少约1mg/ml、至少约5mg/ml、至少约10mg/ml、至少约50mg/ml、至少约100mg/ml和高达约10mg/ml、高达约25mg/ml、高达约50mg/ml、高达约100mg/ml、高达约500mg/ml的浓度包含HB-EGF或等同活性的提供HB-EGF活性的试剂。可以以比用于重复施用的制剂高的初始剂量提供用于持续释放的制剂。治疗活性量可根据因素例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重而变化。可调整剂量方案以提供最佳的治疗反应。例如，可每日施用不止一个的分份剂量，或如通过治疗情况的紧急程度所指示的，按比例减少剂量。

体积可被提供为约1至3滴，或者如果以固体或半固体形式施用时，体积可以是例如高达约5μl至高达约500μl的设置体积的制备的组合物。可将装置形成为将有利于其用于靶区域以促进或抑制愈合的任何形状或构造。固体或半固体形式的几何形状是适合用于送至鼓膜的任何形状，例如球、扁平球、薄膜、贴片、具有均匀或非均匀厚度的盘等等。

可在一系列不止一次施用中向受试者施用制剂。对于治疗组合物，有时需要定期的周期性给药(例如，每4小时，每6小时，每12小时，每24小时等)，例如当以液体提供制剂用于局部施用时。

适合用于局部、经皮和透皮施用的制剂可通过使用适当的悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂来制备。还可将局部制剂与装置一起用于提供连续施用，例如，掺入缓释丸剂或控释贴剂。

还可在生物相容性凝胶中配制活性剂，可局部施用凝胶或将其植入(例如，以在治疗部位提供持续释放)。用于配制使用凝胶递送的所需化合物的适用的凝胶和方法在本领域中是公知的(参见，例如，美国专利第5,801,033、5,827,937、5,700,848号；和MATRIGEL^TM)。该实施方案的实例是经由生物相容性液体或装置将HB-EGF或HB-EGF的抑制剂递送通过耳道，该液体或装置随后在与鼓膜相邻的耳道内固化并且当媒介物随时间过去溶解时，递送HB-EGF或HB-EGF抑制剂。可将媒介物置于耳道中，鼓膜中或中耳内。

制剂可以以单位剂型提供，其中术语“单位剂型”是指适合作为单位剂量供人受试者使用的物理上分离的单位，每个单位含预定量的蛋白酶，该量经计算为与药学上可接受的稀释剂、载体或媒介物相结合时足以产生所需的效果。针对本发明的单位剂型的技术规范取决于所采用的特定复合物和要实现的效果，以及在宿主中与每种化合物相关的药效动力学。

本发明的方面包括交联包含有效剂量的被吸收的HB-EGF的共聚物水凝胶组合物，如上所述的。根据某些实施方案的本发明的交联的共聚物水凝胶组合物包括壳聚糖与聚酯的共聚物和可水解交联剂。在某些实施方案中，交联的水凝胶还包含血纤蛋白原。在一些此类实施方案中，交联的共聚物水凝胶包括壳聚糖与聚酯的共聚物以及可水解交联剂(例如聚交酯)。交联的壳聚糖-聚交酯水凝胶可具有范围为1:1至10:1，诸如1:1至8:1的壳聚糖对聚交酯的比率，其中在某些情况下，交联的壳聚糖-聚交酯水凝胶具有8:1的壳聚糖对聚交酯的比率。交联的目标共聚物水凝胶中的壳聚糖的重量百分比可在1％至99％的范围内，并且聚酯的重量百分数也可在1％至99％的范围内。在一些实施方案中，共聚物水凝胶在壳聚糖与聚酯之间包含一个或多个酯和酰胺键联。交联的目标共聚物水凝胶还包含交联剂。在一些实施方案中，交联剂被配置在生理条件下水解。在一些实施方案中，交联剂可以是丙烯酸酯交联剂，诸如甲基丙烯酸酯交联剂。可水解交联剂可以以在0.05％至10％w/w的交联剂，诸如0.1％至9％w/w，诸如0.5％至8％w/w，诸如0.75％至7％w/w，以及包括1％至5％w/w的范围内的量存在于交联的共聚物水凝胶中。取决于用于交联主题水凝胶的方案，交联密度可变化。在某些情况下，通过化学交联来交联水凝胶。这样，交联密度可取决全所使用的化学交联剂的类型和浓度而变化。或者，水凝胶可被光交联，并且交联密度可取决于与水凝胶组合物接触的电磁辐射的强度以及辐射的持续时间而变化。在本发明的一些实施方案中，主题交联共聚物水凝胶的交联密度可在诸如1×10^-15摩尔/cm³至1×10^-3摩尔/cm³的范围内。因此，取决于交联量，主题水凝胶的泡胀率可变化，范围为诸如1至35。同样地，水凝胶的压缩模量可变化，范围为诸如1kPa至35kPa。参见，例如，共同未决的国际专利申请PCT/US2014/033512，通过引用明确地并入本文。

水凝胶制剂任选地包括血纤蛋白原。可在交联水凝胶之前或之后将血纤蛋白原掺入水凝胶组合物。例如，在某些情况下，将血纤蛋白原添加至水凝胶前体组合物。血纤蛋白原可以以在0.05％至50％w/w的血纤蛋白原，诸如0.1％至45％w/w，诸如0.5％至40％w/w，诸如0.75％至35％w/w，诸如1％至30％，诸如2％至20％，诸如5％至15％(并且包括10％w/w)的范围内的量存在于交联的共聚物水凝胶中。

水凝胶可被合成来实现一定的释放特征。在一些实施方案中，由本发明提供交联的共聚物水凝胶被配置以在生理条件下以基本上零级释放速率释放HB-EGF或HB-EGF试剂。在其它实施方案中，主题交联共聚物水凝胶被配置来在生理条件下以基本上一级释放速率释放HB-EGF或HB-EGF试剂。在其它实施方案中，主题交联共聚物水凝胶被配置来在生理条件下以基本上二级释放速率释放HB-EGF或HB-EGF试剂。在某些实施方案中，主题交联共聚物水凝胶被配置来具有释放特征，释放特征包括：1)其中HB-EGF或HB-EGF试剂以第一预定速率从水凝胶释放的第一时期；和2)其中HB-EGF或HB-EGF试剂以第二预定速率从水凝胶释放的第二时期。

在本发明的一些实施方案中，水凝胶中壳聚糖对聚酯的比率可以改变，在一些实施方案中，介于10:1与9.5:1之间；9.5:1与9:1之间；9:1与8.5:1之间；8.5:1与8:1之间；8:1与7.5:1之间；7.5:1与7:1之间；7:1与6.5:1之间；6.5:1与6:1之间；6:1与5.5:1之间；5.5:1与5:1之间；5:1与4.5:1之间；4.5:1与4:1之间；4:1与3.5:1之间；3.5:1与3:1之间；3:1与2.5:1之间；2.5:1与2:1之间；2:1与1.5:1之间；1.5:1与1:1或其范围内。例如，壳聚糖组分对聚酯组分的质量比可在10:1至1:1，诸如8:1至1:1，诸如5:1至1:1，诸如4:1至1:1(并且包括2:1至1:1)的范围内。在某些情况下，壳聚糖对聚酯的比率为1:1。在其它实施方案中，壳聚糖对聚酯的比率可变化，在一些实施方案中，介于1:1与1:1.5之间；1:1.5与1:2之间；1:2与1:2.5之间；1:2.5与1:3之间；1:3与1:3.5之间；1:3.5与1:4之间；1:4与1:4.5之间；1:4.5与1:5之间；1:5与1:5.5之间；1:5.5与1:6之间；1:6与1:6.5之间；1:6.5与1:7之间；1:7与1:7.5之间；1:7.5与1:8之间；1:8与1:8.5之间；1:8.5与1:9之间；1:9与1:9.5之间；1:9.5与1:10之间或其范围内。例如，壳聚糖对聚酯的比率可在1:1至1:10，诸如1:1至1:8，诸如1:1至1:5，诸如1:1至1:4(并且包括1:1与1:2)的范围内。

交联的共聚物水凝胶可以为1kDa或更大，诸如2kDa或更大，诸如3kDa或更大，诸如5kDa或更大，诸如10kDa或更大，诸如15kDa或更大，诸如20kDa或更大，诸如25kDa或更大，诸如30kDa或更大，诸如40kDa或更大，诸如50kDa或更大，诸如60kDa或更大，并且包括75kDa或更大。

在已制备药物组合物后，可将它们置于适当的容器中，并标记以用于指定病状的治疗。对于本发明的组合物的施用，此类标记可包括施用的量、频率和方法。

组合制剂

本发明的制剂可包含有效剂量的与第二活性剂特别地其它抗微生物剂组合的HB-EGF。例如，其它目标试剂包括各种抗生素，如本领域已知的。抗生素的种类包括青霉素类，例如青霉素G、青霉素V、甲氧西林、苯唑西林、羧苄西林、萘夫西林、氨苄青霉素等；与β-内酰胺酶抑制剂组合的青霉素类、头孢菌素类，例如头孢克洛、头孢唑啉、头孢呋辛、拉氧头孢等；碳青霉烯类；单菌胺类；氨基糖苷类；四环素类；大环内酯类；林可霉素；多粘菌素；磺胺类；喹诺酮类；氯霉素；甲硝唑；壮观霉素；甲氧苄氨嘧啶；万古霉素等。可包括抗病毒剂、例如阿昔洛韦、丙氧鸟苷等。

还将细胞因子和生长因子与HB-EGF组合使用，例如生长因子，诸如转化生长因子(TGF)-β、血小板衍生的生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和表皮生长因子(EGF)、VEGF、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、内皮素-1、角质形成细胞生长因子等。参见，例如，Steed,D.等,J.Am.Call.Surg.183:61-64(1996)；Richard,J.等,DiabetesCare18:64--69(1995)；Steed,D.,J.Vasc.Surg.21:71-78(1995)；Kelley,S.等,Proc.Soc.Exp.Biol.194:320-326(1990)。

使用方法

根据本发明，鼓膜的慢性穿孔的伤口愈合通过提供HB-EGF或升高HB-EGF的水平来改善。这可通过几种不同的方式来实现。例如，可用有效量的活性剂诸如，例如药物、激素、细胞因子、抗体或另一种上调HB-EGF的表达、减少HB-EGF的降解或升高HB-EGF或HB-EGF同源物或衍生物的局部或全身性水平的化合物治疗患者。还可施用编码HB-EGF的核酸以用于治疗目的。

通常地，经由外耳道向患有慢性TM穿孔的个体局部施用包含HB-EGF蛋白，例如人HB-EGF的可溶形式的制剂，持续足以基本上闭合穿孔的一段时间。人或非人受试者可患有或可以不患有损害或减慢鼓膜穿孔的愈合的病状。

本发明提供了HB-EGF或HB-EGF抑制剂组合物，当以有效量施用时，其在受试者的伤口区域中导致升高的或降低的HB-EGF水平。例如，为了加速鼓膜愈合，可将包含HB-EGF的组合物施用于围绕鼓膜穿孔的区域。还可将HB-EGF抑制剂用于抑制正常或过度伤口愈合。在HB-EGF组合物的情况下，为了加速鼓膜愈合，可将组合物施用于与鼓膜穿孔相邻的区域或鼓膜穿孔的区域。可经由任何可生物降解或不可生物降解的来源或结构施用它们。

在另一个实施方案中，将本发明的方法应用于抑制受试者中的穿孔鼓膜的愈合。人或非人受试者可以患有或可以不患有损害或减慢鼓膜穿孔的愈合的病状。例如，此类方法可用作通常被开处方用于慢性中耳炎、鼓膜或耳咽管的畸形、唐氏综合征、腭裂和气压伤(由气压的降低导致的中耳损伤)等的鼓膜切开术和插入鼓膜造孔插管的插入的替代。常规地，将鼓膜造孔插管插入TM，并长时间保持，例如长达1个月、长达2个月、长达3个月、长达4个月、长达6个月，或更长时间。

该方法还用于为人的鼓膜穿孔病状提供临床相关模型的动物模型的产生。在此类模型中，动物可以是任何方便的实验室动物，例如啮齿动物、兔类动物等，并且包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、狗、非人灵长类动物等。

在此类实施方案中，通常通过与鼓膜的局部接触施用效剂量的EGFR配体脱落的抑制剂，以创建对TM的穿孔。在一些此类实施方案中，可在最初产生小的穿孔，例如约0.1至10mm²，约0.1至约5mm²，约0.1至约2.5mm²，约0.1至1mm²的面积。在初始穿孔后，将伤口与有效剂量的制剂中的HB-EGF抑制剂接触，并进行如本文中提供的时间。可将活性剂量的抑制剂维持期望穿孔的时间长度。

试剂盒

本发明的另一个方面提供了用于治疗TM的慢性穿孔的试剂盒。试剂盒包括例如以滴剂、装置、制剂等形式提供有效剂量的HB-EGF的制剂。试剂盒还可包括递送装置，例如滴耳器、用于递送制剂的注射器、用于递送两部分制剂的双筒注射器等。试剂盒还可包含使用说明书。

或者，可提供用于产生对TM的慢性穿孔的试剂盒。试剂盒包括例如以滴剂、装置、制剂等形式提供有效剂量的HB-EGF抑制剂的制剂。试剂盒还可包括递送装置，例如滴耳器，用于递送制剂的注射器、用于递送两部分制剂的双筒注射器等。试剂盒还可包含使用说明书。试剂盒还可包含无菌针或柳叶刀，以用于在TM中产生初始穿孔。

实施例1

HB-EGF的抑制

HB-EGF对于鼓膜模型中的表皮伤口愈合是至关重要的。在大鼠中在鼓膜穿孔后HB-EGF样生长因子的标准化信号强度显示8.5倍的HB-EGF样生长因子的上调。在本文中显示了HB-EGF活性的实验性抑制阻止鼓膜穿孔愈合。

可抑制EGFR配体脱落以创建慢性鼓膜穿孔模型。使用弯针在20只小鼠中在TM的紧张部创建次全穿孔。将OSU8.1(10mM)(一种选择性HB-EGF抑制剂)(参见Tokumaru等(2000)J.CellBiol.)注射至凝胶泡沫上(放置通过穿孔并在穿孔上)超过七天。在时间点(第2、7、14、30、44、60和90天)上处死小鼠，以观察对角质形成细胞迁移的影响。对侧耳用作利用置于凝胶泡沫上的盐水的对照。在2周内闭合所有这些。在3个月时打开7个治疗耳中的5个(71％)。慢性TM穿孔的代表性图像示于图5中。穿孔尺寸在3个月中是稳定的(使用ImageJ将穿孔面积计算为紧张部面积的百分比)。进行更大的组群，在3个月时87.9％(n＝58)具有慢性穿孔。我们的初步研究首次提出建立的基于可再生的生长因子的慢性TM动物模型。

表1显示了将HB-EGF抑制剂(OSU8-1)施用于小鼠中的急性鼓膜穿孔的结果。在2个月时相较于5％的对照呈现100％的HB-EGF抑制剂处理的穿孔，并且在3个月时相较于5％的对照呈现71％的HB-EGF抑制剂处理的穿孔。

表1

组群	在2个月时的穿孔开放	在3个月时的穿孔开放
			对照	5％(n＝21)	5％(n＝19)
HB-EGF抑制剂	100％(n＝9)	71％(n＝7)

创建慢性化脓性中耳炎的动物模型。在创建具有ET闭塞的慢性穿孔模型后，将两种类型的细菌通过现有的慢性穿孔接种至中耳中。在2周时，收集耳液，将其送去进行聚合酶链式反应(PCR)，以测试细菌的存在。所选择的细菌是最常见的参与慢性耳病的两种细菌肺炎链球菌(streptococcuspneumonia)3型(6×10⁶个菌落形成单位/ml的剂量)和铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)(6×10⁹个菌落形成单位/ml的剂量)。

实施例2

慢性鼓膜穿孔的治疗

例证慢性TM穿孔的HB-EGF治疗的功效。

用于耳道中的生长因子递送的生物相容性可吸收的可注射聚合物。为了治疗慢性TM穿孔，期望具有可被滴入耳内，随后硬化并在指定的时帧内缓慢再吸收同时洗脱出药物的液体。聚合物的降解速率和药物洗脱速率是可根据目标靶来容易地调整的。

用于递送生长因子的可生物降解的基于壳聚糖的水凝胶被开发来提供生物可降解的生物再吸收的可注射聚合物，其可运载选择的药物并且随后被滴入耳道。凝胶具有两种液体组分，并且在混合两种成分后在几分钟内可固化。这可通过双孔注射器来容易地施用。或者，可将溶液与交联剂混合，随后进行递送，以及利用单孔注射器进行滴注。

新开发的基于壳聚糖的水凝胶由亲水性壳聚糖骨架分子和疏水性聚丙交酯侧链组成。可将血纤蛋白原掺入共聚合物网络，以提高结合亲和力，增强细胞附着，和提供蛋白水解可降解位点。从聚合物水凝胶的药物释放根据聚合物的特征诸如亲水性亲和力、泡胀性能、降解度和交联密度而变化。测量rhBMP-2从基于壳聚糖的水凝胶的药物释放特征，和聚合物水凝胶在各种条件下的降解行为。

用于本实施例中的凝胶的壳聚糖对聚交酯的具体比率为8:1。另外，将10％w/w的血纤蛋白原掺入预聚物溶液。水凝胶制剂可在与用于化学交联的催化剂混合后数分钟内固化。这可通过双孔注射器或利用单孔注射器来容易地施用。

水凝胶无耳毒性。在穿孔后将水凝胶注射至小鼠鼓膜中。一只耳朵充注聚合物，而相对的耳未注射(对照)。在于9只小鼠中对两个鼓膜进行手术穿孔后60天测量听性脑干反应(ABR)和畸变产物耳声发射(DPOAE)阈值。到鼓膜自行愈合时，两侧之间的听觉阈值没有差异(图2)。数据显示水凝胶是无耳毒的。

HB-EGF治愈慢性鼓膜穿孔。当用40μl含有5μg/ml(经由可生物吸收的基于壳聚糖的聚合物的持续释放剂量)的浓度的重组HB-EGF的凝胶治疗一个组群的小鼠耳中的慢性穿孔，相较于第4周时对照(仅聚合物)的38％(26只中的10只)，92％(24只中的22只)愈合(p<0.01)。使用GF激活GFR胞外结构域配体脱落来克服TM慢性伤口愈合中的该关键步骤的能力证明其对于使用生物疗法的干预的适用性。这是在慢性穿孔的动物动物模型中测试的第一生长因子治疗，其已显示超过对照的显著益处。

HB-EGF治愈具有咽鼓管闭塞的慢性鼓膜穿孔。创建慢性TM穿孔和ET闭塞的动物模型，如图3中所显示的。现有ET闭塞大鼠模型(参见Herda等(2002)Laryngoscope112:1657-62)经改造适合用于小鼠，并且从此已在80只活小鼠中得以成功地进行。利用上述慢性穿孔模型进行ET闭塞。这在3个月时产生湿的无菌排孔。该模型模拟与ET功能障碍组合的慢性穿孔的人病状。

当用40μl浓度为5μg/ml(经由生物可吸收性聚合物壳聚糖的缓释剂量)的重组HB-EGF治疗一个组群的具有该模型(慢性穿孔和ET闭塞)的小鼠时，在6周时，相较于对照(仅聚合物)的对照的9％(23只中的2只)，94％(19只中的18只)愈合(p<0.01)。愈合的或未愈合的慢性TM穿孔的代表性图像示于图4中。在组织学上，相较于即使在闭合发生的那些少数情况下也不存在解质形成细胞层的对照，穿孔被厚的角质形成细胞层闭合。在中耳积液和ET闭塞存在的情况下使用HB-EGF激活EGFR胞外结构域配体脱落来克服TM慢性合口愈合中的该关键步骤的能力用于治疗具有慢性鼓膜穿孔的患者。

在慢性化脓性中耳炎的动物模型进行测试。在创建具有ET闭塞的慢性穿孔模型后，将铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(6×10⁹菌落形成单位/ml的剂量)通过现有慢性穿孔接种至中耳中。在2周时，收集耳液，并将其送去进行聚合酶链式反应(PCR)，以确认细菌的存在。该最性PCR验证了CSOM模型。

随后将小鼠分成两个组群。一个组群只接受聚合物。另一组群接受聚合物和5μg/ml(用于上述模型的相同剂量)的HB-EGF。相较于对照组中的41％(7/17)，100％(16只中的16只)的HB-EGF组愈合(p<0.01)。在对照组中，当愈合确实发生时，其也是不同的。TM通常非常薄，并且相较于稍微有点不透明的正常TM是半透明的。HB-EGF组中的愈合表现正常。仍然使用HB-EGF激活与人CSOM最接近的模型中的EGFR胞外结构域配体来克服TM慢性伤口愈合中的该关键步骤的能力验证了治疗方法。

实施例3

经鼓膜递送法(图5、6和7)。将用于HB-EGF或HB-EGF递送的媒介物紧贴鼓膜或通过鼓膜插入(经外耳道或经由咽鼓管)。其可在一段时间后被除去，或可以是可生物降解的。媒介物可含有将其约束在鼓膜内的设计。这可以是圈、罗口、凸缘、凹槽或宽度或高度的任何变化。其可具有不止一个这些设计来将其保持在适当的位置。媒介物可被穿孔或具有任何适当的尺寸的内腔。可存在许多凸缘或被认为是足够的或过量的对于待保留在鼓膜中的媒介物是所需的宽度和尺寸的任何宽度和尺寸。

图5中描绘的是耳道100；外耳110；和鼓膜120。还描绘了跨膜药物递送装置125，其具有宽度130和长度140。

图6中描绘的是可选的经鼓膜递送装置126的替代实施方案。装置具有宽度131和长度141。装置126包括外部约束150和内部约束155的一个或两个，其中该约束具有宽度160。

图7A-7B中描绘的是经鼓膜递送装置127的另一个实施方案。图7A是显示耳道100和鼓膜120的顶视图。递送装置127具有宽度132和长度142。装置包含多个沿着装置纵向排列的凸缘170，凸缘具有长度171和宽度172。图7B描绘装置的横截面。

实施例4

鼓室内递送装置

可将生长因子递送装置置于鼓膜的层之间。如果是固体媒介物，可通过将一个或多个层提升为翼片，随后在放置后替换翼片来放置其。如果是液体，则可注射其。

图8中描绘的是鼓膜内递送装置128。该装置被插入在鼓膜120中。装置具有宽度133和长度143。

实施例5

将媒介物以固体物体形式紧邻鼓膜放置(图9)。可将媒介物紧贴鼓膜并且提供HB-EGF或HB-EGF抑制剂的本地源。将媒介物置于中间或侧面，部分或全部通过鼓膜。通过鼓膜的媒介物可比穿孔(如果存在的话)更小，更大或与其具有相同的尺寸。

图9中描绘的是靠近鼓膜120的生长因子递送装置128。装置具有宽度134和长度144。

实施例6

生长因子施用的注射方法示于图10中。可将包含生长因子的制剂200递送进耳道100以在其侧表面和/或近中面上与鼓膜120接触，并且还可流进鼓膜穿孔121的区域。可从注射器210通过递送管220分配制剂。可以以单一溶液的方式，或以在递送时混合的两部分溶液的方式提供制剂。

双腔注射器在本领域已知的并且和是可容易获得的，例如除其它以外见：双腔注射器；或美国专利第5,971,953号、美国专利申请第US20030040701、US20140012196、US20130060232号、国际申请WO1999017820A1等中的任一个。

此类制剂包括在混合物后变得更加粘稠或固态的组合物。致粘剂包括，但不限于，结冷胶、N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸钠和n-N-烷基丙烯、聚丙烯酸与聚乙二醇、聚甲基丙烯酸与聚乙二醇、与羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸氢醋酸纤维素乳液、海藻酸钠或、反向热固性胶诸如泊洛沙姆或泊洛沙胺。

可将此类制剂以液体状态(即，可流动形式)递送至鼓膜的外表皮表面。然而，施用后，组合物转化成固体状态，以便组合物与鼓膜保持接触。因此，组合物保持局部紧贴鼓膜，并且药物试剂可转移至鼓膜。粘性或固体组合物可以是可生物降解的或不可生物降解的。

Claims (24)

1.一种在个体中改善慢性鼓膜穿孔的愈合的方法，所述方法包括：

将慢性鼓膜穿孔的部位与包含有效剂量的提供肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)活性的试剂接触，持续足以基本上闭合所述穿孔的一段时间。

2.根据权利要求1所述的方法，其中提供HB-EGF活性的试剂是HB-EGF蛋白的可溶性形式。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述个体是人，并且所述HB-EGF是人HB-EGF。

4.根据权利要求1所述的方法，其中将包含有效剂量的HB-EGF的制剂与所述受累鼓膜接触，持续至少7天的时期。

5.根据权利要求1所述的方法，其中将包含有效剂量的HB-EGF的制剂与所述受累鼓膜接触，持续至少2周的时期。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其中至少每天施用一次所述制剂。

7.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述制剂提供所述HB-EGF的持续释放。

8.根据权利要求1所述的方法，其中以水溶液、凝胶、洗剂、香膏、糊剂或其它媒介物形式提供所述制剂。

9.根据权利要求1所述的方法，其中通过喷雾施用所述组合物。

10.根据权利要求1所述的方法，其中以液体形式施用组合物，所述组合物随后固化以停留在所述鼓膜附近。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述制剂是包含交联的壳聚糖与聚交酯的共聚物的持续释放凝胶。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述持续释放凝胶还包含血纤蛋白原。

13.根据权利要求1所述的方法，其中通过提供所述HB-EGF的持续释放的装置递送所述制剂。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述制剂还包含至少一种另外的活性剂。

15.一种药物制剂，其包含有效剂量的用于权利要求1-14中任一项所述的方法中的HB-EGF。

16.具有HB-EGF活性的试剂在制造用于治疗TM的慢性穿孔的药物中的用途，其中以足以实现所述穿孔的闭合的一段时间和剂量向具有TM的慢性穿孔的患者施用所述药物。

17.一种在个体中抑制鼓膜穿孔的愈合的方法，所述方法包括：

将鼓膜穿孔的部位与包含有效剂量的抑制HB-EGF活性的试剂的制剂接触。

18.根据权利要求17所述的方法，其还包括在所述接触步骤之前在所述鼓膜中产生穿孔的步骤。

19.根据权利要求17所述的方法，其中所述个体是人。

20.根据权利要求17所述的方法，其中以水溶液、凝胶、洗剂、香膏、糊剂或其它媒介物形式提供所述制剂。

21.根据权利要求17所述的方法，其中以液体形式施用所述组合物，所述组合物随后固化以在停留在所述鼓膜附近。

22.根据权利要求17所述的方法，其中所述制剂是包含交联的壳聚糖与聚交酯的共聚物的持续释放凝胶。

23.根据权利要求17所述的方法，其中所述持续释放凝胶还包含血纤蛋白原。

24.根据权利要求1所述的方法，其中通过提供所述HB-EGF抑制剂的持续释放的装置递送所述制剂。