BR112015028367B1

BR112015028367B1 - agente que provê atividade de fator de crescimento de epiderme de ligação de heparina (hb-egf), formulação farmacêutica para tratamento de perfuração crônica de membrana de tímpano e uso destes

Info

Publication number: BR112015028367B1
Application number: BR112015028367-5A
Authority: BR
Inventors: Peter Luke Santa Maria; Yunzhi Peter Yang; Sungwoo KIM; Chloe Domville-Lewis
Original assignee: The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University
Priority date: 2013-05-15
Filing date: 2014-04-09
Publication date: 2020-12-01
Also published as: PH12015502577B1; RU2018146249A; ZA201508289B; HUE049294T2; LT2996709T; KR102318748B1; CN105555296A; PL2996709T3; MX2020001319A; BR122020011229B1; JP2016520080A; US11235027B2; IL242454B; EP2996709A4; US20180256684A1; US20160074476A1; HK1217166A1; AU2019200630B2; EP2996709B1; MX2015015774A

Abstract

AGENTE QUE PROVÊ ATIVIDADE DE FATOR DE CRESCIMENTO DE EPIDERME DE LIGA-ÇÃO DE HEPARINA (HB-EGF), FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA PARA TRATAMENTO DE PERFURAÇÃO CRÔNICA DE MEMBRANA DE TÍMPANO E USO DESTES. A presente invenção refere-se a composições e processos que são providos para a regeneração ou o tratamento de perfuração crônica de membrana de tímpano através de modulação de atividade de HB-EGF.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[001] Perfuração da membrana de tímpano ™ surge mais comu- mente como um resultado de tanto otite média ou trauma. Clinicamente, as manifestações mais comuns de perfuração de TM são perda de audição condutiva e infecção crônica. A causa mais comum de perfuração de TM é infecção. Perfurações associadas com meios de otite aguda não complicada são usualmente pequenas; a vasta maioria cura espontaneamente uma vez a infecção tenha acalmado. Em adição, perfurações grandes podem resultar de infecção com organismos ne- crosantes. Trauma para o ouvido é a outra causa principal de perfurações TM. Causas comuns de dano são insultos rombudos e penetran-tes, rápidas mudanças de pressão barométrica (barotrauma), e excessiva pressão acústica.

[002] Seguindo dano, tecido é conhecido sofrer vários estágios de cura. Embora cura de ferimento na membrana de tímpano envolva estágios iniciais hemostáticos e inflamatórios que são similares a cura de pele convencional, as fases proliferativa e migratória de membrana de tímpano são distintamente diferentes daquelas de outros tecidos. Em maioria de situações de cura de ferimento, um leito de tecido de granulação se forma, que serve como uma plataforma sobre a qual ocorre re-epitelização. Na cura da membrana de tímpano estes eventos ocorrem em uma maneira reversa. A camada epitelial escamosa inicialmente forma uma ponte através de ferimento, e somente então é seguida pela nova formação de componente fibroso. A TM é única em que a camada epidérmica desempenha o papel inicial crítico em migração, com a camada de proliferação basal controlando este proces- so.

[003] Maior parte de perfurações de membrana de tímpano se cura espontaneamente, entretanto, um número de fatores pode retardar ou evitar fechamento, resultando em uma perfuração crônica. Perfurações persistentes surgem comumente no cenário de infecção persistente que prejudica o processo de reparação. Nestas situações, o processo de cura regenerativa de membrana é frustrado, evitando quimiotaxia e subsequente migração epitelial através de ferimento. Histologicamente, em perfurações crônicas, epitélio escamoso cresce sobre a borda da perfuração para encontrar a camada de mucosa medial da TM.

[004] Tratamento para perfuração de TM crônica inclui como metas o tratamento ou prevenção de meios de otite crônica e restauração de ferimento. Terapia convencional inclui o uso de enxertos de tecidos, por exemplo, autoenxertos empregados em timpanoplastia podem usar temporalis fascia como um autoenxerto. Fascia temporal superficial composta por fibroblastos em uma matriz de colágeno pode ser usada. Embora timpanoplastia com um enxerto de tecido conjuntivo autólogo seja um processo altamente bem sucedido para o reparo de perfurações persistentes de TM, pode ser benéfico desenvolver-se um procedimento que não necessite conhecimentos de micro cirurgia, seja mais barato, e possa ser aplicado em uma instalação de escritório. A presente invenção é endereçada a esta necessidade.

PUBLICAÇÕES

[005] Santa Maria et al. (2010) J Mol Histol. 2010 Dec;41(6):309- 14. Santa Maria (2011) Thesis, University of Western Australia. Johnson and Wang (2013) J Control Release 166(2):124-9. Ishihara et al. (2003) J Biomed Mater Res A. 64(3):551-9. Tolino et al. (2011) Bio- chim Biophys Acta. 1810(9):875-8; Shirakata et al. (2005) J Cell Sci. 118(Pt 11):2363-70; Hüttenbrink (2005) HNO 53(6):515-6; Ma et al. (2002) Acta Otolaryngol. 122(6):586-99. WO 2007/037514. US 2010/222265.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] Composições e processos são providos para o tratamento de perfuração de membrana de tímpano crônica. Nos processos da invenção, uma membrana de tímpano perfurada cronicamente é topicamente contatada com uma dose ativa de fator de crescimento epidérmico de ligação de heparina, HB-EGF, ou um agente tendo atividade HB-EGF, por um período de tempo suficiente para prover aperfeiçoada cura da perfuração de membrana. Em algumas concretizações, a dose de HB-EGF é provida em uma formulação de liberação sustentada; em outras concretizações, administração regular de uma formulação de liberação não sustentada é provida. Em algumas concretiza-ções, uma formulação de liberação sustentada é biodegradável. Em outras concretizações, liberação sustentada é provida por um dispositivo, por exemplo, uma bomba ou outro dispositivo de liberação.

[007] A TM sendo tratada é contatada com HB-EGF por um período de tempo suficiente para aperfeiçoar cura da perfuração de TM, isto é, para resultar em substancial fechamento da perfuração, por exemplo, para uma perfuração de menos que cerca de 0,1 mm2 em área. O fechamento pode ser monitorado visualmente, incluindo microscopicamente; funcionalmente, por exemplo, em redução de perda de audição; e semelhantes. O período de tempo para contato com HB- EGF pode ser de pelo menos um dia, pelo menos 3 dias, pelo menos 5 dias, pelo menos 7 dias, pelo menos 10 dias, pelo menos 2 semanas, pelo menos 3 semanas; e pode ser até um dia, até 3 dias, até 5 dias, até 7 dias, até 10 dias, até 2 semanas, até 3 semanas, ou mais de acordo com as necessidades do indivíduo.

[008] Em certas concretizações específicas, a dose efetiva de HB-EGF é provida em uma formulação de liberação sustentada não citotóxica, por exemplo, gel, espuma, inserção, etc., preferivelmente uma formulação biodegradável. Em uma tal concretização, uma dose efetiva de HB-EGF é formulada em um gel compreendendo quitosano, ácido poli lático, e fibrinogênio.

[009] Em uma concretização, a invenção compreende um processo de (i) identificação de um paciente tendo uma perfuração crônica da TM; (ii) contato de TM afetada com uma dose efetiva de HB- EGF, por exemplo, provida na forma de de gotas para serem administradas em intervalos apropriados, em um dispositivo para liberação sustentada de HB-EGF, em uma formulação de liberação sustentada, etc.; e (iii) monitoração de indivíduo para determinar efetivo fechamento da perfuração.

[0010] Um outro aspecto da presente invenção refere-se ao uso de um agente com atividade HB-EGF na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma perfuração crônica da TM, onde o medicamento é administrado a um paciente tendo uma perfuração crônica da TM por um período de tempo e dose suficientes para efetuar um fechamento da perfuração.

[0011] Ainda um outro aspecto da presente invenção provê um kit para tratamento de perfuração crônica da TM. O kit inclui uma formulação que provê uma dose efetiva de HB-EGF, por exemplo, na forma de gotas, dispositivos, formulações, e semelhantes. O kit também pode incluir um dispositivo de liberação, por exemplo, dispensador de gota de ouvido, seringa para liberação de uma formulação, seringa de cilindro dual para liberação de uma formulação de duas partes; e semelhantes. O kit também pode compreender instruções para uso.

[0012] Em outras concretizações, são providos processos para abertura temporária da membrana de tímpano, por exemplo, para inserção de tubos, e semelhantes. Em tais concretizações, uma TM é contatada com uma dose efetiva de um inibidor de HB-EGF, incluindo sem limitação um inibidor de difusão de ligante de EGFR, por um período de tempo suficiente para criar uma pequena perfuração na TM. Em algumas tais concretizações, uma pequena perfuração pode ser feita mecanicamente antes de contatada com o inibidor.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0013] Figura 1. Imagens representativas de TMs seguindo perfurações tratadas com OSU8-1 (um inibidor de difusão de ligante de EGFR) em (a) dia 2 (b) dia 14 (c) dia 44 (d) dia 90 (3 meses). A perfuração é destacada em azul.

[0014] Figura 2. Limites ABR e DPOAE são medidos 60 dias após ambos os tímpanos serem cirurgicamente perfurados em 9 camundongos. Um ouvido não teve injeção (controle), enquanto o ouvido oposto foi enchido com veículo de liberação de polímero de quitosano, fibrinogênio e polilactídeo.

[0015] Figura 3. ET antes (a) e após (b) oclusão com gutta percha. O procedimento no rato foi adaptado através de abertura de bulla usando um dispositivo de gravação com um cinzel de 0,5 mm. Abertura de bolha lateralmente permite a gutta percha ser alimentada abaixo de ET com menos retração de via aérea. ETs foram examinados post mortem confirmando completa oclusão.

[0016] Figura 4. Tratamento GF de perfurações crônicas em um modelo de camundongo de oclusão de ET. A fila superior (a) são imagens representativas do grupo de tratamento mostrando perfurações curadas. A fileira inferior (b) são imagens representativas do grupo controle (somente polímero) mostrando perfuração persistente (destaque azul). Nota: algumas TMs na parte superior curaram com tímpano esclerose.

[0017] Figura 5. Liberação de fator de crescimento trans-tímpano..

[0018] Figura 6. Liberação de fator de crescimento trans- timpânico.

[0019] Figura 7. Liberação de fator de crescimento trans-tímpano.

[0020] Figura 8. Liberação de fator de crescimento intra-tímpano.

[0021] Figura 9. Veículo de liberação de fármaco adjacente à membrana de tímpano.

[0022] Figura 10. Formulação de escoável de liberação de fárma- co.

[0023] As características e muitas outras vantagens da invenção tornar-se-ão melhor entendidas através de referência à seguinte descrição detalhada quando tomada em conjunção com os desenhos acompanhantes.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES

[0024] Antes da presente invenção ser ainda descrita, é para ser entendido que a invenção não é limitada às particulares concretizações da invenção descrita abaixo, quando variações das particulares concretizações podem ser feitas e ainda caem dentro do escopo das reivindicações apostas. Também é para ser entendido que a terminologia empregada é para o propósito de descrição de particulares concretizações, e não é pretendida ser limitante. Neste relatório descritivo e as reivindicações apostas, as formas singulares "um", "uma" e "o" incluem referência plural a menos que o contexto dite de outro modo.

[0025] Onde uma faixa de valores é provida, é entendido que cada valor interveniente, para o décimo da unidade do limite inferior a menos que o contexto claramente dite de outro modo, entre o limite superior e inferior daquela faixa, e qualquer outro valor estabelecido ou interveniente naquela faixa estabelecida, é abrangido na invenção. Os limites superior e inferior destas faixas menores podem ser independentemente incluídos nas faixas menores, e também são abrangidos na invenção, sujeitos a qualquer limite especificamente excluído na faixa estabelecida. Onde a faixa estabelecida inclui um ou ambos dos limites, faixas excluindo qualquer ou ambos daqueles limites incluídos também são incluídas na invenção.

[0026] A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado como comu- mente entendido por aqueles versados na técnica à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer processos, dispositivos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou teste da invenção, processos ilustrativos, dispositivos e materiais são agora descritos.

[0027] Todas as publicações aqui mencionadas são aqui incorporadas para o propósito de descrição e exposição de componentes objetos da invenção que são descritos nas publicações, cujos componentes podem ser usados em conexão com a invenção presentemente descrita.

[0028] A presente invenção foi descrita em termos de particulares concretizações verificadas ou propostas pelo presente inventor para compreender modos preferidos para a prática da invenção. Será apreciado por aqueles versados na técnica que, à luz da presente exposição, numerosas modificações e mudanças podem ser feitas nas particulares concretizações exemplificadas sem fugir do escopo pretendido da invenção. Por exemplo, devido a considerações de equivalência funcional biológica, mudanças podem ser feitas em estrutura de proteína sem afetar a ação biológica em tipo ou quantidade. Todas tais modificações são pretendidas serem incluídas no escopo das reivindicações apostas.

DEFINIÇÕES

[0029] Os termos usados neste relatório descritivo têm genericamente seus significados comuns na técnica, dentro do contexto desta invenção e no contexto específico onde cada termo é usado. Certos termos são discutidos abaixo, ou em outro lugar no relatório descritivo, para provimento de adicional orientação na descrição das composi- ções e processos da invenção e como realizar e usar os mesmos.

[0030] Sujeito. Indivíduos para tratamento com os processos da invenção podem ser de qualquer espécie mamífera ou ave, incluindo humanos. Animais não humanos incluem, sem limitação, mamíferos, animais de laboratório como camundongos, ratos, coelhos, porquinhos da Índia, chinchilas, etc.; animais domésticos como cães e gatos; e animais de fazenda como carneiro, cabras, porcos, cavalos, e vacas. Um animal não humano da presente invenção pode ser um animal mamífero ou não mamífero; um vertebrado ou um invertebrado.

[0031] "Tratamento" de um sujeito ou "tratando" um sujeito para uma doença ou condição aqui significa reduzindo ou aliviando sintomas clínicos da doença ou condição tal como perfuração crônica de TM.

[0032] "Promover", "aperfeiçoar", ou "melhorar" membrana de tímpano ou curando ferimento genericamente significa aumentando a velocidade na qual o ferimento ou perfuração cura ou reduz a extensão de cicatriz ou queloide residual ou tecido necrótico durante ou após cura do ferimento ou perfuração.

[0033] Um "ferimento" é uma quebra ou descontinuidade na estrutura de um órgão ou tecido, incluindo epitélio, tecido conjuntivo, e tecido de músculo. Exemplos de ferimentos incluem, mas não são limitados a, ferimentos de pele, machucados, úlceras, escaras de decúbito, escoriações, lacerações, cortes, perfurações, ferimentos de psoríase, perfurações de membrana de tímpano, abrasões de córnea, e quebras e queimaduras.

[0034] Aplicação "tópica" refere-se à administração local não sistêmica de um ingrediente ativo a uma superfície de um ferimento.

[0035] Membrana de tímpano. A membrana de tímpano é uma membrana com forma de cone, fina que separa o ouvido externo do ouvido médio em humanos e outros mamíferos. Sua função é transmi- tir som a partir do ar para os ossículos dentro de ouvido médio, e então para a janela oval na cóclea cheia de fluido. Portanto, ela por último converte e amplifica vibração no ar para vibração em fluido. O osso malleus faz ponte na folga entre a membrana do tímpano e os outros ossículos.

[0036] Existem duas regiões genéricas da membrana de tímpano: a membrana flácida e a membrana tensa. A membrana flácida consiste em duas camadas, é relativamente frágil, e está associada com disfunção de tubo eustaquiano e colesteatomas. A região de membrana tensa maior consiste em três camadas: pele, tecido fibroso, e mucosa. Ela é comparativamente robusta, e é a região mais comumente associada com perfurações.

[0037] Ruptura ou perfuração da TM pode resultar de uma variedade de traumas, de infecção, e semelhantes. Perfurações da TM podem resultar em uma perda de audição condutora (CHL) que varia de desprezível a 50 dB. Perfurações podem variar em área e localização, por exemplo, anterior, posterior ou ambas; e em área de cerca de 0,1 a cerca de 60 mm2, genericamente na faixa de cerca de 2,5 a 10 mm2 (ver Mehta et al. (2006) Otol Neurotol. 27(2): 136-143). Perfuração pode ser aguda ou crônica. Perfuração aguda é genericamente não tratada, na medida em que a TM usualmente tem autocura. Entretanto, em alguns indivíduos a TM não cura, conduzindo a uma perfuração crônica.

[0038] Perfuração crônica da membrana de tímpano. Uma perfuração que não cura na ausência de tratamento, ou quando tratada através de processos convencionais, por exemplo, com tratamento de antibiótico, pode ser considerada uma perfuração crônica. Será entendido por aqueles versados na técnica que podem haver diferenças no comprimento de tempo requerido para cura entre indivíduos, mas genericamente uma perfuração que não é curada após até cerca de 3 meses, após até cerca de 2 meses, após até cerca de 1 mês, pode ser classificada como uma condição crônica.

[0039] Ferimentos crônicos ou que não curam são ferimentos abertos que falham para epitelializar e fechar em uma razoável quantidade de tempo. Estes ferimentos são clinicamente estagnantes e sem evidência de ainda fechamento. Ferimentos crônicos podem ser pensados como carecendo de apropriados sinais de "início". (Ver, por exemplo, Lorenz and Longaker, em Wounds: Biology, Pathology, e Management, Chapter 7, pp 77-88).

[0040] "Fator de crescimento epidérmico de ligação de heparina", como aqui usado, refere-se a fator de crescimento epidérmico de ligação de heparina, ocorrendo endogenamento em mamífero, por exemplo, humano, fator de crescimento epidérmico de ligação de heparina alélico, derivados conservadores funcionais de fator de crescimento de epiderme de ligação de heparina, fragmentos de fator de crescimento de ligação de heparina funcionalmente ativos e homólogos de fator de crescimento de epiderme de ligação de heparina, tal como fator de crescimento semelhante a fator de crescimento de ligação de hepari- na. HB-EGF também refere-se a formas variantes de HB-EGF, por exemplo, que provêm atividade aperfeiçoada, aumentada estabilidade, maior rendimento ou melhor solubilidade. Composições para uso nos processos da invenção podem compreender uma ou um coquetel de atividades HB-EGF, por exemplo, compreendendo uma pluralidade de diferentes moléculas de HB-EGF. Genericamente uma atividade HB- EGF, como aqui usada, refere-se a ligação ao receptor cognato, ativação do receptor, atividades biológicas que ocorrem como um resultado de ligação de receptor e ativação, e semelhantes.

[0041] HB-EGF é o fator de crescimento predominante na epitelia- lização requerida para cura de ferimento cutâneo. Os efeitos mitogêni- cos e migratórios de HB-EGF sobre ceratinócitos e fibroblastos promo- vem reparo dérmico e angiogênese necessários para cura de ferimento e é um componente principal de fluidos de ferimento. Ligação de superfície de célula de HB-EGF a proteoglicanos sulfato de heparano aperfeiçoa capacidades de promoção de mitogênio aumentando a taxa de cura de ferimento de pele, diminuindo tempos de cura de enxerto de pele humana, e promove rápida cura de úlceras, queimaduras, e ferimentos de espessura de rompimento de epiderme.

[0042] HB-EGF é sintetizado como uma glicoproteína quimiotática e mitogênica ancorada em membrana. HB-EGF é uma glicoproteína de 87 aminoácidos que mostra expressão de gene altamente regulada. Difusão de ectodomínio resulta na forma madura solúvel de HB-EGF, que influencia os fatores de mitogenicidade e quimiotáticos para células de músculo liso e fibroblastos. A forma transmembrana de HB-EGF é o único receptor para toxina de difteria e funciona em sinalização jux- tacrine em células. Ambas formas de HB-EGF participam em processos fisiológicos normais e em processos patológicos incluindo progressão e metástase de tumor, hiperplasia de órgão, e doença ateros- clerótica. Para os propósitos da invenção, genericamente a forma madura, solúvel da proteína é usada. A proteína ou agente pode ser substancialmente pura, por exemplo, livre de outras proteínas, livre de material celular, etc., usualmente pelo menos cerca de 50% pura, pelo menos cerca de 75% pura, pelo menos cerca de 80% pura, pelo me-nos cerca de 90% pura, pelo menos cerca de 95% pura, pelo menos cerca de 99% pura.

[0043] Em uma concretização preferida, uma preparação substancialmente pura de HB-EGF humana é usada. HB-EGF pode ser adquirida em forma purificada, ou produzida através de purificação de componente a partir de humanos ou outros animais, ou através de produção recombinante em células hospedeiras, incluindo células hospedeiras procarióticas como S. cerevisiae ou E. coli, e, mais preferivelmen- te, células hospedeiras mamíferas como células CHO. O HB-EGF pode ser humano tipo selvagem, um homólogo de mamífero, ou modificado / mutante. Em particular, fragmentos do componente que retêm pelo menos uma parte da atividade desejada do componente de inteiro comprimento podem ser usados.

[0044] Em algumas concretizações, o HB-EGF é HB-EGF humano, e compreende a sequência de aminoácidos de GenBank Accession: L17032.1 GI 348175 ou GenBank Accession: L17033.1 GI 34817 ou GenBank Accession: L17032.1 GI 348175, incluindo particularmente as formas maduras solúveis das proteínas ali descritas.

[0045] "Variantes conservativas de função" são proteínas nas quais um dado resíduo de aminoácido foi trocado sem alteração de conformação e função total da proteína, incluindo, mas não limitado a, substituição de um aminoácido com um tendo propriedades similares (tal como, por exemplo, ácido, básico, hidrofóbico, e semelhantes). Aminoácidos com propriedades similares são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, arginina, histidina e lisina são aminoácidos hidrofíli- cos - básicos e podem ser intercambiáveis. Similarmente, isoleucina, um aminoácido hidrofóbico, pode ser substituído com leucina, metioni- na ou valina. Outros aminoácidos que não aqueles indicados como conservados podem diferir em uma proteína ou enzima de mmodo que a porcentagem de similaridade de sequência de proteína ou aminoáci- do entre quaisquer duas proteínas de função similar pode variar e pode ser, por exemplo, de 70% a 99% como determinada de acordo com um esquema de alinhamento tal como através de Processo Cluster, onde similaridade é baseada no algoritmo MEGALIGN. Uma "variante conservativa de função" também inclui um polipeptídeo ou enzima que tem pelo menos 60% de identidade de aminoácido como determinada 20 algoritmos BLAST ou FASTA, preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mesmo mais preferivelmente pelo menos 90%, e ainda mais preferivelmente 95%, e que tem as mesmas ou substancialmente similares propriedades ou funções como a proteína ou enzima nativa ou parente à qual ela é comparada.

[0046] Como aqui usado, o termo HB-EGF pode incluir variantes, homólogos e ortólogos das sequências providas. Uma variante pode ser substancialmente similar a uma sequência nativa, isto é, diferindo por pelo menos um aminoácido, e pode diferir por pelo menos dois, mas usualmente não mais que cerca de dez aminoácidos (o número de diferenças dependendo do tamanho da sequência nativa). As mudanças de sequência podem ser substituições, inserções ou supressões. Mutações de exploração que sistematicamente introduzem ala- nina, ou outros resíduos, podem ser usadas para determinar aminoá- cidos chaves a serem mantidos em sequências variantes. Substitui-ções conservativas de aminoácidos que podem ser usadas para prover uma sequência variante da invenção tipicamente incluem substituições dentro dos seguintes grupos: (glicina, alanina); (valina, isoleuci- na, leucina); (ácido aspártico, ácido glutâmico); (asparagina, glutami- na); (serina, treonina); (lisina, arginina); e (fenil alanina, tirosina).

[0047] A sequência de aminoácidos de uma proteína ocorrendo naturalmente pode ser alterada de várias maneiras conhecidas na técnica para gerar mudanças alvejadas em sequência e assim prover sequências variantes da invenção. Tais variantes tipicamente serão variantes de funcionalidade preservada, que diferem, usualmente em sequência, da correspondente proteína nativa ou parente mas ainda retêm a desejada ou exibem aperfeiçoada atividade e/ou função biológica. Vários processos conhecidos na técnica podem ser usados para gerar mudanças alvejadas, por exemplo, mostra de fago em combinação com mutações randômicas e alvejadas, introdução de mutações de exploração, e semelhantes, e prover uma sequência variante da invenção. São incluídas a adição de His ou etiquetas epitopos para auxiliar em purificação, como aqui exemplificado. Enzimas modificadas para proverem uma específica característica de interesse ainda podem ser modificadas, por exemplo, por mutagênese, embaralhamento de éxon, etc.; como conhecido na técnica, seguido por separação ou seleção, de modo a otimizar ou restaurar a atividade da enzima, por exemplo, para níveis tipo selvagem, e assim prover outras sequências variantes da invenção.

[0048] O termo "HB-EGF" também inclui fragmentos biologicamente ativos. Fragmentos de interesse incluem fragmentos de pelo menos cerca de 20 aminoácidos contíguos, mais usualmente pelo menos cerca de 50 aminoácidos contíguos, e podem compreender 100 ou mais aminoácidos, até a proteína completa, e podem ainda se estender para compreender sequências adicionais.

[0049] Modificações de interesse para a proteína que não alteram sequência primária, mas provêm outras proteínas variantes da invenção incluem derivação química de proteínas, incluindo, por exemplo, acilação, por exemplo, grupos laurila, estearila, miristila, decila, etc., PEGilação, esterificação, ou amidação. Tais modificações podem ser usadas para aumentar a resistência da enzima na direção de proteóli- se, por exemplo, através de ligação de cadeias laterais PEG ou grupos laurila para lisinas de superfície. Também são incluídas modificações de glicosilação, por exemplo, aquelas feitas através de modificação de padrões de glicosilação de uma proteína durante sua síntese e processamento ou em ainda etapas de processamento; por exemplo, através de exposição de proteína a enzimas que afetam glicosilação, tal como glicosilação mamífera ou enzimas de desglicosilação. Também são abrangidas sequências que têm resíduos de aminoácidos fosforilados, por eemplo, fosfotirosina, fosfoserina, ou fosfotreonina.

[0050] Também úteis na prática da, e providas pela presente invenção são proteínas que foram modificadas através do uso de técni- cas de biologia molecular e/ou química de modo a aperfeiçoar sua resistência a degradação proteolítica, oxidação, etc., e para otimizar propriedades de solubilidade ou torna-las mais apropriadas como um agente terapêutico. Por exemplo, a cadeia principal da proteína pode ser ciclizada para aperfeiçoar estabilidade (ver Friedler et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:23783-23789). Análogos de tais proteínas incluem aqueles contendo outros resíduos que não L-aminoácidos ocorrendo naturalmente, por exemplo, D-aminoácidos ou aminoácidos sintéticos não ocorrendo naturalmente.

[0051] Miméticos de HB-EGF. Agentes HB-EGF de interesse também incluem miméticos, por exemplo, moléculas pequenas, proteínas, aptâmeros, e semelhantes, que provêm a atividade biológica de HB- EGF. Tais atividades incluem ligação de HB-EGF a receptores de EGF e proteoglicanos sulfato de heparina sobre a superfície de célula.

[0052] Pró-HB-EGF é sintetizado como uma proteína precursora de transmembrana simples tipo I que então sofre extensivo processamento proteolítico, chamado difusão de ectodomínio (ver, por exemplo, Yan et al. J Cell Biol. 2002; 158(2):221-6; Asakura et al. Nat Med. 2002; 8(1):35-40; Izumi et al. Embo J. 1998;17(24):7260-72; Nakaga- wa et al. J Biol Chem. 1996;271(48):30858-63). Isto libera a forma madura solúvel de HB-EGF. As metalo proteinases (incluindo ADAM 9, 10, 12, 17) responsáveis por difusão de ectodomínio de HB-EGF regula predominantemente a ligação de HB-EGF madura e regula ativação de EGFRs (ver Cisse et al. J Biol Chem. 2005; 280(49):40624-31; Pe- schon et al. Science. 1998;282(5392):1281-4; Sahin and Blobel FEBS Lett. 2007;581(1):41-4; Sahin et al. J Cell Biol. 2004;164(5):769-79). HB-EGF então atua via ambos mecanismos, dependente de EGFR e independente de EGFR. HB-EGF contém um domínio semelhante a EGF pensado ser requerido para membros da família EGF para ligação e ativação de EGFR (Thompson et al. J Biol Chem. 1994; 269(4):2541-9).

[0053] Membros da família EGF podem induzir sinalização justa- crina, autocrina, paracrina ou endócrina dependendo do ambiente celular porque eles são clivados da membrana por metaloproteínases para formação de fator de crescimento solúvel maduro (Singh and Harris, Cell Signal. 2005; 17(10):1183-93). Existem quatro membros identificados da família EGFR (HER1, HER2, HER3, e HER4). Eles são tiro- sina cinases estruturalmente relacionadas com um domínio de espalhamento de membrana simples e um domínio dentro de citoplasma (Plowman, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993;90(5):1746-50; Taylor et al. Semin Cell Dev Biol. 2014). Membros da família EGF têm dife-rentes atividades de ligação para a família EGFR. Diferente de EGF, HB-EGF se liga a ambos HER1 e HER4, como fazem betacelulina e neuregulina2. Ver, Higashiyama et al. Science. 1991;251(4996):936-9; Chang et al. Nature. 1997;387(6632):509-12; Carraway et al. Nature. 1997;387(6632):512-6; Shing et al. Science. 1993; 259(5101):1604-7. HB-EGF também diminui marcadores epiteliais tais como ceratinas 1, 5, 10 e 14 enquanto aumentando genes de motilidade de célula como SNA1, ZEB1, COX-2 e MMP1 (ver Stoll et al. J Invest Dermatol. 2012; 132(9):2148-57).

[0054] Uma "quantidade efetiva" ou uma "quantidade trapeutica- mente efetiva" de HB-EGF, ou um agente que provê atividade de HB- EGF é aquela dose que, quando aplicada sobre um período de tempo, aperfeiçoa a cura de uma perfuração crônica de TM.

[0055] A formulação, isto é, gota líquida, gel de liberação sustentada, etc. pode compreender HB-EGF, ou atividade equivalente de um agente provendo atividade HB-EGF, em uma concentração de pelo menos cerca de 1 ng/mL, pelo menos cerca de 10 ng/mL, pelo menos cerca de 100 ng/mL, pelo menos cerca de 1 micrograma/mL, pelo menos cerca de 10 microgramas/mL, pelo menos cerca de 100 micro- gramas/mL, pelo menos cerca de 200 micrograms/mL, pelo menos cerca de 500 microgramas/mL, pelo menos cerca de 750 microgra- mas/mL, pelo menos cerca de 1 mg/mL, pelo menos cerca de 5 mg/mL, pelo menos cerca de 10 mg/mL, pelo menos cerca de 50 mg/mL, até cerca de 100 mg/mL, até cerca de 500 mg/mL. Uma formulação para liberação sustentada pode ser provida em uma maior concentração inicial do que uma formulação para administração repetida.

[0056] O volume de formulação é tipicamente aquele que é requerido para prover contato útil com a membrana de tímpano, por exemplo, até cerca de 5 microlitros, até cerca de 10 microlitros, até cerca de 25 microlitros, até cerca de 35 microlitros, até cerca de 50 microlitros, até cerca de 75 microlitros, até cerca de 100 microlitros, até cerca de 250 microlitros, até cerca de 375 microlitros, até cerca de 500 microli- tros. Alternativamente um gotejador pode ser provido no qual a dose é uma gota, duas gotas, três gotas, onde, como é conhecido na técnica, uma gota é de cerca de 50 microlitros de volume.

[0057] Uma quantidade terapeuticamente efetiva provê uma resposta clinicamente significante em um sujeito, em que, por exemplo, é promovida cura de perfuração de membrana de tímpano. Alternativamente, uma quantidade terapeuticamente efetiva é suficiente para aperfeiçoar uma condição de cura de ferimento clinicamente significan- te no hospedeiro.

[0058] Uma formulação ou dispositivo de liberação sustentada ou estendida pode ser projetada para ter t1/2 para liberação de fármaco, isto é, o comprimento de tempo para liberação de metade do agente ativo, que é apropriada para a dose de iniciação e desejada concentração local, por exemplo, um t1/2 de cerca de 24 horas, cerca de 48 horas, cerca de 3 dias, cerca de 4 dias, cerca de 5 dias, cerca de 1 semana, cerca de 10 dias, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, etc.

[0059] Uma outra formulação que não de liberação sustentada ou estendida, por exemplo, gotas líquidas para ouvido, etc., pode ser administrada em intervalos apropriados para manutenção de uma dose efetiva, por exemplo, cerca de cada 3 horas, cerca de cada 4 horas, cerca de cada 6 horas, cerca de cada 12 horas, cerca de cada 18 horas, cerca de cada 24 horas, cerca de cada 48 horas, etc.

[0060] Alternativamente, uma quantidade efetiva de HB-EGF, ou um agente que provê atividade de HB-EGF, é uma quantidade que resulta em uma cura mais rápida de uma perfuração ou ferimento em relação à cura na ausência do agente. Uma quantidade efetiva também pode significar uma quantidade ou dose suficiente para aumentar os níveis locais e/ou sistêmicos de HB-EGF, por exemplo, para cerca de 10 porcento, preferivelmente por cerca de 50 porcento, e mais preferivelmente por cerca de 100 porcento do nível encontrado antes de administração do agente ou fármaco ativo.

[0061] O período de tempo para contato com HB-EGF pode ser de até um dia, até 2 dias, até 3 dias, até 5 dias, até 7 dias, até 10 dias, até 12 dias, até 2 semanas, até 3 semanas, ou mais de acordo com as necessidades do indivíduo.

[0062] Um "controle", "valor controle" ou "valor referência" em um ensaio é um valor usado para detectar uma alteração em, por exemplo, a cura de uma membrana de tímpano perfurada ou ferimento de pele, ou quaisquer outros ensaios aqui descritos. Por exemplo, quando estudando cura de uma perfuração de membrana de tímpano, o efeito inibidor / estimulador de um agente pode ser avaliado através de comparação de cura de um ferimento ou perfuração àquela de um controle. O controle ou referência pode ser, por exemplo, um predeterminado valor referência, ou pode ser determinado experimentalmente. Por exemplo, em um tal ensaio, um controle ou referência pode ser a cura de uma ferimento ou perfuração similar em um animal não exposto ao fármaco ou agente ativo, ou um animal tratado com o mesmo fármaco ou agente ativo que não tem capacidade de cura de ferimento prejudi-cada.

[0063] "Inibidor" inclui uma composição ou substância natural ou sintética que evita a ação de HB-EGF, que diminui o nível de HB-EGF ou seu receptor, que bloqueia sinalização intracelular quando HB-EGF dispara seu receptor cognato; etc. Inibidores incluem ácidos nucléicos, por exemplo, anti-sentido, siRNA, ribozimas, etc.; antibióticos específicos para HB-EGF ou seu receptor cognato, inibidores de moléculas pequenas, etc. Em algumas concretizações, o inibidor é SU8-1/KB- R7785 (ver Tokomaru et al. (2000) JCB 151:209-219, aqui especificamente incorporado por referência). Anticorpos específicos para HB- EGF, e reagentes siRNA, shRNA são conhecidos na técnica e comer-cialmente disponíveis (por exemplo, ver Santa Cruz Biotechnology, ou Bertram et al. (2009) Mech. Ageing Dev. 130:657-669.

[0064] Alternativamente anticorpos monoclonais podem ser gerados através de processos convencionais para preparação de anticorpos monoclonais, qualquer técnica que proporcione anticorpos produzidos através de culturas de linha de célula contínua pode ser usada. Exemplos incluem a técnica de hibridoma (Kohler & Milstein, Nature, 256:495-497 (1975)), a técnica trioma, a técnica de hibridoma de célula-B humana (Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983)), e a técnica de hibridoma-EBV para produzir anticorpos monoclonais humanos (Cole, et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)). Técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia simples (patente U.S. 4 946 778) podem ser adaptadas para produção de anticorpos de cadeia simples para produtos polipeptídeos imunogênicos desta invenção. Também, camundongos transgênicos podem ser usados para expressão de anticorpos humanizados para produtos polipeptídeos imunogênicos desta invenção.

[0065] "Estrutura", quando referindo-se à liberação de HB-EGF ou inibidores de HB-EGF inclui, mas não está limitada a, qualquer tablado, polímero, construção, fabricação, montagem, suporte, disco, bloco, revestimento, camada, forro, dispositivo, espuma. Ela também inclui uso de tecido, debris ou enxerto do próprio paciente para atuação como um processo de liberação. A estrutura tanto pode ser aplicada em seu estado formado ou pode ser aplicada como um líquido viscoso que então forma um estado sólido ou permanece em forma líquida.

[0066] "Veículo", então referindo-se à liberação de HB-EGF ou inibidores de HB-EGF inclui, mas não está limitado a, qualquer polímero, agente, carreador, instrumento, operação , meio, aparelhagem, aparelho, contracepção, engenhoca, ferramenta, widget, implemento ou utensílio. O termo "veículo" também refere-se a qualquer carreador ou excipiente solúvel incluindo, mas não limitado a solução salina, solução salina tamponada, dextrose, água, glicerol, e suas combinações. A formulação deve adaptar-se ao modo de administração. Exemplos de apropriadas formulações, conhecidas na técnica, podem ser encontrados em Remington’s Pharmaceutical Sciences (última edição), Mack Publishing Company, and Easton, Pa.

[0067] Como aqui usados, "cerca" ou "aproximadamente" devem significar dentro de 50 porcento, preferivelmente dentro de 20 porcento, mais preferivelmente dentro de 5 porcento, de um dado valor ou faixa.

[0068] Um valor que é "substancialmente diferente"de um outro valor pode significar que há uma diferença estatisticamente significan- te entre os dois valores. Qualquer processo estatístico apropriado conhecido na técnica pode ser usado para avaliar se diferenças são sig- nificantes ou não.

[0069] Diferença "estatisticamente significante" significa uma signi- ficância que é determinada em um intervalo de confiança de pelo menos 90%, mais preferivelmente em um intervalo de confiança de 95%.

[0070] De acordo com a presente invenção podem ser empregadas técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia, e DNA recombinante dentro do conhecimento da técnica. Tais técnicas são inteiramente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, Sambrook et al (Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); Glover (DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, 1985); Hames and Higgins (Nucleic Acid Hybridization, 1985); Hames and Higgins (Transcription And Translation, 1984); Freshney (Animal Cell Culture, 1986); Perbal (A Practical Guide To Molecular Cloning, 1984); and Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1994).

FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS

[0071] Formulações que podem ser usadas na liberação de HB- EGF, e agente HB-EGF, ou inibidor de HB-EGF ou outras composições de acordo com a invenção incluem, mas não são limitadas a, formas de dosagem injetáveis, infusões, gel, pastas, bálsamos, ceras, loções, cremes de pele, e vários outros formatos para administração tópica conhecidos na técnica. As composições também podem ser liberadas localmente na forma de um pulverizado ou solução espargida sobre o ferimento. Alternativamente, as composições da invenção podem estar presentes em curativos de ferimentos, almofadas, curativos, gaze, ou outros meios aplicados sobre um ferimento, a partir dos quais eles são transferidos para a área de ferimento. Tais dispositivos também incluem dispositivos de liberação lenta, liberando continuamente HB-EGF ou inibidor de HB-EGF ou outros componentes por um prolongado período de tempo. Com relação a cura de membranas de tímpano, administração da composição usando um gel, espargimento, ou aplicação semelhante a gota via o canal de ouvido externo, é uma concretização preferida. Formas de dosagens injetáveis ou infusões compreendem uma solução de HB-EGF ou inibidor de HB-EGF em um líquido farmaceuticamente aceitável tal como, por exemplo, solução salina isotônica, água estéril, ou sistemas tampões aquosos. O veículo de liberação também pode incluir qualquer estrutura passando através de ferimento. No caso da membrana de tímpano esta inclui, mas não limitada a, tubos de ventilação ou cateteres.

[0072] Composições farmacêuticas podem incluir, dependendo da formulação desejada, carreadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis, que são definidos como veículos comumente usados para formular composições farmacêuticas para administração a seres humanos ou animais. O diluente é selecionado de modo a não afetar a atividade biológica do agente ativo. Exemplos de tais diluentes são água destilada, água tamponada, solução salina fisiológica, PBS, solução de Ringer, solução de dextrose, e solução de Hank. Em adição, a composição ou formulação farmacêutica pode incluir outros carreado- res, adjuvantes, ou estabilizantes não tóxicos, não terapêuticos, não imunogênicos, excipientes e semelhantes. As composições também podem incluir adicionais substâncias para aproximar condições fisiológicas, tais como agentes de tamponamento e ajuste de pH, agentes de ajuste de toxidez, agentes umectantes e detergentes.

[0073] A composição também pode incluir qualquer um de uma variedade de agentes estabilizantes, tal como um antioxidante, por exemplo. Quando a composição farmacêutica inclui um polipeptídeo, o polipeptídeo pode ser complexado com vários compostos bem conhecidos que aperfeiçoam a estabilidade in vivo do polipeptídeo, ou de outro modo aperfeiçoam suas propriedades farmacológicas (por exemplo, aumentam a meia-vida do polipeptídeo, reduzem sua toxi- dez, aperfeiçoam solubilidade e absorção). Exemplos de tais agentes de complexação ou modificações incluem sulfato, gliconato, citrato e fosfato. Os polipeptídeos de uma composição também podem ser complexados com moléculas que aperfeiçoam seus atributos in vivo. Tais moléculas incluem, por exemplo, carboidratos, poliaminas, ami- noácidos, outros peptídeos, íons (por exemplo, sódio, potássio, cálcio, magnésio, manganês), e lipídeos.

[0074] Ainda orientação com relação a formulações que são apropriadas para vários tipos de administração pode ser encontrada em Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th. Ed. (1985). Para uma breve revisão de processos para liberação de fármaco, ver, Langer, Science 249: 1527-1533 (1990).

[0075] As composições farmacêuticas podem ser administradas para tratamentos terapêuticos. Toxidez e eficácia terapêutica do ingrediente ativo podem ser determinadas de acordo com procedimentos farmacêuticos padrões em culturas de células e/ou animais experimentais, incluindo, por exemplo, determinação de LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente efetiva em 50% da população). A razão de dose entre efeitos tóxicos e terapêutico é o índice terapêutico e ele pode ser expresso como a razão LD50/ED50. Compostos que exibem grandes índices terapêuticos são preferidos.

[0076] Os dados obtidos de cultura de células e/ou estudos com animais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagens para humanos. A dosagem do ingrediente ativo tipicamente está dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem a ED50 com baixa toxidez. A dosagem pode variar dentro desta faixa dependendo da forma de dosagem empregada e a rota de administração utilizada.

[0077] As composições farmacêuticas aqui descritas podem ser administradas em uma variedade de diferentes maneiras. Exemplos incluem administração de uma composição contendo um carreador farmaceuticamente aceitável via rotas tópicas, por exemplo, sobre a superfície da TM, membrana intratímpano, membrana trans-tímpano, etc.

[0078] Formulações apropriadas incluem soluções de injeção estéreis isotônicas, aquosas e não aquosas, que podem conter antioxidan- tes, tampões, bacteriostatos, e solutos que tornam a formulação isotô- nica, e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizadores, e conservantes.

[0079] Os componentes usados para formular as composições farmacêuticas são preferivelmente de alta pureza e são substancialmente livres de contaminantes potencialmente prejudiciais (por exemplo, pelo menos grau National Food (NF), genericamente pelo menos grau analítico, e mais tipicamente pelo menos grau farmacêutico). Além disso, composições pretendidas para uso in vivo são usualmente estéreis. Para a extensão em que um dado composto tem de ser sintetizado antes de uso, o produto resultante é tipicamente substancialmente livre de quaisquer agentes potencialmente tóxicos, particularmente quaisquer endotoxinas, que possam estar presentes durante o processo de síntese ou purificação. Composições para administração parenteral também são estéreis, substancialmente isotônicas e fabricadas sob condições GMP.

[0080] A quantidade efetiva de uma composição terapêutica a ser dada a um particular paciente dependerá de uma variedade de fatores, vários dos quais serão diferentes de paciente para paciente. Um médico competente será capaz de determinar uma quantidade efetiva de um agente terapêutico para administrar a um paciente para promover cura de uma perfuração crônica de TM. Utilizando dados de animais de, e outra informação disponível, um médico pode determinar a dose segura para um indivíduo, dependendo da rota de administração. Composições que são rapidamente depuradas do corpo podem ser administradas em maiores doses, ou em doses repetidas, de modo a manter uma concentração terapêutica. Utilizando conhecimento comum, o médico competente será capaz de otimizar a dosagem de uma particular composição terapêutica ou de formação de imagem no curso de experimentos clínicos de rotina. Tipicamente a dosagem será de 0,001 a 100 miligramas de agente por quilograma de peso de corpo de sujeito.

[0081] A formulação, isto é, gota líquida, gel de liberação sustentada, etc. pode compreender HB-EGF ou atividade equivalente de um agente provendo atividade de HB-EGF, em uma concentração de pelo menos cerca de 1 micrograma/mL, pelo menos cerca de 10 microgra- mas/mL, pelo menos cerca de 100 microgramas/mL, pelo menos cerca de 200 microgramas/mL, pelo menos cerca de 500 microgramas/mL, pelo menos cerca de 750 microgramas/mL, pelo menos cerca de 1 mg/mL, pelo menos cerca de 5 mg/mL, pelo menos cerca de 10 mg/mL, pelo menos cerca de 50 mg/mL, pelo menos cerca de 100 mg/mL, e até cerca de 10 mg/mL, até cerca de 25 mg/mL, até cerca de 50 mg/mL, até cerca de 100 mg/mL, até cerca de 500 mg/mL. Uma formulação para liberação sustentada pode ser provida em uma concentração inicial maior que uma formulação para administração repetida. A quantidade terapeuticamente ativa pode variar de acordo com fatores tais como estado de doença, idade, sexo, e peso do indivíduo. Regime de dosagem pode ser ajustado para prover a ótima resposta terapêutica. Por exemplo, mais de uma dose dividida podem ser administradas diariamente ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida como indicado pelas exigências da situação terapêutica.

[0082] O volume pode ser provido como de cerca de 1 a 3 gotas, ou se administrado em uma forma sólida ou semissólida pode ser uma composição preparada de volume fixado, por exemplo, até cerca de 5 microlitros a até cerca de 500 microlitros de volume. O dispositivo po- de ser formado em qualquer formato ou conformação que facilitará seu uso na área alvo para promover ou inibir cura. A geometria de uma forma sólida ou semissólida é qualquer que seja apropriada para liberação para a membrana de tímpano, por exemplo, uma esfera, uma esfera aplanada, filme, emplastro, disco de espessura uniforme ou não uniforme, e semelhantes.

[0083] A formulação pode ser administrada ao sujeito em uma série de mais de uma administração. Para composições terapêuticas, administração periódica regular (por exemplo, cada 4 horas, cada 6 horas, cada 12 horas, cada 24 horas, etc.) algumas vezes será requerida, por exemplo, onde a formulação é provida como um líquido para administração tópica.

[0084] Formulações apropriadas para administração tópica, trans- cutânea e transdérmica podem ser preparadas através de uso de apropriados agentes de suspensão, solubilizantes, agentes espessan- tes, estabilizadores, e conservantes. Formulações tópicas também podem ser utilizadas com um meio para prover administração contínua, por exemplo, incorporação em pelotas de liberação lenta ou emplastros de liberação controlada.

[0085] O agente ativo também pode ser formulado em um gel bio- compatível, cujo gel pode ser aplicado topicamente ou implantado (por exemplo, para prover liberação sustentada em um sítio de tratamento). Apropriados géis e processos para formulação de um desejado composto para liberação usando um gel são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, patentes U.S 5 801 033; 5 827 937; 5 700 848; e MATRIGEL). Um exemplo desta concretização é a liberação do HB- EGF ou inibidor de HB-EGF através de canal de ouvido via um líquido ou dispositivo biocompatível que então solidifica dentro de canal do ouvido adjacente à membrana de tímpano e libera o HG-EGF ou inibidor de HB-EGF quando o veículo dissolve com o tempo. O veículo po- de ser colocado no canal, na membrana de tímpano ou dentro de ouvido médio.

[0086] Formulações podem ser providas em uma forma de dosagem unitária, onde o termo "forma de dosagem unitária" refere-se a unidades fisicamente discretas apropriadas como dosagens unitárias para sujeitos humanos, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de protease em uma quantidade calculada suficiente para produzir o desejado efeito em associação com um diluente, carreador ou veículo farmaceuticamente aceitável. As especificações para as formas de dosagem unitária da presente invenção dependem do particular complexo empregado e o efeito a ser obtido, e as fármaco dinâmicas associadas com cada complexo no hospedeiro.

[0087] Aspectos da invenção incluem composições de hidrogel de copolímero reticulado compreendendo uma dose efetiva de HB-EGF absorvida, como descrito acima. Composições de hidrogel de copolí- mero reticulado da invenção de acordo com certas concretizações incluem um copolímero de quitosano e um poliéster e um reticulador hi- drolisável. Em certas concretizações, hidrogéis reticulados ainda incluem fibrinogênio. Em algumas tais concretizações, hidrogéis de copolí- mero reticulado incluem um copolímero de quitosano e um poliéster e um reticulador hidrolisável, por exemplo, poli lactídeo. Hidrogéis de quitosano - polilactídeo reticulados podem ter uma razão de quitosano para polilactídeo variando de 1:1 a 10:1, tal como 1:1 a 8:1, onde em certos exemplos, hidrogéis de quitosano - polilactídeo reticulados têm uma razão de quitosano para polilactídeo de 8:1. A porcentagem em peso de quitosano em hidrogéis de copolímero reticulado de interesse pode variar de 1% a 99% e a porcentagem em peso do poliéster tam-bém pode variar de 1% a 99%. Em algumas concretizações, hidrogéis de copolímero incluem qualquer uma ou mais ligações ésteres e amida entre o quitosano e os componentes poliéster. Hidrogéis de copolíme- ro reticulado de interesse também incluem um reticulador. Em algumas concretizações, o reticulador é configurado para hidrolisar sob condições fisiológicas. Em algumas concretizações, o reticulador pode ser um reticulador acrilato, tal como um reticulador metacrilato. O reticula- dor hidrolisável pode estar presente no hidrogel de copolímero reticulado em uma quantidade que varia de 0,05% a 10% em peso / peso de reticulador, tal como 0,1% a 9% em peso / peso, tal como 0,5% a 8% em peso / peso, tal como 0,75% a 7% em peso / peso e incluindo 1 a 5% em peso / peso. Dependendo do protocolo empregado para reticular os hidrogéis objetos, a densidade de reticulação pode variar. Em certos exemplos, o hidrogel é reticulado através de reticulação química. Como tal, a densidade de reticulação pode variar dependendo do tipo e concentração de agente de reticulação química empregado. Alternativamente, o hidrogel pode ser foto reticulado e a densidade de reticulação pode variar dependendo da intensidade de radiação eletromagnética contatada com a composição de hidrogel assim como a duração de irradiação. Em algumas concretizações da invenção, a densidade de reticulação dos hidrogéis de copolímero reticulados objetos pode variar, tal como de 1x10-15 moles/cm3 a 1x10-3 moles/cm3. Da mesma maneira, dependendo da quantidade de reticulação, a razão de intumescimento dos hidrogéis objetos pode variar, variando tal como de 1 kPa a 35 kPa. Ver, por exemplo, pedido de patente internacional copendente PCT/US2014/033512, aqui especificamente incorporado por referência.

[0088] Uma formulação de hidrogel opcionalmente inclui fibrinogê- nio. O fibrinogênio pode ser incorporado na composição de hidrogel antes ou após o hidrogel ter sido reticulado. Por exemplo, em alguns exemplos, fibrinogênio é adicionado à composição precursora de hi- drogel. Fibrinogênio pode estar presente no hidrogel de copolímero reticulado em uma quantidade que varia de 0,05% a 50% em peso / peso de fibrinogênio, tal como de 0,1% a 45% em peso / peso, tal como 0,5% a 40% em peso / peso, tal como de 0,75% a 35% em peso / peso, tal como de 1% a 30%, tal como de 2% a 20%, tal como de 5% a 15% e incluindo 10% em peso / peso.

[0089] Os hidrogéis podem ser sintetizados para obtenção de um certo perfil de liberação. Em algumas concretizações, hidrogéis de co- polímero reticulados providos pela invenção são configurados para liberarem HB-EGF ou um agente HB-EGF sob condições fisiológicas em uma taxa de liberação de ordem substancialmente zero. Em outras concretizações, os hidrogéis de copolímero reticulados objetos são configurados para liberarem HB-EGF ou um agente HB-EGF sob condições fisiológicas em uma taxa de liberação de substancialmente primeira ordem. Ainda em outras concretizações, os hidrogéis de copolí- mero reticulados objetos são configurados para liberarem HB-EGF ou um agente HB-EGF sob condições fisiológicas em uma taxa de liberação de substancialmente segunda ordem. Em certas concretizações, os hidrogéis de copolímero reticulados objetos são configurados para terem um perfil de liberação que inclui: 1) um primeiro período onde HB-EGF ou um agente HB-EGF é liberado do hidrogel em uma primeira taxa predeterminada; e 2) um segundo período onde HB-EGF ou um agente HB-EGF é liberado do hidrogel em uma segunda taxa predeterminada.

[0090] Em algumas concretizações da invenção, a razão de quito- sano para o poliéster no hidrogel pode variar, em algumas concretizações variando entre 10:1 e 9.5:1; 9.5:1 e 9:1; 9:1 e 8.5:1; 8.5:1 e 8:1; 8:1 e 7.5:1; 7.5:1 e 7:1; 7:1 e 6.5:1; 6.5:1 e 6:1; 6:1 e 5.5:1; 5.5:1 e 5:1; 5:1 e 4.5:1; 4.5:1 e 4:1; 4:1 e 3.5:1; 3.5:1 e 3:1; 3:1 e 2.5:1; 2.5:1 e 2:1; 2:1 e 1.5:1; 1.5:1 e 1:1 ou uma sua faixa. Por exemplo, a razão em massa do componente quitosano para o componente poliéster pode variar de 10:1 e 1:1, tal como 8:1 e 1:1, tal como 5:1 e 1:1, tal como 4:1 e 1:1, e incluindo de 2:1 e 1:1. Em certos exemplos, a razão de quitosano para o poliéster é 1:1. Em outras concretizações, a razão de quitosano para o poliéster pode variar, em algumas concretizações variando entre 1:1 e 1:1.5; 1:1.5 e 1:2; 1:2 e 1:2.5; 1:2.5 e 1:3; 1:3 e 1:3.5; 1:3.5 e 1:4; 1:4 e 1:4.5; 1:4.5 e 1:5; 1:5 e 1:5.5; 1:5.5 e 1:6; 1:6 e 1:6.5; 1:6.5 e 1:7; 1:7 e 1:7.5; 1:7.5 e 1:8; 1:8 e 1:8.5; 1:8.5 e 1:9; 1:9 e 1:9.5; 1:9.5 e 1:10 ou uma sua faixa. Por exemplo, a razão de quitosa- no para o poliéster pode variar de 1:1 e 1:10, tal como 1:1 e 1:8, tal como 1:1 e 1:5, tal como 1:1 e 1:4, e incluindo de 1:1 e 1:2.

[0091] Hidrogéis de copolímero reticulados podem ser de 1 kDa ou mais, tal como 2 kDa ou mais, tal como 3 kDa ou mais, tal como 5 kDa ou mais, tal como 10 kDa ou mais, tal como 15 kDa ou mais, tal como 20 kDa ou mais, tal como 25 kDa ou mais, tal como 30 kDa ou mais, tal como 40 kDa ou mais, tal como 50 kDa ou mais, tal como 60 kDa ou mais e incluindo 75 kDa ou mais.

[0092] Após composições farmacêuticas terem sido preparadas, elas podem ser colocadas em um recipiente apropriado e rotuladas para tratamento de uma condição indicada. Para administração de uma composição da invenção, tal rotulação pode incluir quantidade, frequência, e processo de administração.

FORMULAÇÕES DE COMBINAÇÃO

[0093] As formulações da invenção podem compreender uma dose efetiva de HB-EGF em combinação com um segundo agente ativo, particularmente outros agentes antimicrobianos. Por exemplo, outros agentes de interesse incluem uma ampla variedade de antibióticos, como conhecido na técnica. Classes de antibióticos incluem penicilinas, por exemplo, penicilina G, penicilina V, meticilina, oxacilina, car- benicilina, nafcilina, ampicilina, etc.; penicilinas em combinação com inibidores de beta-lactamase, cefalosporinas, por exemplo, cefaclor, cefazolina, cefuroxima,moxalactam, etc.; carbapenems; monobactams; aminoglicosídeos; tetraciclinas; macrolidos; lincomicinas; polimixinas; sulfonamidas; quinolonas; cloranfenical; metronidazol; spectinomicina; trimetroprim; vancomicina; etc. Agentes antivirais, por exemplo, aciclovir, ganciclovir, etc., podem ser incluídos.

[0094] Citocinas e fatores de crescimento também encontram uso em combinação com HB-EGF, por exemplo, fatores de crescimento, tais como fator de crescimento transformante (TGF)-p, fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), fator de crescimento de fibroblas- to (FGF), e fator de crescimento de epiderme (EGF), VEGF, fator-a de necrose de tumor (TNF-a), endotelina-1, fator de crescimento de cera- tinócito, e semelhantes. Ver, por exemplo, Steed, D. et al., J. Am. Call. Surg. 183:61-64 (1996); Richard, J. et al., Diabetes Care 18: 64--69 (1995); Steed, D.,J. Vasc. Surg. 21:71-78 (1995); Kelley, S. et al., Proc. Soc. Exp. Biol. 194:320-326 (1990). Processos de Uso

[0095] De acordo com a invenção, cura de ferimento de uma perfuração crônica da membrana de tímpano é aperfeiçoada através de provimento ou aperfeiçoamento de níveis de HB-EGF. Isto pode ser realizado em várias maneiras diferentes. Por exemplo, um paciente pode ser tratado com uma quantidade efetiva de um agente ativo tal como, por exemplo, um fármaco, hormônio, citocina, anticorpo, ou um outro composto que regula ascendentemente a expressão de HB-EGF; reduz a degradação de HB-EGF; ou aumenta os níveis locais ou sistêmicos de HB-EGF ou um homólogo ou derivado de HB-EGF. Ácidos nucléicos codificando HB-EGF também podem ser administrados para propósitos terapêuticos.

[0096] Tipicamente uma formulação compreendendo uma proteína HB-EGF, por exemplo, a forma solúvel de HB-EGF, é administrada topicamente a um indivíduo sofrendo de uma perfuração crônica de TM via o canal de ouvido externo, por um período de tempo suficiente para fechar substancialmente a perfuração. O sujeito humano ou não humano pode ou não sofrer de uma condição que prejudica ou diminui a cura da perfuração de membrana de tímpano.

[0097] A invenção provê HB-EGF ou composições inibidoras de HB_EGF, que, quando administradas em uma quantidade efetiva, resultam em um nível de HB-EGF aumentado ou diminuído na área de ferimento de um sujeito. Por exemplo, para aceleração de cura de membrana de tímpano, uma composição compreendendo HB-EGF pode ser aplicada à área circundando uma perfuração de membrana de tímpano. Inibidor de HB-EGF também pode ser aplicado para inibir cura de ferimento normal ou em excesso. No caso de composições de HB-EGF, para aceleração de cura de membrana de tímpano, uma composição pode ser aplicada à área adjacente ou local a uma perfuração de membrana de tímpano. Elas podem ser aplicadas via uma fonte ou estrutura biodegradável ou não biodegradável.

[0098] Em uma outra concretização, o processo da invenção é aplicado para inibir a cura de uma membrana de tímpano perfurada em um sujeito. O sujeito humano ou não humano pode ou não sofrer de uma condição que prejudica ou torna lenta a cura da perfuração de membrana de tímpano. Por exemplo, tais processos podem ser aplicados como uma substituição para miringotomia e inserção de tubos de timpanostomia, que é comumente prescrita para otite média crônica, má formação do tímpano ou tubo de Eustáquio, síndrome de Down, fenda de palato, e barotrauma (dano de ouvido médio causado por uma redução de pressão de ar), etc. Convencionalmente um tubo de timpanostomia é inserido na TM, e mantido por um período de tempo estendido, por exemplo, até um mês, até 2 meses, até 3 meses, até 4 meses, até 6 meses, ou mais.

[0099] Os processos também encontram uso na geração de um modelo animal que provê um modelo clinicamente relevante para con- dições de tímpano humano perfurado. Em tais modelos, o animal pode ser qualquer animal de laboratório conveniente, por exemplo, roedores, lagomorfos, etc., e incluindo sem limitação camundongos, ratos, porquinhos da Índia, coelhos, gatos, cães, primatas não humanos; e semelhantes.

[00100] Em tais concretizações, uma dose efetiva de um inibidor de difusão de ligante de EGFR é administrada, usualmente através de contato tópico para a membrana de tímpano, para criar uma perfuração da TM. Em algumas tais concretizações, uma pequena perfuração pode ser inicialmente feita, por exemplo, uma área de cerca de 0,1 a 10 mm2, de cerca de 0,1 a cerca de 5 mm2, de cerca de 0,1 a 2,5 mm2, de cerca de 0,1 a cerca de 1 mm2. Seguindo a perfuração inicial, o ferimento é contatado com uma dose efetiva de um inibidor de HB-EGF, em uma formulação e por um período de tempo como aqui provido. Uma dose ativa do inibidor pode ser mantida pelo comprimento de tempo que a perfuração é desejada.

KITS

[00101] Um outro aspecto da invenção provê um kit para tratamento de perfuração crônica da TM. O kit inclui uma formulação que provê uma dose efetiva de HB-EGF, por exemplo, na forma de gotas, dispositivos, formulações, e semelhantes. O kit também pode incluir um dispositivo de liberação, por exemplo, um dispensador de gota de ouvido, seringa para liberação de uma formulação, seringa de cilindro dual para liberação de uma formulação de duas partes; e semelhantes. O kit também pode compreender instruções para uso.

[00102] Alternativamente um kit pode ser provido para geração de uma perfuração crônica da TM. O kit inclui uma formulação que provê uma dose efetiva de um inibidor de HB-EGF, por exemplo, na forma de gotas, dispositivos, formulações, e semelhantes. O kit também pode incluir um dispositivo de liberação, por exemplo, um dispensador de gota de ouvido, seringa para liberação de uma formulação, seringa de cilindro dual para liberação de uma formulação de duas partes; e semelhantes. O kit também pode compreender instruções para uso. O kit ainda pode compreender uma agulha ou lanceta estéril para geração de uma perfuração inicial na TM.

EXEMPLO 1 Inibição de HB-EGF

[00103] HB-EGF é crítica para cura de ferimento de epiderme em u m modelo de membrana de tímpano. A intensidade de sinal normalizada de fator de crescimento como HB-EGF seguindo perfuração da membrana de tímpano em ratos mostra uma regulação ascendente de 8,5 vezes de fator de crescimento semelhante a HB-EGF. Inibição experimental de atividade de HB-EGF é aqui mostrada evitar a cura de uma perfuração de membrana de tímpano.

[00104] Difusão de ligante de EGFR pode ser inibida para criar um modelo de perfuração de membrana de tímpano crônica. Perfurações subtotais foram criadas na pars tensa de TMs em 20 camundongos usando uma agulha curvada. OSU8.1 (10 mM), um inibidor de HB- EGF seletivo (ver Tokumaru et al. (2000) J. cell Biol.), foi injetado sobre espuma de gel (colocada através e sobre a perfuração) sobre sete dias. Camundongos foram sacrificados em pontos de tempo (Dia 2, 7, 14, 30, 44, 60 e 90) para observar os efeitos sobre migração de cerati- nócitos. O ouvido contralateral foi usado como um controle com solução salina colocada sobre espuma de gel. Todos estes foram fechados dentro de 2 semanas. Cinco de sete (71%) dos ouvidos de tratamento foram abertos em três meses. Imagens representativas de perfuração crônica de TM são mostradas na Figura 5. Tamanho de perfuração foi estável por três meses (usando Imagem J para calcular a área de per-furação como uma porcentagem da área de pars tensa). Uma coorte maior foi empreendida com 87,9% (n = 58) tendo perfurações crônicas em 3 meses. Nosso estudo preliminar pela primeira vez sugeriu um modelo animal de TM crônica baseado em fator de crescimento reproduzível, estabelecido.

[00105] A Tabela 1 mostra os resultados de aplicação de inibidor de HB-EGF (OSU8-1) para perfurações de tímpano agudas em camundongos. 100% das perfurações tratadas com inibidor de HB-EGF estavam presentes em dois meses comparadas a 5% de controles e 71% estavam presentes em três meses comparadas a 5% de controles. TABELA 1

[00106] Criação de um modelo animal para otite média supurativa crônica. Após criação de modelo de perfuração crônica com oclusão de ET, dois tipos de bactérias foram inoculados no ouvido médio através de perfurações crônicas existentes. Em 2 semanas do fluido de ouvido foi coletado e enviado para reação de cadeia polimerase (PCR) para testar a presença de bactérias. As bactérias escolhidas foram duas das mais comuns envolvidas em doença de ouvido crônica, streptococcus pneumonia tipo 3 (dose de 6x106 unidades de formação de colônia por mL) e pseudômonas aeruginosa (dose de 6x109 unidades de formação de colônia por mL).

EXEMPLO 2 Tratamento de perfuração crônica de membrana de tímpano

[00107] A eficácia de tratamento com HB-EGF para perfurações crônicas de TM é demonstrada.

[00108] Um polímero injetável absorvível biocompatível para liberação de fator de crescimento em canal de ouvido.

[00109] Para tratar perfuração crônica de TM, é desejável ter um líquido que possa ser gotejado no ouvido, o qual então endurece e lentamente reabsorve sobre a designada estrutura de tempo enquanto eluindo fora a medicação. A taxa de degradação do polímero e taxa de eluição de fármaco são facilmente ajustáveis de acordo com o alvo de interesse.

[00110] Um hidrogel baseado em quitosano biodegradável para liberação de fatores de crescimento foi desenvolvido para prover um polímero biocompatível, bio-reabsorvível, injetável que pode carrear um fármaco de escolha e então pode ser instilado no canal de ouvido. O gel tem dois componentes líquidos e pode solidificar dentro de uns poucos minutos após mistura de dois componentes. Este pode ser facilmente administrado através de uma seringa de orifício dual. Alternativamente as soluções podem ser misturadas com um agente de reti- culação antes de liberação, e instiladas com uma seringa de orifício dual.

[00111] O hidrogel baseado em quitosano recentemente desenvolvido compreende moléculas de cadeia principal de quitosano hidrofí- lica e cadeias laterais de polilatídeo hidrofóbicas. Fibrinogênio pode ser incorporado nas redes de copolímero para aperfeiçoar afinidade de ligação, aperfeiçoar ligação de célula, e prover sítios proteoliticamente degradáveis. Liberação de fármaco a partir do hidrogel polimérico varia de acordo com as características tais como afinidade hidrofílica, comportamento de intumescimento, degradabilidade, e densidade de reti- culação do polímero. Os perfis de liberação de fármaco de rhBMP-2 a partir de hidrogéis baseados em quitosano foram medidos, e o comportamento de degradação do hidrogel de polímero em uma variedade de condições.

[00112] A específica razão de quitosano para poli lactídeo para o gel usado nos presentes exemplos é de 8:1. Em adição, 10% em peso / peso de fibrinogênio são incorporados na solução de pré-polímero. A formulação de hidrogel pode solidificar dentro de uns poucos minutos após mistura com um catalisador para reticulação química. Esta pode ser facilmente administrada através de uma seringa de orifício dual, ou com uma seringa de orifício simples.

[00113] Hidrogéis são não ototóxicos. Os hidrogéis foram injetados em tímpanos de camundongos seguindo perfurações. Um ouvido foi enchido com o polímero, enquanto o ouvido oposto não teve injeção (controle). Resposta de tronco cerebral auditivo (ABR) e limites de emissão otoacústica de produto de distorção (DPOAE) foram medidos 60 dias após ambos tímpanos serem cirurgicamente perfurados em 9 camundongos. No momento em que os tímpanos curaram espontaneamente, não existiram diferenças em limites auditivos entre os dois lados (Figura 2). Os dados mostram que os hidrogéis são não ototóxi- cos.

[00114] HB-EGF cura perfurações crônicas de membrana de tímpano. Quando uma coorte de perfurações crônicas em ouvidos de camundongos foi tratada com 40 microlitros de um gel contendo HB- EGF recombinante em uma concentração de 5 pg/mL (dose de liberação sustentada via um polímero baseado em quitosano bioabsorvível) 92% (22 de 24) curaram, comparados a 38% (10 de 26) de controles (somente polímero) em 4 semanas (p < 0,01). A habilidade para superar esta etapa crítica em cura de ferimento crônico de TM usando GF para ativar difusão de ligante de ectodomínio GFR demonstra sua adequação para intervenção usando um bioterapêutico. Este é o primeiro tratamento com fator de crescimento testado em um modelo animal de perfuração crônica que mostrou significante benefício sobre controle.

[00115] HB-EGF cura perfurações crônicas de membrana de tímpano com oclusão de tubo Eustaquiano. Um modelo animal de perfuração crônica de TM e oclusão de ET foi criado, como mostrado na Figura 3. Um existente modelo de rato de oclusão de ET (ver Herda et al. (2002) Laryngoscope 112:1657-62) foi adaptado para o camundongo e desde então foi realizado em 80 camundongos vivos com sucesso. A oclusão de ET foi realizada com o modelo de perfuração crônica descrito acima. Isto criou uma perfuração de descarga estéril úmida em 3 meses. Este modelo imita a condição humana de perfuração crônica combinada com disfunção ET.

[00116] Quando uma coorte de camundongos com este modelo (perfurações crônicas e oclusão ET) foi tratada com HB-EGF recombi- nante, 40 microlitros em uma concentração de 5 microgramas/mL (dose de liberação sustentada via um polímero de quitosano bioabsorví- vel) 94% (18 de 19) curaram comparado a 9% (2 de 23) de controles (somente polímero) em 6 semanas (p<0,01). Imagens representativas de perfurações crônicas de TM curadas ou não curando são mostradas na Figura 4. Histologicamente as perfurações fecham com camada espessa de ceratinócitos, comparadas a controles com uma falta de camada de ceratinócitos mesmo naqueles poucos casos em que ocorreu fechamento. A habilidade para superar esta etapa crítica em cura de ferimento crônico de TM usando HB-EGF para ativar difusão de li- gante de ectodomínio EGFR na presença de efusões de ouvido médio e oclusão de ET é útil em tratamento de pacientes com perfuração crônica de membrana de tímpano.

[00117] Testes em um modelo animal para otite média supurativa crônica. Após criação de modelo de perfuração crônica com oclusão ET, Pseudomonas aeruginosa (dose de 6x109 unidades de formação de colônia por mL) foram inoculadas no ouvido médio através de perfurações crônicas existentes. Em 2 semanas o fluido de ouvido médio foi coletado e enviado para reação de cadeia polimerase (PCR) para confirmar a presença de bactérias. Esta PCR positiva validou o modelo CSOM.

[00118] Os camundongos foram então divididos em duas coortes. Uma recebeu somente polímero. A outra recebeu polímero e HB-EGF em 5 microgramas/mL (mesma dose usada nos modelos acima). 100% do grupo tratado com HB-EGF curaram (16 de 16) comparado a 41% (7/17) no grupo controle (p < 0,01). No grupo controle a cura também foi diferente quando ela ocorre. A TM foi frequentemente muito fina e translúcida comparada a uma TM normal levemente opaca. A cura no grupo HB-EGF pareceu normal. A habilidade para ainda superar esta etapa crítica em cura de ferimento crônico de TM usando HB- EGF para ativar ligante de ectodomínio EGFR no modelo mais próximo para CSOM humana valida o processo de tratamento.

EXEMPLO 3

[00119] Um processo trans-tímpano de liberação (Figuras 5, 6 e 7). O veículo para HB-EGF ou liberação de HB-EGF é colocado contra ou através de membrana de tímpano inserido tanto trans-canal como via o tubo Eustaquiano. Ele pode ser removido após um período de tempo, ou pode ser biodegradável. O veículo pode conter um desenho para mantê-lo dentro da membrana de tímpano. Este pode ser um colar, bainha, flange, ranhura, ou qualquer mudança em largura ou altura. Ele pode ter mais de uma destas para mantê-lo no lugar. O veículo pode ser perfurado ou ter um lúmen de qualquer dimensão apropriada. Ali pode haver qualquer número de flanges ou qualquer largura e dimensões que sejam julgadas suficientes ou em excesso daquelas re-queridas para o veículo ser retido na membrana de tímpano.

[00120] É mostrado na Figura 5 o canal de ouvido 100; ouvido externo 110; e membrana de tímpano 120. Um dispositivo de liberação de fármaco transmembrana 125 também é mostrado, o qual tem uma largura 130 e comprimento 140.

[00121] É mostrada na Figura 6 uma concretização alternativa de um dispositivo de liberação trans-tímpano 126. O dispositivo tem uma largura 131 e comprimento 141. O dispositivo 126 compreende uma ou ambas de uma restrição externa 150 e uma restrição interna 155, onde a restrição tem uma largura 160.

[00122] É mostrada nas Figuras 7A-7B uma outra concretização de um dispositivo de liberação trans-tímpano 127. A Figura 7A é uma vista superior mostrando o canal de ouvido 100 e membrana de tímpano 120. O dispositivo de liberação 127 tem uma largura 132 e comprimento 142. O dispositivo compreende uma pluralidade de flanges, 170, arranjados no comprimento ao longo do dispositivo, cujos flanges têm um comprimento 171 e largura 172. A Figura 7B mostra uma seção transversa do dispositivo.

EXEMPLO 4 Dispositivo de liberação intratímpano

[00123] O dispositivo de liberação de fator de crescimento pode ser colocado entre as camadas da membrana de tímpano. Se um veículo sólido, ele pode ser colocado levantando uma ou mais camadas como uma aba então substituindo a aba após colocação. Se líquido ele pode ser injetado.

[00124] É mostrado na Figura 8 um dispositivo de liberação de membrana intratímpano 128. O dispositivo é inserido na membrana de tímpano, 120. O dispositivo tem uma largura 133 e comprimento 143.

EXEMPLO 5

[00125] Colocação de veículo como um objeto sólido adjacente à membrana de tímpano (Figura 9). O veículo pode ser colocado contra a membrana de tímpano e prover uma fonte local de HB-EGF ou inibidor de HB-EGF. O veículo pode ser colocado medial ou lateral com parte ou todo através de membrana de tímpano. A parte através de membrana de tímpano pode ser menor, maior ou do mesmo tamanho como a perfuração se presente.

[00126] É mostrado na Figura 9 um dispositivo de liberação de fator de crescimento 128 adjacente à membrana de tímpano 120. O dispositivo tem uma largura 134 e comprimento 144.

EXEMPLO 6

[00127] Um processo injetável de aplicação de fator de crescimento é mostrado na Figura 10. A formulação compreendendo fator de crescimento 200 pode ser liberada no canal de ouvido 100 para fazer contato com a membrana de tímpano 120 sobre sua superfície lateral e/ou medial, e ainda pode fluir na região de uma perfuração de membrana de tímpano 121. A formulação pode ser dispensada de uma seringa 210, através de um tubo de liberação 220. A formulação pode ser provida como uma solução simples, ou como duas soluções que são misturadas no momento de liberação.

[00128] Seringas de câmaras duais são conhecidas na técnica e facilmente disponíveis, por exemplo, ver entre outras: seringa de câmara dual Lyo-Jet; ou qualquer uma de patente U.S. 5 971 953; pedidos de patente U.S. US20030040701; US20140012196; US 20130060232; pedido internacional WO 1999017820A1; etc.

[00129] Tais formulações incluem composições que, com mistura, mudam para um estado mais viscoso ou sólido. Agentes viscogênicos incluem, sem limitação, gellan, N-isopropil acrilamida com acrilato de sódio e n-N-alquil acrilamida, ácido poliacrílico com polietileno glicol, ácido polimetacrílico com polietileno glicol, CARBOPOL com hidróxi propil metil celulose, acetato de celulose hidrogeno ftalato látex, algi- nato de sódio, ou um gel de termoendurecimento reverso tal como um poloxâmero ou uma poloxamina.

[00130] Tais formulações podem ser liberadas para a superfície epidérmica, externa da membrana de tímpano em um estado semelhante a líquido, isto é, uma forma escoável. Após administração, entretanto, a composição transforma-se em um estado semelhante a sólido de modo que a composição permanece em contato com a mem- brana de tímpano. Como um resultado, a composição permanece localizada contra a membrana de tímpano e o agente farmacológico pode se transferir para a membrana de tímpano. A composição viscosa ou sólida pode ser biodegradável ou não biodegradável.

Claims

1. Uso de fator de crescimento de epiderme de ligação de heparina (HB-EGF), caracterizado pelo fato de ser na fabricação de uma formulação para promover o fechamento de uma perfuração crônica de membrana de tímpano de um indivíduo.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o HB-EGF é uma forma solúvel da proteína HB-EGF.

3. Uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano e o HB-EGF é HB-EGF humana.

4. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que em que a formulação compreende a composição compreendendo uma dose eficaz de HB-EGF é contatado com membrana de tímpano afetada por um período de pelo menos 7 dias.

5. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que em que a formulação compreende a composição compreendendo uma dose eficaz de HB-EGF é contatado com membrana de tímpano afetada por um período de pelo menos 2 semanas.

6. Uso de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que em que a formulação é administrada pelo menos diariamente.

7. Uso de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que em que a formulação provê liberação sustentada do HB-EGF.

8. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a formulação é provida como uma solução aquosa, um gel, uma loção, um bálsamo, pasta ou outro veículo.

9. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada através de um espargimento.

10. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada como um líquido que então solidifica para permanecer adjacente à membrana de tímpano.

11. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a formulação é um gel de liberação sustentada compreendendo um copolímero reticulado de quitosano e polilactídeo.

12. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o gel de liberação sustentada compreende ainda fibrinogênio.

13. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a formulação é liberada por um dispositivo que provê liberação sustentada do HB-EGF.

14. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a formulação compreende ainda pelo menos um agente ativo adicional.

15. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma dose eficaz do fator de crescimento de epiderme de ligação de heparina (HB-EGF) e um veículo farmaceuticamente aceitável para uso como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.

16. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a quitosana e o polilactídeo estão presentes no gel em uma proporção que varia entre 10: 1 e 1: 1.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a quitosana e o polilactídeo estão presentes no gel na proporção de 8: 1.

18. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o gel compreende ainda fibrinogênio.

19. Uso, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o fibrinogênio está em uma concentração que varia de 5% (p/p) a 15% (p/p).

20. Uso, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o fibrinogênio está em uma concentração de 10% (p / p).