UA120037C2 - Застосування гепаринзв'язувального епідермального фактора росту білка для загоєння хронічної перфорації барабанної перетинки - Google Patents

Abstract

Винахід стосується застосування гепаринзв’язувального епідермального фактора росту білка (HB-EGF) для лікування хронічної перфорації барабанної перетинки та фармацевтичної композиції, що містить гепаринзв’язувальний епідермальний фактор росту білка (HB-EGF) для лікування хронічної перфорації барабанної перетинки.

Description

(54) ЗАСТОСУВАННЯ ГЕПАРИНЗВ'ЯЗУВАЛЬНОГО ЕПІДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТУ БІЛКА ДЛЯ

ЗАГОЄННЯ ХРОНІЧНОЇ ПЕРФОРАЦІЇ БАРАБАННОЇ ПЕРЕТИНКИ

(57) Реферат:

Винахід стосується застосування гепаринзв'язувального епідермального фактора росту білка (НВ-ЕСЕ) для лікування хронічної перфорації барабанної перетинки та фармацевтичної композиції, що містить гепаринзв'язувальний епідермальний фактор росту білка (НВ-ЕСЕ) для лікування хронічної перфорації барабанної перетинки.

Рівень техніки

І001| Перфорація барабанної перетинки (БП) найчастіше виникає внаслідок середнього отиту або травми. Найбільш частими клінічними проявами перфорації БП є кондуктивна приглухуватість і хронічна інфекція. Найпоширенішою причиною перфорації БП є інфекція.

Перфорації, пов'язані з неускладненим гострим середнім отитом, звичайно є невеликими; переважна більшість загоюється спонтанно після ослаблення інфекції. Крім того, більші перфорації можуть виникнути внаслідок інфікування некротизуючими мікроорганізмами. Іншою основною причиною перфорації БП є травма вуха. Звичайно причинами травми є тупі й проникаючі пошкодження, швидкі зміни барометричного тиску (баротравми) і надмірний звуковий тиск. 0021) Як відомо, після травми тканини проходять декілька стадій загоєння. Незважаючи на те, що загоєння ран у барабанній перетинці включає спочатку гемостатичну й протизапальну стадії, які схожі на звичайне загоєння шкіри, проліферативна й міграційна фази в барабанній перетинці суттєво відрізняються від цих фаз у інших тканинах. У більшості ситуацій загоєння ран утворюється основа грануляційної тканини, яка слугує як платформа, на якій відбувається рееєпітелізація. При загоєнні барабанної перетинки ці події відбуваються у зворотному порядку.

Шар плаского епітелію спочатку утворює міст через рану, і тільки потім відбувається переформування волокнистого компонента. БП унікальна тим, що шар епідермісу відіграє критичну роль у початковій міграції, причому цей процес контролює проліферуючий базальний шар.

ІЇ0ОЗ3| Більшість перфорацій барабанної перетинки загоюється спонтанно; однак низка чинників може затримувати або запобігати закриттю, що призводить до хронічної перфорації.

Постійно існуючі перфорації звичайно виникають в умовах довготривалої інфекції, що погіршує процес відновлення. У цих ситуаціях не відбувається процес регенеративного загоєння мембрани, хемотаксис і наступна міграція епітеліальних клітин у рані. Гістологічно при хронічних перфораціях плаский епітелій росте по краю перфорації до зустрічі з медіальним шаром слизової оболонки БП. 004) Цілями лікування хронічної перфорації БП є лікування або попередження хронічного середнього отиту й відновлення слуху. Звичайна терапія включає використання трансплантатів тканини, наприклад, при використанні в тимпанопластиці аутотрансплантатів, як аутотрансплантат можна використовувати скроневу фасцію. Можна використовувати поверхневу скроневу фасцію, що складається з фібробластів у колагеновій матриці. Хоча тимпанопластика з використанням трансплантата з аутологічної сполучної тканини є досить успішним способом відновлення постійно існуючих перфорацій БП, було б корисно розробити процедуру, яка не вимагає мікрохірургічних навичок, є менш витратною й може застосовуватися в умовах поліклініки. Цей винахід задовольняє цю потребу.

Публікації

ІОО1| Запіа Маїіа еї а!. (2010) У Мої Нізю!. 2010 Оес:41(6):309-14. Запіа Маїа (2011) Тнезвів,

Опіметзйу ої М/евзієтп Аийзвігаїїа. хуоппзоп апа Мапд (2013) У Сопіго! ВеїІєазе 166(2)7124-9. Івпінага еї аІ. (2003) У Віотей Маїєег Не5 А. 64(3):551-9. Тоїїпо еї аїЇ. (2011) Віоспіт Віорпу5 Асіа. 1810(9):875-8; ЗПпігаката еї аі. (2005) 2 СеїЇ сі. 118(РІ 11)2363-70; Нішепьгіпк (20053. НМО 53(6):515-6; Ма вї а). (2002) Асіа Обюіагуподо!. 122(6):586-99. МО 2007/037514. 005 2010/0222265.

Суть винаходу

І002| Пропонуються композиції й способи лікування хронічної перфорації барабанної перетинки. У способах згідно з цим винаходом хронічно перфорована барабанна перетинка перебуває в місцевому контакті з ефективною дозою гепарин-зв'язувального епідермального фактора росту, НВ-ЕСЕ, або агента, що володіє активністю НВ-ЕСЕ, протягом періоду часу, достатнього для забезпечення покращеного загоєння перфорації мембрани. У деяких варіантах реалізації цього винаходу доза НВ-ЕСЕ пропонується в композиції з уповільненим вивільненням; в інших варіантах реалізації цього винаходу пропонується регулярне введення композиції без уповільненого вивільнення. У деяких варіантах реалізації цього винаходу композиція уповільненого вивільнення є біорозкладною. В інших варіантах реалізації цього винаходу уповільнене вивільнення здійснюється пристроєм, наприклад насосом або іншим устроєм для вивільнення. 003) БП, що піддається лікуванню, контактує з НВ-ЕСЕ протягом періоду часу, достатнього для покращення загоєння перфорації БП, тобто, щоб отримати в результаті значне закриття перфорації, наприклад до площі перфорації менше ніж приблизно 0,1 мм2. Закриття можна контролювати візуально, у тому числі мікроскопічно; функціонально, наприклад, за зменшенням приглухуватості; тощо. Період часу контактування з НВ-ЕСЕ може становити щонайменше одну 60 добу, щонайменше З доби, щонайменше 5 діб, щонайменше 7 діб, щонайменше 10 діб,

щонайменше 2 тижні, щонайменше 3 тижні; і може становити аж до однієї доби, аж до З діб, аж до 5 діб, аж до 7 діб, аж до 10 діб, аж до 2 тижнів, аж до З тижнів або більше, відповідно до потреб індивідуума.

І004| У деяких специфічних варіантах реалізації цього винаходу ефективна доза НВ-ЕСЕ надається в не ототоксичній композиції уповільненого вивільнення, наприклад, у гелі, піні, вставці тощо, переважно, у біорозкладній композиції. В одному такому варіанті реалізації цього винаходу ефективну дозу НВ-ЕСЕ вводять до складу гелю, що містить хітозан, полімолочну кислоту й фібриноген.

ІЇОО5| В одному варіанті реалізації цей винахід включає спосіб, що складається з (Її) ідентифікації пацієнта, що має хронічну перфорацію БП; (її) контактування ураженої БП із ефективною дозою НВ-ЕСЕ, наприклад, що надається у формі крапель для введення через відповідні проміжки часу, в пристрої для уповільненого вивільнення НВ-ЕСЕ, у композиції уповільненого вивільнення тощо; і (ії) моніторинг індивідуума для визначення ефективного закриття перфорації.

І00О6| Інший аспект цього винаходу відноситься до застосування агента з активністю НВ-ЕСЕ при виробництві лікарського засобу для лікування хронічної перфорації БП, причому зазначений лікарський засіб вводять пацієнтові з хронічною перфорацією БП протягом періоду часу й у дозі, достатніх, щоб спричинити закриття перфорації.

ІЇ007| У ще одному аспекті цього винаходу пропонується набір для лікування хронічної перфорації БП. Набір містить композицію, яка забезпечує ефективну дозу НВ-ЕСЕ, наприклад, у формі крапель, пристроїв, композицій тощо. Набір також може містити в собі пристрій доставки, наприклад, дозатор для вушних крапель, шприц для доставки композиції, двоствольний шприц для доставки двокомпонентної композиції тощо. Набір може також містити інструкції із застосування.

І008| В інших варіантах реалізації цього винаходу пропонуються способи тимчасового відкриття барабанної перетинки, наприклад для введення трубок тощо. У таких варіантах реалізації цього винаходу БП контактує з ефективною дозою інгібітора НВ-ЕСЕ включаючи, без обмеження, інгібітор шедінгу ліганда ЕСЕК, протягом періоду часу, достатнього для створення невеликої перфорації в БП. У деяких таких варіантах реалізації цього винаходу невелику

Зо перфорацію можна зробити механічним шляхом до контактування з інгібітором.

Короткий опис графічних матеріалів

І0О09| Фігура 1. Типові зображення БП після перфорацій, які лікували з використанням О508- 1 (інгібітор шедінгу ліганда ЕСЕК) на (а) день 2 (Б) день 14 (с) день 44 (4) день 90 (З місяці).

Перфорація обведена блакитним кольором. 00101 Фігура 2. Пограничні показники тесту-відповіді слухового відділу стовбура мозку (АВК) і отоакустичних виділень продуктів викривлення (ОРОАЕ) визначали у 9 мишей через 60 днів після хірургічної перфорації обох барабанних перетинок. В одне вухо не вводили ін'єкцію (контроль), у той час як протилежне вухо заповнили полімерним засобом доставки для доставки хітозану, фібриногену й полілактиду.

І00111|Ї Фігура 3. Євстахієва труба (ЄТ) перед (а) і після(б) оклюзії гутаперчею. Процедуру у щурів адаптували шляхом відкриття слухової булли за допомогою пристрою для висічення із фрезою 0,5 мм. Відкриття булли латерально дозволяє гутаперчі наповнювати ЄТ у напрямку вниз із меншою ретракцією дихальних шляхів. ЄТ досліджували посмертно, що підтверджувало повну оклюзію. 0012) Фігура 4. Лікування хронічних перфорацій з використанням СЕ у мишачій моделі оклюзії ЄТ. У верхньому ряду представлені (а) репрезентативні зображення групи лікування, що демонструють загоєння перфорацій. У нижньому ряду представлені (Б) репрезентативні зображення контрольної групи (введення тільки полімеру), що демонструють перфорацію, що зберігається (обведена блакитним кольором). Примітка. Деякі БП у верхньому ряду зажили з утворенням тимпаносклерозу. 0013) Фігура 5. Транстимпанальна доставка фактора росту. (0014) Фігура 6. Транстимпанальна доставка фактора росту. 0015) Фігура 7. Транстимпанальна доставка фактора росту. 0016) Фігура 8. Інтратимпанальна доставка фактора росту. 00171 Фігура 9. Засіб доставки лікарського засобу до регіону, що прилягає до барабанної перетинки. 0018) Фігура 10. Текуча композиція для доставки лікарського засобу. 00191) Характерні ознаки й багато інших переваг цього винаходу стануть зрозумілішими з нижченаведеного докладного опису, наведеного в комбінації із прикладеними кресленнями. бо Докладний опис варіантів реалізації цього винаходу

ІЇ0020| Перед подальшим описом цього винаходу необхідно зрозуміти, що винахід не обмежений конкретними варіантами реалізації цього винаходу, описаними нижче, оскільки можуть бути зроблені зміни конкретних варіантів реалізації, які усе ще будуть попадати в обсяг прикладеної формули винаходу. Крім того, необхідно враховувати, що використовувана термінологія призначена для опису конкретних варіантів реалізації цього винаходу й не призначена для обмеження. У цьому описі й прикладеній формулі винаходу однина включає посилання на множину, якщо з контексту очевидно не випливає зворотне.

ІЇ0021| У випадку якщо пропонується діапазон значень, необхідно розуміти, що кожне проміжне значення, до десятих часток одиниці нижньої межі, якщо контекстом чітко не зазначене інше, між верхньою й нижньою межею цього діапазону, а також будь-яке інше зазначене або проміжне значення в цьому зазначеному діапазоні, включається в обсяг цього винаходу. Згадані верхня й нижня межі цих менших діапазонів можуть незалежно включатися в менші діапазони й також входять в обсяг цього винаходу при дотриманні будь-якої конкретно виключеної межі в зазначеному діапазоні. У тому випадку, якщо зазначений діапазон включає одну або обидві межі, діапазони, що виключають будь-яку або обидві згадані включені межі, також включені в цей винахід.

І0022| Якщо не зазначене інше, всі технічні й наукові терміни, використовувані в цьому документі, мають ті ж самі значення, що звичайно розуміє фахівець у тій галузі техніки, до якої відноситься цей винахід. Незважаючи на те, що при практичному здійсненні або випробуванні цього винаходу можуть використовуватися будь-які способи, пристрої й матеріали, подібні або еквівалентні описаним у цьому документі, далі буде представлений опис ілюстративних способів пристроїв і матеріалів. 0023) Усі публікації, згадані в цьому документі, включені в нього за допомогою посилання з метою описання й розкриття компонентів згідно з винаходом, які описані в зазначених публікаціях, тих компонентів, які можна використовувати у зв'язку з описаним винаходом. (0024) Цей винахід описаний у термінах конкретних варіантів реалізації, встановлених або запропонованих авторами цього винаходу для охоплення кращих форм практичного застосування цього винаходу. Фахівцям у цій галузі техніки буде зрозуміло, що у світлі цього опису в конкретних проілюстрованих варіантах реалізації цього винаходу можуть бути зроблені

Зо численні модифікації й зміни, не відступаючи від передбачуваного обсягу цього винаходу.

Наприклад, з міркувань біологічної функціональної еквівалентності в структурі білка можуть бути зроблені зміни, що не впливають на вид або розмір біологічної дії. Усі такі модифікації призначені для внесення в обсяг прикладеної формули винаходу.

Визначення (0025) Терміни, використовувані в цьому описі, у рамках цього винаходу й у конкретному контексті, у якому використовується кожен термін, як правило, мають свої звичайні прийняті в цій галузі техніки значення. Деякі терміни будуть розглянуті нижче або в інших місцях цього опису, щоб забезпечити додаткове керівництво в описі композицій і способів цього винаходу, їх отримання й застосування. 0026) Суб'єкт. Індивідууми, що підлягають лікуванню способами згідно з цим винаходом, можуть належати до будь-якого виду ссавців або птахів, включаючи людину. Тварини, що не відносяться до людського роду, включають, без обмеження, ссавців, експериментальних тварин, таких як миші, щури, кролики, хом'яки, морські свинки, шиншили тощо; свійських тварина, таких як собаки й кішки; і сільськогосподарських тварин, таких як вівці, кози, свині, коні й корови. Тварини згідно з цим винаходом, що не відносяться до людського роду, можуть бути ссавцями або не ссавцями; хребетними або безхребетними.

І0027| «Лікування» суб'єкта або «лікування» суб'єкта від захворювання або патологічного стану в цьому описі означає зниження або ослаблення клінічних симптомів захворювання або патологічного стану, такого як хронічна перфорація БП. (0028) «Стимулювання», «підвищення» або «покращення» загоєння барабанної перетинки або рани звичайно означає збільшення швидкості загоювання рани або перфорації або зменшення ступеня залишкового рубця або появи келоїдної або некротичної тканини під час або після загоєння рани або перфорації.

ІЇ0029| «Рана» являє собою руйнування або розрив у структурі органа або тканини, включаючи епітелій, сполучну тканину й м'язову тканину. Приклади ран включають, але не обмежуються перерахованим, рани шкіри, гематоми, виразки, пролежні, садна, тріщини, порізи, проколи, псоріатичні рани, перфорації барабанної перетинки, подряпини й розриви рогівки й опіки.

І00ОЗ30) «Місцеве» застосування відноситься до несистемного місцевого нанесення активного бо інгредієнта на поверхню рани.

І0031| Барабанна перетинка. Барабанна перетинка являє собою тонку, конусоподібну мембрану, яка у людей і інших ссавців відокремлює зовнішнє вухо від середнього вуха. Її функція полягає в передачі звуку з повітря на кісточки всередині середнього вуха, а потім у овальне вікно в заповнену рідиною завитку. Отже, вона, в остаточному підсумку, підсилює й перетворює вібрацію в повітрі на вібрацію в рідині. Кісточка молоточок є містком у проміжку між барабанною перетинкою й іншими кісточками.

І0032| У барабанній перетинці розрізняють дві основні ділянки: ненатягнуту частину й натягнуту частину. Ненатягнута частина складається з двох шарів, є відносно слабкою, і пов'язана з дисфункцією євстахієвої труби й холестеатомами. Більша за розміром ділянка натягнутої частини складається із трьох шарів: шкіри, волокнистої сполучної тканини й слизової оболонки. Вона порівняно міцна і являє собою ділянку, яка найчастіше пов'язана з перфораціями.

ІЇ0033| Розрив або перфорація БП може бути результатом різних травм, інфекції тощо.

Перфорації БП можуть призводити до кондуктивної приглухуватості (СНІ), яка коливається в діапазоні від незначної до 50 дБ. Перфорації можуть варіювати за площею й локалізацією, наприклад, передня, задня або та і інша; і за площею від приблизно 0,1 до приблизно 60 мм2, як правило, у діапазоні від приблизно 2,5 до 10 мма2 (див. Мейіа єї аї. (2006) Ой! Меигоїої. 27(2): 136-143). Перфорація може бути гострою або хронічною. Гостру перфорацію звичайно не лікують, оскільки БП зазвичай загоюється спонтанно. Однак у деяких індивідуумів не відбувається загоєння БП, що призводить до хронічної перфорації.

І0034| Хронічна перфорація барабанної перетинки. Перфорація, яка не загоюється за відсутності лікування або при лікуванні звичайними способами, наприклад, при лікуванні антибіотиками, може розглядатися як хронічна перфорація. Фахівцям у цій галузі техніки буде зрозуміло, що між індивідуумами можуть бути відмінності в тривалості часу, необхідного для загоєння, але, як правило, перфорація, що не зажила після періоду аж до приблизно З місяців, після періоду аж до приблизно 2 місяців, після періоду аж до приблизно 1 місяця, може бути класифікована як хронічний патологічний стан. 00351 Хронічні рани або рани, що не загоюються являють собою відкриті рани, які не епітелізувалися й не закрилися за розумний строк. Ці рани є клінічно застійними без ознак

Зо подальшого закриття. Хронічні рани можуть розглядатися як рани з відсутністю відповідних «стартових» сигналів. (Див., наприклад, І огеп7 апа І опдакег, іп УУоипав: Віоіоду, Рашо!оду, апа

Мападетенпі, СНаріег 7, рр 77-88). 0036) «Гепарин-зв'язувальний епідермальний фактор росту» при використанні в цьому документі відноситься до фактора, що ендогенно зустрічається у ссавців, наприклад, до гепарин-зв'язувального епідермального фактора росту людини, алельного гепарин- зв'язувального епідермального фактора росту, функціональних консервативних похідних гепарин-зв'язувального епідермального фактора росту, функціонально активних фрагментів гепарин-зв'язувального фактора росту й гомологів гепарин-зв'язувального епідермального фактора росту, таких як гепарин-зв'язувальний фактор росту, подібний епідермальному факторові росту. НВ-ЕСЕ також відноситься до варіантів форм НВ-ЕСЕ, наприклад до тих, які забезпечують підвищену активність, підвищену стабільність, підвищений вихід або кращу розчинність. Композиції для використання в способах згідно з винаходом можуть містити одну або суміш із видів активності НВ-ЕСЕ, наприклад, містити множину різних молекул НВ-ЕСЕ.

Звичайно активність НВ-ЕСЕ, при використанні в цьому документі, відноситься до зв'язування зі спорідненим рецептором, активації зазначеного рецептора, проявам видів біологічної активності, які є результатом зв'язування рецептора й активації тощо.

Ї0037| НВ-ЕСЕ є переважним фактором росту процесу епітелізації, необхідним для загоєння ран шкіри. Мітогенний й міграційний вплив НВ-ЕСЕ на кератиноцити й фібробласти сприяє відновленню шкіри й ангіогенезу, необхідним для загоєння ран, і цей фактор є основним компонентом рідин рани. Зв'язування НВ-ЕСЕ клітинної поверхні з гепарансульфат- протеогліканами підвищує можливості мітогенного стимулювання, прискорюючи загоєння ран шкіри, скорочуючи час, необхідний для приживлення трансплантата шкіри людини, і сприяє швидкому загоєнню виразок, опіків і епідермальних ран розщепленого клаптя.

І0038| НВ-ЕСЕ синтезується у вигляді пов'язаного з мембранною мітогенного й хемотаксисного глікопротеїну. НВ-ЕСЕ є глікопротеїном, що складається з 87 амінокислот, який демонструє експресію гена з високою точністю регулювання. Шедінг ектгодомену призводить до утворення розчинної зрілої форми НВ-ЕСЕ, яка впливає на фактори мітогенності й хемотаксису гладком'язових клітин і фібробластів. Трансмембранна форма НВ-ЕСЕ є унікальним рецептором для дифтерійного токсину й функціонує під час юкстакринної передачі сигналу в бо клітинах. Обидві форми НВ-ЕСЕ беруть участь у нормальних фізіологічних процесах і в патологічних процесах, включаючи прогресування й метастазування пухлин, гіперплазію органів і атеросклероз. Для цілей цього винаходу, як правило, використовується розчинна, зріла форма білка. Білок або агент може бути по суті чистим, наприклад, не містити інші білки, не містити клітинний матеріал тощо, звичайно він може бути щонайменше приблизно на 5095 чистим, щонайменше приблизно на 7595 чистим, щонайменше приблизно на 8095 чистим, щонайменше приблизно на 9095 чистим, щонайменше приблизно на 9595 чистим, щонайменше приблизно на 9995 чистим.

І0039| У переважному варіанті реалізації цього винаходу використовують по суті чистий препарат НВ-ЕСЕ людини. НВ-ЕСЕ можна придбати в очищеній формі або отримати шляхом очищення компонента від людей або інших тварин, або шляхом рекомбінантної продукції в клітинах-хазяїнах, включаючи прокаріотичні клітини-хазяїни, такі як 5. сегемізіає або БЕ. сої і, переважніше, клітини-хазяїни ссавців, такі як клітини СНО. НВ-ЕСЕ може бути людським дикого типу, гомологом ссавців або модифікованим/мутуючим. Зокрема, можуть бути використані фрагменти компонента, які зберігають щонайменше частину необхідної активності повнорозмірного компонента. 0040) У деяких варіантах реалізації цього винаходу НВ-ЕСЕ являє собою НВ-ЕСЕ людини й містить амінокислотну послідовність номера доступу СепВапк: І 17032.1 СІ 348175 або номера доступу СепВапк: І17033.1 СІ 34817 або номера доступу СепВапКк: /17032.1 с 348175, включаючи, зокрема, розчинні зрілі форми білків, описані в цьому документі.

Ї0041| «Функціонально консервативні варіанти» являють собою білки, в яких цей амінокислотний залишок замінений без зміни всієї конформації й функції білка, включаючи, але не обмежуючись перерахованим, заміну амінокислоти іншою амінокислотою, що має аналогічні властивості (такі як, наприклад, кислотні, основні, гідрофобні тощо). Амінокислоти з аналогічними властивостями добре відомі в цій галузі техніки. Наприклад, аргінін, гістидин і лізин є гідрофільними основними амінокислотами й можуть бути взаємозамінними. Аналогічно, ізолейцин, гідрофобна амінокислота, може бути замінений лейцином, метіоніном або валіном.

Амінокислоти, відмінні від зазначених як консервативні амінокислоти, можуть відрізнятися в білку або ферменті таким чином, що відсотковий вміст білка або подібність амінокислотної послідовності між будь-якими двома білками з аналогічною функцією, може варіюватися, і може становити, наприклад, від 7095 до 9995, як визначається у відповідності зі схемою вирівнювання, наприклад, за допомогою кластерного способу, у якому подібність визначається на основі алгоритму МЕСАГСІОМ. «Функціонально консервативний варіант» також включає в себе поліпептид або фермент, що має щонайменше 6095 амінокислотної ідентичності при визначенні алгоритмами 20 ВГА5Т або ГА5ТА, переважно щонайменше 7595, переважніше щонайменше 8595, навіть ще переважніше щонайменше 9095, і ще переважніше 9595, і який має такі самі або по суті аналогічні властивості або функції, що й нативний або батьківський білок або фермент, з яким його порівнюють. 00421) При використанні в цьому документі термін НВ-ЕСЕ може включати в себе варіанти, гомологи й ортологи наданих послідовностей. Варіант може бути по суті аналогічним нативній послідовності, тобто відрізнятися щонайменше однією амінокислотою, і може відрізнятися щонайменше двома, але звичайно не більш ніж приблизно десятьма амінокислотами (кількість відмінностей залежить від розміру нативної послідовності). Зміни послідовності можуть являти собою заміни, інсерції або делеції. Скануючі мутації, які систематично вводять аланін або інші залишки, можуть бути використані для визначення ключових амінокислот для збереження у варіантних послідовностях. Консервативні амінокислотні заміни, які можуть бути використані, щоб забезпечити варіантну послідовність згідно з винаходом, звичайно включають заміни в межах наступних груп: (гліцин, аланін); (валін, ізолейцин, лейцин); (аспарагінова кислота, глутамінова кислота); (аспарагін, глутамін); (серин, треонін); (лізин, аргінін); ї (фенілаланін, тирозин).

І0043| Амінокислотна послідовність білка, що зустрічається в природі, може бути змінена різними відомими в цій галузі техніки способами для генерації цільових змін у послідовності й, таким чином, забезпечувати варіантні послідовності згідно з винаходом. Такі варіанти звичайно будуть являти собою функціонально-збережені варіанти, які відрізняються, як правило послідовністю, від відповідного нативного або батьківського білка, але як і раніше зберігають бажану або демонструють підвищену біологічну активність і/або функцію. Різні способи, відомі в цій галузі технікю, можна використовувати для генерації цільових змін, наприклад, спосіб фагового дисплея в комбінації з випадковими й цільовими мутаціями, введення скануючих мутацій тощо, а також забезпечити варіантну послідовність згідно з винаходом. Як приклад у цей опис включено додавання міток Ніх5 або епітопних міток з метою полегшення очищення. бо Ферменти, модифіковані для забезпечення специфічної характеристики, що представляє інтерес, можуть бути додатково модифіковані, наприклад, за допомогою мутагенезу, «перемішування» екзонів тощо, як відомо в цій галузі техніки, з наступним скринінгом або відбором, з оптимізацією або відновленням активності ферменту, наприклад, до рівнів дикого типу, і в такий спосіб забезпечувати інші варіантні послідовності згідно з винаходом. (0044) Термін «НВ-ЕСЕ» також включає в себе біологічно активні фрагменти. Фрагменти, що представляють інтерес, включають фрагменти, що складаються щонайменше із приблизно 20 суміжних амінокислот, звичайно щонайменше із приблизно 50 суміжних амінокислот, і можуть містити 100 або більше амінокислот, аж до повнорозмірного білка, і можуть подовжуватися далі й містити додаткові послідовності. (00451 Модифікації білка, що представляють інтерес і не змінюють первинну послідовність, але забезпечують інші варіантні білки згідно з винаходом, включають хімічну дериватизацію білків, у тому числі, наприклад, ацилування, наприклад лаурильних, стеарильних, міристильних, децильних груп тощо, ПЕГилювання, етерифікацію або амідування. Такі модифікації можуть бути використані для підвищення стійкості ферменту до протеолізу, наприклад за допомогою приєднання бічних ланцюгів ПЕГ або лаурильних груп до поверхневих лізинів. Також включені модифікації глікозилювання, наприклад, виконані за допомогою модифікації паттернів глікозилювання білка в процесі його синтезу й обробки або на подальших етапах обробки; наприклад, піддаючи білок дії ферментів, які впливають на глікозилювання, наприклад, ферментів ссавців, які викликають глікозилювання або деглікозилювання. Також охоплені послідовності, що мають фосфорильовані залишки амінокислот, наприклад, фосфотирозин, фосфосерин або фосфотреонін.

І0046| Також підходять для використання на практиці й запропоновані в цьому винаході білки, які були модифіковані за допомогою способів молекулярної біології й/або хімії для покращення їхньої стійкості до протеолітичної деградації, окиснення тощо, а також для оптимізації властивостей розчинності або для того, щоб зробити їх більш придатними для застосування як терапевтичного агента. Наприклад, кістяк білка можна піддавати циклізації для підвищення стабільності (див. ЕгієаІег еї а. (2000) 9. Віої. Спет. 275:23783-23789). Аналоги таких білків включають ті, що крім природних І -амінокислот містять і інші залишки, наприклад,

Р-амінокислоти або синтетичні амінокислоти, що не зустрічаються в природі.

Зо І0047| Міметики НВ-ЕСЕ. НВ-ЕСЕ агенти, що представляють інтерес, також включають у себе міметики, наприклад малі молекули, білки, аптамери тощо, які забезпечують біологічну активність НВ-ЕСРЕ. Такі види активності включають зв'язування НВ-ЕСЕ з рецептором ЕСЕ і гепаринсульфат-протеогліканами на клітинній поверхні. (0048) Про-НВ-ЕСЕ синтезується у вигляді одного трансмембранного білка-попередника типу, який потім підлягає значній протеолітичній обробці, що називається шедінгом ектодомену (див., наприклад, Уап еї аї. У Сеїі! Віо!. 2002;158(2):221-6; АзаКигаєї а. Маї Мед. 2002;8(1):35-40;

І2гиті еї ам. ЄЕтбо .). 1998;17(24):7260-72; Макадама еї а). У Віої Спет. 1996;271(48):30858-63). Це забезпечує вивільнення розчинної зрілої форми НВ-ЕСЕ. Металопротеїнази (включаючи АСАМ 9, 10, 12, 17), які відповідають за шедінг ектодомену про-НВ-ЕСЕ, переважно регулюють зв'язування зрілого НВ-ЕСЕ їі регулюють активацію ЕСЕК (див. Сівзе еї а. У Віої Спет. 2005; 280(49):40624-31; Резспоп єї аїЇ. бсіепсе. 1998:282(5392):1281-4; Заніп апа Віоре! РЕВЗ5 І ей. 2007:581(1):41-4; Заніп єї а!. У Сеї! Вісі. 2004:164(5):769-79). Згодом НВ-ЕСЕ діє як через ЕСЕК- залежні, так і через ЕСЕК-незалежні механізми. НВ-ЕСЕ містить ЕСЕ-подібний домен, який, як вважають, є необхідним для представників сімейства ЕСЕ для зв'язування й активації ЕСЕ (Тнотрзгоп еї аї. У Віої Снет. 1994 :269(4):2541-9).

І0049| Представники сімейства ЕСЕ можуть індукувати юкстакринну, аутокринну, паракринну або ендокринну передачу сигналів залежно від навколишнього середовища клітини, тому що під дією металопротеїназ вони відщдеплюються від мембрани з утворенням зрілого розчинного фактора росту (5іпой апа Наїті5, Сеї! бБідпаї. 2005:17(10):1183-93). Існує чотири ідентифіковані представники сімейства ЕСЕК (НЕК, НЕК2, НЕКЗ і НЕКЗ). Вони є структурно спорідненими з тирозинкіназою з одним трансмембранним доменом і доменом у цитоплазмі (Ріом/тап, еї аї.

Ргос Май Асай бсі ОО 5 А. 1993:90(5):1746-50; Тауог еї а. Зетіп Сеїї Оєм Віої. 2014).

Представники сімейства ЕСЕ мають одмінну від сімейства ЕСЕК активність зв'язування. На відміну від ЕСЕ, НВ-ЕСЕ зв'язується як з НЕКТ, так і з НЕК4, як це роблять бетацелюлін і нейрегулін 2. Див. Нідазпіуата еї аїЇ. Зсіепсе. 1991;251(4996):936-9; Спапу єї аїЇ. Маїйшге. 1997;387(6632):509-12; Сатамау еї аї. Майте. 1997;387(6632):512-6; Зпіпд еї аІ. 5сіепсе. 1993; 259(5101):1604-7. НВ-ЕСЕ також зменшує кількість епітеліальних маркерів, таких як кератини 1, 5, 10 і 14, при цьому збільшуючи кількість генів клітинної рухливості, таких як 5МА1, 2ЕВІ1, СОХ- 2 і ММР' (див. ОЇ еї а. У Іпмезі Оептаїйої. 2012:132(9):2148-57).

0050) Термін «ефективна кількість» або «терапевтично ефективна кількість» НВ-ЕСЕ або агента, що забезпечує активність НВ-ЕСЕ, являє собою дозу, яка при застосуванні протягом певного періоду часу, покращує загоєння хронічної перфорації БП. 0051) Композиція, тобто рідкі краплі, гель із уповільненим вивільненням тощо, може містити

НВ-ЕСЕ або агент із еквівалентною активністю, що забезпечує активність НВ-ЕСЕ, у концентрації, що становить щонайменше приблизно 1 нг/мл, щонайменше приблизно 10 нг/мл, щонайменше приблизно 100 нг/мл, щонайменше приблизно 1 мкг/мл, щонайменше приблизно мкг/мл, щонайменше приблизно100 мкг/мл, щонайменше приблизно 200 мкг/мл щонайменше приблизно 500 мкг/мл, щонайменше приблизно 750 мкг/мл, щонайменше приблизно 1 мг/мл, 10 щонайменше приблизно 5 мг/мл, щонайменше приблизно 10 мг/мл, щонайменше приблизно 50 мг/мл, щонайменше приблизно 100 мг/мл і аж до приблизно 10 мг/мл, аж до приблизно 25 мг/мл, аж до приблизно 50 мг/мл, аж до приблизно 100 мг/мл, аж до приблизно 500 мг/мл.

Композиція, призначена для уповільненого вивільнення, може бути надана з вищою вихідною концентрацією порівняно з композицією для повторного введення.

І0052| Об'єм композиції, як правило, є таким, який необхідний для забезпечення відповідного контакту з барабанною перетинкою, наприклад, аж до приблизно 5 мкл, аж до приблизно 10 мкл, аж до приблизно 25 мкл, аж до приблизно 35 мкл, аж до приблизно 50 мкл, аж до приблизно 75 мкл, аж до приблизно 100 мкл, аж до приблизно 250 мкл, аж до приблизно 375 мкл, аж до приблизно 500 мкл. Альтернативно може бути надана крапельниця, у якій доза становить одну краплю, дві краплі, три краплі, причому, як відомо в цій галузі техніки, крапля має об'єм близько 50 мкл. 0053) Терапевтично ефективна кількість забезпечує клінічно значущу відповідь у суб'єкта, яка проявляється в тому, наприклад, що відбувається стимуляція загоєння перфорації барабанної перетинки. Альтернативно, терапевтично ефективна кількість є достатньою для покращення клінічно значущого стану загоєння рани у хазяїна.

Ї0054| Можуть бути розроблені композиції або пристрій для уповільненого або пролонгованого вивільнення, що мають Її» вивільнення лікарського засобу, тобто проміжок часу для вивільнення половини активного агента, що підходить для початкової дози й бажаної локальної концентрації, наприклад, 25 становить приблизно 24 години, приблизно 48 годин,

Ко) приблизно З доби, приблизно 4 доби, приблизно 5 діб, приблизно 1 тиждень, приблизно 10 діб, приблизно 2 тижні, приблизно З тижні тощо. 0055) Композиція, що не є композицією уповільненого або пролонгованого вивільнення, наприклад, рідкі вушні краплі тощо, може бути введена з інтервалами, що підходять для підтримки ефективної дози, наприклад, приблизно кожні З години, приблизно кожні 4 години, приблизно кожні 6 годин, приблизно кожні 12 годин, приблизно кожні 18 годин, приблизно кожні 24 години, приблизно кожні 48 годин тощо. (0056) Альтернативно, ефективна кількість НВ-ЕСЕ або агента, що забезпечує активність

НВ-ЕСЕ, являє собою кількість, яка призводить до швидшого загоєння перфорації або рани порівняно з загоєнням за відсутності такого агента. Ефективна кількість може також означати кількість або дозу, достатню для збільшення локальних і/або системних рівнів НВ-ЕСБЕ, наприклад, приблизно на 10 відсотків, переважно, приблизно на 50 відсотків, і переважніше приблизно на 100 відсотків від рівня, виявленого до введення активного агента або лікарського засобу.

І0057| Період часу контактування з НВ-ЕСЕ може становити аж до однієї доби, аж до 2 діб, аж до З діб, аж до 5 діб, аж до 7 діб, аж до 10 діб, аж до 12 діб, аж до 2 тижнів, аж до З тижнів або більше відповідно до потреб індивідуума. 0058) «Контроль», «контрольне значення» або «еталонне значення» в аналізі являє собою значення, яке використовується для виявлення зміни, наприклад, загоєння перфорованої барабанної перетинки або рани шкіри, або в яких-небудь інших аналізах, описаних у цьому документі. Наприклад, при вивченні загоєння перфорації барабанної перетинки, інгібуючий/стимулюючий вплив агента можна оцінити шляхом порівняння загоєння рани або перфорації з контрольним загоєнням. Контроль або еталон може являти собою, наприклад, попередньо задане еталонне значення або може бути визначений експериментально.

Наприклад, у такому аналізі контроль або еталон може являти собою загоєння аналогічної рани або перфорації у тварини, що не зазнала впливу лікарського засобу або активного агента, або у тварини, пролікованої тим самим препаратом або активним агентом, але у якої здатність загоєння ран не порушена. 0059) Термін «інгібітор» включає природну або синтетичну композицію або речовину, яка запобігає дії НВ-ЕСЕ, яка знижує рівень НВ-ЕСЕ або його рецептора, яка блокує бо внутрішньоклітинну передачу сигналів, коли НВ-ЕСЕ приводить у дію свій споріднений рецептор тощо. Інгібітори включають у себе нуклеїнові кислоти, наприклад, антисмислові, міРнНК, рибозими тощо; антитіла, специфічні для НВ-ЕСЕ або його спорідненого рецептора, інгібітори малих молекул тощо. У деяких варіантах реалізації цього винаходу інгібітор являє собою О50И8- 1/КВ-К7785 (див. ТоКотаги еї аї. (2000) УСВ 151:209-219, включений у цей документ шляхом посилання). Антитіла, специфічні для НВ-ЕСЕ, і реагенти міРНК, мшРНК відомі в цій галузі техніки й комерційно доступні (наприклад, див. Запіа Сги?7 ВіоїесппоЇоду або Вепгат еї аї. (2009)

Меси. Адеіпду Ову. 130: 657-669.

ІЇ0060| Альтернативно, моноклональні антитіла можуть бути отримані за допомогою звичайних способів отримання моноклональних антитіл, причому можна використовувати будь- який спосіб, який забезпечує антитіла, що виробляються культурами стабільних клітинних ліній.

Приклади включають методику гібридоми (Койіег 8 Міїєїеїп, Маїшге, 256:495-497 (1975), методику тріоми, методику В-клітинної гібридоми людини (Ко2бог еї аї!., ІттипоЇоду Тодау 4:72 (1983)) і методику ЕВМ-гібридоми для отримання моноклональних антитіл людини (Соїе, еї аї.,

Мопосіопаї Апіїродієз апа Сапсег Тнегару, Агап В. І і55, Іпс., рр. 77-96 (1985)). Методики, описані для отримання одноланцюгових антитіл (патент США Мо 4946778) можуть бути адаптовані для отримання одноланцюгових антитіл до продуктів імуногенного поліпептиду згідно з цим винаходом. Крім того, для експресії гуманізованих антитіл до продуктів імуногенних поліпептидів згідно з цим винаходом, можуть використовуватися трансгенні миші.

І0061| Термін «структура», відносно доставки НВ-ЕСЕ або інгібіторів НВ-ЕСЕ, включає, але не обмежується перерахованим, будь-який каркас, полімер, конструкцію, споруду, установку, підтримку, диск, блок, покриття, шар, опору, підкладку, пристрій, піну. Він також включає використання власної тканини пацієнта, залишків органічних речовин у рані або трансплантат для дії як спосіб доставки. Структура може застосовуватися або у сформованому стані або може бути нанесена у вигляді в'язкої рідини, яка згодом приймає твердий стан або залишається в рідкій формі. 0062 Термін «засіб доставки», коли мова йде про доставку НВ-ЕСЕ або інгібіторів НВ-ЕСЕ, включає, але не обмежується перерахованим, будь-який полімер, агент, носій, інструмент, процес, середовище, апарат, прилад, пристосування, гаджет, інструмент, віджет, приналежності або посуд. Термін «засіб доставки» також відноситися до будь-якого розчинного носія або

Зо допоміжної речовини, включаючи, але не обмежуючись перерахованим, фізіологічний розчин, буферний фізіологічний розчин, декстрозу, воду, гліцерин і їхні комбінації. Композиція повинна відповідати способу введення. Приклади підходящих композицій, відомих у цій галузі техніки, наведені в публікації Кетіпдіоп'є Ріпагтасешііса! 5сіепсе5 (останнє видання), Маск Рибіїєпіпу

Сотрапу, апа Еавіоп, Ра. 0063) При використанні в цьому документі терміни «близько» або «приблизно» означають у межах 50 відсотків, переважно в межах 20 відсотків, переважніше в межах 5 відсотків від заданого значення або діапазону. (0064) Значення, яке «значуще відрізняється» від іншого значення може означати, що існує статистично значуща різниця між цими двома значеннями. Будь-який підхожий статистичний спосіб, відомий у цій галузі техніки, може бути використаний для оцінки того, чи є відмінності значущими чи ні. 0065) «Статистично значуща» відмінність означає значущість, що визначається в довірчому інтервалі, щонайменше в 9095, переважніше в 9595 довірчому інтервалі.

І0066| Відповідно до цього винаходу в ньому можуть бути використані звичайні способи молекулярної біології, мікробіології й методики рекомбінантних ДНК у межах кваліфікації в цій галузі техніки. Такі методики докладно описані в літературі. Див., наприклад, затюогоок еї аї (МоїІесшіаг Сіопіпд-А І абогаїютгу Мапиаї, Соїай брііпа Нагброг І абогаюгу Ргезз, 1989); Сіомег (ОМА

Сіопіпд: А Ртгасіїсаї Арргоасі, Моїштев І апа І, 1985); Натевз апа Ніддіпв (Мисієїс Асій

Нубгіаіганоп, 1985); Натез апа Ніддіпе (Тгтапз5сгіріоп Апа Тгапзіайоп, 1984); Егезппеу (Апітаї

Сеїї Сикиге, 1986); Регбаї! (А Ргасіїса! Ссціде То МоїІесшаг СіІопіпду, 1984); і А!Мзибеї еї аї. (Сштепі

Ргогосоїв іп Моіесшіаг Віоіоду, доп УМіеу к Бопв, Іпс., 1994).

Фармацевтичні композиції

І0067| Композиції, які можуть бути використані для доставки НВ-ЕСЕ і агента НВ-ЕСБЕ, або інгібітора НВ-ЕСЕ, або інші композиції відповідно до цього винаходу, включають, але не обмежуються перерахованим, лікарські форми для ін'єкцій, інфузій, гель, пасти, бальзами, воски, лосьйони, креми для шкіри, а також різні інші форми для місцевого застосування, відомі в цій галузі техніки. Композиції також можуть бути доставлені місцево у формі порошку або розчину, що розпилюється на рану. Альтернативно, композиції згідно з винаходом можуть бути представлені у вигляді ранових пов'язок, прокладок, пластирів, марлі або інших засобів для бо нанесення на рану, з яких вони переносяться на ділянку рани. Такі пристрої також містять у собі пристрої уповільненого вивільнення, які безупинно вивільняють НВ-ЕСЕ, або інгібітор НВ-ЕСЕ, або інші компоненти протягом пролонгованого періоду часу. Що стосується загоєння барабанних перетинок, введення композиції з використанням гелю, спрею або введення по краплях через зовнішній слуховий канал, є одним із переважних варіантів реалізації цього винаходу. Лікарські форми для ін'єкцій або інфузій містять розчин НВ-ЕСЕ або інгібітора ЕСЕ-

НВ у фармацевтично прийнятній рідині, такій як, наприклад, ізотонічний сольовий розчин, стерильна вода або водні буферні системи. Засіб доставки може також включати будь-яку структуру, що проходить через рану. У випадку барабанної перетинки він включає, але не обмежується перерахованим, вушні шунти або катетери.

І0068| Фармацевтичні композиції можуть включати в себе, залежно від бажаного складу, фармацевтично прийнятні нетоксичні носії або розріджувачі, які визначаються як засоби доставки, звичайно використовувані для розробки фармацевтичних композицій для введення тваринам або людині. Розріджувач вибирають так, щоб він не впливав на біологічну активність активного агента. Прикладами таких розріджувачів є дистильована вода, забуферена вода, фізіологічний розчин, ФСБ, розчин Рінгера, розчин декстрози й розчин Хенкса. Крім того, фармацевтична композиція або склад може містити в собі інші носії, ад'юванти або нетоксичні, нетерапевтичні, неімуногенні стабілізатори, допоміжні речовини тощо. Композиції можуть також містити додаткові речовини, щоб наблизитися до фізіологічних умов, такі як регулюючі рівень рН і буферні агенти, агенти, що регулюють тонічність змочувальні агенти й детергенти.

І0069| Композиція може також містити будь-який із множини стабілізуючих агентів, такий як, наприклад, антиоксидант. Якщо фармацевтична композиція містить поліпептид, зазначений поліпептид може бути присутнім у вигляді комплексу з різними добре відомими сполуками, які підвищують стабільність поліпептиду іп мімо, або іншим способом підсилюють його фармакологічні властивості (наприклад, збільшують період напівжиття поліпептиду, знижують його токсичність, підвищують розчинність або поглинання). Приклади таких модифікацій або комплексоутворюючих агентів включають сульфат, глюконат, цитрат і фосфат. Поліпептиди композиції можуть також утворювати комплекси з молекулами, які покращують їхні характеристики іп мімо. Такі молекули включають, наприклад, вуглеводи, поліаміни, амінокислоти, інші пептиди, іони (наприклад, натрій, калій, кальцій, магній, марганець) і ліпіди.

І0070| Подальші вказівки щодо композицій, які підходять для різних типів введення, можна знайти в Кетіпдіоп'є Рпапгтасецшііса! 5сіепсе5, Масе Рибріїзпіпд Сотрапу, РПйШадеї!рпіа, Ра., 17 ей. (1985). Див. короткий огляд способів доставки лікарських засобів у публікації І апдег, Зсіепсе 249:1527-1533 (1990).

І0071| Фармацевтичні композиції можуть бути введені для терапевтичних видів лікування.

Токсичність і терапевтична ефективність активного інгредієнта може бути визначена у відповідності зі стандартними фармацевтичними процедурами в культурах клітин і/або з використанням експериментальних тварин, включаючи, наприклад, визначення 050 (дози, летальної для 5095 популяції) і ЕО5О (дози, терапевтично ефективної для 5095 популяції).

Співвідношення доз між токсичним і терапевтичним ефектами являє собою терапевтичний індекс, який виражають як співвідношення І050/ЕЮО5О. Переважними є сполуки, що демонструють більші терапевтичні індекси. 00721 Дані, отримані з досліджень у культурах клітин і/або з використанням тварин, можна застосовувати для визначення діапазону доз для людини. Доза активного інгредієнта звичайно перебуває в межах діапазону циркулюючих концентрацій, які включають ЕЮО5О з низькою токсичністю. Доза може змінюватися в межах цього діапазону залежно від використовуваної лікарської форми й шляху введення.

І0073| Фармацевтичні композиції описані в цьому документі можна вводити, використовуючи множину різних способів. Приклади включають введення композиції, що містить фармацевтично прийнятний носій за допомогою місцевих шляхів введення, наприклад на поверхню БП, усередину барабанної перетинки, через барабанну перетинку тощо.

І0074| Відповідні композиції включають водні й неводні ізотонічні стерильні розчини для ін'єкцій, які можуть містити антиоксиданти, буфери, бактеріостатичні й розчинені речовини, які надають композиції ізотонічність, і водні й неводні стерильні суспензії, які можуть включати суспендуючі агенти, солюбілізатори, загущувачі, стабілізатори й консерванти.

І0075| Компоненти, використовувані для розробки фармацевтичних композицій є переважно компонентами високої чистоти й по суті не містять потенційно шкідливих домішок (наприклад, щонайменше відповідають категорії чистоти згідно з вимогами Національної комісії із продовольства США (МЕ), як правило, щонайменше відповідають аналітичній категорії, і більш типово щонайменше фармацевтичної категорії). Крім того, композиції, призначені для бо застосування іп мімо, як правило, є стерильними. У випадку якщо цю сполуку необхідно синтезувати перед застосуванням, отриманий продукт, як правило, по суті не містить будь-яких потенційно токсичних речовин, зокрема будь-яких ендотоксинів, які можуть бути присутніми в процесі синтезу або очищення. Композиції для парентерального введення також є стерильними, по суті ізотонічними й отриманими в умовах СМР.

І0076| Ефективна кількість терапевтичної композиції для введення конкретному пацієнтові буде залежати від множини факторів, деякі з яких будуть різнитися від пацієнта до пацієнта.

Компетентний лікар зможе визначити ефективну кількість терапевтичного агента для введення пацієнтові для стимуляції загоєння хронічної перфорації БП. Використовуючи дані ЕО5БО, отримані у тварин, і іншу доступну інформацію, лікар може визначити безпечну дозу для індивідуума, залежно від шляху введення. Для підтримки терапевтичної концентрації, композиції, які швидко виводяться з організму, можна вводити у вищих дозах або в повторних дозах. Використовуючи звичайну кваліфікацію, компетентний лікар зможе оптимізувати дозу конкретної терапевтичної або візуалізуючої композиції в ході звичайних клінічних випробувань.

Звичайно доза становить від 0,001 до 100 мг агента на кілограм маси тіла суб'єкта.

І0077| Композиція, тобто рідкі краплі, гель з уповільненим вивільненням тощо, може містити

НВ-ЕСЕ або агент із еквівалентною активністю, що забезпечує активність НВ-ЕСЕ, у концентрації, що становить щонайменше приблизно 1 мкг/мл, щонайменше приблизно 10 мкг/мл, щонайменше приблизно 100 мкг/мл, щонайменше приблизно 200 мкг/мл, щонайменше приблизно 500 мкг/мл, щонайменше приблизно 750 мкг/мл, щонайменше приблизно 1 мг/мл, щонайменше приблизно 5 мг/мл, щонайменше приблизно 10 мг/мл, щонайменше приблизно 50 мг/мл, щонайменше приблизно 100 мг/мл і аж до приблизно 10 мг/мл, аж до приблизно 25 мг/мл, аж до приблизно 50 мг/мл, аж до приблизно 100 мг/мл, аж до приблизно 500 мг/мл.

Композиція, призначена для уповільненого вивільнення, може бути надана з вищою вихідною концентрацією порівняно з композицією для повторного введення. Терапевтично активна кількість може варіюватися залежно від таких факторів, як стан захворювання, вік, стать і маса тіла індивідуума. Для забезпечення оптимальної терапевтичної відповіді схема дозування може бути скоригована. Наприклад, щодня можна вводити більше однієї окремої дози, або доза може бути пропорційно зменшена відповідно до показань і необхідності терапевтичної ситуації.

Ї0078| Може бути забезпечений об'єм від приблизно 1 до З крапель або, при введенні у твердій або напівтвердій формі, можуть бути приготовлені композиції заданого об'єму, наприклад, з об'ємом від аж до приблизно 5 мкл до аж до приблизно 500 мкл. Пристрій може бути сформований у будь-якій формі або конформації, яка полегшить його застосування в цільовій ділянці для стимуляції або інгібування загоєння. Геометрична форма твердої або напівтвердої лікарської форми являє собою будь-яку придатну для доставки до барабанної перетинки, наприклад сфера, сплющена сфера, плівка, пластир, диск рівномірної або нерівномірної товщини тощо.

Ї0079| Композицію можна вводити суб'єктові у вигляді серії з більш ніж одного введення. Для терапевтичних композицій іноді необхідне регулярне періодичне введення (наприклад, кожні 4 години, кожні 6 годин, кожні 12 годин, кожні 24 години тощо), наприклад якщо композиція надана у вигляді рідини для місцевого застосування. 0080) Композиції, придатні для місцевого, черезшкірного й трансдермального введення, можуть бути отримані шляхом використання відповідних суспендуючих агентів, солюбілізаторів, загущувачів, стабілізаторів і консервантів. Композиції для місцевого застосування можуть бути використані також із засобами для забезпечення безперервного введення, наприклад, включені в гранули з повільним вивільненням або пластири з контрольованим вивільненням.

І0081| Активний агент може також бути введений до складу композиції у вигляді біологічно сумісного гелю, причому цей гель можна наносити місцево або імплантувати (наприклад, для забезпечення уповільненого вивільнення в місці лікування). Відповідні гелі й способи складання рецептури бажаної сполуки для доставки за допомогою гелю добре відомі в цій галузі (див., наприклад, патенти США під номерами 5801033; 5827937; 5700848; і МАТКІСЕ! ТМ). Прикладом цього варіанта реалізації винаходу є доставка НВ-ЕСЕ або інгібітора НВ-ЕСЕ через слуховий канал за допомогою біосумісної рідини або пристрою, яке твердне усередині слухового каналу поблизу барабанної перетинки й доставляє НВ-ЕСЕ або інгібітор НВ-ЕСЕ під час того, як засіб доставки згодом розчиняється. Засіб доставки можна розміщати в каналі, у барабанній перетинці або всередині середнього вуха.

І0082| Композиції можуть бути надані в одиничній дозованій формі, причому термін «одинична дозована форма» відноситься до фізично дискретних одиниць, що підходять як одиничні дози для суб'єктів-людей, де кожна одиниця містить попередньо задану кількість протеази, розраховану як достатня кількість для забезпечення заданого ефекту, у комбінації з бо фармацевтично прийнятним розріджувачем, носієм або засобом доставки. Характеристики одиничних дозованих форм цього винаходу залежать від конкретного використовуваного комплексу й ефекту, який необхідно досягти, а також від фармакодинаміки, пов'язаної з кожним комплексом, в організмі-хазяїні.

Ї0083| Аспекти цього винаходу включають у себе гідрогелеві композиції на основі зшитих співполімерів, що містять ефективну дозу абсорбованого НВ-ЕСЕ, як описано вище. Гідрогелеві композиції на основі зшитих співполімерів згідно з цим винаходом відповідно до конкретних варіантів реалізації включають співполімер хітозану й поліестеру і зшиваючий агент, що піддається гідролізу. У деяких варіантах реалізації цього винаходу зшиті гідрогелі додатково містять фібриноген. У деяких таких варіантах реалізації цього винаходу гідрогелі на основі зшитих співполімерів включають співполімер хітозану й поліестеру й зшиваючий агент, що піддається гідролізу, наприклад, полілактид. Зшиті гідрогелі хітозану й полілактиду можуть мати співвідношення хітозану до полілактиду в діапазоні від 1:1 до 10:1, наприклад, від 1:1 до 8/1, причому в деяких випадках, зшиті гідрогелі хітозану й полілактиду мають співвідношення хітозану до полілактиду 8:11. Масовий відсоток хітозану в гідрогелях на основі зшитого співполімеру, що представляють інтерес, може варіюватися в діапазоні від 195 до 9995, а масовий відсоток поліестеру може варіюватися в діапазоні від 195 до 9995. У деяких варіантах реалізації цього винаходу гідрогелі на основі співполімеру містять один або більше естерних або амідних зв'язків між хітозаном і компонентами поліестеру. Гідрогелі на основі зшитих співполімерів, що представляють інтерес, також включають зшиваючий агент. У деяких варіантах реалізації цього винаходу зшиваючий агент призначено для гідролізу у фізіологічних умовах. У деяких варіантах реалізації цього винаходу зшиваючий агент, може бути акрилатним зшиваючим агентом, наприклад, метакрилатним зшиваючим агентом. Зшиваючий агент, що піддається гідролізу може бути присутнім у гідрогелі на основі зшитого співполімеру в кількості в діапазоні від 0,0595 до 1095 мас./мас. зшиваючого агента, наприклад від 0,195 до 995 мабс./мас, наприклад від 0,595 до 895 мас./мас, наприклад від 0,7595 до 795 мас./мас. і включно від 195 до 595 мас./масє. Залежно від протоколу, використовуваного для зшивання обговорюваних гідрогелів, щільність зшивки може варіюватися. У деяких випадках гідрогель зшито хімічною зшивкою. Таким чином, щільність зшивки може варіюватися залежно від типу й концентрації використовуваного хімічного зшиваючого агента. Альтернативно, гідрогель можна піддавати

Зо фотозшивці й щільність зшивки може варіюватися залежно від інтенсивності електромагнітного випромінювання, що контактує з гідрогелевою композицією, а також від тривалості опромінення.

У деяких варіантах реалізації цього винаходу щільність зшивки обговорюваних гідрогелів на основі зшитих співполімерів може бути, наприклад, у діапазоні від 1хХ10-15 моль/см3 до 1х10-3 моль/см3. Альтернативно, залежно від кількості зшиваючого агента, коефіцієнт набрякання обговорюваних гідрогелів може змінюватися в межах, наприклад, від 1 до 35. Аналогічно, модуль стиснення гідрогелів може змінюватися, наприклад, у діапазоні від 1 кПа до 35 кПа.

Дивіться, наприклад, міжнародну патентну заявку РСТ/О52014/033512, що одночасно розглядається, включену в цей документ шляхом посилання. 00841 Гідрогелеві композиції необов'язково містять фібриноген. Фібриноген може бути введений у гідрогелеву композицію перед або після зшивки гідрогелю. Наприклад, у деяких випадках фібриноген додають до попередника гідрогелевої композиції. Фібриноген може бути присутнім у гідрогелі на основі зшитого співполімеру в кількості в діапазоні від 0,0595 до 5090 мас./мас. фібриногену, наприклад від 0,195 до 4595 мас./мас., наприклад від 0,595 до 4095 мас./мас., наприклад від 0,7595 до 3595 мас./мас., наприклад від 195 до 3095, наприклад від 2905 до 20965, наприклад від 595 до 1595 і включаючи 1095 мас./мас. 0085 Гідрогелі можуть бути синтезовані для досягнення певного профілю вивільнення. У деяких варіантах реалізації цього винаходу гідрогелі на основі зшитих співполімерів, запропоновані в цьому винаході, призначені для вивільнення НВ-ЕСЕ або агента НВ-ЕСЕ у фізіологічних умовах по суті зі швидкістю вивільнення нульового порядку. В інших варіантах реалізації цього винаходу обговорювані гідрогелі на основі зшитих співполімерів призначені для вивільнення НВ-ЕСЕ або агента НВ-ЕСЕ у фізіологічних умовах по суті зі швидкістю вивільнення першого порядку. В інших варіантах реалізації цього винаходу обговорювані гідрогелі на основі зшитих співполімерів призначені для вивільнення НВ-ЕСЕ або агента НВ-

ЕСЕ у фізіологічних умовах по суті зі швидкістю вивільнення другого порядку. У деяких варіантах реалізації цього винаходу обговорювані гідрогелі на основі зшитих співполімерів призначені для профілю вивільнення, який включає: 1) перший період, під час якого НВ-ЕСЕ або агент НВ-ЕСЕ вивільняється з гідрогелю з першою попередньо заданою швидкістю; і 2) другий період, під час якого НВ-ЕСЕ або агент НВ-ЕСЕ вивільняється з гідрогелю із другою попередньо заданою швидкістю.

0086) У деяких варіантах реалізації цього винаходу співвідношення хітозану й поліестеру в гідрогелі може варіювати, у деяких варіантах реалізації цього винаходу в діапазоні від 10:11 до 9,5:1; від 9,5:1 до 9:1; від 9:1 до 8,5:1; від 8,5:1 до 8:1; від 8:11 до 7,5:1; від 7,5:1 до 7:1; від 7:1 до 6,5:1; від 6,5:1 до 6:1; від 6:1 до 5,5:1; від 5,5:1 до 5:1; від 5:1 до 4,5:1; від 4,5:1 до 4:1; від 4:1 до 3,5:1; від 3,5:1 до 3:1; від 3:11 до 2,5:1; від 2,5:1 до 2:1; від 2:11 до 1,5:1; від 1,5:1 до 11.

Наприклад, масове співвідношення компонента хітозану й компонента поліестеру може перебувати в діапазоні від 10:11 до 1:1, наприклад від 8:1 до 1:1, наприклад від 5:1 до 1:11, наприклад від 4:1 до 1:1, включаючи від 2:1 до 1:1. У деяких випадках співвідношення хітозану й поліестеру становить 1:1. В інших варіантах реалізації цього винаходу співвідношення хітозану й поліестеру може варіюватися, у деяких варіантах реалізації цього винаходу в діапазоні від 1:1 до 1:1,5; від 1:1,5 до 1:2; від 1:2 до 1:2,5; від 1:2,5 до 1:3; від 1:3 до 1:3,5; від 1:3,5 до 1:4; від 1:4 до 1:4,5; від 1:4,5 до 1:5; від 1:5 до 1:5,5; від 1:5,5 до 1:6; від 1:6 до 1:6,5; від 1:6,5 до 1:7; від 1:7 до 1:7,5; від 1:7,5 до 1:8; від 1:8 до 1:8,5; від 1:8,5 до 1:9; від 1:9 до 1:9,5; від 1:9,5 до 1:10.

Наприклад, співвідношення хітозану й поліестеру може перебувати в діапазоні від 1:1 до 1:10, наприклад від 1:1 до 1:8, наприклад від 1:1 до 1:5, наприклад від 1:1 до 1:4, включаючи від 1:1 до 1:2.

ІЇ0087| Гідрогелі на основі зшитих співполімерів можуть мати масу 1 кДа або більше, наприклад 2 кДа або більше, наприклад З кДа або більше, наприклад 5 кДа або більше, наприклад 10 кДа або більше, наприклад 15 кДа або більше, наприклад 20 кДа або більше, наприклад 25 кДа або більше, наприклад 30 кДа або більше, наприклад 40 кДа або більше, наприклад 50 кДа або більше, наприклад 60 кДа або більше й включаючи 75 кДа або більше. (0088) Після приготування фармацевтичні композиції можуть бути поміщені у відповідний контейнер і промарковані для лікування зазначеного патологічного стану. Для введення композиції згідно з цим винаходом, таке маркування буде включати кількість, частоту й спосіб введення.

Комбіновані композиції 00891 Склади згідно з цим винаходом можуть містити ефективну дозу НВ-ЕСЕ у комбінації з другим активним агентом, зокрема, іншим антимікробним агентом. Наприклад, інші агенти, що представляють інтерес, включають широку різноманітність антибіотиків, як відомо в цій галузі техніки. Класи антибіотиків включають в себе пеніциліни, наприклад пеніцилін с, пеніцилін М, метицилін, оксацилін, карбеніцилін, нафцилін, ампіцилін тощо; пеніциліни в комбінації з р- інгібіторами лактамаз, цефалоспорини, наприклад цефаклор, цефазолін, цефуроксим, моксалактам тощо; карбапенеми; монобактами; аміноглікозиди; тетрацикліни; макроліди; лінкоміцини; поліміксини; сульфаніламіди; хінолони; хлорамфенікол; метронідазол; спектиноміцин; триметоприм; ванкоміцин тощо; противірусні агенти, наприклад ацикловір, ганцикловір тощо можуть бути включені.

Ї0090| Цитокіни й фактори росту також знаходять застосування в комбінації з НВ-ЕСЕ, наприклад такі фактори росту як трансформуючий фактор росту (ТОРБ)-В, тромбоцитарний фактор росту (РОСЕ), фібробластний фактор росту (ЕСЕ) і епідермальний фактор росту (ЕСЕ),

МЕСБЕ, фактор некрозу пухлини-а (ТМЕ-о0), ендотелін-1, кератиноцитарний фактор росту тощо.

Див., наприклад, Зіееєай, 0. еї аї., У. Ат. СаїІ. 5Бига. 183:61-64 (1996); Віснага, 5. єї а!., Оіареїе5

Саге 18: 64-69 (1995); 5ієвед, 0.,9У. Мавс. 5и!иг9. 21:71-78 (1995); КеїІєу, 5. еї аЇ., Ргос. ос. Ехр.

Віо!. 194:320-326 (1990).

Способи застосування 00911 Відповідно до цього винаходу загоєння рани при хронічній перфорації барабанної перетинки покращується при забезпеченні підвищених рівнів НВ-ЕСЕ. Це може бути досягнуто декількома різними способами. Наприклад, пацієнта можна лікувати ефективною кількістю активного агента, такого як, наприклад, лікарський засіб, гормон, цитокін, антитіло або інша сполука, яка стимулює експресію НВ-ЕСЕ; зменшує деградацію НВ-ЕСЕ; або збільшує місцеві або системні рівні НВ-ЕСЕ або гомолога або похідного НВ-ЕСР. У терапевтичних цілях можна також вводити нуклеїнові кислоти, що кодують НВ-ЕСЕ. 00921 Звичайно композицію, що містить білок НВ-ЕСЕ, наприклад розчинну форму НВ-ЕСЕ людини, місцево вводять індивідуумові, що страждає хронічною перфорацією БП, через зовнішній слуховий канал, протягом періоду часу, по суті достатнього для закриття перфорації.

Суб'єкт, що є людиною або, що не є людиною, може страждати від патологічного стану, який перешкоджає або сповільнює загоєння перфорації барабанної перетинки або може не страждати від такого стану.

Ї0О093)| У цьому винаході запропоновані композиції НВ-ЕСЕ або інгібітора НВ-ЕСЕ, які при введенні в ефективній кількості призведуть до збільшення або зниження рівня НВ-ЕСЕ в ділянці 60 рани суб'єкта. Наприклад, для прискорення загоєння барабанної перетинки, композиція, що містить НВ-ЕСЕ, може бути нанесена на ділянку, що оточує перфорацію барабанної перетинки.

Інгібітор НВ-ЕСЕ можна також наносити для інгібування нормального або надмірного загоєння рани. У випадку композицій НВ-ЕСЕ для прискорення загоєння барабанної перетинки, композиція може бути нанесена на ділянку, що прилягає або перебуває по сусідству з перфорацією барабанної перетинки. Їх можна наносити за допомогою будь-якого біорозкладного або біонерозкладного джерела або структури.

Ї0094| В іншому варіанті реалізації цього винаходу спосіб згідно з цим винаходом застосовують для інгібування загоєння перфорованої барабанної перетинки у суб'єкта. Суб'єкт, що є людиною або не є людиною, може страждати від патологічного стану, який перешкоджає або сповільнює загоєння перфорації барабанної перетинки або не страждати від такого стану.

Наприклад, такі способи можна застосовувати як заміну міринготомії й введенню тимпаностомічних трубок, які звичайно призначають при хронічному середньому отиті, ваді розвитку барабанної перетинки вуха або євстахієвої труби, синдромі Дауна, розщепленні неба (вовча паща) і баротравмах (травма середнього вуха, викликана зниженням тиску повітря) тощо. Звичайно тимпаностомічну трубку вводять у БП і утримують протягом тривалого періоду часу, наприклад протягом періоду аж до одного місяця, аж до 2 місяців, аж до З місяців, аж до 4 місяців, аж до 6 місяців або більше.

Ї0095| Способи також знаходять застосування в групі тваринних моделей, яка забезпечує клінічно значущу модель патологічних станів перфорованої барабанної перетинки людини. У таких моделях тварина може бути будь-якою зручною експериментальною твариною, наприклад гризунами, зайцеподібними тощо, і включаючи, але не обмежуючись перерахованим, мишей, щурів, морських свинок, кроликів, котів, собак, приматів, що не відносяться до людського роду тощо. 0096) У таких варіантах реалізації цього винаходу для створення перфорації БП вводять ефективну дозу інгібітора шедінгу ліганда ЕСЕК, звичайно за допомогою місцевого контактування з барабанною перетинкою. У деяких таких варіантах реалізації цього винаходу спочатку можна виконати невелику перфорацію, наприклад площею від приблизно 0,1 до 10 мма2, від приблизно 0,1 до приблизно 5 ммаг, від приблизно 0,1 до 2,5 мм2, від приблизно 0,1 до приблизно 1 мм2. Після початкової перфорації рана контактує з ефективною дозою інгібітора

Зо НВ-ЕСЕ, що перебуває в композиції, і протягом періоду часу, як запропоновано в цьому документі. Активна доза інгібітора може підтримуватися протягом періоду часу, необхідного для наявності перфорації.

Набори

ЇО097| В іншому аспекті цього винаходу пропонується набір для лікування хронічної перфорації БП. Набір містить у собі композицію, яка забезпечує ефективну дозу НВ-ЕСЕЕ, наприклад, у формі крапель, пристроїв, композицій тощо. Набір також може включати в себе пристрій для доставки, наприклад, дозатор для вушних крапель, шприц для доставки композиції, двоствольний шприц для доставки двокомпонентної композиції тощо. Набір може також містити інструкції із застосування. 0098) Альтернативно може бути запропонований набір для створення хронічної перфорації

БП. Набір містить композицію, яка забезпечує ефективну дозу НВ-ЕСЕ, наприклад, у формі крапель, пристроїв, композицій тощо. Набір також може містити пристрої для доставки, наприклад, дозатор для вушних крапель, шприц для доставки композиції, двоствольний шприц для доставки двокомпонентної композиції тощо. Набір може також містити інструкції з застосування. Набір може додатково містити стерильну голку або скальпель для створення початкової перфорації в БП.

Приклад 1

Інгібування НВ-ЕС ЕЕ

Ї0099| НВ-ЕСЕ є критично важливим для загоєння рани в моделі барабанної перетинки.

Нормалізована інтенсивність сигналу НВ-ЕСтЕ-подібного фактора росту після перфорації барабанної перетинки у щурів показує 8,5-кратне стимулювання НВ-ЕСт-подібного фактора росту. У цьому описі показано, що експериментальне інгібування активності НВ-ЕСЕ запобігає загоєнню барабанної перетинки. 00100) Для створення моделі хронічної перфорації барабанної перетинки можна інгібувати шедінг ліганда ЕСЕК. Проміжні перфорації були створені в натягнутій частині БП із використанням вигнутої голки у 20 мишей. О508.1 (10 мМ), селективний інгібітор НВ-ЕСЕ (див.

Токитаги еї аї. (2000) 9. СеїІ Віої.), вводили ін'єкцією в гелеву піну (розміщену через перфорацію й на ній) протягом семи днів. Мишей умертвляли в моменти часу (день 2, 7, 14, 30, 44, 601 90), щоб спостерігати ефекти міграції кератиноцитів. Протилежне вухо використовували як бо контроль, у нього на гелеву піну поміщали фізіологічний розчин. Всі з цих перфорацій закривалися в межах 2 тижнів. П'ять із семи (7195) перфорацій у оброблених вухах були відкритими через три місяці. Репрезентативні зображення хронічної перфорації БП показані на

Фігурі 5. Розмір перфорації був стабільним протягом трьох місяців (з використанням програмного забезпечення Ітаде) для розрахунків площі перфорації у вигляді відсотка від площі натягнутої частини). У більшої когорти, 87,995 (п - 58), була наявність через З місяця хронічних перфорацій. У попередньому дослідженні, проведеному авторами цього винаходу, була встановлена відтворена тваринна модель на основі застосування фактора росту при хронічній перфорації БП.

ЇО0О10О1| У таблиці 1 показані результати застосування інгібітора НВ-ЕСЕ (0508-1) для створення гострої перфорації барабанної перетинки у мишей. 10095 перфорацій, пролікованих інгібітором НВ-ЕСЕ, були присутні через два місяці порівняно з 595 у контрольній групі, і 71905 були присутні через три місяці порівняно з 595 у контрольній групі.

Таблиця 1 місяці місяці

І00102| Створення тваринної моделі хронічного гнійного середнього отиту. Після створення моделі хронічної перфорації з оклюзією ЄТ, через існуючі хронічні перфорації в середнє вухо інокулювали два типи бактерій. Через 2 тижні відібрали рідину з вуха й відправили для проведення дослідження на наявність бактерій за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Вибрані бактерії являли собою дві з найчастіше залучених у хронічне захворювання вуха, Бігеріососси5 рпештопіа типу З (доза бх10б колонієутворюючих одиниць на мл) і

Рзепдотопаз аегидіпоза (доза бх109 колонієутворюючих одиниць на мл).

Приклад 2

Лікування хронічної перфорації барабанної перетинки

ЇО0103| Була продемонстрована ефективність лікування хронічних перфорацій БП за допомогою НВ-ЕСЕЕ. 00104) Біосумісний розсмоктуваний полімер для ін'єкцій для доставки фактора росту у вушний канал. Для лікування хронічної перфорації БП бажано мати рідину, яку можна закрапати у вухо, і яка потім твердне й повільно розсмоктується протягом призначеного періоду часу, з елююванням лікарського засобу. Швидкість розсмоктування полімеру й швидкість елюювання

Зо лікарського засобу легко регулюється відповідно до мети, що представляє інтерес. 00105) Був розроблений біорозкладний гідрогель на основі хітозану для доставки факторів росту, щоб забезпечити біосумісний, біорозсмоктуваний ін'єкційний полімер, який може нести лікарський засіб вибору, а потім може бути інстильований у вушний канал. Гель має два рідкі компоненти й може тверднути протягом декількох хвилин після змішування двох компонентів.

Його можна легко вводити двоствольним шприцом. Альтернативно, розчини можна змішувати з зшиваючим агентом перед доставкою й інстилювати за допомогою шприца з одним випускним отвором. 00106) Нещодавно розроблений гідрогель на основі хітозану містить гідрофільні молекули кістяка хітозану й гідрофобні полілактидні бічні ланцюги. У мережі співполімерів для покращення афінності зв'язування, підвищення прикріплення клітин і забезпечення сайтів, що піддаються протеолітичному розкладанню, може бути включений фібриноген. Вивільнення лікарського засобу з полімерного гідрогелю змінюється відповідно до характеристик, таких як гідрофільна афінність, особливості набрякання, розсмоктуваність і щільність зшивки полімеру.

Вимірювали профілі лікарського вивільнення гпВМР-2 з гідрогелів на основі хітозану й особливості деградації полімерного гідрогелю в різних умовах.

Ї00107| Конкретне співвідношення хітозану до полілактиду для гелю, використовуваного в цих прикладах, становить 8:1. Крім того, у полімерний розчин вводять 1095 мабс./мас. фібриногену. Композиція гідрогелю може тверднути протягом декількох хвилин після змішування з каталізатором хімічної зшивки. Його можна легко вводити двоствольним шприцом або шприцом з одним випускним отвором. 00108) Гідрогелі не є ототоксичними. Гідрогелі вводили в барабанні перетинки мишей після перфорацій. Одне вухо заповнювали полімером, у той час як у протилежне вухо ін'єкцію не вводили (контроль). Граничні значення тесту-відповіді слухового відділу стовбура мозку (АВЕ) і отоакустичних виділень продуктів викривлення (ОРОАЕ) визначали у 9 мишей через 60 днів після хірургічної перфорації обох барабанних перетинок. До часу спонтанного загоєння барабанних перетинок не було ніяких відмінностей порогів чутності між двома сторонами (Фігура 2). Ці дані демонструють, що гідрогелі не є ототоксичними.

Ї00109| НВ-ЕСЕ загоює хронічні перфорації барабанної перетинки. При лікуванні когорти мишей із хронічними перфораціями у вухах за допомогою 40 мкл гелю, що містить рекомбінантний НВ-ЕСЕ у концентрації 5 мкг/мл (уповільнене вивільнення дози через біорозкладний полімер на основі хітозану), загоєння відбувалося у 9295 (22 з 24) у порівнянні з 38905 (10 з 26) контрольних тварин (тільки полімер) за 4 тижні (р « 0,01). Можливість подолати цей критичний етап хронічного загоєння рани БП за допомогою СЕ, щоб активувати шедінг ліганда ектодомену ЕК, демонструє придатність для втручання з використанням біотерапевтичних засобів. Це дослідження є першим дослідженням лікування фактором росту у тваринній моделі хронічної перфорації, яке показало значну перевагу порівняно з контролем. 00110) НВ-ЕСЕ загоює хронічні перфорації барабанної перетинки з оклюзією євстахієвої труби. Була створена тваринна модель хронічної перфорації БП і оклюзії ЄТ, як показано на

Фігурі 3. Існуючу щурячу модель оклюзії ЄТ (див. Негаа еї аї. (2002) І агупдозсоре 112:1657-62) адаптували для мишей, і відтоді успішно реалізували у 80 живих мишей. Оклюзію ЄТ виконували в моделі хронічної перфорації, описаній вище. Це за З місяці створило вологу стерильну перфорацію з виділеннями. Ця модель імітує патологічний стан хронічної перфорації в комбінації з дисфункцією ЄТ у людини.

ІЇ00111| При лікуванні когорти мишей у цій моделі (хронічні перфорації й оклюзія ЄТ) рекомбінантним НВ-ЕСЕ, в об'ємі 40 мкл із концентрацією 5 мкг/мл (уповільнене вивільнення дози через біорозкладний полімер на основі хітозану), загоєння відбувалося у 9495 (18 з 19) у порівнянні з 995 (2 з 23) контрольних тварин (тільки полімер) за б тижнів (р « 0,01).

Репрезентативні зображення хронічних перфорацій БП, які зажили і які не зажили показано на

Фігурі 4. Гістологічно перфорації закриваються товстим шаром кератиноцитів, у порівнянні з контрольними тваринами з відсутністю шару кератиноцитів навіть у тих деяких випадках, коли відбулося закриття. Можливість подолати цей критичний етап хронічного загоєння рани БП за допомогою НВ-ЕСЕ, щоб активувати шедінг ліганда ектодомену ЕСЕК за наявності виділень із середнього вуха й оклюзії ЄТ, є корисною для лікуванні пацієнтів із хронічною перфорацією

Зо барабанної перетинки.

І00112| Дослідження у тваринній моделі хронічного гнійного середнього отиту. Після створення моделі хронічної перфорації з оклюзією ЄТ, проводили інокуляцію в середнє вухо

Рзейдотопазх аегидіпоза (доза бх109 колонієутворюючих одиниць на мл) через існуючі хронічні перфорації. Через 2 тижні відбирали рідину з вуха й відправляли для проведення дослідження для підтвердження наявності бактерій за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).

Цей позитивний результат ПЛР підтверджував модель С5ОМ.

ІЇ00113| Потім мишей розділяли на дві когорти. Одна отримувала тільки полімер. Інша отримувала НВ-ЕСЕ у дозі 5 мкг/мл (та сама доза, що в описаних вище моделях). Загоєння в групі НВ-ЕСЕ становило 10095 (16 із 16) у порівнянні з 4195 (7/17) у контрольній групі (р « 0,01).

У контрольній групі за наявності загоєння воно також мало відмінності. Часто БП була дуже тонкою й напівпрозорою порівняно з майже непрозорою нормальною БП. Загоєння в групі НВ-

ЕСЕ виявилося нормальним. Можливість усе ще подолати цей критичний етап хронічного загоєння рани БП за допомогою НВ-ЕСЕ, щоб активувати ліганд ектодомену ЕСЕК у найближчій моделі СЗОМ, підтверджує цей спосіб лікування.

Приклад З 00114) Транстимпанальний спосіб доставки (Фігури 5, 6 і 7). Засіб доставки для доставки

НВ-ЕСЕ або НВ-ЕСЕ розміщають впритул до барабанної перетинки або вводять через канал або через євстахієву трубу. Через деякий період часу його можна дістати або він піддасться біорозкладенню. Засіб доставки може мати конфігурацію для утримання його всередині барабанної перетинки. Він може являти собою кільце, манжету, мати виступи, канавки або будь- які зміни за шириною або висотою. Засіб доставки може мати більше ніж один із перерахованих вище елементів для утримання його на місці. Засіб доставки може бути перфорований або мати просвіт будь-якого відповідного розміру. У ньому може бути будь-яка кількість виступів будь-якої ширини й розмірів, які вважаються достатніми або надлишковими порівняно з необхідним засобом, щоб утримуватися в барабанній перетинці. 00115) На фігурі 5 зображений вушний канал 100; зовнішнє вухо 110; і барабанна перетинка 120. Також зображено пристрій 125 для трансмембранної доставки лікарського засобу, що має ширину 130 і довжину 140.

ІЇ00116|Ї На Фігурі 6 зображено альтернативний варіант реалізації пристрою 126 для бо трансмембранної доставки. Пристрій має ширину 131 і довжину 141. Пристрій 126 містить один або обидва з зовнішнього обмежника 150 і внутрішнього обмежника 155, причому обмежник має ширину 160.

І00117| На Фігурах 7А-7В зображено альтернативний варіант реалізації пристрою 127 для трансмембранної доставки. На Фігурі 7А представлено вид зверху, що демонструє вушний канал 100 і барабанну перетинку 120. Пристрій 127 для доставки має ширину 132 і довжину 142.

Пристрій містить множину виступів 170, розташованих у поздовжньому напрямку вздовж пристрою, причому ці виступи мають довжину 171 і ширину 172. На Фігурі 7В зображено пристрій у поперечному перерізі.

Приклад 4

Пристрій для інтратимпанальної доставки 00118) Пристрій для доставки фактора росту можна розмістити між шарами барабанної перетинки. Якщо засіб доставки є цільним, його можна розміщати, піднімаючи один або більше шарів як клапоть, а потім замінити клапоть після розміщення. Якщо засіб є рідким, його можна ввести за допомогою ін'єкції.

І00119| На Фігурі 8 показано пристрій 128 для доставки всередині барабанної перетинки.

Пристрій введено в барабанну перетинку 120. Пристрій має ширину 133 і довжину 143.

Приклад 5

ІЇ00120| Розміщення засобу доставки у вигляді цільного об'єкта суміжно з барабанною перетинкою (Фігура 9). Засіб доставки можна розміщати впритул до барабанної перетинки й забезпечувати місцеве джерело НВ-ЕСЕ або інгібітора НВ-ЕСРЕ. Засіб доставки можна розміщати медіально або латерально, частково або повністю через барабанну перетинку.

Частина, що проходить через барабанну перетинку, може бути менше, більше або відповідати за розміром перфорації, за її наявності.

І00121| На фігурі 9 зображено пристрій 128 для доставки фактора росту, розміщений суміжно з барабанною перетинкою 120. Пристрій має ширину 134 і довжину 144.

Приклад 6 00122) Спосіб застосування фактора росту з використанням ін'єкції показано на Фігурі 10.

Композицію, що містить фактор росту 200, можна доставити у вушний канал 100 для створення контакту з барабанною перетинкою 120 на її латеральній і/або медіальній поверхні, і вона може

Зо далі протікати в ділянку перфорації 121 барабанної перетинки. Композицію можна розподіляти зі шприца 210 через трубку 220 для доставки. Композицію можна надавати у вигляді одного розчину або у вигляді двох розчинів, які змішуються в момент доставки. 00123) Двокамерні шприци відомі в цій галузі техніки й легко доступні, наприклад, дивися серед іншого: І уо-Уескю двокамерний шприц; або будь-який з описаних у патенті США Мо 5971953; заявці на патент США Ш5В20030040701; 0520140012196; 05 20130060232; міжнародній заявці М/О1999017820А1; тощо. 00124) Такі композиції включають композиції, які за змішування змінюють стан на в'язкий або твердий. Агенти, що збільшують в'язкість, включають, не обмежуючись перерахованим, гелан, М-ізопропілакриламід з акрилатом натрію й н-М-алкілакриламідом, поліакрилову кислоту з поліетиленгліколем, поліметакрилову кислоту з поліетиленгліколем, САКВОРОЇФ з гідроксипропілметилцелюлозою, латекс із ацетату гідрофталату целюлози, альгінат натрію або гель, що піддається зворотному термозатвердінню, такий як полоксамер або полоксамін. 00125) Такі композиції можуть бути доставлені до зовнішньої, епідермальної поверхні барабанної перетинки в стані, подібному рідкому тобто в текучій формі. Однак після введення композиція приймає твердий стан, так що композиція залишається в контакті з барабанною перетинкою. У результаті композиція залишається локалізованою впритул до барабанної перетинки, і фармакологічний агент може передаватися на барабанну перетинку. В'язка або тверда композиція може бути біорозкладною або біонерозкладною.

Claims (45)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Застосування гепаринзв'язувального епідермального фактора росту білка (НВ-ЕСЕ), для лікування хронічної перфорації барабанної перетинки.

2. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що білок НВ-ЕСЕ являє собою білок НВ-ЕСЕ людини.

3. Застосування за п. 2, яке відрізняється тим, що білок НВ-ЕСЕ являє собою розчинну форму білка НВ-ЕСЕ.

4. Застосування за будь-яким із пп. 1-3, яке відрізняється тим, що лікування включає контактування місця хронічної перфорації барабанної перетинки з фармацевтичною композицією, що містить ефективну дозу НВ-ЕСЕ, протягом періоду часу, достатнього для значущого закриття перфорації.

5. Застосування за будь-яким із пп. 1-4, яке відрізняється тим, що композиція контактує з місцем хронічної перфорації барабанної перетинки протягом періоду, що становить щонайменше 7 діб.

6. Застосування за п. 4, яке відрізняється тим, що композиція контактує з місцем хронічної перфорації барабанної перетинки протягом періоду, що становить щонайменше 2 тижні.

7. Застосування за п. 4, яке відрізняється тим, що композицію вводять щонайменше щодня.

8. Застосування за п. 4, яке відрізняється тим, що композиція забезпечує уповільнене вивільнення НВ-ЕСЕЕ.

9. Застосування за п. 4, яке відрізняється тим, що композиція представлена у вигляді водного розчину, гелю, лосьйону, бальзаму, пасти або іншого середовища-носія.

10. Застосування за п. 4, яке відрізняється тим, що композицію вводять за допомогою розпилення.

11. Застосування за п. 4, яке відрізняється тим, що композицію вводять у вигляді рідини, яка згодом твердне, щоб залишатися прилягаючою до барабанної перетинки.

12. Застосування за п. 4, яке відрізняється тим, що композиція являє собою гель із уповільненим вивільненням, що містить зшитий співполімер хітозану та полілактиду.

13. Застосування за п. 12, яке відрізняється тим, що гель з уповільненим вивільненням додатково містить фібриноген.

14. Застосування за п. 4, яке відрізняється тим, що композицію доставляють за допомогою пристрою, який забезпечує уповільнене вивільнення НВ-ЕСЕ.

15. Застосування за п. 4, яке відрізняється тим, що композиція додатково містить щонайменше один додатковий активний агент.

16. Фармацевтична композиція для лікування хронічної перфорації барабанної перетинки, яка містить ефективну дозу гепаринзв'язувального епідермального фактора росту білка (НВ-ЕСЕ).

17. Фармацевтична композиція за п. 16, яка відрізняється тим, що білок НВ-ЕСЕ являє собою білок НВ-ЕСЕ людини.

18. Фармацевтична композиція за п. 16, яка відрізняється тим, що білок НВ-ЕСЕ являє собою Зо розчинну форму білка НВ-ЕСЕ.

19. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 16-18, яка відрізняється тим, що вона контактує з місцем хронічної перфорації барабанної перетинки протягом періоду часу, достатнього для значущого закриття перфорації.

20. Фармацевтична композиція за п. 19, яка відрізняється тим, що вона контактує з місцем хронічної перфорації барабанної перетинки протягом періоду, що становить щонайменше 7 діб.

21. Фармацевтична композиція за п. 19, яка відрізняється тим, що вона контактує з місцем хронічної перфорації барабанної перетинки протягом періоду, що становить щонайменше 2 тижні.

22. Фармацевтична композиція за п. 19, яка відрізняється тим, що її вводять щонайменше щодня.

23. Фармацевтична композиція за п. 19, яка відрізняється тим, що вона забезпечує уповільнене вивільнення НВ-ЕСЕ.

24. Фармацевтична композиція за п. 16, яка відрізняється тим, що вона представлена у вигляді водного розчину, гелю, лосьйону, бальзаму, пасти або іншого середовища-носія.

25. Фармацевтична композиція за п. 16, яка відрізняється тим, що її вводять за допомогою розпилення.

26. Фармацевтична композиція за п. 16, яка відрізняється тим, що її вводять у вигляді рідини, яка згодом твердне, щоб залишатися прилягаючою до барабанної перетинки.

27. Фармацевтична композиція за п. 16, яка відрізняється тим, що вона являє собою гель із уповільненим вивільненням, що містить зшитий співполімер хітозану та полілактиду.

28. Фармацевтична композиція за п. 27, яка відрізняється тим, що гель з уповільненим вивільненням додатково містить фібриноген.

29. Фармацевтична композиція за п. 16, яка відрізняється тим, що її доставляють за допомогою пристрою, який забезпечує уповільнене вивільнення НВ-ЕСЕ.

30. Фармацевтична композиція за п. 16, яка відрізняється тим, що вона додатково містить щонайменше один додатковий активний агент.

31. Застосування гепаринзв'язувального епідермального фактора росту білка (НВ-ЕСЕ), у виробництві лікарського засобу для лікування хронічної перфорації барабанної перетинки.

32. Застосування за п. 31, яке відрізняється тим, що білок НВ-ЕСЕ являє собою білок НВ-ЕС Е Гс10) людини.

33. Застосування за п. 31, яке відрізняється тим, що білок НВ-ЕСЕ являє собою розчинну форму білка НВ-ЕСЕ.

34. Застосування за будь-яким із пп. 31-33, яке відрізняється тим, що лікарський засіб контактує з місцем хронічної перфорації барабанної перетинки протягом періоду часу, достатнього для значущого закриття перфорації.

35. Застосування за п. 34, яке відрізняється тим, що лікарський засіб контактує з місцем хронічної перфорації барабанної перетинки протягом періоду, що становить щонайменше 7 діб.

36. Застосування за п. 34, яке відрізняється тим, що лікарський засіб контактує з місцем хронічної перфорації барабанної перетинки протягом періоду, що становить щонайменше 2 тижні.

37. Застосування за п. 34, яке відрізняється тим, що лікарський засіб вводять щонайменше щодня.

38. Застосування за п. 34, яке відрізняється тим, що лікарський засіб забезпечує уповільнене вивільнення НВ-ЕСЕЕ.

39. Застосування за п. 31, яке відрізняється тим, що лікарський засіб представлений у вигляді водного розчину, гелю, лосьйону, бальзаму, пасти або іншого середовища-носія.

40. Застосування за п. 31, яке відрізняється тим, що лікарський засіб вводять за допомогою розпилення.

41. Застосування за п. 31, яке відрізняється тим, що лікарський засіб вводять у вигляді рідини, яка згодом твердне, щоб залишатися прилягаючою до барабанної перетинки.

42. Застосування за п. 31, яке відрізняється тим, що лікарський засіб являє собою гель із уповільненим вивільненням, що містить зшитий співполімер хітозану та полілактиду.

43. Застосування за п. 42, яке відрізняється тим, що гель з уповільненим вивільненням додатково містить фібриноген.

44. Застосування за п. 31, яке відрізняється тим, що лікарський засіб доставляють за допомогою пристрою, який забезпечує уповільнене вивільнення НВ-ЕСЕ.

45. Застосування за п. 31, яке відрізняється тим, що лікарський засіб додатково містить щонайменше один додатковий активний агент. ї- (8) (с! (в В В КК В ОВК я с с с Я

Віхвовісь стужеавеко ніж зь слюхажого віхціву стевії КК ВМКЕНХХ МОЗКОМ Се уНІ ааоекВу ї ; кра нУмгу Ххазкустачні валін Деруннн ша й ! пн нн Кр пли я Й Шут пеня сх їх й ЩІ І ду у ук уучуучууууууучууучучччнх і й п сок Сх ДИ Ер ши я реж нн о зни во ц ша. й . че я З . й ШЕ ШИ щі : пері ення де і й й Й щш ч А ОКУ КК я тт ї Ду ки КН с. " в Ж у ще Кожен ся Є їй | Й К. ї ень нн нн с х х с . ся у БІК і: " и чим - Я ння Ж. з КК знан ОМ с . шу : | чи ши х У ох код З пт ЖЕ сю ре я ке хх Денне етнететете ст енеететененнено що Ух х СКК ЖЖ ЖЖ ЖЖ ЖЖ ЖЖ ЖЖ ЖЖ ЖЖ ЖЖ ЖЖ жжюя п в. кн жк. Й ши пф оС, в Аня Кі хюоону тв т Й сення Я Кк МН МеВ дну З ЩО двблнуєу т ордером СОЯ ща ХК хм їх БА ся КХ вх Ки 2 со -Яючя їй А дк референт» Ї й ся й во вчинивши ЗЖегкщиє йти Я БЕ ха 43 аа За сля Частетвів ві У Вб она сво ЗБ о Я У Часті щі

ФІГ. жом ке ах о ЩО ООН ВН пеки НЕ п ОО ПК ОК ПЕ тя Я МВ КЗО ПУХ До ПЕК ОККО СИМ ооо оо всю ООН ПО ж с ООН ВУ КМ СО ПК КН і ши с 0 з ШІ ши. ос 1.

і о. с г СЯ ПК КУ ООН ПІ о. - т з с о о о г пло о «КЕ плини КМИН у ПО Зх КОЖ ЗЕ Ох о : шк т Дю (Б с 00 ЕЕ Ве о ПО ох ОО сс. ння ОКО жк ПО о ЕВ ОМА п ОН . що шо о о. : Я се Ух 7 МНЕ МУКУ А Женя КК КК о. Ен КЕ ОО КОВО Ко о ОККО З МУ КОХ УК ЛА ЕКЗ ИН со: ЩО ОВО о 0 з п с . Ох м що и Б с с х Мов п о. о о. о п Ко щи ПК КК Ве КО с дХ КО Ж СУ ОО У С У Н У: КМ БОКОМ ОО о . и НО Ох а ах с М» ВОЗ п Я ОО 0 ЗХ хх ХОМ ах о М 5 ХУ ОХ Хе ОК ОХ ОКУ п о ОКУ М Хе ПКУ Ко КОМ ОСМ

Б о. нн о. УЗ ОК ОО Ж КО ОО, ЕК ЗЕ жо о о. с 5 с о о МОЗОК ЕВ ВКА НАХ и КК ОКА ПО У я ко с с ЕМО КО оо п ОО о ХО ОО ОВ КА ОО КН а 0. . с ХХ о УМО о и п о о КУ УКХ АК НАМ ЗУ ОКО ЕХ З З ОО о ВОМ с о: с о о. с

ФІГ. З с с дош по о М о: я с о о ХО с ЕС с шо сє КА о ЗО ОО М Ж ши п. с с її» с с ів) . . о МО Б С ЦЕ ЕХ с є с с с . о с о с п. п. с (С о с о

ФІГ. 4 ле І М ІК Е хх сопла, - щей Ка чи Ї ХМ Ї -АВ Ше: : Яна сосни ВИНІ о 1 АХ Я ї , і / 4 зо о 7 . т й

ФІГ. 5 в | 138 у ден 1 ВО 4 дання і і я цк й нин чинни КЗ сен Шк цу ах

ФІГ. 6 144 нн. І 127 Ж Пан ша 433 точ У 130 тн й 7 ре 2 У дя то й 172 то

ФІГ. 7

100- т п М во кн хе іо Її 143

ФІГ. 8 шк! с / / у отв їсе -й - т мон 18о 100 здо ех ЧУГ, 5 и и А БУ ї -о Ї ек: ри чи іг ач // ха л. Зх ем ЧЕ «у // Ва б ці 20 // Лі У й й / позу / і / // ФІГ, 10