CN116171147A - 伤口愈合组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含Agrin片段或其衍生物的药物组合物。在一个实施方案中，Agrin片段或其衍生物包含Agrin的LG3结构域，其在LG3结构域的z位点处具有8个氨基酸的插入物，其中插入物的序列是ELANEIPV。在另一个实施方案中，Agrin片段或其衍生物还包含Agrin的LG2结构域。本发明还涉及包含药物组合物的水凝胶或支架。本发明还涉及药物组合物、水凝胶或支架在治疗伤口(例如缓慢愈合的伤口或不愈合的伤口)中的用途。

Description

伤口愈合组合物及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年7月24日提交的新加坡临时申请号10202007138Y的优先权权益，其内容通过引用整体并入本文用于所有目的。
技术领域
本发明总体上涉及分子生物学和生物化学领域。特别地，本发明涉及用于治疗伤口的组合物。
背景技术
据估计，全球超过4亿人患有糖尿病(http://www.idf.org)。仅在新加坡，据估计20-80岁的人中有11％患有糖尿病，仅次于美国，并且这个数字将显著上升。
糖尿病的主要并发症是伤口不愈合。开始是小刮擦，后来可以变成大的、不愈合的伤口，在某些情况下只能通过截肢治疗。在新加坡，伤口不愈合是非创伤性下肢截肢的主要原因，每天发生超过4例下肢截肢。伤口或溃疡不愈合可以持续12个月或更长时间，并且具有65％的非常高的复发率。据估计，每年糖尿病预算的33％用于糖尿病足部溃疡。近年来，无法有效治疗伤口不愈合导致新加坡的伤口护理成本急剧增加，目前估计每年远超过7亿新加坡元。
尽管伤口不愈合很普遍并且带来了巨大的医疗负担，但仍没有有效的治疗方法。因此，提供用于治疗不愈合伤口的组合物和方法的需求仍未得到满足。
发明内容
在一个方面，提供了包含Agrin片段或其衍生物的药物组合物，其中所述Agrin片段或其衍生物包含Agrin的LG3结构域和在LG3结构域的z位点处的八氨基酸插入物ELANEIPV(SEQ ID NO:1)。
在另一个方面，提供了包含编码Agrin片段或其衍生物的核酸分子的载体，其中所述Agrin片段或其衍生物包含Agrin的LG3结构域和在LG3结构域的z位点处的八氨基酸插入物ELANEIPV(SEQ ID NO:1)。
在另一个方面，提供了包含如本文公开的载体的宿主细胞。
在另一个方面，提供了包含如本文公开的药物组合物的水凝胶或支架(scaffold)。
在另一个方面，提供了如本文公开的药物、水凝胶或支架，其用于治疗。
在另一方面，提供了一种治疗伤口的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用药学有效量的如本文公开的药物组合物、水凝胶或支架。
在另一方面，提供了药学有效量的如本文公开的药物组合物、水凝胶或支架在制备用于治疗伤口的药物中的用途。
附图说明
当结合非限制性实例和附图考虑时，参考详细的说明将能够更好地理解本发明，其中：
图1示出了研究皮肤损伤对多种蛋白(包括Agrin)表达的影响的测定结果。(a)在伤口愈合小鼠模型中，来自受伤细胞的单细胞转录组学的基于ECM的伤口特征的基因表达分析(学生‘t’检验，分别为*p<0.05、**p<0.005)。(b)对汇合的细胞进行伤口刮擦并允许其迁移。在指定时间点后，对于指定基因，通过RT-PCR分析从迁移细胞分离的mRNA。数据表示为平均值+/-s.d.。对所有基因进行多重t检验，比较创伤后的各个阶段；p值以表格形式表示(灰色值表示减少)。(c)针对Agrin表达对迁移皮肤细胞(如图b中的)进行Western印迹分析。GAPDH用作上样对照。图示了指定细胞中Agrin水平的光密度定量。数据表示为平均值+/-s.d.(n＝3次实验，多重t检验，p值如图所示)。(d)针对指定蛋白，在未受伤的皮肤角质形成细胞(keratinocyte)和成纤维细胞中进行Western印迹分析。GAPDH用作上样对照。图示了指定细胞中Agrin水平的光密度定量(n＝3次实验，**p＝0.001，*p＝0.02，学生‘t’检验)。(e)共聚焦显微术分析指定天数的小鼠皮肤穿孔伤口活检切片的Agrin免疫荧光，并用DAPI复染。比例尺：50μm。小鼠皮肤切片中Agrin染色的平均荧光强度(MFU)以图形方式定量。数据表示为平均值+/-s.d.(n＝3只小鼠，每次分析三个切片，**p＝0.003，学生‘t’检验)。白色虚线分别表示表皮和真皮边界。(f)显示相对Agrin表达的损伤后指定天数的小鼠皮肤穿孔伤口活检的免疫组织学切片。比例尺：100μm，EP-表皮，D-真皮，d-WAT-真皮白色脂肪组织。虚线表示表皮和真皮边界。通过ImageJ以图形方式定量小鼠皮肤切片中的平均Agrin强度。数据表示为平均值+/-s.d.(n＝3只小鼠，每个时间点分析三个切片，ANOVA和学生‘t’检验，p值在图中表示)。结果显示在对皮肤的机械损伤期间触发Agrin表达。
图2是显示AGRN和GPC1敲低对创伤后角质形成细胞迁移的影响的测定。(a)RT-PCR分析显示HaCaT细胞中AGRN和GPC1的敲低。(b)对对照、Agrin耗竭和GPC1敲低细胞进行刮擦伤口测定。在指定的时间点呈现了显示相对迁移的代表性明视场图像。使用ImageJ定量平均未迁移面积+/-s.d.(n＝3，学生‘t’检验，分别为**p＝0.005、****p＝0.000009、****p＝0.00002)。比例尺：50μm。(c)在伤口刮擦后，在24小时时间段内Agrin和GPC1敲低的HaCaT的迁移速度的比较(n＝3，学生‘t’检验，****p<0.00001)。结果显示Agrin和Glypican-1在创伤后角质形成细胞迁移中起作用。
图3是显示Agrin敲低对体内伤口愈合的影响的测定。(a)示出了创伤之前的AgrinsiRNA处理和在小鼠受伤皮肤上施用含有siRNA的Aquaphore软膏的方案。(b)在无固定物(左图)和有固定物(右)条件下，在伤口损伤的第0天皮内siRNA注射后72小时后，对小鼠穿孔活检伤口裂解物的Western印迹。探测小鼠皮肤裂解物的Agrin。肌动蛋白或GAPDH用作上样对照。(c)在损伤后第5天的无固定物伤口中，显示用对照和指定的Agrin siRNA处理的小鼠受伤皮肤中的Agrin免疫染色的共聚焦显微图像。比例尺：50μm。白色虚线表示迁移的表皮。(d)在损伤后第8天，用对照和Agrin siRNA#1处理的苏木精和伊红染色的小鼠皮肤切片(n＝4只小鼠/组)。双向箭头是指未覆盖的伤口区域。星号*表示覆盖伤口的迁移上皮舌(epithelial tongue)。比例尺：50μm。(e)验证了HEK细胞中由抗人Agrin的指定隐形siRNA(stealth siRNA)导致的Agrin敲低的Western印迹。GAPDH用作上样对照。(f)显示用对照、Agrin siRNA#1处理的人皮肤外植体中的Agrin免疫染色的共聚焦显微图像。随后从第2天起用sAgrin挽救一批经Agrin siRNA处理的外植体。示出了创伤后第8天的图像。细胞核用DAPI染色。箭头表示未覆盖的伤口区域。比例尺：50μm。(g)在损伤后第8天，用75nM对照或Agrin siRNA#1处理的人皮肤外植体的代表性苏木精和伊红染色切片。第三图由皮肤外植体切片组成，所述皮肤外植体切片在第0天用Agrin siRNA#1软膏处理，但随后分别在第2、4和6天接受另外含有sAgrin(20μg)的软膏。箭头表示在对照皮肤切片中覆盖伤口区域的迁移上皮舌。双向箭头是指未覆盖的伤口区域。比例尺：500μm。结果显示对Agrin进行沉默延迟了体内伤口愈合。
图4示出了研究Agrin耗竭对皮肤伤口愈合的影响的测定结果。(a)用乱序或AgrinsiRNA#1-3处理小鼠皮肤。三天后，对经siRNA处理的区域进行穿孔创伤，随后每2-3天分别用含有75nM指定siRNA的基于Aquaphore的局部软膏处理。在创伤后的指定天数示出了用上述含有siRNA的局部软膏处理的小鼠皮肤在指定天数的穿孔伤口的代表性照片。相对于创伤后的指定天数对平均伤口直径作图。数据表示为平均值+/-s.d(n＝4只小鼠/组，双因素ANOVA，分别为*p＝0.02、0.03和0.01)。比例尺：1mm。(b)显示了创伤后第5天，在用指定siRNA处理的小鼠皮肤切片中迁移上皮舌中的K17和DAPI染色的共聚焦显微图像。比例尺：50μm。相对K17染色强度表示为平均值+/-s.d.(n＝3个切片/组，学生‘t’检验，分别为p＝0.01，p＝0.002)。(c)显示了ICR小鼠品系中使用的固定物伤口敷料方案的照片。对有固定物(封闭的)和无固定物(开放的)伤口在第7天定量的伤口直径进行定量(每组n＝3只小鼠，*p＝0.05，学生‘t’检验)。(d)用乱序或Agrin siRNA#1处理小鼠皮肤。三天后，对经siRNA处理的区域进行穿孔创伤，随后每2-3天分别用含有75nM指定siRNA的基于Aquaphore的局部软膏处理。用10mm固定物栓系的伤口用Tegaderm覆盖。在敷料和siRNA软膏施用的指定天数示出了代表性照片。在创伤后的指定天数对平均伤口直径作图。数据表示为平均值+/-s.d(n＝3只小鼠/组，ANOVA p＝0.003)。(e)显示在创伤后第7天，在用指定siRNA处理的小鼠皮肤切片中，迁移上皮舌中的K17和DAPI染色的共聚焦显微图像。比例尺：50μm。白色块箭头表示弱化的上皮舌。相对K17占据率表示为平均值+/-s.d.(n＝3个切片/组，学生‘t’检验，p＝0.001)。(f)天狼猩红染色显示在第7天对照和Agrin siRNA处理的小鼠皮肤的伤口床中的相对胶原蛋白分布。示出了代表性的明视场和偏振光图像。加框区域表示放大视图。比例尺：100μm。使用ImageJ定量相对胶原纤维(从每组3只小鼠分析n＝4个切片，学生‘t’检验，*p＝0.02)。(g)对人皮肤外植体进行穿孔创伤，并且每三天用含有75nM乱序对照或Agrin siRNA#1的软膏处理。对于组3，在第2天后将20μg sAgrin掺入软膏中并每两天分别施用一次。分别示出了第0天和第10天皮肤伤口的代表性照片。在损伤后第10天计算相对伤口直径，表示为平均值+/-s.d.(n＝3/组，学生‘t’检验，分别为***p＝0.0001，*p＝0.03)。比例尺：0.5mm。(h)代表性共聚焦图像，其示出了覆盖对照、Agrin耗竭的和通过sAgrin皮肤外植体挽救的那些皮肤外植体的伤口床的迁移角质形成细胞中的K17染色。箭头标记迁移角质形成细胞的前缘。白线表示伤口边界。比例尺：50μm。结果显示Agrin耗竭损害皮肤伤口愈合。
图5是显示Agrin敲低对角质形成细胞和真皮成纤维细胞的2D迁移的影响的测定。(a)用对照或Agrin siRNA处理的BJ和HaCaT细胞中Agrin基因表达的RT-PCR分析。数据表示为平均值+/-s.d.。随后将这些敲低细胞用于transwell迁移测定。分析一批Agrin耗竭的细胞响应于底室中作为化学引诱物的sAgrin(10μg/ml)的迁移(第三图)。使用ImageJ定量迁移并表示为平均值+/-s.d.(n＝3，学生‘t’检验，分别为p＝0.0004、0.0003和0.0005)。比例尺：20μm。(b)对对照、Agrin耗竭的和用10μg/ml sAgrin预处理18小时的Agrin敲低的BJ或原代小鼠真皮成纤维(DF)细胞进行刮擦伤口测定。在指定时间点呈现了显示相对迁移的代表性明视场图像。使用ImageJ定量平均未迁移面积+/-s.d.(n＝3，学生‘t’检验，分别为*p<0.05、**p<0.004、***p<0.0005、****p＝0.000002、****p<0.000001)。比例尺：20μm。还示出了验证DF中Agrin敲低的Western印迹，其中GAPDH作为上样对照。(c)对照、Agrin耗竭的和用10μg/ml sAgrin预处理18小时的Agrin敲低的指定角质形成细胞中的刮擦伤口测定。示出了代表性明视场图像。比例尺：20μm。验证HEK细胞中Agrin表达的RT-PCR分析也呈现为平均值+/-s.d(中图)，而对于原代小鼠角质形成细胞呈现了确认Agrin敲低的Western印迹(最右图)。结果如图(b)中那样定量(n＝3，学生‘t’检验，分别为****p<0.000001，**p<0.005，*p<0.05，所有其他p值在图中表示)。(d)在创伤后15小时，如图(b和c)中处理的指定细胞的迁移速度的比较(n＝4个独立迁移事件，学生‘t’检验，p值在图中示出)。结果显示Agrin敲低阻碍了角质形成细胞和真皮成纤维细胞的2D迁移。
图6Agrin影响伤口损伤后的角质形成细胞增殖。(a)对照、Agrin耗竭的指定角质形成细胞和用10μg/ml sAgrin挽救18小时的那些角质形成细胞用20μM BrdU标记12小时，然后进行伤口-刮擦测定。在刮擦后4小时固定细胞，并用抗BrdU和K17抗体染色。细胞核用DAPI复染。示出了在伤口边缘处(前导)和距离伤口边缘至少200μm处(跟随)的代表性共聚焦图像。以图形方式显示每种条件下增殖细胞的相对百分比(对于来自三次重复的每种条件分析n＝5-6张图像，学生‘t’检验，分别为**p＝0.006，*p-0.003，p＝0.005，***＝0.0001)。比例尺：10μm。(b-c)示出迁移伤口边缘处的增殖状态的示意图。在创伤后第7天，在对照和Agrin耗竭的伤口边缘和伤口床中对Ki67染色的免疫组织切片。实心箭头表示表皮(Ep)的基部，而箭头表示伤口边缘。星号(*)表示伤口边缘处Ki67增殖的损失。比例尺：100μm。使用Image J定量增殖细胞的百分比(从两只单独的小鼠分析n＝4个切片，学生‘t’检验，**p＝0.001)。结果显示Agrin影响伤口损伤后的角质形成细胞增殖。
图7示出了研究Agrin是否产生有利于集体(collective)角质形成细胞迁移和伤口闭合的机械感受态环境(mechanically competent environment)的测定结果。(a)将汇合的经处理的HaCaT细胞在单独的软基底或补充有sAgrin(10μg/ml)的软基底中培养18小时。去除屏障板(barrier stencil)后，分别在0h和24h在4X明视场显微镜下对细胞的集体迁移进行成像。在硬基底上培养的未经处理的HaCaT用作对照。在不同ECM刚度下由HaCaT共同覆盖的代表性伤口面积显示为平均值+/-s.d.(n＝3，学生‘t’检验，**p<0.001)。比例尺：50μm。(b)将未处理或用sAgrin(10μg/ml)处理的HaCaT细胞在软基底中培养，并使其如(a)中那样迁移。在去除屏障后4小时后固定细胞并用K17染色。代表性共聚焦图像显示迁移前缘中的K17和DAPI染色。比例尺：10μm。定量相对K17强度以表示迁移后4h未处理和sAgrin处理的HaCaT中的前导细胞部分(n＝10张图像/组，学生‘t’检验，*p＝0.01)。白色箭头表示前导细胞。虚线表示伤口边缘。(c)对照和Agrin耗竭的HaCaT在单独的硬基底中生长18小时，然后在去除屏障板后0小时和24小时分析它们的迁移潜力。将一批Agrin耗竭的细胞在含有10μg/ml sAgrin的硬基底上培养18小时，随后如上所述分析迁移。由每种条件的细胞覆盖的代表性明视场图像和定量迁移面积显示为平均值+/-s.d.。比例尺：50μm。Western印迹显示HaCaT细胞中Agrin的敲低。GAPDH用作上样对照。(d)在去除屏障后4小时将与在(c)中相同处理的细胞固定，并针对K17和DAPI染色。示出了代表性的共聚焦图像。比例尺：10μm。虚线表示伤口边缘。定量表达K17的前导细胞的相对百分比并表示为平均值+/-s.d.(每个条件n＝10张图像，学生‘t’检验，分别为**p＝0.002和0.001)。(e)显示在软基质(0.8KPa)中存在或不存在10μg/ml sAgrin的情况下，在创伤后第0天和第5天，小鼠原代角质形成细胞相对于真皮成纤维细胞的相对迁移的3D硬度依赖性迁移测定。示出了迁移细胞的代表性明视场图像。比例尺：100μm。通过ImageJ定量相对迁移面积(n＝3张图像/组，学生‘t’检验，*p＝0.02)。黑色虚线表示原始伤口区域。(f)在指定天数，对照和Agrin耗竭的原代小鼠角质形成细胞和真皮成纤维细胞单独迁移或在10μg/ml包埋在硬基质(30KPa)中的sAgrin存在下迁移的代表性明视场图像。比例尺：100μm。通过ImageJ定量相对迁移面积(每组n＝3张图像，学生‘t’检验，分别为*p＝0.05，**p＝0.005，**p＝0.002和***p＝0.0005)。Western印迹图像揭示了指定细胞中Agrin敲低的程度。GAPDH用作上样对照。(g)示出了从3天大的小鼠幼仔中提取皮肤的示意图，该皮肤随后分别在单独的软或硬ECM或含有sAgrin的ECM中培养。(h)显示在第5天，自单独的或补充有20μg/ml sAgrin的软ECM上的小鼠皮肤外植体生长的角质形成细胞长出(outgrowth)的明视场显微图像。通过ImageJ测量长出面积，并以图形方式表示为平均值+/-s.d.(n＝3个外植体/组，学生‘t’检验，*p＝0.03)。比例尺：50μm。(i)将在硬ECM上培养的小鼠皮肤外植体用小鼠对照或Agrin siRNA处理3天。随后将一批Agrin耗竭的小鼠外植体在用20μg/ml sAgrin调节的硬ECM上再培养2天。第5天Agrin表达的代表性RT-PCR分析显示为平均值+/-s.d.(n＝3只小鼠外植体，每组)。还示出了显示角质形成细胞长出的明视场图像。比例尺：50μm。使用ImageJ定量长出面积，并表示为平均值+/-s.d.(每组n＝3个外植体，学生‘t’检验，分别为*p＝0.019和0.04)。(j)AFM测量迁移对照、Agrin耗竭和在创伤后4小时用10μg/ml sAgrin挽救的那些中的细胞硬度。示出了以帕斯卡为单位的相对硬度(每组分析n＝10-15个细胞，三次重复，学生‘t’检验，分别为*p＝0.01，*p＝0.008)。(k)显示在微制造的基底上迁移的对照、Agrin耗竭的和挽救的HaCaT中的牵引力的热图。白色箭头指向前缘。比例尺：100μm。所有条件下前缘牵引力的计算(来自三个实验的n＝6-10张图像，学生‘t’检验，分别为*p＝0.02和0.04)。(l)PIV分析示出了PDMS基底上的迁移对照、Agrin耗竭的和挽救的HaCaT中的速度矢量。绿色箭头表示速度场。白色星号表示涡流区域。比例尺：100μm。量化的速度以图形方式呈现(n＝3，学生‘t’检验，***p＝0.0001)。结果表明，Agrin通过增强牵引应力和流体速度动力学来敏化ECM刚度下的集体迁移。
图8显示Agrin对迁移角质形成细胞硬度的影响。(a)对用10μg/ml sAgrin预处理18小时的对照、Agrin耗竭的和Agrin敲低的原代小鼠角质形成细胞进行刮擦伤口测定。在刮擦后4h，通过AFM分析前缘(白线)处的细胞。示出了验证Agrin敲低的代表性Western印迹，其中GAPDH作为上样对照。比例尺：10μm。(b)示出了指定条件的AFM硬度图。力标度表示0-7KPa。结果显示Agrin导致了迁移的角质形成细胞的硬度。
图9示出了研究Agrin是否通过协调细胞骨架结构来调节伤口损伤期间的细胞力学的测定结果。(a)在损伤后的指定时间点，汇合的对照、Agrin耗竭的和用10μg/ml sAgrin处理18小时的那些的伤口边缘的共聚焦图像。将细胞针对磷酸化肌球蛋白轻链(pMLC)和F-肌动蛋白进行免疫染色，并用DAPI复染。比例尺：10μm。(b)刮取对照、Agrin siRNA处理的和用10μg/ml sAgrin处理18小时的Agrin耗竭的HEK细胞的汇合培养物。在指定的时间点收集来自迁移区域的细胞裂解物，并通过Western印迹分析pMLC活化。Agrin表达验证了敲低功效，而肌动蛋白用作上样对照。(c-d)汇合的HEK细胞未经处理或用10μg/ml sAgrin营养18小时。在伤口刮擦之前，使一批sAgrin营养的HEK细胞进一步经受10μm布雷他汀(Blebbistatin)2小时，并使细胞单独或在sAgrin和布雷他汀存在下迁移指定的时间。刮伤后，将细胞在指定的时间点固定，并针对pMLC、F-肌动蛋白和DAPI染色。示出了代表性的共聚焦图像。比例尺：10μm(c)。对于图d，迁移细胞在创伤后18小时固定并在明视场显微镜下可视化。每种条件的细胞迁移的相对伤口面积表示为平均值+/-s.d.(n＝3，学生‘t’检验，分别为**p＝0.001，***p＝0.0001)。(e)将对照和Agrin siRNA#1处理的HEK细胞用与20μgBSA或sAgrin缀合的4.5μm磁珠在4℃包被30分钟。然后刮擦汇合的细胞并使其在存在或不存在施加力的永磁体的情况下迁移30分钟。在创伤后30分钟，将细胞固定并针对pMLC和肌动蛋白进行免疫染色，并用DAPI使细胞核可视化。示出了sAgrin包被的磁珠的代表性共聚焦图像。比例尺：10μm。白色圆圈表示珠。白色箭头表示富集的pMLC-肌动蛋白结构。(f)将Agrin耗竭的HEK细胞中的sAgrin珠附近的pMLC强度定量为来自三个独立实验的平均强度(分析了n＝8-15个细胞，学生‘t’检验，分别为*p＝0.04、***p＝0.0001)。比例尺：10μm。白色圆圈指代珠，而蓝色虚线圆圈表示在每个珠周围定量的感兴趣区域(ROI)200μ2面积。(g)将HEK细胞单独以小(800μ2)或大(1600μ2)纤连蛋白包被的十字图案或用20μg/ml sAgrin包被的该十字图案培养4-6小时。示出了针对pMLC和F-肌动蛋白免疫染色并用DAPI复染的十字形细胞的代表性共聚焦图像。F-肌动蛋白应力纤维的相对数量量化为来自三个独立实验的平均值+/-s.d.(每组n＝10个细胞，学生‘t’检验，分别为**p＝0.005、*p＝0.01)。比例尺：10μm。(h)在大纤连蛋白或纤连蛋白-sAgrin包被的微图案中铺板4h的HEK细胞的pMLC强度图的共聚焦图像。比例尺：10μm。十字形细胞的横向弧的应力曲率的定量表示为来自三个实验的平均值+/-s.d.(n＝10-15个细胞/组，学生‘t’检验，**p＝0.002)。(i)将对照或Agrin耗竭的HEK细胞在纤连蛋白图案上或在纤连蛋白和sAgrin包被的较大微图案上铺板4h。将所得的十字形细胞固定并用pMLC和F-肌动蛋白进行免疫染色，用DAPI标记细胞核。示出了代表性的共聚焦图像。比例尺：10μm。在十字细胞的相应横向弧处由pMLC强度指示的应力曲率被定量为来自三个实验的平均值+/-s.d.(每组n＝10个细胞，学生‘t’检验，分别为**p＝0.001、**p＝0.005)。结果显示Agrin在伤口损伤期间调节细胞力学。
图10显示Agrin诱导的力识别对肌动球蛋白接合的影响。(a)磁力传递到受伤角质形成细胞的设置。简言之，用与对照或sAgrin预缀合的磁珠在4℃包被角质形成细胞(HaCaT)30分钟。随后刮擦细胞并使其在37℃在标准培养条件下迁移或在置于细胞上方6mm的永磁体施加30分钟200pN的力的情况下迁移。(b)SDS-PAGE凝胶显示20μg配体-sAgrin、牛血清白蛋白(BSA)和纤连蛋白(FN)与磁珠的各自缀合。在共价缀合后，无珠上清液中的相应游离蛋白(在与磁珠一起孵育之前的上清液中探测)减少。(c)将用BSA、sAgrin或FN珠包被30分钟的HaCaT细胞在标准条件下或在永磁体力下再迁移30分钟。随后将细胞固定并针对活性整联蛋白β1(HUTS-4克隆)和Agrin染色。细胞核用DAPI复染。白色圆圈表示磁珠位置。比例尺：10μm。由三个实验定量每个珠周围200μ2面积处的相对强度，并表示为平均值+/-s.d.(n＝10-15个细胞/组)。(d-e)对照和Agrin siRNA#1处理的HEK细胞在siRNA处理后72小时后用sAgrin和FN(d)或多配体聚糖4珠(e)进行如在(b)中的力转导。磁分离珠粘附的蛋白质，并在探测pMLC和总MLC的Western印迹分析中对其进行解析。探测各细胞裂解物的Agrin，并将GAPDH用作上样对照。(f-h)在标准条件(未施力)或施加永磁体力下用sAgrin(f)、FN(g)或BSA(h)包被的磁珠探测的Agrin耗竭的HEK细胞的代表性共聚焦图像。将细胞固定并分别针对pMLC和F-肌动蛋白进行免疫染色。DAPI标记细胞核。白色圆圈代表珠。比例尺：10μm。(i)将Agrin耗竭的HaCaT细胞暴露于提高浓度的sAgrin包被的磁珠30分钟。创伤后，使细胞在未施力或永磁体力施加下迁移30分钟，随后固定并针对pMLC染色。细胞核用DAPI染色。块箭头表示珠附近增强的pMLC募集。根据三个实验(n＝10-15个细胞)对珠周围200μ2区域的pMLC强度进行定量，表示为平均值+/-s.d.。比例尺：10μm。(j)用sAgrin珠处理Agrin耗竭的HaCaT，并使其在持续的力施加下迁移指定的时间点。将所得细胞如在(i)中进行处理并定量。结果显示Agrin对受伤角质形成细胞的力识别引入了肌动球蛋白的参与。
图11示出了Agrin耗竭的角质形成细胞的转录组分析的结果。(a)RNA-Seq，其揭示了Agrin基因表达的损失(n＝3次重复)。来自siControl和siAgrin HaCaT(n＝3个样品)的RNA-Seq的大量群体的MDS图。(b)Agrin敲低的HaCaT细胞中的基因本体(GO)分析显示最显著下调的基因簇。(c)在Agrin敲低时的GSEA分析揭示了属于ECM结构成分的基因集被高度下调。(d)在HaCaT细胞中Agrin耗竭后，NABA基质组(与ECM相关)的上调和下调基因簇。(e)RT-PCR分析验证了所选的一组显著上调和下调的基因。
图12示出了鉴定伤口损伤后角质形成细胞中Agrin介导的机械张力的下游效应物的测定结果。(a)显示在硬塑料板中培养的对照和Agrin耗竭的HaCaT中差异表达的基因的火山图。插图显示MMP的水平。(n＝3次重复)。(b)GSEA分析显示下调的簇对应于介导对创伤正调控的基因。(c)将铺板在软基底上的HaCaT细胞用增加浓度的sAgrin处理18小时(左图)或用10μg/ml sAgrin处理指定的时间(右图)。进行Western印迹分析以检测MMP12和Agrin水平。GAPDH用作上样对照。(d)将对照或Agrin siRNA处理的HaCaT细胞铺板在硬基底上。将多批Agrin耗竭的细胞进一步铺板在含有渐增浓度的sAgrin的硬基底上并培养18小时。随后，通过Western印迹分析细胞裂解物的指定蛋白。肌动蛋白用作上样对照。MMP12的三个独立实验的光密度测定结果定量为平均值+/-s.d.(学生‘t’检验，分别为*p<0.03、**p<0.005)。(e)呈现了检测用于刮擦测定的对照和MMP12 siRNA处理的HaCaT或小鼠角质形成细胞(KRT)中的MMP12水平的Western印迹。刮擦测定使用对照、Agrin耗竭的和用10μg/mlsAgrin预处理18小时的Agrin耗竭的HaCaT/小鼠KRT。示出了创伤后指定时间点的代表性明视场图像。结果被定量为每组留下的未迁移的伤口面积，表示为平均值+/-s.d.(n＝3，学生‘t’检验，分别为**p<0.005，***p＝0.0001)。比例尺：50μm。(f)显示相应小鼠KRT和DF中MMP12敲低的Western印迹。GAPDH用作上样对照。在指定的天数，对照和MMP12耗竭的原代小鼠角质形成细胞和真皮成纤维细胞单独迁移或在10μg/ml包埋在软基质(0.8KPa)中的sAgrin存在下迁移的代表性明视场图像。比例尺：100μm。通过ImageJ定量相对迁移面积(每组n＝4个伤口，多重‘t’检验，分别为***p＝0.0001和****p＝0.00006)。(g)将放置在单独的软胶原蛋白基底上或具有20μg/ml sAgrin的软胶原蛋白基底上的小鼠皮肤外植体用溶剂(DMSO)或MMP408(5nM)处理5天。示出了显示在第5天自外植体生长的角质形成细胞长出的代表性明视场图像。比例尺：50μm。使用ImageJ定量长出面积，并表示为平均值+/-s.d.(每组n＝4个外植体，学生‘t’检验，**p＝0.002)。(h)用对照和MMP12 siRNA处理HaCaT细胞。三天后，用10μg/ml sAgrin处理一批MMP12耗竭的细胞18小时。随后，刮擦汇合的细胞，并在指定的时间点固定细胞并针对pMLC、肌动蛋白和DAPI染色。示出了迁移细胞的共聚焦图像。比例尺：10μm。白色箭头指向肌动球蛋白缆线。(i)允许与在(h)中相同方式处理的HEK细胞迁移指定的时间点。通过Western印迹分析测试来自迁移细胞的细胞裂解物的指定蛋白。GAPDH用作上样对照。(j)显示在不存在或存在10μg/ml sAgrin 18-24小时的情况下由对照和MMP12耗竭的HaCaT显示的牵引应力的热图。比例尺：100μm。以帕斯卡(Pa)为单位的前缘应力以图形方式呈现(来自三个实验的n＝6-10张图像，学生‘t’检验，*p＝0.007，ns p＝0.06，去除异常值后*-siControl vs siMMP12*p＝0.01，siControl vs siMMP12+sAgrin**p＝0.001，分别为学生‘t’检验，*p＝0.007)。(k)在伤口-刮擦之前，在4℃下用sAgrin或FN缀合的磁珠将MMP12耗竭的HaCaT细胞标记30分钟。在创伤后，将37℃下的迁移细胞单独放置或置于永久磁力下30分钟，固定，并分别针对pMLC、肌动蛋白和DAPI染色。示出了代表性的共聚焦图像。比例尺：10μm。白色圆圈代表珠。在来自三个独立实验(n＝10个细胞/组，学生‘t’检验，ns)的每个珠周围的200μ2区域中定量平均pMLC强度+/-s.d.。结果显示MMP12是Agrin的机械感知的下游效应物。
图13示出了MMP1和MMP10的耗竭对伤口愈合和细胞机械张力的影响。(a)RT-PCR分析证实HaCaT细胞中MMP1和MMP10的抑制。对对照、MMP1和MMP10耗竭的HaCaT和用10μg/mlsAgrin预处理18小时的那些进行刮擦伤口测定。在指定的时间点呈现显示相对迁移的代表性明视场图像。使用ImageJ定量平均未迁移面积+/-s.d.(n＝3，学生‘t’检验，p值如图所示)。比例尺：50μm。(b)比较单独的或用10μg/ml sAgrin处理的指定敲低细胞在创伤后15小时的迁移速度(n＝4，学生‘t’检验，分别为****p＝0.00001、****p＝0.0001、**p＝0.001)。(c)RT-PCR分析显示在HaCaT细胞中创伤后指定时间点MMP1和MMP10的mRNA表达。(d)刮擦对照、MMP1和MMP10耗竭的HaCaT细胞并使其迁移4小时。随后将细胞固定并针对pMLC和F-肌动蛋白进行免疫染色。示出了代表性的共聚焦图像。用DAPI对细胞核进行复染。白色箭头指示前缘处的肌动球蛋白缆线。比例尺：10μm。(e)对照、MMP1和MMP10耗竭的HaCaT细胞在大的十字图案上铺板6小时。随后将细胞固定并针对pMLC和F-肌动蛋白染色，用DAPI标记细胞核。白色箭头指代pMLC富集的横向弧。将富集了pMLC的相关应力曲率定量为来自三个独立实验的平均值+/-s.d.(n＝6个细胞/组，学生‘t’检验，分别为p＝0.5和p＝0.16)。结果显示MMP1和MMP10的耗竭损害伤口愈合而不影响细胞机械张力。
图14显示Agrin对MMP12表达、细胞力学和集体流体迁移的影响。(a)通过Western印迹来分析对照和Agrin siRNA处理的细胞的细胞裂解物的MMP12和Agrin表达。肌动蛋白和GAPDH分别用作上样对照。(b)明胶和酪蛋白酶谱法检测对照和Agrin耗竭的HaCaT细胞上清液中MMP12的催化活性。通过明胶(左)或酪蛋白(右)凝胶内消化来分析对照、单独AgrinsiRNA处理的或用增加剂量的sAgrin处理24小时的细胞上清液的MMP12催化活性。MMP12条带(～54KDa)的出现是MMP12的明胶消化结果。示出了来自三个独立实验之一的代表性图像。使用ImageJ定量相对MMP12条带强度(n＝3，学生‘t’检验，分别为*p＝0.02和0.03，多重t检验，p值如图所示)。(c)在伤口损伤后0h和24h检测迁移的HaCaT中的MMP12 mRNA的RT-PCR分析。数据表示为平均值+/-s.d.。创伤指定的细胞并使其迁移。在指定的时间点，收集来自迁移细胞的细胞裂解物并通过Western印迹分析MMP12。GAPDH用作上样对照。(d)汇合的HaCaT细胞不做处理或用sAgrin(10μg/ml)预处理18小时，然后刮擦并使其迁移6小时。在指定的时间点，将细胞固定并分别针对MMP12和Agrin进行免疫染色。示出了代表性的共聚焦图像。白色箭头指示迁移边缘处的前导细胞。比例尺：10μm。(e)对照和Agrin耗竭的小鼠皮肤切片的代表性共聚焦显微图像，显示伤口边缘处的MMP12表达。白色虚线表示迁移的上皮舌。细胞核用DAPI复染。比例尺：50μm。(f)显示在固定物条件下第4天对照和Agrin耗竭的小鼠皮肤组织上的MMP12水平的Western印迹分析。GAPDH用作上样对照。(g)对照和Agrin耗竭的HaCaT细胞在硬基底上培养。在含有20μg/ml sAgrin的硬基底上培养一批Agrin耗竭的细胞。Western印迹证实HaCaT细胞中MMP12表达的损失。GAPDH用作上样对照。汇合后，刮擦细胞并使其迁移4小时。然后将细胞固定并针对K17进行免疫染色。虚线表示迁移前沿。前导细胞中的K17强度定量为来自两个独立实验的平均值+/-s.d.(n＝20-30个细胞，学生‘t’检验，分别为*p＝0.009和0.04)。(h-i)HaCaT细胞未处理或用10μg/ml sAgrin预处理18小时。随后，将细胞用溶剂(DMSO)或5nM MMP408抑制剂预处理2小时，然后创伤它们并使它们在溶剂或抑制剂存在下再迁移4小时。示出了显示K17和用DAPI(g)染色的细胞核的共聚焦图像。白色虚线表示迁移前沿。比例尺：10μm。指定时间的明视场显微图像显示迁移的细胞(h)。使用ImageJ根据三个独立实验定量未覆盖的伤口面积，表示为平均值+/-s.d.(学生‘t’检验，*p<0.05、**p<0.005)。比例尺：50μm。(j)共聚焦图像显示自存在DMSO或5nM MMP408下在单独的软ECM上或补充有sAgrin的那些上培养5天的小鼠皮肤外植体生长的K17免疫染色长出(n＝2个独立实验，每组3个皮肤外植体)。白色虚线表示长出区域。比例尺：50μm。(k)将对照和MMP12耗竭的HaCaT细胞接板在大的FN包被的微图案上4-6小时。此外，将一批MMP12耗竭的细胞接板在含有20μg/ml sAgrin的FN图案上4-6小时。随后将细胞固定并针对pMLC和F-肌动蛋白染色，用DAPI标记细胞核。白色箭头指代pMLC富集的横向弧。将富集了pMLC的相关应力曲率定量为来自三个独立实验的平均值+/-s.d.(n＝15-20个细胞/组，学生‘t’检验，**p＝0.001-0.004)。比例尺：10μm。(l)在对照、MMP12耗竭的和用sAgrin处理的MMP12敲低的原代小鼠角质形成细胞中细胞硬度的AFM计算(n＝来自三次重复分析的10-15个细胞，学生‘t’检验，*p＝0.01)。(m)在对照、MMP12敲低细胞和用sAgrin处理的细胞的集体迁移期间流体速度的PIV分析。显示了来自三个独立实验中的一个的结果。绿色箭头表示速度矢量。比例尺：100μm。迁移速度量化为来自四个独立实验的平均值+/-s.d.(学生‘t’检验，***p<0.0001)。Agrin调节的MMP12加强了细胞力学和集体流体迁移。
图15显示小鼠皮肤中MMP12的敲低。(a)用对照或MMP12特异性siRNA处理小鼠。三天后，在存在或不存在200μg sAgrin的情况下收集皮肤组织，并对MMP12水平进行Western印迹。GAPDH用作上样对照。(b)在伤口损伤后第10天，与(a)中相同处理的小鼠的皮肤组织的共聚焦成像。白色虚线表示表皮和真皮边界。比例尺：10μm。
图16示出了研究MMP12耗竭在Agrin诱导的伤口愈合中的作用的测定结果。(a)对照siRNA或小鼠特异性MMP12 siRNA注射在小鼠皮肤上的预期伤口部位。三天后，创伤该部位，并且在存在或不存在200μgsAgrin的情况下，每隔一天将含有对照或MMP12 siRNA的基于Aquaphore的软膏施加在有固定物的伤口上。呈现了在指定天数的小鼠皮肤伤口的照片。比例尺：1mm。在指定的天数定量伤口直径(每组n＝3-4只小鼠，ANOVA，分别为*p＝0.007、*p＝0.01、***p＝0.0001)。(b)在创伤后第10天接受如图(a)中的siRNA组合处理的小鼠皮肤的代表性苏木精和伊红染色切片。由黑色箭头编码的区域表示未愈合区域。比例尺：100μm。(c)代表性共聚焦图像显示在不存在或存在sAgrin处理的情况下对照和MMP12耗竭的小鼠皮肤中的pMLC染色。比例尺：10μm。使用Zeiss Fluoview定量pMLC强度(每组n＝3个独立的小鼠切片，学生‘t’检验，分别为*p＝0.01、**p＝0.005和0.002)。(d)创伤后第10天指定小鼠皮肤切片的天狼猩红染色图像。呈现了代表性的明视场和偏振视图。比例尺：100μm。WB表示伤口床。使用ImageJ进行各类型的胶原纤维的分布并以图形方式呈现(n＝3个切片/组，学生‘t’检验，p值呈现在表中)。(e)在损伤后10天，在存在或不存在sAgrin处理的情况下，在对照和MMP12缺陷小鼠皮肤伤口床中通过CD-31免疫组织化学分析检测血管生成。血管的数量及其直径以图形方式呈现为平均值+/-s.d.(每组n＝3只小鼠，分析来自每组三只小鼠的每张图像的30-60个血管，ANOVA，*p＝0.02，多重t检验，分别为*p＝0.02，p＝0.01，p＝0.008，**p＝0.0009)。结果表明，MMP12是体内sAgrin诱导的伤口愈合所需的。
图17示出了研究sAgrin是否可以用作生物添加剂皮肤伤口愈合材料的测定结果。(a)用作生物添加剂的C-末端Agrin片段的蛋白质序列。纯化的sAgrin的凝胶过滤图。在考马斯染色的凝胶中并通过使用Agrin抗体的Western印迹来测试重组sAgrin。(b)用递增浓度的sAgrin处理小鼠角质形成细胞指定天数的BrDu增殖测定(n＝3个实验，学生‘t’检验，分别为**p＝0.001和*p＝0.01)。(c)对用递增剂量的sAgrin处理的HaCaT/小鼠角质形成细胞进行刮擦伤口测定。在创伤后的指定时间显示代表性明视场图像。比例尺：20μm。使用ImageJ定量所得的未覆盖的伤口面积，表示为平均值+/-s.d.(n＝3，学生‘t’检验，*p<0.01)。(d)刮擦未处理的或sAgrin(10μg/ml)HaCaT细胞并使其迁移4小时。随后，将细胞固定并针对K17进行免疫染色，并用DAPI对细胞核进行染色。呈现了代表性的共聚焦图像。白色箭头指向迁移方向。白色虚线表示迁移前沿。比例尺：10μm。(e)显示来自在单独的软基底上或补充有sAgrin(20μg/ml)的软基底上培养5天的小鼠皮肤外植体的K17染色的共聚焦图像。Ex是指外植体，Ex周围的虚线表示外植体的边界。虚线之间的区域分别表示长出区域。比例尺：50μm。实验进行三次，每组三个外植体。(f)将Agrin耗竭的HaCaT用sAgrin或FN包被的珠处理30分钟，然后将其创伤。将细胞单独放置或置于磁力下并使其迁移30分钟，然后将它们固定并针对MMP12和pMLC进行免疫染色。细胞核用DAPI复染。示出了代表性的共聚焦图像(n＝2个实验重复)。比例尺：10μm。(g)每2-3天将含有200μg BSA(对照)或增加量的sAgrin的基于凡士林的软膏局部施用于小鼠皮肤的穿孔伤口。在指定的天数显示经处理的小鼠伤口区域的代表性照片。比例尺：1mm。在指定的天数测量伤口的相对直径，并表示为根据一个实验图形表示的平均值+/-s.d.(n＝3只小鼠/组，单因素ANOVA，分别为*p<0.04，**p<0.004)。(h)在损伤后第7天，BSA或sAgrin处理的小鼠皮肤的Ki67染色切片。使用ImageJ定量增殖细胞的程度(n＝从两个独立的小鼠伤口分析的3个切片，学生‘t’检验，*p＝0.01)。(i)在创伤后第7天，BSA和sAgrin处理的小鼠皮肤切片(无固定物模型)的天狼猩红染色图像。呈现了代表性的明视场和偏振视图。比例尺：100μm。白色箭头表示未愈合区域。使用ImageJ进行各类型胶原纤维的定量(每组分析n＝3个切片，学生‘t’检验，分别为*p＝0.01和0.05)。结果表明，sAgrin在体外和体内加速伤口愈合，其可作为伤口愈合生物材料而具有临床相关性。
图18示出了研究基于Agrin的局部生物材料对皮肤伤口愈合的影响的测定结果。(a-b)每两天将掺入BSA或Agrin(200μg)的基于Pluronic-F-127的软膏施用于小鼠的穿孔伤口。接受指定软膏的伤口在图中保持未覆盖(a-未用固定物固定)。对于图b，将200μg鼠尾胶原蛋白与sAgrin和BSA一起用作另外的对照。用10mm透明尼龙固定物系住伤口，并用Tegaderm(固定物)覆盖所施用的软膏。代表性照片分别显示接受上述处理的小鼠中的穿孔伤口区域。比例尺：1mm。自伤口产生以来随时间作图的平均伤口面积+/-s.d.(每组n＝4只小鼠，ANOVA，分别为p<0.0001，p＝0.001，p＝0.0001)。(c)在损伤后第2天，对照和Agrin处理的伤口边缘的苏木精和伊红染色的明视场图像。星号(*)表示在伤口边缘处形成上皮舌的迁移角质形成细胞。双向黑色箭头(无固定物)显示创伤后第2天迁移的角质形成细胞的长度。黑色箭头(有固定物)表示在创伤后第10天未愈合的区域。比例尺：100μm。(d-)显示了在无固定物条件(第2天)或有固定物条件(第7天)下接受BSA、胶原蛋白或sAgrin处理的小鼠皮肤伤口中K17表达占据率的免疫荧光共聚焦图像。相对K17强度以图形形式显示(n＝由每组3只小鼠分析的3-6个切片，学生‘t’检验，分别为*p＝0.01、**p＝0.005、***p＝0.0001)。(e-f)显示在损伤后第2天(在无固定物模型中)或第7天(固定物模型)接受BSA、胶原蛋白或Agrin软膏的小鼠皮肤的伤口边缘内和伤口床处的MMP12(e)和pMLC(f)的代表性共聚焦免疫荧光图像。相对染色强度表示为来自三只小鼠的三至四个切片的平均值+/-s.d.(学生‘t’检验，分别为*p＝0.02、p＝0.04、p＝0.03、p＝0.01和***p＝0.001)。比例尺：100μm。白色虚线表示迁移表皮的厚度，而白色实线将角质形成细胞与下方的真皮区域分开。(g)在创伤后第10天，BSA、胶原蛋白和sAgrin处理的小鼠皮肤切片(固定物模型)的天狼猩红染色图像。呈现了代表性的明视场和偏振视图。比例尺：100μm。WB表示伤口床。白色箭头表示未愈合区域。使用ImageJ进行各个类型的胶原纤维的定量(n＝每组三只小鼠所分析的3个切片，学生‘t’检验，p值显示在图中)。(h)在无固定物和固定物条件下，在损伤后的指定天数，BSA、胶原蛋白和Agrin处理的小鼠皮肤伤口床中的CD-31免疫组织化学分析。箭头表示血管。血管的数量及其直径以图示方式表示为平均值+/-s.d.。(n＝从每组三只小鼠分析5-10个切片，学生‘t’检验，分别为*p＝0.01，*p＝0.04，ANOVA*p＝0.02，和***p＝0.0001)。结果表明，基于Agrin的局部生物材料加速了皮肤伤口愈合。
图19示出了在伤口愈合的早期阶段期间由sAgrin诱导的促炎蛋白的概况。(a)显示在接受BSA、胶原蛋白或sAgrin处理的小鼠皮肤中创伤后4小时和48小时通常诱导的细胞因子和趋化因子的mRNA表达的热图。以上示出了每种条件的代表性伤口的照片。所选显著基因的组的相应p值以表格形式表示(n＝3只小鼠/组，多重t检验)。(b)如(a)中处理的小鼠皮肤中的Western印迹分析，显示所选蛋白质的蛋白质表达。GAPDH用作上样对照(每组分析n＝2个独立的小鼠伤口)。
图20显示研究Agrin对血管生成的影响的测定结果。(a)对照和Agrin siRNA处理的BJ-GFP细胞和用细胞追踪蓝标记18小时的HDMEC中的Western印迹分析。GAPDH用作上样对照。将如图(a)中处理的细胞共培养24小时以形成球状体。对于每种指定条件示出生芽的明视场图像。相应的成纤维细胞和HDMEC球状体分别由绿色和蓝色荧光描绘。比例尺：100μm。使用ImageJ定量生芽(每种条件n＝3个球状体，学生‘t’检验，分别为*p＝0.05和p＝0.02)。结果显示Agrin通过促进真皮成纤维细胞和内皮细胞之间的相互作用来介导血管生成。
图21示出了解释了伤口损伤触发的Agrin微环境有利于有成效的愈合程序的工作模型。简而言之，Agrin使受伤细胞对ECM刚度、力识别和几何约束敏感，从而导致改善的牵引应力、弹性和细胞骨架张力，以促进在创伤部位上产生增强的流体样动力学集体迁移。此外，Agrin部署MMP12作为其下游效应物，以在角质形成细胞迁移期间强化角质形成细胞的机械感知(mechanoperception)和肌动球蛋白完整性。Agrin驱动的机械感受态伤口愈合微环境的累积结果通过促进再上皮化(re-epithelialization)、最佳ECM沉积和血管生成而产生更高的集体迁移和伤口闭合。
图22示出了用于对创伤后共同迁移的细胞中的牵引力进行成像的实验设置。(a)示出了3D打印的模具和浇铸的水凝胶块的图像。(b)图像示出了聚丙烯酰胺块在玻璃底培养皿上用于制造人工伤口的预期用途。
具体实施方式
伤口愈合的阶段以有组织的方式进行，并遵循四个过程：止血、炎症、增殖和成熟。止血是通过凝血闭合伤口的过程。炎症是伤口愈合的第二阶段，它控制出血并防止感染。增殖是用由胶原蛋白和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)构成的新组织重建伤口的阶段。成熟阶段是当胶原蛋白从III型重塑为I型并且伤口完全闭合的阶段。增殖阶段包括血管生成、纤维增生和肉芽组织形成、胶原蛋白沉积、再上皮化和收缩，并且是伤口愈合的关键阶段。再上皮化是增殖阶段的关键步骤。角质形成细胞是负责再上皮化的主要细胞。伤口边缘处的活化角质形成细胞迁移穿过伤口床，直至上皮舌在伤口中心相遇。由此，角质形成细胞分化以形成新的皮肤屏障。在表皮受伤时，伤口边缘处的角质形成细胞经历从非能动的上皮状态到间充质样状态(mesenchymal-like state)的转变，在间充质样状态中，它们失去细胞-细胞接触并变得能动。迁移细胞重新组织其肌动蛋白细胞骨架并分泌蛋白酶以重塑ECM并使其能够迁移穿过伤口。在迁移细胞的正后方，角质形成细胞快速增殖以提供足够的细胞来覆盖伤口。不愈合伤口的特征在于有缺陷的角质形成细胞迁移，结果是再上皮化无法发生。
在本公开中已经示出，在机械损伤后，在皮肤的表皮层和真皮层内显著触发了Agrin表达，并且补充sAgrin(Agrin的C-末端重组蛋白片段，其具有与其受体脂蛋白相关受体-4(LRP4)和整联蛋白的结合位点)显著挽救了伤口愈合和角质形成细胞的迁移。因此，在第一方面，本发明涉及包含Agrin片段或其衍生物的药物组合物，其中Agrin片段或其衍生物包含Agrin的LG3结构域和在LG3结构域的z位点处的八氨基酸插入物ELANEIPV(SEQ IDNO:1)。如上定义的Agrin片段或其衍生物含有与脂蛋白相关受体-4(LRP4)和整联蛋白的结合位点。
在一些实例中，Agrin片段或其衍生物还包含Agrin的LG2结构域。
Agrin是分子量为400-600kDa的大的乙酰肝素蛋白聚糖。Agrin的蛋白质核心由约2000个氨基酸组成，质量为约225kDa。Agrin是由9个K(kunitz型)结构域、2个LE(层粘连蛋白-EGF样)结构域、1个SEA(精子蛋白、肠激酶和agrin)结构域、4个EG(表皮生长因子样)结构域和3个LG(层粘连蛋白球状)结构域构成的多结构域蛋白。Agrin以几种剪接变体存在，并且可被表达为含有N-末端NtA(N-末端Agrin)结构域的分泌蛋白，其是Agrin的最丰富形式。Agrin的C-末端的75kDa部分以第一个EG结构域起始。Agrin的相互作用配偶体(包括α-肌营养不良蛋白聚糖、肝素、一些整联蛋白和LRP4)的数个结合位点被定位到C-末端区域。在人Agrin的C-末端部分中，存在两个选择性剪接位点y和z。y位点位于LG2结构域内，z位点位于LG3结构域内。在y位点处，可以存在0、4、17或21(4+17)个氨基酸的插入物；而在z位点处，可以存在0、8、11或19(8+11)个氨基酸的插入物。
脂蛋白受体相关蛋白4(Lipoprotein receptor-related protein 4，LRP-4)，也称为低密度脂蛋白受体相关蛋白4，是人中由LRP4基因编码的蛋白。LRP-4是脂蛋白受体相关蛋白家族的成员，并且可以是Wnt信号转导的调节剂。
整联蛋白是促进细胞-细胞和细胞-ECM粘附的跨膜受体。在配体结合后，整联蛋白激活信号转导通路，所述信号转导通路介导诸如细胞周期的调节、细胞内细胞骨架的组织化和新受体向细胞膜的移动等细胞信号。整联蛋白的存在允许对细胞表面处的事件进行快速和灵活的响应。
如本文所用的术语“LG2”和“LG3”是指Agrin的第二和第三层粘连蛋白球状结构域。LG2和LG3应涵盖这些结构域的所有可能的不同剪接变体。在一个实例中，在y位点没有任何插入的Agrin的LG2结构域具有序列：
PFLADFNGFSHLELRGLHTFARDLGEKMALEVVFLARGPSGLLLYNGQKTDGKGDFVSLALRDRRLEFRYDLGKGAAVIRSREPVTLGAWTRVSLERNGRKGALRVGDGPRVLGESPVPHTVLNLKEPLYVGGAPDFSKLARAAAVSSGFDGAIQLVSLGGRQLLTPEHVLRQVDVTSFAGHPC(SEQ ID NO：2)。在一个实例中，在y位点具有4个氨基酸的插入物的Agrin的LG2结构域具有序列：
PFLADFNGFSHLELRGLHTFARDLGEKMALEVVFLARGPSGLLLYNGQKTDGKGDFVSLALRDRRLEFRYDLGKGAAVIRSREPVTLGAWTRVSLERNGRKGALRVGDGPRVLGESPVPKSRKHTVLNLKEPLYVGGAPDFSKLARAAAVSSGFDGAIQLVSLGGRQLLTPEHVLRQVDVTSFAGHPC(SEQ ID NO：3)，其中插入物的序列是KSRK(SEQ ID NO：4)。在上述LG2结构域中，y位点起始于P(脯氨酸)119。在一个实例中，如本文所述的Agrin片段或衍生物包含在y位点没有任何插入的Agrin的LG2结构域。在一个实例中，在z位点处没有任何插入的Agrin的LG3结构域具有序列：
EYLNAVTESEKALQSNHFELSLRTEATQGLVLWSGKATERADYVALAIVDGHLQLSYNLGSQPVVLRSTVPVNTNRWLRVVAHREQREGSLQVGNEAPVTGSSPLGATQLDTDGALWLGGLPELPVGPALPKAYGTGFVGCLRDVVVGRHPLHLLEDAVTKPELRPC(SEQ ID NO：5)。在另一个实例中，在z位点具有8个氨基酸的插入物的Agrin的LG3结构域具有序列：
EYLNAVTESELANEIPVEKALQSNHFELSLRTEATQGLVLWSGKATERADYVALAIVDGHLQLSYNLGSQPVVLRSTVPVNTNRWLRVVAHREQREGSLQVGNEAPVTGSSPLGATQLDTDGALWLGGLPELPVGPALPKAYGTGFVGCLRDVVVGRHPLHLLEDAVTKPELRPC(SEQ ID NO：6)，其中插入物的序列是ELANEIPV(SEQID NO：1)。在上述LG3结构域中，z位点在S(丝氨酸)9和E(谷氨酸)10之间。在一些实例中，包含Agrin的LG3结构域和LG3结构域的z位点处的八氨基酸插入物的Agrin片段或其衍生物具有以下序列：DTLAFDGRTFVEYLNAVTESELANEIPVEKALQSNHFELSLRTEATQGLVLWSGKATERADYVALAIVDGHLQLSYNLGSQPVVLRSTVPVNTNRWLRVVAHREQREGSLQVGNEAPVTGSSPLGATQLDTDGALWLGGLPELPVGPALPKAYGTGFVGCLRDVVVGRHPLHLLEDAVTKPELRPCPTP(SEQ ID NO：7)。
在一些实例中，包含Agrin的LG2和LG3结构域和LG3结构域的z位点处的八氨基酸插入物的Agrin片段或其衍生物具有以下序列：
Figure BDA0004032299190000252
由于不影响生物活性的其他序列变异是可能的，因此本发明不应限于所示序列的结构域LG2和LG3的不同剪接变体。在一些实例中，Agrin片段或其衍生物包含与本文提供的示例性LG2和/或LG3结构域序列具有至少约60％、或至少约65％、或至少约70％、或至少约75％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的序列。
如本文所用的术语“衍生物”是指通过修饰从基础序列衍生的多肽，所述修饰包括氨基酸缺失或向多肽或变体添加氨基酸以及对侧链进行修饰，其中所述衍生物保留基础蛋白质的活性。所得衍生物将与原始多肽的基础序列保留至少约60％、或至少约65％、或至少约70％、或至少约75％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％的同源性。该衍生物还将表现出与未经修饰的多肽在性质上相似的效果。
在一些实例中，Agrin片段或其衍生物额外地包含至少一个天然存在于Agrin中的另外的结构域，包括但不限于LG1和EGF样结构域EG1-4。LG1和EG1-4结构域的示例性序列如下：LG1结构域：APVPAFEGRSFLAFPTLRAYHTLRLALEFRALEPQGLLLYNGNARGKDFLALALLDGRVQLRFDTGSGPAVLTSAVPVEPGQWHRLELSRHWRRGTLSVDGETPVLGESPSGTDGLNLDTDLFVGGVPEDQAAVALERTFVGAGLRGCIRLLDVNNQRLELGIGPGAATRGSGVGEC(SEQ ID NO：9)。EG1结构域：PPKPCDSQPCFHGGTCQDWALGGGFTCSCPAGRGGAVCE(SEQ ID NO：10)。EG2结构域：GDHPCLPNPCHGGAPCQNLEAGRFHCQCPPGRVGPTCA(SEQ ID NO：11)。EG3结构域：EKSPCQPNPCHGAAPCRVLPEGGAQCECPLGREGTFCQ(SEQ ID NO：12)。EG4结构域：AGHPCTRASGHPCLNGASCVPREAAYVCLCPGGFSGPHCE(SEQ ID NO：13)。
Agrin片段或其衍生物可以通过本领域公知的常规重组工程改造获得，并在本公开的工作实施例中举例说明。总之，编码Agrin片段或其衍生物的核酸分子在合适的表达系统中表达，随后纯化所得蛋白质。因此，在一些实例中，提供了编码本文公开的Agrin片段或其衍生物的核酸分子。在一个实例中，编码包含LG3结构域和在z位点处的8个氨基酸插入物的Agrin片段或其衍生物的核酸分子具有以下序列：CATATGGACACCCTGGCGTTCGATGGTCGTACCTTTGTTGAGTACCTGAACGCGGTGACCGAGAGCGAACTGGCGAACGAGATCCCGGTTGAAAAGGCGCTGCAGAGCAACCACTTCGAGCTGAGCCTGCGTACCGAAGCGACCCAAGGTCTGGTGCTGTGGAGCGGCAAAGCGACCGAACGTGCGGACTACGTTGCGCTGGCGATTGTGGATGGTCACCTGCAGCTGAGCTATAACCTGGGCAGCCAACCGGTGGTTCTGCGTAGCACCGTTCCGGTGAACACCAACCGTTGGCTGCGTGTGGTTGCGCACCGTGAGCAGCGTGAAGGTAGCCTGCAAGTTGGCAACGAAGCGCCGGTGACCGGTAGCAGCCCGCTGGGTGCGACCCAGCTGGACACCGATGGTGCGCTGTGGCTGGGTGGCCTGCCGGAACTGCCGGTTGGTCCGGCGCTGCCGAAGGCGTATGGTACCGGCTTTGTGGGTTGCCTGCGTGACGTGGTTGTTGGTCGTCACCCGCTGCACCTGCTGGAGGATGCGGTTACCAAACCGGAACTGCGTCCGTGCCCGACCCCGTAAGGATCC(SEQ ID NO：14)。在一个实例中，编码包含LG2结构域、LG3结构域和z-位点处的8个氨基酸插入物的Agrin片段或其衍生物的核酸分子具有以下序列：CATATGCTGGGTCGTGAGGGCACCTTCTGCCAAACCGCGAGCGGTCAAGATGGTAGCGGTCCGTTTCTGGCGGATTTCAACGGTTTTAGCCACCTGGAACTGCGTGGCCTGCACACCTTCGCGCGTGACCTGGGCGAGAAGATGGCGCTGGAAGTGGTTTTTCTGGCGCGTGGTCCGAGCGGTCTGCTGCTGTACAACGGCCAGAAGACCGACGGTAAAGGCGATTTCGTTAGCCTGGCGCTGCGTGACCGTCGTCTGGAGTTTCGTTATGATCTGGGTAAAGGTGCTGCGGTTATTCGTAGCCGTGAGCCGGTGACCCTGGGTGCGTGGACCCGTGTGAGCCTGGAACGTAACGGTCGTAAGGGTGCGCTGCGTGTTGGTGATGGTCCGCGTGTGCTGGGCGAGAGCCCGGTTCCGCACACCGTGCTGAACCTGAAGGAACCGCTGTACGTTGGTGGCGCGCCGGACTTCAGCAAGCTGGCGCGTGCGGCGGCGGTTAGCAGCGGTTTTGATGGCGCGATTCAGCTGGTTAGCCTGGGTGGCCGTCAACTGCTGACCCCGGAGCACGTGCTGCGTCAAGTTGACGTTACCAGCTTTGCGGGTCACCCGTGCACCCGTGCGAGCGGTCATCCGTGCCTGAACGGTGCGAGCTGCGTTCCGCGTGAAGCGGCGTACGTGTGCCTGTGCCCGGGTGGCTTTAGCGGTCCGCACTGCGAGAAGGGTCTGGTGGAGAAGAGCGCGGGTGACGTGGATACCCTGGCGTTCGATGGCCGTACCTTTGTTGAGTATCTGAACGCGGTGACCGAGAGCGAACTGGCGAACGAGATCCCGGTTGAAAAGGCGCTGCAGAGCAACCACTTCGAGCTGAGCCTGCGTACCGAAGCGACCCAAGGTCTGGTGCTGTGGAGCGGCAAAGCGACCGAACGTGCGGACTACGTTGCGCTGGCGATTGTGGATGGTCACCTGCAGCTGAGCTATAACCTGGGCAGCCAACCGGTGGTTCTGCGTAGCACCGTTCCGGTGAACACCAACCGTTGGCTGCGTGTGGTTGCGCACCGTGAGCAGCGTGAAGGTAGCCTGCAAGTTGGCAACGAAGCGCCGGTGACCGGTAGCAGCCCGCTGGGTGCGACCCAGCTGGACACCGATGGTGCGCTGTGGCTGGGTGGCCTGCCGGAACTGCCGGTTGGTCCGGCGCTGCCGAAGGCGTATGGTACCGGCTTTGTGGGTTGCCTGCGTGACGTGGTTGTTGGTCGTCACCCGCTGCACCTGCTGGAGGATGCGGTTACCAAACCGGAACTGCGTCCGTGCCCGACCCCGTAAGGATCC(SEQ ID NO：15)。
在一些实例中，提供了包含编码本文公开的Agrin片段或其衍生物的核酸分子的载体。如本文所用的术语“载体”包括可用于表达其中包含的DNA序列的载体，其中此类DNA序列与能够实现其表达的其他序列(例如，启动子/操纵子序列)可操作地连接。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是“质粒”的形式，“质粒”是指载体形式的不与染色体结合的环状双链DNA环。本领域已知的多种表达载体可用于获得包含编码本文公开的Agrin片段或其衍生物的核酸分子的载体，包括但不限于细菌表达载体，例如pET28、pUC19、pBR327、pBR322、pET3a、pEXP4-DEST、pSP72、pET SUMO、pBAD TOPO、pGEX-4T2、pQE-30和pACYC177载体，以及哺乳动物表达载体，例如pACT、pBIND、pG5luc、pTNT、pTarget、pReg neo、pCat3-Basic、pSI、pcDBA和pCMV载体。在一个实例中，表达载体是pET28载体。在一个具体实例中，表达载体是含有His标签的pET28载体。
本公开还提供了包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码本文公开的Agrin片段或其衍生物的核酸分子。数种原核和真核表达系统适用于产生如本文公开的Agrin片段或其衍生物。原核表达系统包括但不限于在大肠杆菌(E.coli)中的表达。真核表达系统包括在小鼠骨髓瘤细胞中的表达、在昆虫细胞中的杆状病毒介导的表达以及在人胚肾(HEK)细胞中的表达、在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的瞬时表达和在巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)中的稳定表达。这些系统具有以下优点：它们可以容易地适应无血清条件以减少上清液中污染蛋白质的量，并且可以适应大规模生产。此外，可以使用多种细胞系，包括HEK293T和HEK293细胞、COS细胞、CHO细胞、HeLa细胞、H9细胞、Jurkat细胞、NIH3T3细胞、C127细胞、CV1细胞、CAP细胞或SF细胞。因此，在一个实例中，本公开提供了包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码本文公开的Agrin片段或其衍生物的核酸分子。在一个具体实例中，宿主细胞是大肠杆菌细胞。本公开还提供了一种产生如本文公开的Agrin片段或其衍生物的方法，该方法包括培养如本文公开的宿主细胞以表达Agrin片段或其衍生物，并收获产生的Agrin片段或其衍生物。在一些实例中，该方法还包括纯化获得的Agrin片段或其衍生物。
为了纯化获得的Agrin片段或其衍生物，可以应用标准蛋白质纯化技术。His标记的蛋白质可以使用IMAC纯化，并且离子交换色谱或使用肝素柱的亲和纯化也可以使用。还可以使用通过针对Agrin的C-末端部分产生的抗体进行纯化。然后可以使用例如羟基磷灰石柱或通过凝胶过滤进一步纯化洗脱的蛋白质。
本申请中公开的Agrin片段或其衍生物可以是分泌形式或跨膜形式。在一些实例中，Agrin片段或其衍生物是分泌形式。在一些实例中，Agrin片段或其衍生物是可溶性的。
本申请中公开的Agrin片段或其衍生物可以是任何来源的。在一些实例中，Agrin片段或其衍生物来源于人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊或其他哺乳动物物种。在一些具体实例中，Agrin片段或其衍生物来源于人或小鼠。
在一些实例中，本文公开的药物组合物包含约0.01％至约25％、或约0.01％至约10％、或约0.03％至约1％、或约0.03％至约5％、或约1％至约10％w/v、或约6％、8％、10％、15％或20％w/v的Agrin片段或其衍生物。
在一些实例中，本文公开的药物组合物还包含其他协同作用于伤口以促进伤口愈合或伤口闭合或治疗不愈合伤口的活性剂。
在一些实例中，药物组合物还包含药学上可接受的载剂和/或其他药学上可接受的惰性试剂。
如本文所用的术语“药学上可接受的”是指适合于药物施用而没有过度毒性、不相容性、不稳定性、刺激性、过敏反应等的成分、试剂或组合物。
如本文所用的术语“载剂”是指与Agrin片段或其衍生物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂、媒介物和其他惰性试剂。
药学上可接受的载剂的实例包括但不限于糖、淀粉、纤维素、赋形剂、油、乙二醇、多元醇、酯、琼脂和缓冲剂。以上是载剂的非限制性实例。药学上可接受的载剂可以由本领域普通技术人员容易地配制。
赋形剂的实例包括但不限于溶剂、润肤剂和/或乳化剂、油性基质、防腐剂、抗氧化剂、张力调节剂、渗透增强剂和增溶剂、螯合剂、缓冲剂、表面活性剂、一种或多种聚合物及其组合。用于水性或亲水性局部制剂的合适溶剂包括水；乙醇；异丙醇；水和乙醇和/或异丙醇的混合物；甘油；乙二醇、丙二醇或丁二醇；DMSO；以及它们的混合物。用于疏水性局部制剂的合适溶剂包括矿物油、植物油和硅油。如果需要，可以将如本文所述的药物组合物溶解或分散在疏水油相中，然后可以将油相在包含单独的水或与低级醇、甘油和/或乙二醇组合的水的水相中乳化。合适的润肤剂包括烃油和蜡，例如矿物油、矿物脂(petrolatum)、石蜡、纯地蜡、地蜡、微晶蜡、聚乙烯、角鲨烯、全氢角鲨烯、硅油、甘油三酯、乙酰甘油酯，例如乙酰化甘油单酯；乙氧基化甘油酯，如乙氧基化单硬脂酸甘油酯；脂肪酸或二羧酸的烷基酯。用作润肤剂的合适的硅油包括二甲基聚硅氧烷、甲基(苯基)聚硅氧烷和水溶性和醇溶性硅氧烷二醇共聚物。用作润肤剂的合适的甘油三酯包括植物和动物脂肪和油，包括蓖麻油、红花油、棉籽油、玉米油、橄榄油、鱼肝油、杏仁油、鳄梨油、棕榈油、芝麻油和大豆油。适合用作润肤剂的羧酸或二元酸的酯包括脂肪酸的甲基酯、异丙基酯和丁基酯。烷基酯的具体实例包括月桂酸己酯、月桂酸异己酯、棕榈酸异己酯、棕榈酸异丙酯、油酸癸酯、油酸异癸酯、硬脂酸十六烷基酯、硬脂酸癸酯、异硬脂酸异丙酯、乳酸二月桂酯、乳酸肉豆蔻酯和乳酸鲸蜡酯；和脂肪酸的链烯基酯，如肉豆蔻酸油基酯、硬脂酸油基酯和油酸油基酯。二酸的烷基酯的具体实例包括己二酸二异丙酯、己二酸二异己酯、己二酸双(己基癸基)酯和癸二酸二异丙酯。可用于局部制剂的其它合适类别的润肤剂或乳化剂包括脂肪酸、脂肪醇、脂肪醇醚、乙氧基化脂肪醇、乙氧基化脂肪醇的脂肪酸酯和蜡。用作润肤剂的脂肪酸的具体实例包括壬酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、异硬脂酸、羟基硬脂酸、油酸、亚油酸、蓖麻油酸、花生酸、山嵛酸和芥酸。用作润肤剂的脂肪醇的具体实例包括月桂醇、肉豆蔻醇、鲸蜡醇、十六烷醇、硬脂醇、异硬脂醇、羟基硬脂醇、油醇、蓖麻油醇、山嵛醇和瓢儿菜醇，以及2-辛基十二烷醇。适合用作润肤剂的蜡的具体实例包括羊毛脂及其衍生物，包括羊毛脂油、羊毛脂蜡、羊毛脂醇、羊毛脂脂肪酸、羊毛脂酸异丙酯、乙氧基化羊毛脂、乙氧基化羊毛脂醇、乙氧基化胆固醇、丙氧基化羊毛脂醇、乙酰化羊毛脂、乙酰化羊毛脂醇、羊毛脂醇亚油酸酯、蓖麻酸羊毛脂醇酯(lanolin alcohols recinoleate)、蓖麻酸羊毛脂醇酯的乙酸酯、蓖麻酸羊毛脂醇酯的乙酸酯、乙氧基化醇酯的乙酸酯、羊毛脂的氢解物、氢化羊毛脂、乙氧基化氢化羊毛脂、乙氧基化山梨糖醇羊毛脂以及液体和半固体羊毛脂。还可用作蜡的包括烃蜡、酯蜡和酰胺蜡。可用的蜡包括蜡酯，诸如蜂蜡、鲸蜡、肉豆蔻酸肉豆蔻酯和硬脂酸硬脂酯；蜂蜡衍生物，例如聚氧乙烯山梨醇蜂蜡；和植物蜡，包括巴西棕榈蜡和小烛树蜡。多元醇和聚醚衍生物可用作局部制剂中的溶剂和/或表面活性剂。合适的多元醇和聚醚包括丙二醇、二丙二醇、聚丙二醇2000和4000、聚(氧乙烯共-氧丙烯)二醇、甘油、山梨糖醇、乙氧基化山梨糖醇、羟丙基山梨糖醇、聚乙二醇200-6000、甲氧基聚乙二醇350、550、750、2000和5000、聚[环氧乙烷]均聚物(100,000-5,000,000)、聚亚烷基二醇和衍生物、己二醇、2-甲基-2,4-戊二醇、1,3-丁二醇、1,2,6-己三醇、2-乙基-1,3-己二醇、具有15至18个碳原子的邻位二醇、以及三羟甲基丙烷的聚氧丙烯衍生物。多元醇酯可用作乳化剂或润肤剂。合适的多元醇酯包括乙二醇单和二脂肪酸酯、二甘醇单和二脂肪酸酯、聚乙二醇(200-6000)单和二脂肪酸酯、丙二醇单和二脂肪酸酯、聚丙二醇2000单油酸酯、聚丙二醇2000单硬脂酸酯、乙氧基化丙二醇单硬脂酸酯、甘油单和二脂肪酸酯、聚甘油聚脂肪酸酯、乙氧基化甘油单硬脂酸酯、1,3-丁二醇单硬脂酸酯、1,3-丁二醇二硬脂酸酯、聚氧乙烯多元醇脂肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯和聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯。用于局部制剂的合适乳化剂包括阴离子、阳离子、非离子和两性离子表面活性剂。优选的离子乳化剂包括磷脂，例如卵磷脂和衍生物。卵磷脂和其他磷脂可用于制备含有如本文所述的组合物的脂质体。当磷脂如卵磷脂置于水中并因此形成一个双层或一系列双层时，一旦提供足够的能量，则发生脂质囊泡的形成，每个双层被水分子分开。脂质体可以通过在水中超声处理磷脂来产生。低剪切速率产生多层脂质体。持续的高剪切超声处理倾向于形成较小的单层脂质体。疏水性化学物质可以溶解在磷脂双层膜中。脂质体的脂质双层通过与角质形成细胞的细胞膜融合而将如本文所述的组合物递送至角质形成细胞。甾醇，包括例如胆固醇和胆固醇脂肪酸酯；酰胺如脂肪酸酰胺、乙氧基化脂肪酸酰胺和脂肪酸链烷醇酰胺也可用作润肤剂和/或渗透促进剂。可用于与水性基质一起制备粘性凝胶或乳膏的合适的粘度增强剂或增稠剂包括聚丙烯酸钠、黄原胶、聚乙烯吡咯烷酮、丙烯酸聚合物、角叉菜胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙氧基化聚丙烯酰胺、聚乙氧基化丙烯酸酯和聚乙氧基化链烷硫醇。用于局部制剂的合适的防腐剂和/或抗氧化剂包括苯扎氯铵、苯甲醇、苯酚、脲、对羟基苯甲酸酯、丁羟基甲苯(BHT)、丁羟基苯甲醚5(BHA)、生育酚及其混合物。用于局部制剂的合适螯合剂包括乙二胺四乙酸、其碱金属盐、其碱土金属盐、其铵盐和其四烷基铵盐。载剂的pH优选为约4.0至10.0，更优选为约6.8至约7.8。可以使用缓冲溶液或其他pH调节剂来控制pH。合适的pH调节剂包括磷酸和/或磷酸盐、柠檬酸和/或柠檬酸盐、氢氧化物盐(即氢氧化钙、氢氧化钠、氢氧化钾)和胺，例如三乙醇胺。合适的缓冲溶液包括包含磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的溶液的缓冲液，保持pH在5.8和8之间；和缓冲液，其包含磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的溶液，保持pH在6和7.5之间。其它缓冲剂包括柠檬酸/柠檬酸钠，以及磷酸氢二钠/柠檬酸。
本文公开的药物组合物可以另外包含常规佐剂，例如丙酸、丙二醇、常规缓冲剂、防腐剂、亲水性乳化剂、亲脂性乳化剂、香料、润肤剂、除臭剂、保湿剂等。着色剂也可任选地加入本文公开的组合物中。应避免对伤口或周围皮肤有害的佐剂，以及可能与药物组合物反应和/或不利地降低药物组合物有效性的那些佐剂。
本文公开的药物组合物可以配制成广泛种类的待局部施用的制品，包括但不限于洗剂、乳膏、凝胶、棒、喷雾剂、软膏、乳液、糊剂、泡沫、粉末和成膜产品。这样的药物组合物可以配制用于定时控制的释放。如果将药物组合物配制成乳液，则乳液可具有连续的水相和不连续的非水相或油相(水包油乳液)，或连续的非水相或油相和不连续的水相(油包水乳液)。
在一些实例中，如本文公开的药物组合物还包含一种或多种防腐剂。防腐剂的实例包括但不限于螯合剂，例如EDTA、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)和儿茶素；苯甲酸钠；山梨酸钾；和硝酸钠。组合物可包含约0.01％至约5％，或约0.1％至约3％，或约0.015％至约1％，或约0.015％至约0.5％，或约0.01％至约0.1％，或约0.0225％至约0.1％w/v或约0.015％、0.225％或0.1％w/v的防腐剂。
本文提供的组合物还可以包含一种或多种抗微生物剂。抗微生物剂可以起到对抗可能阻碍愈合环境的任何细菌蛋白酶活性的作用，这允许伤口朝向最佳愈合状态发展。抗微生物剂的实例包括但不限于芦荟、ashitaba、噬菌体、β-防御素、季铵化合物、氯己定、铜、分散素B(dispersin B)、精油、庆大霉素、乳铁蛋白、溶葡萄球菌素、N-卤胺、一氧化氮、油酸、PLUNC、聚己缩胍双胍(polyhexanide biguanide，PHMB)、细菌素、硒、银化合物、三氯生、锌及其组合等组分。芦荟含有许多光化学化合物，包括但不限于单宁、皂苷、类黄酮和富马酸。如本文所用，术语“PLUNC”是指编码腭、肺、鼻上皮癌相关蛋白的基因或克隆以及该蛋白本身。季铵化合物的实例包括苄索氯铵和苯扎氯铵。β-防御素的实例是抗菌肽(cathelicidin)(LL-37)。银化合物的实例可包括胶体银、离子银、非离子银、氯化银、银纳米颗粒和磺胺嘧啶银。精油的实例包括但不限于肉桂油、丁香油、桉树油和茶树油。氯己定的实例是葡萄糖酸氯己定。组合物可包含约0.01％至约1％、或约0.05％至约1％、或约0.05％至约0.5％w/v的抗微生物剂。
本文公开的药物组合物还可以包含其他试剂，例如生长因子、细胞因子和蛋白酶抑制剂。生长因子的实例包括但不限于表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、血小板衍生生长因子(PDGF)、包括酸性成纤维细胞生长因子(α-FGF)和碱性成纤维细胞生长因子(β-FGF)的成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子-β(TGF-β)和胰岛素样生长因子(IGF-1和IGF-2)及其组合。
在一些实例中，如本文公开的药物组合物可以输注在载剂材料内、注射到载剂材料中、被载剂材料吸收、层铺在载剂材料上、包封在载剂材料内或涂覆在载剂材料上，所述载剂材料例如绷带、纱布、伤口敷料、粘性绷带、支架或水凝胶。载剂材料可以是生物可吸收的，例如包括聚乙醇酸、聚乳酸、聚二噁烷酮、聚羟基丁酸酯、聚羟戊酸酯(polyhydrozyvalerate)、聚氨基酸聚原酸酯、聚乙烯醇、胶原蛋白、明胶、壳聚糖、氧化再生纤维素、透明质酸、藻酸盐或其衍生物；或者可以是非生物可吸收的，例如包括聚氨酯、聚乙烯醇或纱布。载剂材料不同于药物组合物中使用的载剂和药学上可接受的载剂。
合适的载剂材料的实例包括但不限于：绷带、纱布、伤口敷料、粘性绷带、支架、水凝胶，特别是含有纤维素衍生物的水凝胶，所述纤维素衍生物包括羟乙基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素及其混合物；以及含有聚丙烯酸和明胶的水凝胶。上述载剂材料可以包括藻酸盐(作为增稠剂或刺激剂)、控制pH的缓冲剂(例如磷酸氢二钠/磷酸二氢钠)、调节渗透压的试剂(例如氯化钠)和稳定剂(例如EDTA)。
在一些具体实例中，载剂材料是水凝胶或支架。
如本文所用的术语“水凝胶”是指亲水性聚合物的三维(3D)网络。水凝胶通常可以吸收大量的流体，并且同时由于各个聚合物链的化学或物理交联而保持结构。在平衡状态下，水凝胶通常为60-90％的流体和仅10-30％的聚合物。在一些实例中，水凝胶的水含量为约70-80％。由于交联聚合物网络的固有生物相容性，水凝胶是特别有用的。可以通过交联亲水性生物聚合物或合成聚合物来制备水凝胶。通过亲水性生物聚合物的物理或化学交联形成的水凝胶的实例包括但不限于透明质酸、壳聚糖、藻酸盐、胶原蛋白、葡聚糖、果胶、角叉菜胶、聚赖氨酸、明胶或琼脂糖。这些材料由用直链或支链多糖或多肽制成的高分子量骨架链(framework chain)组成。
水凝胶非常类似于天然活细胞外基质。还可以通过掺入PLA、PLGA或PGA聚合物使水凝胶在体内可降解。此外，水凝胶可以用纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白修饰，或者例如用RGD进行表面修饰，这可以促进细胞粘附和增殖。此外，分子量、嵌段结构、可降解键和交联模式的改变可影响水凝胶的强度、弹性和降解性质。
水凝胶也可以用官能团修饰，用于共价连接多种蛋白质(例如胶原蛋白)或化合物(如治疗剂)。可以与基质结合的治疗剂包括但不限于镇痛剂、麻醉剂、抗真菌剂、抗生素、抗炎剂、驱肠虫剂、解毒剂、止吐剂、抗组胺剂、抗高血压剂、抗疟剂、抗微生物剂、抗精神病剂、退热剂、防腐剂、抗心律失常剂、抗结核剂、镇咳剂、抗病毒剂、心脏活性剂、泻剂、化学治疗剂、彩色或荧光成像剂、皮质类固醇(如类固醇)、抗抑郁剂、镇抑剂、诊断助剂、利尿剂、酶、祛痰剂、激素、催眠药、矿物质、营养补充剂、拟副交感神经剂、钾补充剂、辐射增敏剂、放射性同位素、镇静剂、磺胺类药物、兴奋剂、拟交感神经剂、镇定剂、抗尿路感染药、血管收缩剂、血管扩张剂、维生素、黄嘌呤衍生物等。治疗剂还可以是其他小有机分子、天然分离的实体或其类似物、有机金属试剂、螯合金属或金属盐、基于肽的药物、或肽或非肽受体的结合剂或靶向剂。可以掺入水凝胶基质中的分子包括但不限于维生素和其他营养补充剂；糖蛋白(例如胶原蛋白)；纤连蛋白；肽和蛋白质、碳水化合物(简单和复杂的)；蛋白聚糖；抗原；寡核苷酸(有义和反义DNA和/或RNA)；抗体(例如，抗感染原、肿瘤、药物或激素的抗体)；和基因治疗试剂。
已经报道了水凝胶的许多分类。例如，水凝胶可以分为由天然聚合物形成的水凝胶和由合成聚合物形成的水凝胶。取决于结合基团上的离子电荷，水凝胶可以是阳离子的、阴离子的或中性的。水凝胶也可以分类为惰性水凝胶、物理水凝胶、化学水凝胶或生物化学水凝胶。惰性水凝胶对正常的化学或生物过程无活性，并且它们抗降解，且不被身体吸收。物理水凝胶可以响应于环境条件如温度、离子浓度、pH或其他条件如两种组分的混合的变化而经历从液体到凝胶的转变。化学水凝胶使用共价键合，与其他弱材料相比，其引入机械完整性和抗降解性。在生物化学水凝胶中，生物制剂如酶或氨基酸参与凝胶化过程。还可以基于其结构将水凝胶分为不同的组：无定形、半结晶、结晶和水胶体聚集体。
在一些实例中，水凝胶是惰性水凝胶。在一些其他实例中，水凝胶是物理水凝胶，特别是温敏水凝胶。温敏水凝胶使用温度作为外部刺激来显示溶液-凝胶转变，并且大多数温敏聚合物可以在体温附近形成水凝胶。多种惰性和温敏水凝胶是可商购的。例如，凡士林是惰性水凝胶，Pluronic F-127是温敏水凝胶。
支架可以用细胞、生长因子、细胞外基质组分、营养物、整联蛋白或促进细胞生长的其他物质输注、包被或包含细胞、生长因子、细胞外基质组分、营养物、整联蛋白或促进细胞生长的其他物质。支架还可以用作本文公开的药物组合物的载剂材料。支架可以由生物或合成支架材料形成，并且在组织工程领域中用于支持蛋白质粘附和细胞向内生长以用于组织修复和再生。支架技术的现有技术依赖于用于蛋白质吸附和细胞迁移的周围组织空间的固有特征。合适的支架材料的非限制性实例包括细胞外基质蛋白，例如纤维蛋白、胶原蛋白或纤连蛋白，以及合成或天然存在的聚合物，包括生物可吸收或不可吸收的聚合物，例如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、聚乙烯吡咯烷酮、聚己内酯、聚碳酸酯、聚富马酸酯、己内酯、聚酰胺、多糖(包括藻酸盐(例如藻酸钙)和壳聚糖)、透明质酸、聚羟基丁酸酯、聚羟基戊酸酯、聚二噁烷酮、聚原酸酯、聚乙二醇、泊洛沙姆、聚磷腈、聚酸酐、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨酯(例如
Figure BDA0004032299190000381
)、聚丙烯酸酯、乙烯-乙酸乙烯酯聚合物和其他酰基取代的乙酸纤维素及其衍生物、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚乙烯基咪唑、氯磺化聚烯烃、聚环氧乙烷、聚乙烯醇、/>
Figure BDA0004032299190000384
和尼龙。支架还可以包含陶瓷，例如羟基磷灰石、珊瑚磷灰石、磷酸钙、硫酸钙、碳酸钙或其他碳酸盐、生物玻璃、同种异体移植物、自体移植物、异种移植物、脱细胞组织或任何上述的复合物。在一些实例中，支架可包含胶原蛋白(例如，/>
Figure BDA0004032299190000382
或/>
Figure BDA0004032299190000383
支架)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、聚氨酯、多糖、羟基磷灰石或聚乙二醇。另外，支架可在支架的分开或多个区域中包含任意两种、三种或更多种材料的组合，所述材料是非共价或共价组合的(例如，共聚物如聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物或三元共聚物)，或其组合。
在另一方面，提供了如本文公开的药物组合物，其用于治疗。
在一个方面，提供了治疗伤口的方法，该方法包括向有需要的受试者施用药学有效量的如本文公开的药物组合物。
本公开还提供了用于促进受试者中上皮组织再生的方法。在一些实例中，在受试者的伤口部位处的上皮组织的再生被促进，并且因此有助于促进受试者的伤口愈合。
本公开还提供了如本文公开的药物组合物，其用于治疗受试者的伤口。本公开还提供了如本文公开的药物组合物，其用于促进受试者中上皮组织的再生。还提供了如本文公开的药物组合物在制备用于治疗受试者伤口的药物中的用途。还提供了如本文公开的药物组合物在制备用于促进受试者中上皮组织再生的药物中的用途。
如本文所用，术语“治疗”包括减少或缓解疾病或病症的至少一种不良反应或症状。如本文所用，“药学有效量”是指足以产生有益或所需临床效果的药物组合物的量。所述量可以在一次或多次施用中施用。然而，可以基于每位患者的个体因素精确地确定被认为是有效量的因素，包括但不限于患者的年龄、伤口的大小、伤口的类型、伤口的严重程度、药物组合物的施用途径等。该量可以由技术人员基于已知的程序(包括临床试验)和本文公开的方法容易地确定。
如本文所用，术语“受试者”包括温血动物，优选哺乳动物，包括人。在一些具体实例中，受试者是灵长类动物。在一个具体实例中，受试者是人。
在一些实例中，受试者是患有或被认为患有潜在病症或疾病的受试者。在一些其他实例中，受试者患有或被认为患有癌症。在一些另外的实例中，受试者患有或被认为患有糖尿病。在又一些其他实例中，受试者正在经历进一步治疗或已经经历进一步治疗，其中该治疗是但不限于化学疗法、化学预防、放射疗法、免疫抑制疗法、类固醇治疗等。
如本文所用，术语“伤口”是指对身体的损伤，其通常涉及膜(例如皮肤)的撕裂或破裂。创伤还可以包括对下方的组织的损伤，并且在大多数情况下，通常是身体上的外部物理力的结果。
在一些实例中，伤口的特征在于缓慢愈合或不愈合。
例如，不愈合伤口是这样的伤口，其不按照大多数伤口愈合时的在可预测的时间量内的一组有序阶段的方式愈合；在三个月内不愈合的伤口通常被认为是不愈合伤口。伤口可以显示出一系列愈合速率，其中急性和不愈合伤口位于该系列的相对端。
发生不愈合或缓慢愈合的伤口的可能原因可以是例如由于预先存在的和/或潜在的病症或疾病，或因为受试者正在经历进一步治疗，由此进一步治疗导致伤口愈合受损。这些病症或疾病可以是病理性的或非病理性的，并且可以通过存在于受试者中而恶化或加剧伤口愈合。此类病症和/或疾病的实例是但不限于癌症、糖尿病(I型和II型)、皮肤病、自身免疫病症、上皮层(epithelial lining)、真皮和/或真皮下的炎性病症(内部和外部)、湿疹等。
伤口的实例包括但不限于慢性伤口、急性伤口、创伤性伤口、亚急性伤口和开裂伤口、由烧伤引起的伤口、部分厚度烧伤、溃疡(例如糖尿病性溃疡、压力性溃疡或静脉功能不全溃疡)、皮瓣(flap)和移植物。在一个实例中，伤口由烧伤或慢性伤口引起。
本文公开的药物组合物可以通过直接局部施用而施用于伤口。或者，可以将药物组合物施用于载剂材料，然后将其施用于伤口。此类方法可包括将药物组合物施用于待施用于伤口的绷带、纱布或敷料。还可以将本文提供的药物组合物添加到其他已知用于治疗伤口的组合物中。
术语“局部”施用是指向皮肤、真皮或组织部位的施用，并且向此类组织部位的施用可包括向邻近组织部位或在组织部位内的施用。
如本文所用的术语“组织部位”宽泛地指位于组织上或组织内的伤口或缺损，所述组织包括但不限于骨组织、脂肪组织、肌肉组织、神经组织、真皮组织、血管组织、结缔组织、软骨、肌腱或韧带。
除了局部施用之外，本文公开的药物组合物还可以通过其他途径施用于有需要的受试者。施用方式的实例包括但不限于静脉内、血管内、肌内、皮下、脑内、腹膜内、软组织注射、手术部位、关节镜部位和经皮插入，例如通过直接注射、插管或导管插入。任何施用可以是药物组合物的单次施用或多次施用。施用可以在待治疗的受试者的单个部位或多于一个部位进行。多次施用可以基本上同时发生或在不同时间分开发生。
在本公开中还显示，如本文所述的Agrin片段或衍生物促进集体角质形成细胞迁移。还表明，由Agrin促进的集体角质形成细胞迁移通过使MMP12作为下游效应物参与来实现。由于伤口再上皮化在伤口边缘处的角质形成细胞被激活以进行迁移后开始，因此本公开还提供了用于促进伤口再上皮化的方法，该方法包括施用如本文公开的Agrin片段或其衍生物。
如本文所用，术语“再上皮化”是指通过上皮细胞迁移而在伤口和环境之间产生新屏障的过程。参与再上皮化的起始、维持和完成的细胞和分子过程对于成功的伤口闭合而言是必需的。
本文说明性描述的本发明可以在不存在本文未具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制的情况下适当地实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被广泛地理解而不受限制。另外，本文使用的术语和表达已被用作描述性术语而不是限制，并且在使用这些术语和表达时并不意图排除所示和所述特征的任何等同物或其部分，但是应当认识到，在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解，尽管已经通过优选实施方案和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以采用本文所公开的、其中所体现的发明的修改和变化，并且这些修改和变化被认为是在本发明的范围内。
本领域技术人员将理解，本领域已知的多种方法和技术可用于实施本发明的某些实施方案。
在整个本公开中，某些实施方案可以公开为范围形式。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对所公开范围的范围的硬性限制。因此，范围的描述应被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，诸如1至6的范围的描述应被认为已具体公开了诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等的子范围，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的宽度如何，这都适用。
本发明已在本文中宽泛且一般性地被描述。落入一般性公开内容内的每个较窄的种类和亚属分组也形成本发明的一部分。这包括带有从该属中去除任何主题的附带条件或否定限制的一般性描述的发明，不论所去除的材料是否在本文中具体叙述过。
其他实施方案在以下权利要求和非限制性实施例内。此外，在根据马库什组描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明也因此根据马库什组的任何单个成员或成员亚组进行描述。
实验部分
材料和方法
抗体、siRNA和试剂
在研究中使用以下抗体：小鼠单克隆抗Agrin(D-2)，Santa Cruz Biotechnology，Cat#sc-374117；RRID:AB_10947251；人Agrin克隆PIF12(内部产生)；兔多克隆Agrin抗体，Novus Biologicals，Cat#NBP1-90209，小鼠单克隆抗整联蛋白β1，Abcam，Cat#ab24693；RRID:AB_448230；抗整联蛋白β1，活化的，克隆HUTS-4，Cat#MAB2079Z，RRID：AB_2233964；小鼠单克隆抗β肌动蛋白(C4)，Santa Cruz Biotechnology，Cat#sc-47778；RRID:AB_2714189；兔多克隆抗GAPDH(FL-335)，Santa Cruz Biotechnology，Cat#sc-25778；RRID:AB_10167668；磷酸肌球蛋白轻链2(Ser19)抗体#3671，RRID：AB_330248，抗肌球蛋白轻链(磷酸-S20)抗体(ab2480)，RRID：AB_303094；肌球蛋白轻链2抗体#3672，RRID：AB_330278；MMP-12抗体克隆G-2，Cat#sc-390863；抗MMP12抗体，Abcam，Cat#ab137444；MMP12多克隆抗体，Thermo Fisher Scientific，Cat#PA5-27254，RRID：AB_2544730；兔多克隆抗CD31，Abcam，Cat#ab28364；RRID：AB_726362；山羊抗兔IgG-HRP，Santa Cruz Biotechnology，Cat#sc-2030；RRID:AB_631747；山羊抗小鼠IgG-HRP，Santa Cruz Biotechnology，Cat#sc-2005；RRID：AB_631736；山羊抗小鼠IgM-HRP，Santa Cruz Biotechnology，Cat#sc-2973；RRID:AB_650513；山羊抗兔IgG(H+L)Alexa Flour 488Invitrogen，Cat#A11034；山羊抗小鼠IgM Alexa Flour 594，Invitrogen，Cat#A21044。在该研究中使用以下siRNA：人Agrin隐形siRNA(一组3个)HSS139721、HSS180123、HSS180124；小鼠Agrin隐形siRNA(一组3个)MSS201833、MSS201834、MSS201835(Thermo Fisher Scientific)、来自Dharmacon的人Agrin smartpool(Cat#L-031716-00-0050)、人MMP12(Cat#L-005954-00-0050)。特异性siRNA序列列于表3中。按照制造商推荐的指南，将Lipofectamine RNAimax(Invitrogen)用于siRNA转染。纤连蛋白获自Gibco和Advanced Biomatrix。鼠尾I型胶原蛋白来自Corning。Alexa-488缀合的F-肌动蛋白鬼笔环肽来自Thermo Fisher Scientific。分别地，布雷他汀和Pluronic F127获自Sigma，MMP408获自Merck Millipore。Aquaphore获自Beirsdorf AG，而凡士林获自Unilever。二甲亚砜来自Kanto Chemical，co.，Inc.，Cat#10378-00。CellTiter
Figure BDA0004032299190000443
AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(MTS,Promega Cat#G3580)用于增殖测定。5-溴-2'-脱氧尿苷-BrdU(#Cat ab142567)和抗BrdU抗体(Cat#ab6326)购自Abcam。
小鼠
将购自InVivos的六至八周龄雌性实验ICR(命名：IcrTac：ICR)小鼠用于穿孔活检伤口愈合体内测定。在离体小鼠皮肤外植体测定中，使用随机比例的雄性和雌性新生ICR小鼠幼仔。在任何可能的情况下，考虑到动物使用的伦理和简约处置方法进行实验。动物研究不以盲法方式进行。将动物随机分配到不同的实验组。用于每个实验的动物数量在图例中表示为n＝x只小鼠/组。进行的所有动物实验都是根据新加坡科技研究局(A*STAR)生物资源中心(BRC)审查的实验方案进行的，严格遵守机构动物护理和使用委员会(IACUC)关于生物研究中动物模型的伦理使用的指南。
细胞系和人皮肤外植体
将人表皮角质形成细胞系HaCaT维持在含有10％胎牛血清(FBS)以及青霉素和链霉素(Gibco Cat#15140148)抗生素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(Gibco)中。将获自ATCC(
Figure BDA0004032299190000442
CRL-2522TM)的人包皮正常成纤维细胞(BJ)在含有抗生素的DMEM(Gibco)中传代。如所推荐的，将购自CELL Applications,Inc.,(Cat#C-12003)的正常原代成体表皮角质形成细胞(HEK)维持在制造商提供的角质形成细胞生长培养基中。来自C57BL小鼠品系的原代角质形成细胞购自CellBiologics(Cat#C57-6066K)并按照制造商推荐的上皮细胞生长培养基(Cat#M6621,CellBiologics)维持。从C57BL小鼠品系(Cat#m-GFP-6067)分离小鼠原代真皮成纤维细胞，并在完全成纤维细胞培养基(CellBiologics，Cat#M2267)中培养。带有3mm穿孔伤口的基底膜上的表皮全厚度(EPIDERM-FTTM)人皮肤外植体购自MatTekLifesciences，并使用公司提供的培养基维持。所有细胞在37℃和5％CO2的标准培养条件下增殖。
体外和体内RNA干扰和敲低
按照制造商推荐的缓冲液溶解期望的siRNA。对于体外研究，将50nM对照或靶向siRNA与5μl Lipofectamine RNAimax(Thermo Fisher Scientific)混合，并在室温下孵育30分钟。将siRNA：lipofectamine混合物加至250μl还原的生长因子培养基中。72小时后通过RT-PCR或Westem印迹验证敲低。对于体内和离体RNAi，在室温下将75nM隐形siRNA与8μlLipofectamine RNAiMAX(Thermo Fisher Scientific)混合30分钟。随后，将siRNA混合物缓慢掺入Aquaphore凝胶和磷酸盐缓冲盐水(PBS)的1∶1混合物中用于局部递送。对于用皮肤外植体的处理，在创伤后第0天将siRNA lipofectamine混合物加至Aquaphore以形成1∶1混合物，并孵育指定的天数。为了有效敲低，在受伤后第4天重新施用局部siRNA软膏。对于用sAgrin挽救的外植体，在受伤后第2、4和6天加入含有20μg蛋白质的Aquaphore混合物。
重组Agrin表达和纯化
将含有8个氨基酸‘Z8’插入物和LG3结构域的C-末端片段(AgrinZ8LG3，具有序列：
DTLAFDGRTFVEYLNAVTESELANEIPVEKALQSNHFELSLRTEATQGLVLWSGKATERADYVALAIVDGHLQLSYNLGSQPVVLRSTVPVNTNRWLRVVAHREQREGSLQVGNEAPVTGSSPLGATQLDTDGALWLGGLPELPVGPALPKAYGTGFVGCLRDVVVGRHPLHLLEDAVTKPELRPCPTP(SEQ ID NO：7))克隆到含有His-ta的pET28载体中并在大肠杆菌(菌株BL21-DE3)中表达。用质粒转化该细菌。将单个菌落接种在含有抗生素的TB培养基中，并在15℃下用IPTG诱导16小时。通过离心收获细胞，并将细胞沉淀在裂解缓冲液中裂解，然后超声处理。使用凝胶过滤色谱通过Superdex75柱在咪唑缓冲液中纯化所得的含有Agrin蛋白片段的上清液，使其流经22μm低蛋白结合滤器进行灭菌，并将其溶解在PBS溶液中。
穿孔-活检伤口愈合模型
将小鼠圈养在21℃和12h光照-黑暗周期的标准条件下，自由获取食物。随后，使用稀释在100ml盐水溶液中的氯胺酮100mg/kg和甲苯噻嗪(Xylazin)10mg/kg腹膜内(i.p.)麻醉小鼠。从颈底部向背部剃掉整个肩部区域上的毛。用酒精拭子和10％聚维酮碘(Betadine)抗菌溶液擦拭皮肤。使用无菌4mm穿孔活检针(Integra Miltex,Integra York,P.A.,Inc.)在肩部区域中线的任一侧造成圆形对称的4mm伤口。使用解剖刀和剪刀小心地去除伤口皮肤以产生全厚度伤口，在分析的时间段期间使伤口保持开放用于局部施用。对于带有固定物的伤口愈合模型，将10mm透明环形尼龙片(Grace Bio-Laboratories,Bend,OR)放置在4mm伤口周围。将固定物放置成使伤口位于中心，通过粘合剂(Krazy
Figure BDA0004032299190000461
；Elmer’s Inc.)粘合到皮肤上，并用Tegaderm敷料覆盖。用基于石油膏(凡士林)、温敏水凝胶(Pluronic F127-Sigma)或市售皮肤软膏(Aquaphore-Beiersdorf,Inc.)的不同制剂处理伤口。对于基于凡士林的软膏乳液制剂，将10mg/cm2凡士林软膏与含有指定量的Agrin(100μg、200μg或500μg)和100μg BSA(w/w)的经过滤PBS溶液混合，并每两天局部施用。对于siRNA介导的敲低实验，将75nM指定的siRNA与PBS中的lipofectamine一起孵育。随后，每两天将PBS(含有siRNA)：Aquaphore的1：1混合物局部施用于伤口区域。使用包含20％(w/w)Pluronic F127(Sigma)的局部制剂，使其溶解在含有终浓度为200μg/ml的sAgrin或BSA的无菌且经0.22μ过滤的溶液中。将该混合物在4℃下溶解过夜以确保获得液相。混合物在高于约20℃的温度下形成均质凝胶，并局部分散以覆盖伤口。每隔一天使用游标卡尺评估伤口闭合。对于两种模型，在整个进行观察的愈合时间点期间，将动物单独笼养在机构动物设施中。进行的所有伤口愈合动物实验都是根据新加坡科技研究局(A*STAR)生物资源中心(BRC)审查的实验方案进行的，严格遵守机构动物护理和使用委员会(IACUC)关于生物研究中动物模型的伦理使用的指南。
小鼠皮肤外植体测定
处死3日龄的ICR品系小鼠幼崽，在70％乙醇中洗涤肩部区域中线任一侧的后皮，并使用手术刀切除。将切除的皮肤在70％乙醇中洗涤，并在不存在或存在20μg/ml sAgrin的情况下放置(真皮侧朝下)在具有限定硬度的预制凝胶基底(substrate)上。使外植体粘附2小时，然后如前所述地31加入含有300μM Ca2+的角质形成细胞培养基(DMEM)。在Axiovert-200倒置显微镜下对角质形成细胞的长出和皮肤组织定期成像，随后将其在4％多聚甲醛中固定并针对角蛋白(Keratin)17抗体进行免疫染色。
基底硬度操纵和微图案化
根据制造商的建议，用硬度范围为0.8KPa(软)至30KPa(硬)的Col-T-gel(FischerScientific)包被组织培养板，并使其在37℃下在组织培养孵育器内固化40分钟。一些实验用接种在规定硬度的聚水凝胶板上的细胞进行：分别为0.2kPa和16kPa软和硬的聚水凝胶(CytoSoft，Advanced Biomatrix，Inc.)。硅氧烷基底的硬度的测定由制造商根据先前公布的方案进行。对于某些实验，在凝胶化过程之前将指定量的sAgrin掺入0.8KPa胶原蛋白凝胶中。凝胶化后，将胰蛋白酶消化的细胞或切除的小鼠皮肤外植体接种到单独的或含有sAgrin的、不同硬度的凝胶上。将细胞/组织在标准培养条件下与500μl推荐的培养基一起孵育指定的天数。通过在来自法国Cytoo,Inc.的19.5×19.5mm盖玻片上微光刻产生具有纤连蛋白包被的岛的十字形微图案。微图案的表面积分别为800μ2或1600μ2。将初始siRNA处理后的5万个细胞置于微图案上4-6小时，然后处理它们用于免疫荧光。对于一些实验，在加入细胞之前18小时，在载玻片上加入10μg/ml sAgrin。
3D-硬度依赖性角质形成细胞成纤维细胞共培养迁移测定
通过改变先前公开的方案，使用限定硬度的胶原蛋白构建体创建3D体外伤口愈合模型。根据制造商推荐的方案，用Col-T-gel(0.8KPa-软)或(30KPa-硬)制备含有300,000个原代小鼠真皮成纤维细胞(DF)的胶原蛋白构建体。对于一些实验，将经siControl和siAgrin处理的DF掺入软或硬胶原蛋白构建体内。使携带成纤维细胞的构建体在培养箱中固化45分钟。加入与底层的硬度匹配的第二层胶原蛋白，其含有350,000个原代小鼠角质形成细胞(KRT)，并使构建体固化3-4小时。除去过量培养基后，用1×PBS轻轻洗涤构建体两次。插入倒置的2μ移液管尖端并在构建体的中心处轻轻旋转以产生圆形伤口。从伤口区域快速除去胶原蛋白和细胞，并用40μL与构建体的稠度和设置相匹配的软的或硬的Col-T凝胶进行替换。将所得的创伤构建体置于培养箱内，并在30分钟后进行成像以用于第0天时间点。对迁移的角质形成细胞进行成像直至创伤后第5天。
Western印迹分析
将操纵后的指定细胞用冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次，并用补充有1×蛋白酶抑制剂混合物(Roche Applied Biosciences)的冷1％ NP-40裂解缓冲液在4℃下裂解15分钟。将细胞裂解物以13,000rpm离心15分钟。随后使用Bradford试剂进行蛋白质估计。随后，将40-50μL总蛋白与等体积的2×Laemmli样品缓冲液混合，并在95℃加热5分钟。然后用SDS-PAGE凝胶分离。将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，并在含有0.1％ Tween-20的1×PBS中重构的5％脱脂乳中封闭，并用相应的一抗探测过夜。然后用补充有0.1％ Tween-20的1×PBS洗涤膜；以15分钟间隔洗涤三次。然后在缀合的辣根过氧化物酶HRP二抗(SantaCruz Biotechnology)中孵育1小时。孵育后，将印迹再次如上洗涤三次，然后用增强的化学发光(ECL)底物(Pierce/Bio-Rad)覆盖，并通过图像处理器在X射线胶片上可视化或通过Chemidoc分析仪(Bio-Rad)数字化可视化。使用Image-J软件定量各条带的密度。
免疫荧光和共聚焦显微术
将细胞在八孔室载玻片或盖玻片上培养过夜。然后用PBS洗涤细胞两次，并用4％多聚甲醛固定15分钟。随后，在室温下用含有1mM Ca+2和1mM Mg+2的磷酸盐缓冲盐水(PBSCM)中的0.1％ Triton X使细胞透化15分钟。将透化的细胞与荧光稀释缓冲液(FDB)中的指定抗体在室温下孵育1-2小时或在4℃下孵育过夜，然后用PBSCM洗涤5次并与二抗；Alexa Fluor(Thermo Fisher Scientific)在室温下孵育1h。将载玻片再次用PBSCM洗涤五次，并用含有DAPI的Vectashield培养基封固(mount)。然后通过Zeiss共聚焦显微镜对染色的细胞成像。通过Zen blue软件处理和分析图像。使用Zen blue软件内图像分析中的工具选择参数获得强度测量值。
组织学和免疫荧光-组织学
收获人皮肤等同物和小鼠皮肤组织，将其包埋，并使用苏木精和伊红进行常规组织学。对于免疫染色，将组织在10％中性缓冲福尔马林溶液中固定24小时。随后，使用超薄切片机将组织切片，并在pH 9或pH 6(对于指定的抗体)下进行抗原修复(antigen-retrieval)。一抗以1:50稀释的浓度使用，而相应的Alexa-488和Alexa-594二抗(ThermoFisher Scientific)分别以1:100和1:500的浓度在荧光稀释缓冲液中使用。将载玻片封固在含有DAPI的VECTASHIELD hardsetTM抗褪色封固介质中。按照先前公开的方案，通过对石蜡包埋的小鼠皮肤组织进行天狼猩红染色来实现胶原蛋白的定量，以作为ECM沉积的标志物。
体外伤口愈合测定
使用20μL移液管尖端对6孔板中的对照和Agrin耗竭的细胞的汇合单层进行单向刮擦。然后在室温下用1×PBS洗涤，并在37℃和5％ CO2下在完全培养基中孵育，如所示地使用或不使用sAgrin。在指定的时间点定期拍摄伤口区域的相差图像。对于一些伤口愈合迁移测定，将角质形成细胞在屏障板(Nalge Nunc.,Inc)内的软或硬基底上培养18小时。除去屏障后，使细胞迁移并在指定的时间点使用Axiovert 200倒置显微镜成像。
牵引力显微术
基底制备-首先将两部分硅酮(silicone)弹性体DOWSIL CY52-276(Dow Inc.)以1:1的重量比充分混合。然后将混合物倒入放置在水平表面上的35mm玻璃底培养皿(iwaki3930-035，Asahi Techno Glass Corporation，Japan)中，达到～500μm的厚度。预固化过夜后，将硅酮包被的培养皿在80℃下进一步烘烤2小时以完全固化。为了使随后的微球附着最大化，用(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(A3648，Sigma-Aldrich)预处理硅酮膜。为了硅烷化，将含有96％v/v、2％v/v APTES和1％v/v乙酸(A6283，Sigma Aldrich)的1ml溶液加入到玻璃底培养皿中，覆盖整个硅酮膜，并放置10分钟以反应。然后用96％v/v乙醇冲洗硅酮膜两次，然后快速浸入Milli-Q水中以除去所有溶液：用这种方式从膜除去溶液优于用氮气吹干，因为后者可能将灰尘引入表面，随后影响附着的微球分布的均匀性。此后，将培养皿在80℃下再烘烤2小时以促进硅氧烷键形成。为了将荧光乳胶微球物理吸附到硅酮膜上，首先将6μl100nm橙色荧光(540/560)羧酸酯改性的微球(F8800，ThermoFisher Scientific)在10mlMilli-Q水中稀释并超声处理10分钟。然后使稀释的微球通过0.22μm过滤器直接进入含有500μl 500mM MES缓冲液(pH 6.0)(M3671，Sigma Aldrich)的15ml falcon管中。然后将微球再次超声处理10分钟，而后加至先前制备的培养皿内的APTES硅烷化硅酮膜以对其进行覆盖。将溶液放置5分钟以使微球附着。然后，为了除去溶液，小心且快速地倾翻培养皿，使得在单次动作中除去所有溶液，因为如果允许回流，溶液的表面张力将使微球分离。然后将微球偶联的培养皿在80℃下烘烤2小时，并且通常在一周内使用。为了促进粘附细胞的附着，用浓度为50μg/ml的人血浆纤连蛋白(10838039001，来自Sigma Aldrich)包被微球偶联的硅酮膜至表面密度为5μg/cm2。通过原子力显微术根据如下文章节中所述的先前建立的方案测定用于TFM的硅酮基底的硬度。
牵引力成像-使用Nikon Biostation IMQ在37℃和5％ CO2下，在24小时内以10分钟间隔对HACAT细胞片层(sheet)迁移和微球位移进行活细胞成像。使用内部20×物镜(0.5NA)和1.3百万像素单色相机获取相衬(phase contrast)和辐射荧光(epifluorescence)图像。用于辐射荧光的光源是Intensilight Hg预定心光纤照明器，并且使用德克萨斯红滤光器组对橙色微球成像。为了考虑z漂移，通常在z堆叠中取焦平面任一侧间隔1μm的2-3个平面。针对每种条件对三个独立样品进行成像，并且对于每个独立样品，随机选择和跟踪3-4个位置。
通过原子力显微术(AFM)的细胞硬度
使用Nanowizard IV BioAFM系统(JPK Instruments，Germany)测量小鼠角质形成细胞的硬度。在含PBS培养基的培养皿上培养汇合的小鼠角质形成细胞单层。使用100μl移液管尖端跨培养皿的中心刮擦该单层，并在4小时后进行表征。在伤口边缘处随机选择的细胞上进行压痕，其中直径(～4.5μm)的聚苯乙烯珠连接到使用1Hz的3nN力的悬臂的末端(k＝0.03N/m，Novascan Technologies，Inc.，Ames，IA)。对来自一式三份实验的超过60个细胞进行表征并取平均值以评估每种条件的杨氏模量。使用JPK数据处理软件(JPKInstruments，Germany)计算杨氏模量值，其采用球形压头(直径4.5μm；泊松比0.5)的赫兹接触模型以拟合延伸曲线。
用于伤口愈合测定模型中集体牵引力测量的聚丙烯酰胺块的制造首先如下制备聚丙烯酰胺前体混合物。为了制备1ml这样的前体混合物，将200μl 40％w/v水性AC(1610140，Bio-Rad)、200μl 2％w/v水性BIS(1610142，Bio-Rad)、1.5μl TEMED(1610800，Bio-Rad)和583μl Milli-Q水充分混合在一起。然后将500μl该混合物与8μl 10％过硫酸铵(1610700，Bio-Rad)组合，并快速移液到腔尺寸为1.2×1.2×0.5cm的3D打印模具中。然后将稍大的甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯(440159，Sigma-Aldrich)硅烷化玻璃的正方形片置于顶部。一旦反应完成，玻璃将与聚丙烯酰胺共价结合，并且充当块的固体支持体；它还将有助于向块添加重量。该玻璃支持体的硅烷化程序类似于正文中对硅酮膜进行的硅烷化程序，不同之处在于使用TMSPMA代替APTES。30分钟后，将固体水凝胶从模具中取出，并浸入Milli-Q水中过夜以洗掉剩余的有毒组分。模具和成品块如图2(a)所示，并且该块在玻璃底培养皿中的预期放置如图02(b)所示。
使用微加工装置用于集体牵引力显微术的伤口测定
在接种HaCaT细胞之前，使含有ECM包被的硅酮膜的35mm培养皿装有聚丙烯酰胺水凝胶块(1.2×1.2×0.5cm，也参见图22)，其将最终用于在HaCaT细胞片中产生干净的伤口。使用聚丙烯酰胺水凝胶是因为它抗蛋白质结合，因此将防止细胞粘附到其上，并且还防止ECM从硅酮表面移除。在用生长培养基平衡培养皿中的水凝胶块30分钟后，用新鲜培养基替换培养皿，并将约7×105个细胞均匀地接种在水凝胶块周围。在移除水凝胶块之前，将装置孵育24小时，然后对细胞进行成像(也参见图2)。
经由配体缀合磁珠的力传递
根据制造商的手册将配体缀合至4.5μm环氧化物顺磁性磁珠(Dynabeads M-450Epoxy，Thermo Fisher Scientific)。简言之，将磁珠在0.1M磷酸钠缓冲液(pH 7.4)中洗涤两次。随后，在4℃下，将8×107个磁珠于0.1M磷酸钠缓冲液(pH 7.4)中分别缀合20μgsAgrin、BSA和FN，并在整个过程中轻轻旋转，持续16-18小时。通过还原SDS-PAGE凝胶分析，使用配体缀合磁珠的子集来验证蛋白质与磁珠的缀合程度。洗涤剩余的磁珠，随后将其储存在4℃下的0.1％ BSA-磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.4)中。随后将它们悬浮在培养基中并在37℃下添加到细胞上30分钟。用PBS短暂洗涤以除去过量的未粘附磁珠后，将细胞置于距离永久钕磁体(KJ Magnetics，USA)6mm的位置30min，这允许磁珠上的垂直张力为约200pN量级。然后将细胞固定在4％多聚甲醛中，透化并处理，以用于免疫荧光。
牵引力的数学计算
使用PIVLab计算与荧光珠图像相关的位移场，PIVLab是基于互相关(cross-correlation)的开源颗粒图像速度测量学(Particle Image Velocimetry)MATLAB包。将处于无应力状态(即，在将1％v/v十二烷基硫酸钠(L4509，Sigma Aldrich)添加到培养物中以杀死细胞后足够长时间)的基底的图像用作参考图像以计算这些变形。在互相关期间，使用四窗口通路(pass)，每个(正方形)窗口的尺寸分别为64、32、16和16像素，步幅(stride)之间具有50％的窗口重叠。然后使用MATLAB代码，将这些计算的位移场用于执行傅里叶变换牵引细胞计数法(Fourier Transform Traction Cytometry，FTTC)以推断牵引力。对于所有FTTC计算，杨氏模量和泊松比分别假设为10kPa和0.5。采用L曲线准则选择最优L2正则化参数。更具体地，针对每个样本电影的第1帧、第10帧、第20帧、第30帧、第40帧、第50帧和第60帧构建L曲线，然后使用MATLAB的L角函数选择与每个L曲线相对应的最佳正则化参数。所有最优正则化的中值(即，针对每个样本的每个帧计算的参数)被认为是最优正则化参数(发现为1.26×10-9)，其然后针对所有样本固定。注意，较大的正则化参数将减小我们计算的力场的大小，这样做是为了通过针对不同的样本条件系统性地选择更小或更大的正则化参数来避免在所计算的牵引场量级中产生人为差异。
图像拼接
使用基于图像互相关的内部脚本将相邻图像场拼接在一起以生成更大的牵引力场。
真皮内皮细胞成纤维细胞3D-血管生成测定
将十万个人真皮微血管内皮细胞(HDMEC)用细胞追踪蓝CMAC(7-氨基-4-氯甲基香豆素-Invitrogen)预标记过夜，并与等量的表达GFP的BJ细胞混合。用相关siRNA处理两种细胞，并使其按照先前建立的方案形成共培养球状体。在包埋后24小时捕获生芽EC的图像，并如前所述使用来自Fiji的Sprout形态插件(Image J)进行定量。
MMP12活性测定
按照先前公开的方案，通过明胶和酪蛋白酶谱法监测MMP12活性。简言之，使对照或Agrin耗竭的HaCaT细胞在不含FBS的培养基中生长至80-90％汇合。将从每个培养皿收集的上清液以10,000rpm离心5分钟，并使用Amicon ultra柱浓缩。将20微升培养基与2×SDS上样缓冲液混合，并上样到10％明胶或酪蛋白凝胶上。用孵育缓冲液洗涤凝胶，随后用考马斯亮蓝染色1小时。将凝胶脱色30分钟，然后使用Chemidoc成像仪成像。
定量逆转录PCR(RT-PCR)和RNA测序
根据制造商推荐的方案，使用Qiagen RNeasy mini试剂盒从指定细胞中提取总RNA。然后使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)逆转录总RNA。将产生的cDNA(200ng)用作RT-PCR的模板，该RT-PCR使用基于SYBRTM Green或TaqmanR(ThermoFisher Scientific)的预混液和探针。将数据相对于作为内源对照的GAPDH归一化。表1中提供了研究中用于各个靶基因的RT-PCR引物。对于RNA测序，使用Agilent RNA 6000Pico试剂盒在Bioanalyzer仪器(Agilent)上分析RNA质量。基于制造商的说明书，用TruSeqStranded mRNA Library Prep试剂盒(Illumina)将总共4μg RNA用于RNA测序文库制备。文库的扩增限于7个PCR循环。通过qPCR(用于Illumina的KAPA文库定量试剂盒，Roche)对纯化的文库进行。Agilent高灵敏度DNA试剂盒用于评估文库子集的片段长度，然后将其余文库组合成一个池，并进一步在NextSeq500(Illumina)上进行测序。测序条件由75bp读段长度的单读段高输出运行表示。使用STAR 2.6.1d将来自fastq文件的原始读段与hg38基因组比对。Bam文件用samtools排序和索引。基于来自gtf文件gencode.v29.annotation.gtf的特征，用htseqcount定量映射到每个基因的读段的相对数量。然后将读段的原始计数输入到R中的EdgeR中，以分别使用Gene-ontology、GSEA或其他分析进行差异表达分析。使用来自分子签名数据库(MSigDB)v6.2的基因集，运行基因集富集分析(GSEA)软件3.0的GSEA预排序工具进行基因集富集分析。使用Metascape(https://metascape.org/)鉴定富集的基因本体(Gene Ontology)术语和KEGG途径。仅考虑假发现率(false discovery rate，FDR)低于1％且条件之间表达变化超过2倍的基因。
表1.使用的RT-PCR引物列表
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统计分析
每个实验的生物和技术重复的数量在图例中示出。对于大多数体外实验，除非在图例中有不同的说明，否则进行三次生物学重复。对于体内实验，没有动物被排除在分析之外，并且没有使用功率分析(power analysis)预先确定样本大小。动物的年龄和性别在方法部分中提及。随机化不应用于使用细胞系的实验。数据表示为平均值+/-s.d.。使用GraphPad Prism软件，采用学生‘t’检验来检测配对比较，并使用ANOVA或多重t检验来比较多个组。当*p<0.05、**p<0.005、***p<0.0005时，数据分别被认为是统计学上显著的。被认为不显著的数据被标识为‘ns’。没有使用先前的统计检验或假设来确定体外、离体和体内实验的样本量。选择三个生物学重复用于体外实验，因为它遵循生物医学研究中通常保持的实践。
结果
皮肤创伤启动Agrin富集的微环境
损失的ECM组分的重建显著影响上皮伤口愈合，以产生新基质，该新基质支持角质形成细胞的再上皮化，以促进伤口闭合。关注于伤口愈合的早期阶段(其中表达角蛋白17(KRT17)的角质形成细胞是再上皮化的标志)，我们鉴定了ECM蛋白的伤口标签，包括Agrin(AGRN)、基底膜蛋白聚糖(Perlecan)(HSPG2)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖(Glypican)1-3(GPC1-3)，其在小鼠皮肤中的穿孔伤口活检后1-10天内增强(图1a)。遵循这种趋势，使用刮擦伤口模型在体外验证这些ECM蛋白的表达水平，所述刮擦伤口模型在几种皮肤细胞类型中表型复制机械损伤的环境，所述皮肤细胞类型分别包括永生化和原代人角质形成细胞(HaCaT和HEK)以及人皮肤成纤维细胞(BJ)。如图1b所示，发明人分析了在持续24小时的早期时间范围内起始伤口覆盖的迁移细胞中的mRNA和蛋白质水平。选择蛋白聚糖AGRN、GPC1和HSPG2，因为它们在小鼠模型的愈合早期阶段期间显著上调(图1a)。在起始机械创伤后的迁移的皮肤细胞组中观察到所选ECM伤口标签基因的mRNA水平增加；其中，在进行观察的创伤后24小时期间，在所有分析的皮肤细胞类型中AGRN的表达一致地增加(图1b)。值得注意的是，在损伤后3至24小时内角质形成细胞HaCaT和HEK中的Agrin表达显著增加，而在创伤后24小时观察到成纤维细胞(BJ)的显著增强(图1b)。相反，在损伤后3至24小时内，GPC1 mRNA仅在HaCaT细胞中增加2至5倍，而在HEK和BJ细胞中没有显示出显著增加(图1b)。HSPG2在任何分析的细胞系中未显示任何显著增加(图1b)。与图1a中分析的数据一致，观察到与Agrin敲低相比，耗竭的GPC1对创伤后的HaCaT细胞迁移速度显示出更大抑制(图2a-c)。尽管在损伤后的角质形成细胞和成纤维细胞中Agrin表达被更稳健地诱导(图1b)，但GPC1也可以作为促进皮肤伤口愈合的重要ECM蛋白聚糖。在该研究中，发明人关注于Agrin，因为其在皮肤损伤相关模型中的作用从未被记载过。此外，在人和小鼠角质形成细胞和成纤维细胞组中进行观察的受伤后24小时内，Agrin的蛋白水平也显示出一致的约2至4倍增加(图1c)。即使在非受伤状态下，与它们各自的真皮成纤维细胞相比，人和小鼠角质形成细胞都表达更高的Agrin水平，这意味着角质形成细胞来源的Agrin可能在皮肤受伤修复中起关键作用(图1d)。在4mm穿孔伤口愈合小鼠模型中，早在第2天就在伤口边缘和伤口床周围检测到稳健的Agrin表达，其在第4天达到峰值，随后在受伤后第8天内正常化(图1e)。免疫组织化学分析进一步揭示，与第2天的真皮相比，表皮的角质形成细胞层内Agrin表达显著激增，其在伤口损伤后第4天达到最大(图1f)。虽然在第2至4天之间在损伤的真皮层内也观察到增加的Agrin表达，但在损伤后的任何阶段在皮下组织和真皮白色脂肪组织(D-WAT)中未检测到显著变化(图1f)。总之，这些结果揭示，在机械损伤后，在皮肤的表皮层和真皮层内显著触发了Agrin表达。
Agrin耗竭损害皮肤伤口愈合
为了测试Agrin富集的微环境在促进体内伤口愈合方面的功能相关性，本发明人利用三种独立的隐形siRNA敲低小鼠皮肤中的Agrin，以分别观察在“无固定物”和“有固定物”条件下对穿孔活检伤口后的愈合速率的影响(图3a)。隐形siRNA提供了增强的稳定性、最小的脱靶效应和对皮肤组织的可及性，因此越来越多地用于动物模型中的有效敲低。在两种模型中，在受伤前三天在预期创伤部位局部注射siRNA，这有效地降低了受伤当天皮肤损伤部位的基础Agrin水平(图3b，左图)。将乱序或Agrin siRNA混合在局部软膏制剂中，并每两天施用于开放伤口部位，以在无固定物模型中在整个愈合的早期阶段(包括受伤后9天)稳健地消耗Agrin表达。在第4天，在用Agrin siRNA异位处理的小鼠中，在对照皮肤的伤口边缘和伤口床周围检测到的强Agrin表达显著减少，这验证了Agrin敲低的功效(图3c)。Agrin表达的抑制显著延迟了体内皮肤伤口愈合，表明Agrin对于皮肤伤口修复是重要的(图4a)。此外，有效的伤口愈合依赖于角质形成细胞表达几种伤口响应性角蛋白(例如角蛋白6、14和17)的能力，这些角蛋白推动前者在伤口部位的迁移行为。伤口闭合由称为“上皮舌”的一段迁移性角质形成细胞引发。突出的上皮舌大部分遮盖了经乱序siRNA处理过的皮肤中的伤口部位，而在Agrin耗竭的皮肤切片中留下绝大多数伤口未覆盖(图3d)。在这方面，在用Agrin siRNA处理的小鼠皮肤中观察到了创伤部位的角质形成细胞迁移的显著损失(>50％)(如相对K17占据率所示的)(图4b)。
此外，4mm穿孔伤口被牢固地粘附到皮肤上的10mm固定物包围，从而代表用于伤口愈合的“封闭”的有固定物的条件。施用含有相应siRNA的软膏，随后用Tegaderm覆盖伤口区域(图4c)。因此，固定物的使用使“荷包绳(purse-string)”介导的伤口收缩最小化，并且通过再上皮化显著促进伤口闭合。与无固定物条件下的伤口敷料相比，覆盖有固定物的伤口敷料在第7天降低了伤口愈合速率(图4c)。通过使用该体内模型作为测量角质形成细胞迁移的指标，皮肤Agrin水平被有效抑制(图3b，右图)。固定物小鼠模型中的Agrin耗竭通过减弱角质形成细胞再上皮化来延迟皮肤伤口愈合，如由减少的K17占据率所示的(图4d-e)。与受损的再上皮化相结合，Agrin耗竭严重抑制了伤口床中成熟和中间胶原纤维的沉积，表明Agrin耗竭的皮肤中ECM补充受损导致延迟的愈合反应(图4f)。
此外，针对人Agrin的siRNA用于抑制其在角质形成细胞和人皮肤外植体模型中的表达(图3e-f)。值得注意的是，表达Agrin的角质形成细胞有效地迁移以闭合经对照siRNA处理的皮肤外植体中的伤口，其被Agrin siRNA#1显著抑制(图3f-g)。Agrin的耗竭(通过Agrin siRNA#1)稳健地减弱了表达K17的上皮舌迁移，从而显著延迟了这些人皮肤外植体中的离体伤口闭合率(图4g-h、3g)。有趣的是，对具有与其受体脂蛋白相关受体-4(Lrp4)和整联蛋白的结合位点的Agrin(sAgrin)的C-末端重组蛋白片段进行补充显著挽救了人皮肤外植体模型中的伤口愈合和角质形成细胞的迁移(图4g-h)。根据这些体内和离体功能可见，Agrin的敲低严重损害了真皮成纤维细胞和角质形成细胞(人和小鼠来源)中的跨孔迁移和刮擦伤口响应性迁移速度，其再次部分地被Agrin挽救(图5a-d)。
由于角质形成细胞的再上皮化与其增殖状态紧密协调，接下来记录了Agrin是否支持角质形成细胞在伤口损伤后的迁移阶段期间的增殖。在伤口损伤后4h内的早期体外迁移期间，Agrin耗竭不影响前导细胞的增殖速率，如通过5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU)掺入测定所测量的(图6a)。然而，通过Agrin敲低显著降低了远离伤口边缘的跟随细胞的增殖，而通过补充sAgrin则挽救了这一结果(图6a)。因此，Agrin耗竭在体外有差异地影响前导细胞和跟随细胞的增殖状态。在体内，当伤口边缘处的高度增殖性角质形成细胞(跟随者)将迁移细胞(前导者)推过伤口时，实现了有效的伤口再上皮化(图6b)。如经对照siRNA处理的伤口切片中所示，在再上皮化期间，表皮基部的增殖性角质形成细胞(实心箭头)在第7天被过度增殖性伤口边缘区域(箭头)主动推动(图6b)。与表皮基部的受损增殖相结合，Agrin耗竭分别严重阻碍了伤口边缘和伤口床处真皮层中的角质形成细胞增殖(图6b-c)。因此，这些证据表明，在伤口环境中富集的Agrin支持了角质形成细胞增殖，其引发了有效的集体迁移阶段和伤口闭合。
Agrin使角质形成细胞对ECM刚度和流体集体迁移敏感
已经证明了Agrin在伤口愈合反应中的作用，本发明人探索了Agrin是否产生有利于集体角质形成细胞迁移和伤口闭合的机械感受态环境。由于来自ECM的主体硬度(bulkstiffness)刺激多种细胞类型中的迁移，本发明人合理地认为Agrin可以整合ECM硬度信号和创伤皮肤环境内的集体角质形成细胞迁移。在硬(30kPa)基底上培养的HaCaT细胞的集体迁移显著高于顺应性(compliant)基底(0.8kPa)(图7a)。非常有趣的是，在顺应性基底内掺入sAgrin显著提升了迁移速率，其与单独的硬ECM中的迁移速率相当(图7a)。集体角质形成细胞迁移由角蛋白17(K17)的表达引发，特别是由位于伤口边缘的前导细胞引发。在这样的条件下，向软底物补充sAgrin通过激活表达K17的前导细胞而刺激了集体迁移(图7b)。相反，与对照细胞相比，硬基底上的Agrin耗竭的角质形成细胞具有较慢的迁移潜力，并且当将Agrin整合到硬基质中时，这被显著挽救(图7c)。经历硬基底的细胞中的Agrin耗竭也导致表达K17的迁移前导细胞显著损失(图7d)。表达K17的前导细胞部分在Agrin耗竭的细胞中被显著恢复，而该Agrin耗竭的细胞在感测到硬ECM中补充的sAgrin后显示出增强的迁移(图7c-d)。
作为2D刮擦伤口测定的补充，本发明人接下来设计了体外3D基底硬度依赖性迁移测定，以概括Agrin在天然皮肤组织所经历的潜在真皮培养物和本体基底刚度的同时影响下介导角质形成细胞迁移的作用。在该策略中，首先将原代小鼠真皮成纤维细胞(DF)包埋在顺应性胶原蛋白基质(0.8kPa)内，随后用小鼠角质形成细胞(KRT)覆盖(图7e)。在中心产生伤口，并立即用软基质补充所得区域，使角质形成细胞迁移通过顺应性环境。如图7e所示，在软基质内补充sAgrin在损伤后第5天强烈增强角质形成细胞迁移。在由硬基质再现的情况下，KRT和DF二者中的Agrin耗竭均稳健地消除了迁移速率(图7f，第二图)。有趣的是，在硬基质中补充sAgrin强烈地恢复了角质形成细胞迁移(图7f，第三图)。值得注意的是，由DF表达的Agrin不足以挽救Agrin耗竭的角质形成细胞在硬基质上的迁移(图7f，第四图)。此外，Agrin耗竭的DF对阻断角质形成细胞在硬基质上迁移的影响最小(图7f，第五图)。总之，这些数据表明角质形成细胞内Agrin表达的增加主要响应于ECM刚度感测，ECM刚度感测对于驱动伤口微环境中的迁移是必需的且足以驱动伤口微环境中的迁移。
在下一个范例中，测试了sAgrin敏化自经历不同基底刚度的小鼠皮肤外植体生长的集体离体角质形成细胞长出的能力。相应地，当分别在存在或不存在sAgrin的情况下将来自2日龄小鼠幼崽的全厚度后部皮肤置于对应于软或硬基底的胶原蛋白基质上时，监测集体角质形成细胞长出(图7g)。与单独的软胶原蛋白基质上的外植体相比，补充有sAgrin的顺应性基底显著增强角质形成细胞长出(图7h)。在这些经历硬基质而没有任何外源性sAgrin、通过小鼠特异性siRNA处理实现了Agrin耗竭的皮肤外植体中，其在培养后的5天后无法产生角质形成细胞长出(图7i，中图)。不同的是，被sAgrin支架化的硬基底敏化的Agrin耗竭的皮肤外植体表现出更高的角质形成细胞长出(图7i，第三图)。综上，这些数据表明Agrin增强角质形成细胞中的ECM刚度感测，其指导受伤后的集体迁移。
细胞通过增强其有利于提高运动性的细胞骨架张力来在其固有材料性质方面引入细微变化，由此对本体ECM硬度作出响应。为了检查Agrin富集的环境赋予的角质形成细胞的机械感知，首先通过原子力显微术测量损伤后的迁移角质形成细胞的硬度，作为细胞固有材料性质的标志物。在伤口刮擦后4h记录为～2.1KPa的迁移小鼠角质形成细胞的刚度在Agrin敲低后显著降低至～0.9KPa(图7j和8a-b)。值得注意的是，sAgrin是细胞刚度显著增加(～1.5KPa)的原因，从而增强了这些迁移的角质形成细胞的机械感知(图7j和8b)。因此，Agrin敲低使迁移细胞“软化”，使它们不能穿过伤口床。接下来，进行牵引力显微术(TFM)以测量在模拟伤口损伤的机械应力环境中由基底上的迁移细胞施加的累积力。在该集体迁移模型中，最大牵引力由ECM前缘处的细胞施加。Agrin耗竭的细胞的集体迁移受到严重阻碍，说明与对照细胞相比较低的平均牵引应力(图7k)。虽然对照细胞在前缘处具有较高的集体牵引力，但是Agrin耗竭的细胞在前导细胞和跟随细胞内具有显著较小的牵引力，这导致较低的迁移潜力(图7k)。迁移后6h后前缘处细胞的平均牵引应力为～4.67Pa，在Agrin耗竭后降低了～32％。此外，使用颗粒图像速度测量学(PIV)绘制速度场，以表征上皮伤口中涉及的集体细胞迁移的流体动力学。在对照细胞中观察到均匀的速度分布，这归因于量级较大的速度矢量和呈现流体弹性样迁移行为的偶然旋涡运动和涡流(图7l)。这种流体迁移在很大程度上被Agrin的抑制破坏(图7l)。引人注目的是，通过向Agrin耗竭的细胞补充sAgrin，显著增强了前沿处的集体牵引应力、协调的速度场和流体集体迁移(图7k-l)。这些结果表明，Agrin赋予ECM以细胞内在硬度和增强的牵引力，由协调的流体动力学导致了集体角质形成细胞迁移。
Agrin机械转导(mechanotransduction)调节损伤后细胞力学
对于增强的角质形成细胞的流体运动性这一结果，一个重要的问题在于Agrin是否是通过协调细胞骨架结构来在伤口损伤期间调节细胞力学的。通过在胚胎和成体伤口愈合的前沿处的肌动球蛋白缆线的形成展示了决定角质形成细胞中集体迁移完整性的组织化的细胞骨架结构。首先，本发明人检查了Agrin是否在伤口应力期间在前缘处协调肌动球蛋白动力学。在对照角质形成细胞中，创伤在4小时内产生了强健的肌动球蛋白缆线(图9a)。缺乏Agrin的细胞缺乏这些肌动球蛋白缆线，而经外源处理的Agrin则恢复了这些肌动球蛋白缆线(图9a)。通过在对照细胞中伤口损伤后2小时内的磷酸化肌球蛋白轻链(pMLC)的显著诱导而突显出了这种肌动球蛋白缆线网，其赋予了增强的收缩力和迁移速度(图9a-b)。Agrin耗竭的细胞在创伤后2小时内始终显示出pMLC活化的严重抑制，并且这通过sAgrin预处理得以恢复(图9b)。重组sAgrin处理导致pMLC强烈募集到伤口边缘，形成稳定的肌动球蛋白缆线，其被MLC抑制剂布雷他汀消除(图9c)。其次，强健的肌动球蛋白缆线的形成对于集体细胞迁移是不可或缺的，因为布雷他汀处理消除了伤口损伤后sAgrin诱导的HaCaT迁移(图9d)。这些证据支持了Agrin在创伤后组织前沿处的肌动球蛋白结构以维持细胞迁移潜力。
为了更深入地了解细胞机械感知是如何通过由Agrin诱导的力识别机制导致的肌动球蛋白参与来校准的，发明人使用永磁体，通过配体包被的磁珠在受伤的角质形成细胞上施加机械力，该磁珠模拟伤口微环境所经历的异常机械力的影响。在该设置中，磁珠分别与对照蛋白(牛血清白蛋白-BSA或纤连蛋白-FN)和sAgrin缀合，随后结合至细胞表面。放置在培养板中的细胞上方6mm处的永磁体确保在伤口刮擦后通过配体包被的珠持续施加30分钟200pN的力(图10a)。通过残余游离蛋白在缀合后的突然减少来示出与珠经由共价键合的有效配体缀合(图10b)。与整联蛋白配体FN类似，sAgrin珠显著增加了对照迁移角质形成细胞中的活化的整联蛋白β1-Agrin定位，表明力的局部施加诱导了增强的机械张力(图10c)。在没有任何额外磁力的对照细胞中，在创伤后30分钟检测到肌动球蛋白缆线(图9e，未施力图)；然而，外力的施加进一步激增了pMLC募集，其定位于形成强健的肌动球蛋白缆线的sAgrin珠附近(图9e，施力图)。形成鲜明对比的是，Agrin敲低细胞在如图9a中所报道的正常创伤后条件下分别表现出较差的pMLC和肌动球蛋白缆线的定位(图9e)。预计通过sAgrin的瞬时力传递应部分地呈现出更多的肌动球蛋白募集，从而体现了对受伤细胞的增强的机械响应。因此，用sAgrin施加30分钟力导致临近珠周围处的pMLC增加约2倍，这部分地挽救了在培养基中没有任何预先sAgrin暴露的Agrin耗竭的细胞中的肌动球蛋白缆线活性(图9e-f)。在向受伤的细胞施力后，与FN相比，sAgrin在对照细胞中诱导了更多的pMLC募集，但与由多配体聚糖-4(Syndecan-4，SDC4)诱导的pMLC募集类似(图10d-e，siControl图)。虽然FN作为全局机械传感器刺激整联蛋白并且多配体聚糖-4调节细胞力学，但是这些完全不足以挽救缺乏Agrin的细胞中的肌球蛋白机械张力。本质上来看，Agrin耗竭的细胞中的降低的pMLC仅被由sAgrin(而不是被FN和SDC4)珠转导的力恢复(图10d-e，siAgrin图)。同样地，与FN或BSA珠相比，在创伤后30分钟，在Agrin耗竭的细胞中施力后，sAgrin包被的磁珠增强了pMLC募集(图10f-h)。额外地通过以下策略测试了Agrin作为机械转导物的特异性：首先，对sAgrin包被的珠的增加在伤口刮擦后30分钟以剂量依赖性方式实现了更多的pMLC募集(图10i)。其次，将经由sAgrin包被的珠的持续刺激所带来的力的施加增加至高达60分钟，导致伤口损伤后的增强的pMLC机械感知(图10j)。这些结果主张：Agrin作为外力的机械转导物发挥作用，其足以在伤口损伤后全面改造集体迁移所需的细胞骨架动力学。
除了ECM组分的损失之外，角质形成细胞通常在不同的几何张力下穿过创伤区域，其适应于形态和细胞骨架的较大尺度变化。为了模拟Agrin是否影响角质形成细胞在暴露于几何约束时上移其细胞骨架张力的能力，将正常HEK细胞以不同表面积的十字形FN图案培养。FN包被的十字形微图案迫使细胞呈极化取向，其中F-肌动蛋白应力纤维源自背弧，而大量的肌动球蛋白应力纤维在朝向基部的横向弧处聚集成束。较小的(800μ2)纤连蛋白图案压缩了细胞，甚至进一步导致了F-肌动蛋白应力纤维的严重损失(图9g)。尽管补充了sAgrin的十字图案仅在较小的范围内，但其部分地挽救了F-肌动蛋白应力纤维并使更多的pMLC募集到横向弧(图9g)。sAgrin这种在几何约束的HEK细胞中诱导应力纤维形成的作用在大的十字(1600μ2)图案中进一步被凸显，其中细胞表现出突出的张力特征，其分别包括在细长的F-肌动蛋白应力纤维和横向弧处的肌动球蛋白张力(图9g，下图)。值得注意的是，sAgrin赋予了显著更高的张力曲率，其在较大十字图案中的细胞横向弧处富集有活化的MLC(图9h)。重要的是，F-肌动蛋白应力纤维和pMLC富集的横向弧张力束在Agrin耗竭的细胞中完全消除(图9i，分别为第一图和第二图)。有趣的是，掺入FN十字基质内的sAgrin恢复了F-肌动蛋白应力纤维网和pMLC富集的横向弧的张力特征(图9i，第三图)。总之，这些结果表明张力感测机制由几何约束下角质形成细胞中的Agrin赋予，从而向着有利于愈合程序的ECM基质的方向对其进行调适。
MMP12在伤口损伤后作为Agrin-机械转导的中介物
为了鉴定伤口损伤后角质形成细胞中Agrin介导机械张力的下游效应物，本发明人通过RNAseq分析对模拟高硬度ECM的塑料中培养的对照细胞与Agrin耗竭的细胞进行了全转录组比较(图11a)。多维标度(Multidimensional scaling，MDS)揭示了对照和Agrin耗竭的大量RNA群体之间的不同基因谱(图11a)。在对硬ECM中由Agrin差异调节的惊人数量的基因进行分层后，选择使用基因本体论(gene ontology，GO)分析得到的几个高度显著的簇(图12a、图11b、表2和表3)。GO、网络和基因集富集分析(GSEA)揭示，在Agrin敲低时急剧下调的大多数基因属于ECM调节，包括ECM的基质组(matrisome)相关和结构组分(图11b-d)。在Agrin耗竭时，在由Agrin调控的前10个显著基因中，包括基质金属蛋白酶(MMP)在内的几种基质组蛋白(matrisomal protein)一致地减少，而其他蛋白如Serpine2、白介素1a-b上调(图12a和11d)。与对细胞迁移的影响一致，GSEA分析还揭示了正调控伤口愈合的基因簇的整体减少(图12b)。我们验证了所选择的一组上调和下调基因的mRNA表达(图11e)。发现包括MMP 12、MMP 10和MMP 1在内的几种MMP的mRNA的表达在Agrin敲低后显著降低。
表2.研究中使用的促炎细胞因子和趋化因子引物
Figure BDA0004032299190000681
表3.小干扰RNA(siRNA)序列
Figure BDA0004032299190000691
下一组实验关注于鉴定在伤口环境中介导Agrin的机械功能的关键MMP。首先，评估MMP 1、MMP 10和MMP 12是否独立地影响伤口刮擦后的角质形成细胞迁移。相应地，敲低MMP 1和MMP 10减少了角化细胞的迁移，而sAgrin处理不能恢复角化细胞的迁移(图13a)。相比之下，MMP12敲低示出了最大的损伤后迁移速度的抑制(图13b)。引人注目的是，在HaCaT细胞中没有观察到伤口损伤后MMP1和MMP10的mRNA水平的一致上调(图13c)。最重要的是，MMP1或MMP10耗竭对降低伤口边缘处的肌动球蛋白张力没有影响(图13d)。当在大的十字图案上培养时，MMP1或MMP10耗竭的细胞未显示出F-肌动蛋白应力纤维网和pMLC富集的横向弧的张力特征的任何减少(图13e)。尽管受Agrin调控，但这些观察结果排除了MMP1或MMP10作为恢复伤口愈合机制的下游中介物的任何显著作用。
MMP12成为在伤口修复中介导Agrin的机械张力的最重要的潜在候选物。在一组永生化和原代角质形成细胞和真皮成纤维细胞培养物中，与其mRNA水平类似，MMP12蛋白水平在Agrin耗竭后显著降低(图14a)。由于Agrin耗竭后mRNA和蛋白质水平均降低，MMP12的明胶和酪蛋白降解催化活性的损失在Agrin沉默的角质形成细胞中明显，其通过补充sAgrin而以剂量依赖性模式恢复(图14b)。
接下来确定MMP12的激活是否是在伤口损伤相关的Agrin富集的环境中Agrin对ECM刚度敏化的结果。首先，将HaCaT细胞培养在单独的软基底(0.8kPa)或具有增加浓度的补充的sAgrin的软基底中培养。重要的是，掺入sAgrin的软基底以剂量依赖性方式强烈稳定MMP12蛋白水平(图12c，第一图)。增强培养的角质形成细胞在用sAgrin调节的软基底中的暴露时间也提高了MMP12水平，表明Agrin严密地模拟ECM刚度诱因以正调节角质形成细胞中的MMP12水平(图12c，右图)。相反，经历硬ECM的细胞中Agrin的消耗导致MMP12水平的显著降低(图12d)。Agrin敲低细胞在感测到来自硬ECM的sAgrin诱因后以剂量依赖性方式恢复其MMP12水平(图12d)。其次，与MMP1或MMP10不同，伤口损伤强烈激活MMP12的mRNA(～4倍)和蛋白质水平，这严格映照于几种皮肤细胞中Agrin过表达时的mRNA和蛋白质水平(图14c、13c和图1b)。早在伤口刮擦后6h，就在迁移前沿处的细胞内检测到了MMP12和Agrin；通过补充sAgrin进一步提高了这种效果，由此模拟了伤口损伤后集体角质形成细胞迁移的良好平台(图14d)。在对照siRNA处理的小鼠皮肤中，介导体内伤口闭合的迁移上皮舌有效表达了MMP12(图14e)。局部Agrin耗竭显著剥夺了弱化的上皮舌内的MMP12水平，其随后未能闭合伤口(图14e)。在体内固定物伤口愈合模型中，Agrin耗竭还强烈抑制了损伤后第4天内的MMP12表达，这导致较差的愈合速率(图14f)。这在体外重现，其中MMP12敲低模拟人永生化和原代小鼠角质形成细胞在伤口后刮擦后的迁移损失，类似于Agrin耗竭的细胞所表现出的(图12e)。综上，这些证据表明伤口应激的Agrin微环境激活MMP12以用于集体角质形成细胞迁移。
数个观察结果进一步暗示MMP12介导了创伤后Agrin诱导的集体迁移。首先，sAgrin无法刺激MMP12耗竭的人和小鼠角质形成细胞中的迁移(图12e)。其次，经历硬底物(30kPa)的角质形成细胞中MMP12的敲低严重阻碍了表达K17的迁移细胞，并且这不能通过提供sAgrin而恢复(图14g)。第三，用MMP408(一种特异性MMP12抑制剂)短期处理角质形成细胞钝化了sAgrin诱导的表达K17的角质形成细胞在软基底中和在正常细胞培养条件下的迁移(图14h-i)。第四，如先前在3D硬度依赖性迁移测定中所报道的，在损伤后，掺入sAgrin的软基质刺激了小鼠角质形成细胞在真皮成纤维细胞上的迁移(图12f，第一图和第二图)。相反，小鼠角质形成细胞和下方的真皮成纤维细胞中的MMP12耗竭完全消除了角质形成细胞迁移，其甚至不能被补充有sAgrin的顺应性基质挽救(图12f，第三图和第四图)。在离体情况下，自补充有sAgrin的软基质诱导的小鼠皮肤外植体生长的增强的K17表达性迁移长出被MMP408抑制剂的存在突然消除(图12g和14j)。
回想到MMP12调节了由Agrin驱动的迁移的事实，合理地将MMP12确定为创伤应激的角质形成细胞中Agrin感测机械张力的中介物。因此，下一组实验聚焦于确定MMP12在响应于富含Agrin的环境时全面调整细胞骨架张力方面的作用，如在早期伤口愈合阶段期间所准备的。创伤后在Agrin充足的角质形成细胞中产生的强健的肌动球蛋白缆线随着MMP12耗竭而被中断，并伴随着伤口边缘处pMLC的显著抑制(图12h)。即使sAgrin处理也没有恢复肌动球蛋白缆线网，这揭示了这些MMP12抑制细胞中细胞骨架取向的明显缺陷(图12h)。同样，在所观察的创伤后2h内，sAgrin处理不能挽救MMP12耗竭的角质形成细胞中严重降低的pMLC水平(图12i)。此外，在以大的十字图案几何延伸时，与对照细胞相比，MMP12敲低的细胞和提供有sAgrin的细胞未表现出F-肌动蛋白应力纤维和横向弧中的pMLC富集(图14k)，表明在伤口损伤后的集体细胞迁移期间Agrin对细胞骨架张力的全面调整需要功能性MMP12。
由于MMP12抑制后集体迁移受损，检查了细胞骨架张力降低是否是由MMP12抑制引起的Agrin的机械转导能力逐渐减弱的结果。为此，发明人首先绘制了在损伤后4h期间MMP12抑制的小鼠角质形成细胞的细胞硬度。引人注目的是，MMP12敲低显著降低了迁移角质形成细胞的硬度，其不能通过sAgrin处理恢复(图14l)。除了降低的细胞硬度之外，在TFM底物上迁移的MMP12敲低的角质形成细胞的牵引应力在迁移前沿处部分降低(图12j)。有趣的是，sAgrin的处理未能在MMP12耗竭的角质形成细胞的迁移前缘处诱导足够的牵引力(图12j)。与对照细胞相比，MMP12敲低抑制了前沿处的均匀速度分布，这进一步降低了补充有sAgrin的细胞中的流体弹性样迁移(图14m)。这些结果表明，Agrin与MMP12结合以向角质形成细胞提供流体迁移行为。此外，在MMP12耗竭后，受伤的角质形成细胞中由Agrin诱导的力传递引起的pMLC活化也受到抑制。FN和sAgrin介导的力传递都不能在创伤后30分钟时挽救MMP12耗竭的细胞中的降低的pMLC强度(图12k)。总之，这些结果揭示，MMP12耗竭的细胞中肌动球蛋白张力的宏观缺陷消除了皮肤损伤后由Agrin赋予的机械感知能力。此外，伤口环境中有助于加速角质形成细胞迁移和伤口闭合的的Agrin机械转导在很大程度上依赖于MMP12。
Agrin不能愈合MMP12缺陷小鼠皮肤中的伤口
为了测试sAgrin是否通过在体内使MMP12参与来赋予机械感受态伤口愈合环境，在创伤后第0天和第10天通过隐形siRNA来耗尽MMP12，所述隐形siRNA有效抑制皮肤MMP12水平(图15a-b)。当与用对照siRNA处理的那些相比时，小鼠皮肤中MMP12表达的抑制延迟了伤口愈合速率(图16a-b)。更重要的是，在损伤后10天内，在sAgrin处理的对照动物中观察到的加速的愈合速率和再上皮化的程度在MMP12耗竭后显著降低(图16a-b)。进一步注意到，对照和sAgrin处理的伤口边缘和伤口床中提高的pMLC表达在MMP12耗竭的皮肤切片中显著减弱(图16c)。此外，在伤口床处的MMP12耗竭后，sAgrin诱导的成熟和混合胶原纤维沉积显著减少(图16d)。因此，MMP12耗竭导致了无机械感受能力(mechanicallyincompetent)的环境，该环境主要失去了ECM补充和肌动球蛋白机械张力，即使当用sAgrin处理时也是如此。在MMP12耗竭的小鼠皮肤的伤口床内还观察到减少的血管生成(更少的血管)(图16e)。因此，当小鼠皮肤中的MMP12被抑制时，sAgrin的处理未能诱导稳健的表达CD-31的血管(图16e)。总之，这些观察结果揭示了sAgrin需要MMP12来在体内产生机械感受态的促血管生成伤口愈合小生境(niche)。
Agrin作为水凝胶材料中的生物添加剂促进伤口愈合
伤口闭合中的Agrin引发的环境促使发明人测试了sAgrin本身是否加速体外和体内伤口愈合，其可作为伤口愈合的生物材料而具有临床相关性。本发明人通过凝胶过滤产生了含有‘z’插入物的sAgrin重组蛋白，其产生对应于23kDa大小的纯化蛋白(图17a)。除了如BrDu掺入测定(图17b)所示的sAgrin支持原代小鼠角质形成细胞增殖的事实之外，当用增加浓度的sAgrin处理角质形成细胞时，注意到加速的迁移速率(图17c)。此外，sAgrin处理还分别增强了表达K17的前导角质形成细胞在体外的迁移，以及离体的自小鼠皮肤外植体的角质形成细胞长出(图17d-e)。在Agrin耗竭的细胞中，经由sAgrin(而非FN)的力传递有效增强了pMLC活化区域中的MMP12募集(图17f)。这些结果揭示Agrin通过支持其增殖阶段而特异性地刺激角质形成细胞迁移。
最后，使用两个独立的全厚度小鼠穿孔活检无固定物和有固定物伤口愈合模型，在两种不同的用于局部施用的水凝胶中评估了当作为生物添加剂提供时sAgrin与对照蛋白的伤口愈合属性。在第一个范例中，将sAgrin或对照蛋白(BSA)掺入凡士林中，作为惰性水凝胶材料用于局部递送至根据无固定物愈合模型的受伤皮肤。测定了以不同浓度掺入凡士林中的sAgrin促进的愈合功效。如所示的，在无固定物伤口愈合模型中，sAgrin以剂量依赖性方式显著加速了小鼠穿孔伤口的愈合速率(图17g)。随后，测试了溶解在Pluronic F-127(作为温敏水凝胶，其广泛用于局部递送)中的单一浓度的sAgrin(200μg)，以监测愈合过程。类似地，当与对照局部水凝胶制剂相比时，经sAgrin促进的水凝胶治疗显著提高了体内伤口愈合的速率(图18a)。sAgrin处理的小鼠皮肤切片的迁移表皮基部处和伤口边缘处的Ki67+ve增殖细胞的增强支持了改善的愈合速率(图17h)。
此外，使用有固定物的伤口愈合小鼠模型测试了sAgrin与作为生物添加剂的鼠尾胶原蛋白-I和BSA相比的功效。在所观察到的损伤后12天内，当与类似浓度的胶原蛋白或BSA相比时，在Pluronic F127内掺入200ug sAgrin显著加速了伤口愈合(图18b)。这些结果表明，Agrin作为生物添加剂可以加速伤口愈合反应，而与用于伤口愈合的两个独立小鼠模型中的局部递送的水凝胶材料无关。此外，在sAgrin处理后，观察到迁移的上皮舌从无固定物伤口的伤口边缘显著延伸(图18c)。在创伤后第10天的固定物条件下，与BSA或胶原蛋白处理组相比，sAgrin处理的动物主要表现出愈合的皮肤，并且在伤口区域附近出现再生的毛囊(图18c)。在无固定物模型伤口愈合的早期阶段(第2天)期间，其还伴随着在接受基于sAgrin的水凝胶的小鼠皮肤的伤口边缘和伤口床处所观察到的稳健的表达K17的角质形成细胞长出、MMP12表达和pMLC活化(图18d-f)。由于在固定物条件下伤口愈合需要更长的时间范围，与BSA或胶原蛋白处理的对应物相比，辨认出在损伤后第7天，在sAgrin处理的动物中K17占据、MMP12表达和pMLC活性也有类似增加(图18d-f)。由于伤口床内的ECM补充指导整个愈合过程，因此当与BSA和胶原蛋白处理组相比时，sAgrin处理的伤口床显示出更高的成熟和混合胶原纤维沉积(图18g)。在无固定物条件下，在第7天，在伤口床内观察到sAgrin对胶原蛋白沉积的类似增强(图17i)。因此，这些数据还表明sAgin促进了伤口床中具有最佳胶原蛋白沉积，以维持伤口愈合小生境内的硬度(图18g和17i)。
已知在伤口愈合过程早期炎症细胞因子的迅速表达启动了有效的皮肤愈合程序。因此，接下来研究了sAgrin是否选择性地激活关键细胞因子和趋化因子以调节与伤口愈合相关的炎症反应。本发明人分析了已知在小鼠皮肤损伤后48小时内诱导的几种细胞因子和趋化因子的mRNA表达。其中，与BSA或胶原蛋白处理组相比，接受sAgrin处理的小鼠皮肤伤口在损伤后48小时内显著诱导TGF-β1、VEGF-A、MCP-1、MIP-1β和MIP-2(图19a)。实际上，当与BSA和胶原蛋白处理的小鼠皮肤伤口组织相比时，在sAgrin处理组中证实了TGF-β1、VEGF-A和MCP-1的增强的蛋白质表达(图19b)。sAgrin使一组高选择性促炎蛋白的及时参与可能为加速伤口愈合程序奠定了基础。
确定由sAgrin引起的改善的愈合速率是否经由伤口床中的持续血管生成而发生对于再生医学领域具有潜在意义。因此，在第6天，在无固定物模型中，在Agrin处理的小鼠皮肤伤口床中观察到血管生成的稳定增强，其中血管数量和它们各自的直径增加(图18h)。与BSA或胶原蛋白相比，在固定物模型中，在损伤后第12天，在sAgrin处理的小鼠皮肤伤口床中也观察到增加的血管数量及其直径(图18h)。因此，体内数据表明Agrin可以增强真皮成纤维细胞和内皮细胞的相互作用，从而增强伤口床内的血管生成活性。为了在体外测试这一点，在人真皮成纤维细胞(GFP标记的BJ)和人真皮微血管内皮细胞(cell-tracker蓝标记的HDMEC)中耗竭Agrin，并使它们经受3D共培养生芽血管生成测定(图20a)。值得注意的是，对照球状体共培养物产生了强烈的生芽，生芽通过分别抑制内皮细胞和成纤维细胞中的Agrin而显著减少(图20b，分别为第二图和第三图)。非常有趣的是，在成纤维细胞和内皮细胞中同时耗竭Agrin导致生芽血管生成的更强消除(图20b)。总之，这些结果表明Agrin通过促进真皮成纤维细胞和内皮细胞之间的相互作用来支持伤口床中的促血管生成环境。因此，除了为用作促进皮肤组织修复的生物材料奠定坚实的平台之外，本研究中的证据表明，局部递送sAgrin通过增强维持最佳ECM沉积、血管生成从而促进集体角质形成细胞迁移的机械转导环境来加速体内伤口愈合。
讨论
伤口愈合代表一个复杂但高度协调的生物程序，其恢复受损组织结构的正常状态。皮肤伤口愈合的顺序特征在于损伤信号触发血凝块形成以限制血流的稳态阶段，然后是对受伤细胞进行清创的炎症阶段。接下来，增殖阶段在被称为再上皮化的过程中控制角质形成细胞增殖、存活和迁移通过创伤区域。所有上述内容的及时执行最终导致了伤口闭合和组织完整性的修复。因此，损伤后的有效角质形成细胞迁移的主要标准取决于新的细胞外基质(ECM)及其组分的沉积速率，所述新的细胞外基质及其组分随后触发有利于愈合过程的血管生成。
除了支架功能之外，ECM充当与其周围组织的“动态通信层”，其通常屏蔽机械应力和/或指示组织平衡不利的外在应力，从而维持组织完整性。此外，皮肤充当优异的机械感受器器官，以分析如何使机械力整合在结构化的组织结构内以维持关键的生物学功能。为了强调皮肤细胞与其周围ECM之间的这种动态机械反馈，大量的可溶性和基质结合蛋白由ECM时空调节。在损伤期间，大部分ECM丢失，使得下方的组织不能响应于大量外在机械应力，这种现象称为机械感知。在遭受损伤时机械感知能力的缺乏在很大程度上导致了影响细胞存活和迁移的肌动球蛋白张力的大规模缺陷。作为有利于解释伤口愈合早期阶段的吸引人的假设，伤口愈合小生境内关键ECM蛋白的从头表达可以通过改善机械感知和潜在地恢复ECM和皮肤组织之间的机械相互作用(mechanoreciprocity)来修复下方的皮肤组织。在这个前提下，首要的兴趣是识别整合机械刺激并在受伤细胞内建立机械感知的关键ECM组分，从而使它们适应伤口应力环境。
在该研究中，发明人研究了Agrin是否通过改善角质形成细胞机械感知来调节机械感受态的伤口微环境，从而强化皮肤组织修复。
在组织损伤时，对紊乱的ECM及其周围组织所作出的整合了机械力、组织压缩、来自ECM的本体应力和细胞的集体迁移等各个方面的综合改变是启动愈合程序所必需的。值得注意的是，这种补充受伤的ECM、从而使伤口环境对不利的物理应力敏感，进而导致有效的愈合反应并限制肥厚性瘢痕形成的协调努力，在再生医学中是至关重要的。本文提供的全面证据揭示了几个重要发现，这些发现促进了我们对伤口愈合中的机械生物学的理解，并为组织修复策略提供了巨大意义。首先，Agrin代表了重要的ECM蛋白聚糖，在受伤的皮肤组织中会触发Agrin的表达，并且这种Agrin富集的微环境调节了机械局势(landscape)以进行高效的伤口愈合(图12g)。其次，Agrin通过使角质形成细胞对不同形式的物理参数(例如本体ECM刚度、机械力和几何约束)敏感来引导它们在创伤部位上进行集体迁移。第三，由Agrin赋予的机械感知能力在伤口损伤后强力地全面修复细胞骨架结构，并且在很大程度上依赖于MMP12的活化。因此，经由MMP12活化的Agrin机械转导提供了一种整合机制，其使受伤的皮肤细胞能够反击由伤口损伤引起的不利机械应力并加速它们的迁移速率。第四，认识到机械感受态的Agrin富集的伤口环境的重要性之后，本研究的结果还另外揭示了适当利用sAgrin作为生物添加剂伤口愈合材料可以为创伤提供巨大的临床价值。
上皮细胞经历广泛范围的物理应力，包括ECM刚度、细胞形状和几何形状的形貌变化、粘附的缺乏和机械力的施加。这些参数中的每一个都决定了伤口环境中的细胞行为，然而，对于使受伤细胞能够对这些物理参数作出响应的ECM蛋白的性质知之甚少。在这一信念的驱动下，Agrin部分地使角质形成细胞敏化，以通过响应于包括本体ECM刚度在内的诸多物理参数来实施集体迁移，在几何约束结构中上移细胞骨架张力，并在外力施加到受伤细胞时充当局部机械转导物(图21)。尽管如此，由于在外力下，整联蛋白的FN接合无法在不存在Agrin的情况下恢复肌动球蛋白缆线，因此响应于伤口微环境的细胞骨架修复幅度和增强的机械感知似乎是独特针对Agrin机械转导的。与细胞向硬化ECM的集体迁移产生更高的牵引力的观点一致，Agrin作为ECM参与者的潜力是至关重要的，其在损伤后赋予了角质形成细胞相当大程度的弹性，帮助它们具有更高的牵引力、细胞骨架张力和改善的运动性。虽然Agrin耗竭独立地抑制角质形成细胞和真皮成纤维细胞中的2D刮擦伤口愈合，但是3D硬度依赖性角质形成细胞成纤维细胞共培养迁移测定显示出真皮成纤维细胞来源的Agrin不足以恢复Agrin耗竭的角质形成细胞在硬基底上的迁移。此外，真皮成纤维细胞中Agrin的敲低不影响具有完整Agrin的覆层角质形成细胞在硬基底上的迁移速率。鉴于未受伤和受伤的角质形成细胞表达比真皮成纤维细胞中更高的Agrin，这些研究系列主张由角质形成细胞表达的Agrin在感知到本体ECM刚度时充当主要调节物来协调在创伤区域上发生的迁移。
创伤后不久Agrin富集环境诱导的动态ECM重组尚未完全建立。该研究中的转录组学数据揭示了在Agrin耗竭的角质形成细胞中胶原蛋白和ECM结构组分的总体损失。鉴于Agrin耗竭延迟了伤口愈合，显然Agrin通过MMP12赋予了综合性的ECM重组信号来维持伤口愈合。这由数个观察结果证实，所述观察结果显示，ECM内整合的sAgrin在体外和离体恢复了角质形成细胞内的迁移反应，其通过MMP12的耗竭或抑制而减弱。例如，当掺入随后活化MMP12的sAgrin时，自紧密模拟下方真皮硬度的胶原蛋白凝胶上的小鼠皮肤外植体生长的角质形成细胞长出强烈地增加。此外，除了操纵组织力学以提供更好的对机械损伤的恢复力之外，sAgrin水凝胶处理在体内通过MMP12活性所阐释的加速愈合效果可能涉及动态ECM重组，如增加的胶原蛋白沉积所表明的。
总之，该研究揭示了损伤触发的Agrin经由角质形成细胞中的MMP12活性迫使机械感知得以增强，从而整合了宽范围的机械刺激，最终有利于伤口愈合。
序列表
<110> 新加坡科技研究局
<120> 伤口愈合组合物及其用途
<130> 73177PCT
<160> 119
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 1
Glu Leu Ala Asn Glu Ile Pro Val
1 5
<210> 2
<211> 184
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 2
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1 5 10 15
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20 25 30
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65 70 75 80
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 4
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Glu Ala Thr Gln Gly Leu Val Leu Trp Ser Gly Lys Ala Thr Glu Arg
35 40 45
Ala Asp Tyr Val Ala Leu Ala Ile Val Asp Gly His Leu Gln Leu Ser
50 55 60
Tyr Asn Leu Gly Ser Gln Pro Val Val Leu Arg Ser Thr Val Pro Val
65 70 75 80
Asn Thr Asn Arg Trp Leu Arg Val Val Ala His Arg Glu Gln Arg Glu
85 90 95
Gly Ser Leu Gln Val Gly Asn Glu Ala Pro Val Thr Gly Ser Ser Pro
100 105 110
Leu Gly Ala Thr Gln Leu Asp Thr Asp Gly Ala Leu Trp Leu Gly Gly
115 120 125
Leu Pro Glu Leu Pro Val Gly Pro Ala Leu Pro Lys Ala Tyr Gly Thr
130 135 140
Gly Phe Val Gly Cys Leu Arg Asp Val Val Val Gly Arg His Pro Leu
145 150 155 160
His Leu Leu Glu Asp Ala Val Thr Lys Pro Glu Leu Arg Pro Cys
165 170 175
<210> 7
<211> 189
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 7
Asp Thr Leu Ala Phe Asp Gly Arg Thr Phe Val Glu Tyr Leu Asn Ala
1 5 10 15
Val Thr Glu Ser Glu Leu Ala Asn Glu Ile Pro Val Glu Lys Ala Leu
20 25 30
Gln Ser Asn His Phe Glu Leu Ser Leu Arg Thr Glu Ala Thr Gln Gly
35 40 45
Leu Val Leu Trp Ser Gly Lys Ala Thr Glu Arg Ala Asp Tyr Val Ala
50 55 60
Leu Ala Ile Val Asp Gly His Leu Gln Leu Ser Tyr Asn Leu Gly Ser
65 70 75 80
Gln Pro Val Val Leu Arg Ser Thr Val Pro Val Asn Thr Asn Arg Trp
85 90 95
Leu Arg Val Val Ala His Arg Glu Gln Arg Glu Gly Ser Leu Gln Val
100 105 110
Gly Asn Glu Ala Pro Val Thr Gly Ser Ser Pro Leu Gly Ala Thr Gln
115 120 125
Leu Asp Thr Asp Gly Ala Leu Trp Leu Gly Gly Leu Pro Glu Leu Pro
130 135 140
Val Gly Pro Ala Leu Pro Lys Ala Tyr Gly Thr Gly Phe Val Gly Cys
145 150 155 160
Leu Arg Asp Val Val Val Gly Arg His Pro Leu His Leu Leu Glu Asp
165 170 175
Ala Val Thr Lys Pro Glu Leu Arg Pro Cys Pro Thr Pro
180 185
<210> 8
<211> 437
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 8
Leu Gly Arg Glu Gly Thr Phe Cys Gln Thr Ala Ser Gly Gln Asp Gly
1 5 10 15
Ser Gly Pro Phe Leu Ala Asp Phe Asn Gly Phe Ser His Leu Glu Leu
20 25 30
Arg Gly Leu His Thr Phe Ala Arg Asp Leu Gly Glu Lys Met Ala Leu
35 40 45
Glu Val Val Phe Leu Ala Arg Gly Pro Ser Gly Leu Leu Leu Tyr Asn
50 55 60
Gly Gln Lys Thr Asp Gly Lys Gly Asp Phe Val Ser Leu Ala Leu Arg
65 70 75 80
Asp Arg Arg Leu Glu Phe Arg Tyr Asp Leu Gly Lys Gly Ala Ala Val
85 90 95
Ile Arg Ser Arg Glu Pro Val Thr Leu Gly Ala Trp Thr Arg Val Ser
100 105 110
Leu Glu Arg Asn Gly Arg Lys Gly Ala Leu Arg Val Gly Asp Gly Pro
115 120 125
Arg Val Leu Gly Glu Ser Pro Val Pro His Thr Val Leu Asn Leu Lys
130 135 140
Glu Pro Leu Tyr Val Gly Gly Ala Pro Asp Phe Ser Lys Leu Ala Arg
145 150 155 160
Ala Ala Ala Val Ser Ser Gly Phe Asp Gly Ala Ile Gln Leu Val Ser
165 170 175
Leu Gly Gly Arg Gln Leu Leu Thr Pro Glu His Val Leu Arg Gln Val
180 185 190
Asp Val Thr Ser Phe Ala Gly His Pro Cys Thr Arg Ala Ser Gly His
195 200 205
Pro Cys Leu Asn Gly Ala Ser Cys Val Pro Arg Glu Ala Ala Tyr Val
210 215 220
Cys Leu Cys Pro Gly Gly Phe Ser Gly Pro His Cys Glu Lys Gly Leu
225 230 235 240
Val Glu Lys Ser Ala Gly Asp Val Asp Thr Leu Ala Phe Asp Gly Arg
245 250 255
Thr Phe Val Glu Tyr Leu Asn Ala Val Thr Glu Ser Glu Leu Ala Asn
260 265 270
Glu Ile Pro Val Glu Lys Ala Leu Gln Ser Asn His Phe Glu Leu Ser
275 280 285
Leu Arg Thr Glu Ala Thr Gln Gly Leu Val Leu Trp Ser Gly Lys Ala
290 295 300
Thr Glu Arg Ala Asp Tyr Val Ala Leu Ala Ile Val Asp Gly His Leu
305 310 315 320
Gln Leu Ser Tyr Asn Leu Gly Ser Gln Pro Val Val Leu Arg Ser Thr
325 330 335
Val Pro Val Asn Thr Asn Arg Trp Leu Arg Val Val Ala His Arg Glu
340 345 350
Gln Arg Glu Gly Ser Leu Gln Val Gly Asn Glu Ala Pro Val Thr Gly
355 360 365
Ser Ser Pro Leu Gly Ala Thr Gln Leu Asp Thr Asp Gly Ala Leu Trp
370 375 380
Leu Gly Gly Leu Pro Glu Leu Pro Val Gly Pro Ala Leu Pro Lys Ala
385 390 395 400
Tyr Gly Thr Gly Phe Val Gly Cys Leu Arg Asp Val Val Val Gly Arg
405 410 415
His Pro Leu His Leu Leu Glu Asp Ala Val Thr Lys Pro Glu Leu Arg
420 425 430
Pro Cys Pro Thr Pro
435
<210> 9
<211> 177
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 9
Ala Pro Val Pro Ala Phe Glu Gly Arg Ser Phe Leu Ala Phe Pro Thr
1 5 10 15
Leu Arg Ala Tyr His Thr Leu Arg Leu Ala Leu Glu Phe Arg Ala Leu
20 25 30
Glu Pro Gln Gly Leu Leu Leu Tyr Asn Gly Asn Ala Arg Gly Lys Asp
35 40 45
Phe Leu Ala Leu Ala Leu Leu Asp Gly Arg Val Gln Leu Arg Phe Asp
50 55 60
Thr Gly Ser Gly Pro Ala Val Leu Thr Ser Ala Val Pro Val Glu Pro
65 70 75 80
Gly Gln Trp His Arg Leu Glu Leu Ser Arg His Trp Arg Arg Gly Thr
85 90 95
Leu Ser Val Asp Gly Glu Thr Pro Val Leu Gly Glu Ser Pro Ser Gly
100 105 110
Thr Asp Gly Leu Asn Leu Asp Thr Asp Leu Phe Val Gly Gly Val Pro
115 120 125
Glu Asp Gln Ala Ala Val Ala Leu Glu Arg Thr Phe Val Gly Ala Gly
130 135 140
Leu Arg Gly Cys Ile Arg Leu Leu Asp Val Asn Asn Gln Arg Leu Glu
145 150 155 160
Leu Gly Ile Gly Pro Gly Ala Ala Thr Arg Gly Ser Gly Val Gly Glu
165 170 175
Cys
<210> 10
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 10
Pro Pro Lys Pro Cys Asp Ser Gln Pro Cys Phe His Gly Gly Thr Cys
1 5 10 15
Gln Asp Trp Ala Leu Gly Gly Gly Phe Thr Cys Ser Cys Pro Ala Gly
20 25 30
Arg Gly Gly Ala Val Cys Glu
35
<210> 11
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 11
Gly Asp His Pro Cys Leu Pro Asn Pro Cys His Gly Gly Ala Pro Cys
1 5 10 15
Gln Asn Leu Glu Ala Gly Arg Phe His Cys Gln Cys Pro Pro Gly Arg
20 25 30
Val Gly Pro Thr Cys Ala
35
<210> 12
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 12
Glu Lys Ser Pro Cys Gln Pro Asn Pro Cys His Gly Ala Ala Pro Cys
1 5 10 15
Arg Val Leu Pro Glu Gly Gly Ala Gln Cys Glu Cys Pro Leu Gly Arg
20 25 30
Glu Gly Thr Phe Cys Gln
35
<210> 13
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 13
Ala Gly His Pro Cys Thr Arg Ala Ser Gly His Pro Cys Leu Asn Gly
1 5 10 15
Ala Ser Cys Val Pro Arg Glu Ala Ala Tyr Val Cys Leu Cys Pro Gly
20 25 30
Gly Phe Ser Gly Pro His Cys Glu
35 40
<210> 14
<211> 582
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 14
catatggaca ccctggcgtt cgatggtcgt acctttgttg agtacctgaa cgcggtgacc 60
gagagcgaac tggcgaacga gatcccggtt gaaaaggcgc tgcagagcaa ccacttcgag 120
ctgagcctgc gtaccgaagc gacccaaggt ctggtgctgt ggagcggcaa agcgaccgaa 180
cgtgcggact acgttgcgct ggcgattgtg gatggtcacc tgcagctgag ctataacctg 240
ggcagccaac cggtggttct gcgtagcacc gttccggtga acaccaaccg ttggctgcgt 300
gtggttgcgc accgtgagca gcgtgaaggt agcctgcaag ttggcaacga agcgccggtg 360
accggtagca gcccgctggg tgcgacccag ctggacaccg atggtgcgct gtggctgggt 420
ggcctgccgg aactgccggt tggtccggcg ctgccgaagg cgtatggtac cggctttgtg 480
ggttgcctgc gtgacgtggt tgttggtcgt cacccgctgc acctgctgga ggatgcggtt 540
accaaaccgg aactgcgtcc gtgcccgacc ccgtaaggat cc 582
<210> 15
<211> 1326
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 15
catatgctgg gtcgtgaggg caccttctgc caaaccgcga gcggtcaaga tggtagcggt 60
ccgtttctgg cggatttcaa cggttttagc cacctggaac tgcgtggcct gcacaccttc 120
gcgcgtgacc tgggcgagaa gatggcgctg gaagtggttt ttctggcgcg tggtccgagc 180
ggtctgctgc tgtacaacgg ccagaagacc gacggtaaag gcgatttcgt tagcctggcg 240
ctgcgtgacc gtcgtctgga gtttcgttat gatctgggta aaggtgctgc ggttattcgt 300
agccgtgagc cggtgaccct gggtgcgtgg acccgtgtga gcctggaacg taacggtcgt 360
aagggtgcgc tgcgtgttgg tgatggtccg cgtgtgctgg gcgagagccc ggttccgcac 420
accgtgctga acctgaagga accgctgtac gttggtggcg cgccggactt cagcaagctg 480
gcgcgtgcgg cggcggttag cagcggtttt gatggcgcga ttcagctggt tagcctgggt 540
ggccgtcaac tgctgacccc ggagcacgtg ctgcgtcaag ttgacgttac cagctttgcg 600
ggtcacccgt gcacccgtgc gagcggtcat ccgtgcctga acggtgcgag ctgcgttccg 660
cgtgaagcgg cgtacgtgtg cctgtgcccg ggtggcttta gcggtccgca ctgcgagaag 720
ggtctggtgg agaagagcgc gggtgacgtg gataccctgg cgttcgatgg ccgtaccttt 780
gttgagtatc tgaacgcggt gaccgagagc gaactggcga acgagatccc ggttgaaaag 840
gcgctgcaga gcaaccactt cgagctgagc ctgcgtaccg aagcgaccca aggtctggtg 900
ctgtggagcg gcaaagcgac cgaacgtgcg gactacgttg cgctggcgat tgtggatggt 960
cacctgcagc tgagctataa cctgggcagc caaccggtgg ttctgcgtag caccgttccg 1020
gtgaacacca accgttggct gcgtgtggtt gcgcaccgtg agcagcgtga aggtagcctg 1080
caagttggca acgaagcgcc ggtgaccggt agcagcccgc tgggtgcgac ccagctggac 1140
accgatggtg cgctgtggct gggtggcctg ccggaactgc cggttggtcc ggcgctgccg 1200
aaggcgtatg gtaccggctt tgtgggttgc ctgcgtgacg tggttgttgg tcgtcacccg 1260
ctgcacctgc tggaggatgc ggttaccaaa ccggaactgc gtccgtgccc gaccccgtaa 1320
ggatcc 1326
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 16
gatgcacgca cctcgatgt 19
<210> 17
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 17
ggcccccctg gcatt 15
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 18
gaccccagac aaatgtgatc ct 22
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 19
ttcaggctcg ggattcca 18
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 20
cctagtctat tcatagctaa tcaaga 26
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 21
agtggaggaa agctgtgcat ac 22
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 22
aaagcgaccg gcaatataaa 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 23
atagctcagg acccgatttg 20
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 24
acgcagctct gtgtcaaagg t 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 25
tgatgaacga gactcgacag c 21
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 26
gcgggagcga gcagatccag 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 27
ggaagctggc aaactggcag 20
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 28
tctcattgca agatcatcgc c 21
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 29
ccccatgaat aacacagcac c 21
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 30
ttagaggaga aatgccaagg aa 22
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 31
cactgatgaa ggaggaagga ag 22
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 32
tggactctcc ggattgacca agtt 24
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 33
atttgggata gttggctcct cgct 24
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 34
cccatctatc agcaggctcc 20
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 35
aaagcgatac cgccttctg 19
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 36
taagaatgct tccaggacca ctc 23
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 37
gctgtaacat ctgccgattt ttc 23
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 38
ctcggcatga atctgatgaa tg 22
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 39
tggcagttcc cacgttattg 20
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 40
tggactatca gctccgctac tatg 24
<210> 41
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 41
gtggcagtgt tggtctcgc 19
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 42
ctacacgcta caccctcgac 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 43
acgtcctcac accaggaaac 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 44
gcgcccaaac cgaagtcata 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 45
atgggggatg caggattgag 20
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 46
ccgtatttct actcggatgc tg 22
<210> 47
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 47
tggcttgggt ttcctgtc 18
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 48
ggactcagct ccatgtctat cc 22
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 49
actgaggtct cccctaagat cc 22
<210> 50
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 50
gagaaagtgg ttgagagg 18
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 51
gtaatcaacg acggcaag 18
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 52
tgacaggatg cagaaggaga tta 23
<210> 53
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 53
agccaccgat ccacacaga 19
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 54
ctataaattg agcccgcagc 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 55
gaccaaatcc gttgactccg 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 56
acaccgtcct caacctgaag 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 57
ccaggttgta gctcagttgc 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 58
cggccccgcc atggagctcc 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 59
ggcagttacc gccaccgggg 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 60
agcatggacg tggctgtgcc 20
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 61
ggcgtgcgtg tgtagcctgt 20
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 62
aatggcacgg actaatttgc 20
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 63
tatgagggtt tgtggggtgt 20
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 64
aatgctgcag ccccaaggaa t 21
<210> 65
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 65
ctgggcaact ggacaactca actc 24
<210> 66
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 66
catcactgcc acccagaaga ctg 23
<210> 67
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 67
atgccagtga gcttcccgtt cag 23
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 68
gcctcaaacc ttccaaatca 20
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 69
tggatccatt tcctcaaagg 20
<210> 70
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 70
cctgtccaaa ctaaggc 17
<210> 71
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 71
ggttttctca tagatggcg 19
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 72
gtacctccac catgccaagt 20
<210> 73
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 73
tcacatctgc aagtacgttc g 21
<210> 74
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 74
ccttccagga tgaggacatg a 21
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 75
tgagtcacag aggatgggct c 21
<210> 76
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 76
cctccaactg tctaccagtt cc 22
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 77
gcctggctaa gttattgtgc 20
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 78
tgaatgcctg agagtcttgg 20
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 79
ttggcagcaa acagcttatc 20
<210> 80
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 80
tgctcgtggc tgccttct 18
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 81
caggaagtgg gagggtcaga 20
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 82
cgcccagaca gaagtcatag 20
<210> 83
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 83
tcctcctttc caggtcagtt a 21
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 84
tgcacccaaa ccgaagtcat 20
<210> 85
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 85
ttgtcagaag ccagcgttca c 21
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 86
caagctcatc tgtgcagacc 20
<210> 87
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 87
cgcctgtagt gcataagagt cc 22
<210> 88
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 88
caccactccc tgctgctt 18
<210> 89
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 89
acacttggcg gttccttc 18
<210> 90
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 90
taggctggag atctacaaga gg 22
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 91
agtgcttgag gtggttgtgg 20
<210> 92
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 92
agccttccgc taccttctta 20
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 93
gctgttgcct ttgttcttgg 20
<210> 94
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 94
cgtgtggata caggatgttg acag 24
<210> 95
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 95
aggaggagcc catctttctg taac 24
<210> 96
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 96
ggttcacgat cctgctcctg ac 22
<210> 97
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 97
gctgggcctg agaacactca ag 22
<210> 98
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 98
tgagcaagag aggccctatc 20
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 99
aggcccctcc tgttattatg 20
<210> 100
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 100
gcctcttctc attcctgctt g 21
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 101
ctgatgagag ggaggccatt 20
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 102
acggccttcc ctacttcaca 20
<210> 103
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 103
catttccacg atttcccaga 20
<210> 104
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 104
cgtgcgtgac atcaaagaga a 21
<210> 105
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 105
tggatgccac aggattccat 20
<210> 106
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 106
ccuuugucga guaccucaac gcugu 25
<210> 107
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 107
acagcguuga gguacucgac aaagg 25
<210> 108
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 108
cauacggcaa cgagugucag cugaa 25
<210> 109
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 109
uucagcugac acucguugcc guaug 25
<210> 110
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 110
gcgauuuaug gacuuugacu gguuu 25
<210> 111
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 111
aaaccaguca aaguccauaa aucgc 25
<210> 112
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 112
ggagaccugc caguuuaacu cugua 25
<210> 113
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 113
uacagaguua aacuggcagg ucucc 25
<210> 114
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 114
agguucccuu caggugggca augaa 25
<210> 115
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 115
uucauugccc accugaaggg aaccu 25
<210> 116
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 116
ccaaaguccu gugauuccca gccuu 25
<210> 117
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 117
aaggcuggga aucacaggac uuugg 25
<210> 118
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 118
ggagcucacg gagacuucaa cuauu 25
<210> 119
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 119
aauaguugaa gucuccguga gcucc 25

Claims (15)

1.一种药物组合物，其包含Agrin片段或其衍生物，其中所述Agrin片段或其衍生物包含Agrin的LG3结构域和在所述LG3结构域的z位点处的八氨基酸插入物ELANEIPV(SEQ IDNO：1)。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中在所述z位点处没有任何插入物的Agrin的LG3结构域包含序列
Figure FDA0004032299180000011
3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述Agrin片段或其衍生物包含序列
Figure FDA0004032299180000012
4.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述Agrin片段或衍生物进一步包含Agrin的LG2结构域。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中在y位点处没有任何插入物的Agrin的LG2结构域包含序列
Figure FDA0004032299180000013
6.根据权利要求4或权利要求5所述的药物组合物，其中所述Agrin片段或其衍生物包含序列
Figure FDA0004032299180000021
7.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述Agrin片段或其衍生物是可溶的。
8.一种载体，其包含编码Agrin片段或其衍生物的核酸分子，其中所述Agrin片段或其衍生物包含Agrin的LG3结构域和在LG3结构域的z位点处的八氨基酸插入物ELANEIPV(SEQID NO：1)。
9.一种宿主细胞，其包含根据权利要求8所述的载体。
10.一种水凝胶或支架，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的药物组合物。
11.根据权利要求10所述的水凝胶，其中所述水凝胶是惰性水凝胶或温敏水凝胶。
12.根据权利要求1至7中任一项所述的药物组合物，或根据权利要求10或11所述的水凝胶，或根据权利要求10所述的支架，其用于治疗。
13.一种治疗伤口的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用药学有效量的根据权利要求1至7中任一项所述的药物组合物、或根据权利要求10或11所述的水凝胶、或根据权利要求10所述的支架。
14.药学有效量的根据权利要求1至7中任一项所述的药物组合物、或根据权利要求10或11所述的水凝胶、或根据权利要求10所述的支架在制备用于治疗伤口的药物中的用途。
15.根据权利要求13所述的方法或根据权利要求14所述的用途，其中所述伤口是缓慢愈合的伤口或不愈合的伤口。
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