CN103037892A - 诱导血管生成的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在血管形成不足相关病症中诱导血管生成的药物组合物和方法，所述病症例如缺血和糖尿病性病症，例如糖尿病性足溃疡。具体地讲，提供了包含含有肝细胞生长因子/分散因子的1K1片段的持续释放纳米粒的药物组合物。

Description

诱导血管生成的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求在35 U.S.C. § 119(e)之下的于2010年9月1日提交的美国临时申请顺序号61/378,968和2010年2月22日提交的美国临时申请顺序号61/306,768的权益，所述临时申请的内容通过引用全部结合到本文中。

发明领域

本发明的实施方案涉及在血管形成不足相关病症中诱导血管生成的药物组合物和方法，所述病症例如缺血和糖尿病性病症，例如糖尿病性足溃疡。

发明背景

成人新血管形成对改善缺血性疾病具有潜力，缺血性疾病在美国是发病率和死亡率的首要原因(1)。缺血性疾病包括心血管病症，包括心绞痛、周围动脉病、组织溃疡(tissue sore)。Ferrara和Kerbel最近明确表达‘治疗性血管生成’是心血管医学的新出现的和令人兴奋的前沿(2)。促进新血管形成，对于伤口愈合、例如在糖尿病性溃疡的处理是至关重要的。面对糖尿病的一个主要的基础问题就是伤口愈合受损。在所有糖尿病人(2,600,000人)中预期有15%在其一生中会出现足溃疡。这些溃疡的特点倾向于慢性，因为它们不能愈合或愈合极其缓慢。在美国有超过750,000个患者患有糖尿病性足溃疡，在欧洲有980,000个，而在世界其它地区有1,100,000个，总共有2,800,000个患者。糖尿病性足溃疡是一个严重问题，因为多达25%糖尿病性足溃疡最终将需要截肢。糖尿病性伤口愈合的医学重要性并非言过其实。愈合能力对于人类健康而言是至关重要的，因为伤口愈合使患者能克服创伤性损伤、手术和因例如糖尿病等代谢障碍、微生物或其它物理或化学试剂所致的伤口。因此，需要促进新血管形成的药物。

然而，对于‘治疗性血管生成’而言，尽管使用重组蛋白或基因治疗的早期临床前研究和I期临床试验显示出有希望的结果，但是更严格的II期和III期研究却报道了不一致的结果(3-6)。这些临床试验的最新综述强调了载体‘洗出’(vector ‘washout’)导致暴露给血管生成剂(angiogenic agent)的暴露持续时间不足，这是可削弱治疗有效性的关键因素(7)。第二个挑战是血管生成因子(angiogenc factor)的稳定性，所述血管生成因子是大的蛋白质，在正常生理条件下通常不稳定。此外，这些蛋白质的糖基化在临床开发上具有重大挑战性。希望具有能克服这些挑战的组合物和方法。

发明概述

在此，我们将蛋白质工程与纳米技术结合起来，克服了在治疗中使用血管生成因子所观察到的挑战。本发明的实施方案基于以下观察结果：与给予游离1K1相比，肝细胞生长因子/分散因子(HGF/SF)的片段1K1当配制成纳米粒时增强血管生成。具体地讲，递送装载有1K1的纳米粒，通过ERK磷酸化导致MAPK信号转导的持续激活，并与单给予1K1片段相比在体外和体内显著诱导更多的小管形成(tubulogenesis)。

因此，提供包含生物相容性聚合物和有效量的肝细胞生长因子/分散因子的1K1蛋白片段的纳米粒的药物组合物，其中生物可降解聚合物包裹1K1蛋白。在一个实施方案中，所述1K1蛋白包含SEQ ID. NO:1。

在一个实施方案中，所述药物组合物的纳米粒的平均粒度为约50 nm至约500 nm，或约60 nm至约150 nm。

在所述纳米粒的配制中可使用任何生物相容性聚合物，在一个实施方案中，所述生物相容性聚合物是生物可降解聚合物并且所述生物可降解聚合物选自：聚酯、羟基脂族羧酸、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(dl-丙交酯/乙交酯、聚(乙二醇)、多糖、凝集素、糖胺聚糖、脱乙酰壳多糖、纤维素和丙烯酸酯聚合物。

在一个实施方案中，所述生物相容性聚合物是聚酯，例如包含聚-乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)的聚酯。

在某些实施方案中，所述药物组合物的纳米粒在规定的天、周或月的时间周期内释放治疗有效量的1K1蛋白，即在规定时间周期内持续释放。在一个实施方案中，所述纳米粒在约2天、约3天、约4天、约5天、约7天、或约14天的规定时间周期内释放治疗有效量的1K1蛋白。

在某些实施方案中，在规定时间周期内从所述纳米粒中释放的治疗有效量足以在释放的规定时间周期内导致细胞ERK的持续磷酸化。

在某些实施方案中，与所述化合物不存在时的血管生成相比，在规定时间周期内从所述纳米粒中释放的治疗有效量足以增加受试者的血管生成达至少约5%、约10%、约20%、约30%、约40%、约50%或约60%。

在某些实施方案中，所述治疗有效量是约0.1mg/kg至约1000 mg/kg的剂量。

可将所述药物组合物配制用于局部给药、肠内给药和胃肠外给药。在一个实施方案中，配制所述组合物用于局部给药，所述组合物是软膏剂、洗剂、喷雾剂、乳膏剂或凝胶剂。

也提供了治疗血管形成不足相关病症的方法。所述方法包括给予受试者治疗有效量的所述药物组合物，所述药物组合物包含生物相容性聚合物和有效量的肝细胞生长因子/分散因子的1K1蛋白片段的纳米粒，其中所述生物可降解聚合物包裹1K1蛋白。在一个实施方案中，所述治疗有效量是约0.1mg/kg至约1000 mg/kg 1K1蛋白的剂量。

在本发明的另一方面，提供治疗血管形成不足相关病症的方法，所述方法包括给予受试者有效量的1K1蛋白，其中以导致细胞ERK的持续磷酸化的方式给予所述1K1蛋白。例如，可使用在规定的天、周或月的时间周期内释放1K1的持续释放制剂例如胶囊剂、凝胶剂、薄膜剂或其它基质进行给药。使用1K1蛋白的持续释放制剂进行的给药，导致ERK的持续磷酸化并增强小管形成，从而在受试者中显著增加血管生成。

所述治疗所考虑的病症包括：心肌缺血性病症(例如心肌梗塞、坏死组织的血管再形成例如梗塞或血管成形术之后的心肌的血管再形成、心绞痛、心脏移植、血管移植以及重新开放血管以改善所述损伤的血管形成、灌注、胶原化(collagenization)和组织)、伤口愈合、以及组织和器官移植(例如自体的或异源的微血管移植的增强)。对伤口愈合的促进包括切口愈合、骨修复、烧伤愈合、心肌损伤的梗塞后修复、胃溃疡愈合和胃肠道其它溃疡愈合，通常促进组织的形成、糖尿病性溃疡的愈合、维持和修复。也考虑了移植组织的新血管形成，尤其是在患有血管不足、例如糖尿病的受试者中。

在一个实施方案中，所述血管形成不足相关病症选自：脑血管缺血、肾缺血、肺缺血、肢体缺血、心肌缺血、组织缺血、冠状动脉缺血、周围动脉病、肢体缺血、糖尿病性溃疡、坏疽、需要新血管形成以促进愈合的伤口、以及Buerger综合征(Buerger's syndrome)。在一个实施方案中，所述血管形成不足相关病症是糖尿病性足溃疡。

本发明的药物组合物可经局部给药、肠内给药或胃肠外给药而给予。在一个实施方案中，所述药物组合物给予多次，例如使用不同治疗方案。

附图简述

图 1A 至 1H 显示 1K1- 肝素复合物的结构特征和与 MET 受体的相互作用。图1A显示全长多结构域HGF/SF的结构域结构。α-链由N-端结构域(氨基酸32–121)和4个三环结构域(kringle domain)(K1、K2、K3和K4)组成，β-链含有丝氨酸蛋白酶(protinease)结构域(spdh结构域)。图1B显示NK1-肝素复合物的晶体结构(16) (PDB检索1GMO)。显示2个NK1二聚体通过肝素连接。图1C显示1K1-肝素复合物的晶体结构(PDB检索3MPK)。显示2个1K1二聚体通过肝素连接。图1B和图1C用Pymol划出。将回复突变K132E和R134E引入1K1的K1结构域，以灭活低亲和力肝素-结合位点。图1D是1K1的氨基酸序列，显示出突变位点。下划线的氨基酸表示经肝素连接的2个1K1二聚体。图1E和图1F显示使用表面等离振子共振，在12聚体肝素存在下NK1和1K1分别与MET567的结合。使用自最高浓度200 nm的浓度的每种蛋白的2倍稀释。样品和反应缓冲液中的12聚体肝素浓度是10 μM。图1G和图1H分别显示NK1-肝素-MET567的三元复合物和1K1-肝素-MET567的三元复合物的速度沉降分析。数据显示c(s)针对s*20,w的图。在10聚体肝素存在下，1K1比NK1的三元复合物的量明显更高。

图 2A 至 2D 显示 HGF/SF 和 1K1 诱导的内皮细胞增殖。图2A显示在2种不同浓度(10^{− 10} M和10^{− 7} M)的HGF/SF和1K1存在下人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖。图2B显示在24 h时PI3激酶抑制剂LY294002对1K1-诱导的细胞增殖的作用。图2C显示在48 h时Met抑制剂PHA 665752对1K1-诱导的HUVEC增殖的作用。图2D显示在72 h时MAP激酶抑制剂PD98059对1K1-诱导的HUVEC增殖的作用。数据代表平均值±SEM(n = 3)。符号“***”表示对比于经溶媒处理的对照，p值小于0.001；符号“*”表示对比于经溶媒处理的对照，p值小于0.05；符号“###”表示对比于1K1[10^{− 7} M]，p值小于0.001；符号“#”表示对比于1K1 [10^{− 7} M]，p值小于0.05。

图 3A 至 3C 显示 1K1 通过与 MET 激酶结合而诱导内皮小管形成。图3A和图3B显示分别使用平均管长和平均结节(node)数的3种形态测定分析，关于在生长因子减少的基质胶(growth-factor-reduced matrigel) (图未显示)上药理学抑制剂对1K1-诱导的HUVEC管形成的作用的图像的定量测定。数据代表平均值±SEM像素(n = 3)。符号“**”表示对比于经溶媒处理的对照，p值小于0.01；符号“#”表示对比于1K1([10^{− 7} M])，p值小于0.05。图3C是代表性的蛋白质印迹，显示在经Met抑制剂PHA 665752 (10^{− 6} M)、LY294002 (50 μM)和PD98059 (50 μM)处理2 h，再经1K1处理10分钟的HUVEC中的磷酸Erk和总Erk以及磷酸Akt和总Akt表达。数字表示：1: 溶媒, 2: HGF/SF (10^{− 8} M), 3: 1K1 (10^{− 7} M), 4: 1K1 + PHA 665752 (10^{− 6} M) 5: 1K1 + LY294002 (50 μM), 6: 1K1 + PD98059 (50 μM)。对于样品号4、5和6，使用1K1 (10^{− 7} M)以及所述抑制剂。

图 4A 至 4F 显示 1K1- 纳米粒在体外诱导血管生成。图4A显示包裹1K1的纳米粒(1K1-NP)的透射电镜(TEM)图像(条=500nm)。图4B显示经动态光散射实验所测的包裹1K1的纳米粒的大小分布(nm)。图4C显示在PBS中在室温下温育时从纳米粒中释放1K1的释放动力学。Y轴上的值代表从1K1-NP中释放的1K1的量，以μg为单位。图4D显示在48 h时Met抑制剂PHA 665752对1K1-NP诱导的HUVEC增殖的作用。图4E显示在48 h时PI3激酶抑制剂LY294002对1K1-NP诱导的HUVEC增殖的作用。图4F显示在48 h时MAP激酶抑制剂PD98059对1K1-NP诱导的HUVEC增殖的作用。数据代表平均值± SEM (n = 3)。符号“***”表示对比于经溶媒处理的对照，p值小于0.001；符号“**”表示对比于经溶媒处理的对照，p值小于0.01；符号“###”表示对比于1K1 (10^{− 7} M)，p值小于0.001；符号“##”表示对比于1K1 (10^{− 7} M)，p值小于0.01；符号“#”表示对比于1K1(10^{− 7} M)，p值小于0.05。

图 5A 至 5C 显示通过 1K1-NP 的血管生成因子的持续释放显著诱导血管生成反应。图5A显示使用平均管长，关于在基质胶上药理学抑制剂对1K1-NP诱导的HUVEC管形成的作用的图像的定量测定。数据代表平均值±SEM像素(n = 3)。符号“*”表示对比于经溶媒处理的对照，p值小于0.05；符号“##”表示对比于1K1 (10^{− 7} M)，p值小于0.01；符号“#”表示对比于1K1 (10^{− 7} M)，p值小于0.05。图5B是代表性的蛋白质印迹，显示在经Met抑制剂PHA 665752 (10^{− 6} M)、LY294002 (50 μM)和PD98059 (50 μM)处理2 h，再经10 min 1K1-NP和1K1处理的HUVEC中的磷酸Erk和总Erk以及磷酸Akt和总Akt。数字表示：1: 溶媒(PBS), 2: 溶媒(空PLGA), 3: 新鲜制备的1K1 (0.5 × 10^{− 7} M), 4: 在37 ℃温育24 h的1K1 (0.5 × 10^{− 7} M), 5: 在37 ℃温育24 h的1K1-NP (0.5 × 10^{− 7} M), 6: 1K1-NP + PHA665752 (10^{− 6} M), 7: 1K1-NP + LY294002 (50 μM), 8:1K1-NP + PD98059 (50 μM)。对于样品号6、7和8，使用(0.5 × 10^{− 7} M) 1K1-NP以及所述抑制剂。图5C是代表性的蛋白质印迹，显示在经(0.5x 10^{− 7} M) 1K1和(0.5 × 10^{− 7} M) 1K1-NP处理8.5 h的HUVEC中的磷酸Erk和总Erk。

图 6A 至 6F 显示使用斑马鱼模型的 1K1 和 1K1-NP 在体内介导的血管生成作用。将1K1或1K1-NP与生长因子减少的基质胶(Mgel)注射到肠下血管(SIV)附近。在所示条件的SIV然后用碱性磷酸盐染色并在明视野中观察，如图6A至6E所示。所示条件是：图6A: 溶媒(Mgel)；图6B: 空PLGA在Mgel中；图6C: 1K1在Mgel中；图6D: 1K1-NP在Mgel中；和图6E: 1K1-NP。图6F显示处理对血管生成的作用的形态测定定量测定。数据显示平均值SEM ± (n = 3)。

图 7A 至 7D 显示 1K1 (200 ng/ 塞 (plug)) 和 1K1-NP (200 ng/ 塞 ) 在体内在生长因子减少的基质胶植入物中诱导血管生成的作用。图7A至7D显示针对冯维勒布兰德因子(von Willebrand factor)免疫标记并用DAPI对核进行复染的植入物的横截面。图7A (溶媒)和图7B (空NP)显示核DAPI染色，但对冯维勒布兰德因子染色是阴性。图7C (1K1)和图7D (1K1-NP)显示用冯维勒布兰德因子免疫标记描绘的血管图像。以512 × 512像素分辨率捕获图像。

发明详述

本发明的实施方案基于以下观察结果：肝细胞生长因子/分散因子(HGF/SF) 1K1片段当配制成纳米粒时与给予游离1K1相比增强血管生成。具体地讲，递送1K1纳米粒，导致MAPK信号转导的持续激活并与单给予1K1片段相比在体外和体内显著诱导更多的小管形成。

肝细胞生长因子/分散因子(HGF/SF) (SEQ ID NO: 3)是多效性生长因子，其通过Met受体而促进内皮细胞增殖和迁移(9)。在先前的研究中，我们已经证明HGF/SF通过激活促分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇-3-激酶途径(P13K) (11-12)而独立于血管内皮生长因子诱导血管生成(10)。此外，Met受体已经证明在低氧中被上调，这表明HGF/SF将会引发缺血组织激活(13)。这些结果表明HGF/SF在促血管生成治疗中可起到重要作用。然而，HGF/SF是肝素结合蛋白，具有由N-端(N)结构域、4拷贝三环结构域(K1至K4)和与丝氨酸蛋白酶(SP)同源的C-端结构域组成的复杂多结构域结构(图1A) (14)。生物活性HGF/SF如下产生：通过连接第4三环和SP结构域的接头的蛋白酶剪切，得到双链(α/β)杂二聚体，其中α链和β链因以下5个推定的糖基化位点而都表现出相当的异质性：3个在α-链中(残基289、397和471)，2个在β-链中(残基561和648)。NK1片段是编码N结构域和K1结构域的HGF/SF转录物的可变剪接变体，其缺乏糖基化位点并在硫酸肝素共同受体或其结构类似肝素存在下表现为部分受体激动剂(15)。NK1含有2个肝素结合位点：1个在N结构域中，1个在包含氨基酸K132、R134和R181的K1结构域中(14, 16)。K1结构域通过K132和R134的反转电荷突变(reverse charge mutation)的肝素结合位点缺失，得到蛋白1K1 (K132E:R134E)，一种在体外和体内具有强效活性的Met受体的稳定的和非糖基化的激动剂(17)。

本文所用的肝细胞生长因子/分散因子(HGF/SF)的“1K1”片段是指肝细胞生长因子/分散因子(HGF/SF)的NK1片段(SEQ ID NO: 2)，其含有HGF/SF的至少部分N-端结构域和至少部分第一三环(K1)结构域，其中K1结构域的肝素结合位点已经被消除，例如通过插入反转电荷突变，参见美国专利号7,795,214。在一个实施方案中，1K1片段是SEQ ID NO: 1。在某些实施方案中，1K1片段与SEQ ID NO: 1的多肽具有至少70%相似性、至少80%相似性、至少90%相似性、或至少95%相似性。正如本领域所知，两个多肽间的“相似性”是通过比较一个多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代物与第二多肽的序列而测定的。在一个实施方案中，1K1片段与SEQ ID NO: 1的氨基酸序列具有至少50%氨基酸序列同一性、至少60%同一性、至少70%同一性、至少80%同一性、至少90%同一性、或至少95%同一性。也考虑本文所用1K1片段的氨基酸序列添加物。

本文所用的1K1片段具有血管生成活性，即促进血管生成，例如通过刺激血管内皮细胞生长和增殖。通过使用本领域常规测定，可检测血管生成活性，所述测定包括所附实施例中描述的任何测定。额外测定包括但不限于包括使用非血管化小鼠眼(例如Kenyon等, Invest Opthalmol. Vis. Sci. 37:625, 1996)或兔眼(例如参见Gaudric等，Ophthal. Res. 24:181, 1992)的角膜囊袋测定(cornea pocket assay)。该测定具有的优势是，容易测定新血管并且新血管基本上必须是正常无血管角膜中的新形成的血管。另一测定包括使用鸡绒毛膜尿囊膜(CAM测定；参见Wilting等, Anat. Embryol. 183:259, 1991)。在大鼠中的其它测定例如大鼠主动脉环模型，提供可重现的测定，其通常用于鉴定血管生成激动剂(例如参见Lichtenberg等, Pharmacol Toxicol. 84:34, 1999)。通过监测作为MET受体拮抗剂的能力，可评估活性，例如如同美国专利号7,795,214所述。

本文所用的术语“血管生成”是指血管的生长或形成。血管生成包括新血管从原先存在的血管上生长，以及血管发生(vasculogenesis)(是指自发血管形成)和套叠(intussusception)(是指通过已有血管的分开所致的新血管形成)。血管生成包括“新血管形成”、“血管再生”、“新血管产生”、“血管再形成”和“增加的侧支循环”。

术语“血管生成剂”是指刺激、加速、促进或增加血管生成的任何化合物或物质，无论是单用或与另一物质联用。

本发明的实施方案提供纳米粒药物组合物，所述组合物包含生物相容性聚合物和有效量的HGF/SF的1K1蛋白片段。

通过本领域技术人员众所周知的方法可产生1K1蛋白。技术人员使用本文所含信息和参考文献以及本领域已知技术(例如参见Sambrook, Fritsch和Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989，和Ausubel等, Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1992)，可以容易地制备编码本发明多肽和/或其调节元件的全部或部分的序列。这些技术包括使用编码NK1 (SEQ ID NO: 2)的核酸的定向诱变。可将编码HGF/SF的1K1片段(例如SEQ ID NO:1)的核酸掺入到重组表达载体中，例如与能够供用于被宿主细胞表达编码序列的控制序列可操作地连接。

术语“可操作地连接”是指其中所述元件呈允许它们按照它们预定方式起作用的关系的并列。控制序列与编码序列“可操作地连接”是以这样的方式连接，所述方式使得在与控制序列相容的条件下完成编码序列的表达。

可选择或构建合适的载体，其含有合适的调节序列，包括启动子序列、终止子片段、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其它合适序列。载体可以是质粒、病毒例如噬菌体噬菌粒或杆状病毒、粘粒、YAC、BAC或PAC，如果合适的话。可提供具有复制起点、任选表达所述多核苷酸的启动子和任选所述启动子的调节子的载体。载体可含有一个或多个选择标记基因，例如就细菌质粒而言的氨苄青霉素抗性基因或对于哺乳动物载体而言的新霉素抗性基因。可在体外使用载体，例如用于产生RNA或者用于转染或转化宿主细胞。在各种各样不同宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是熟知的。

合适的宿主细胞包括细菌、真核细胞(例如哺乳动物和酵母)和杆状病毒系统。在本领域中可用于异源多肽表达的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、COS细胞等。

可选择与宿主细胞相容的启动子和其它表达调节信号，对于所述宿主细胞而设计表达载体。例如，酵母启动子包括酿酒酵母(S. cerevisiae) GAL4启动子和ADH启动子、粟酒裂殖酵母(S. pombe) nmt1启动子和adh启动子。哺乳动物启动子包括响应重金属例如镉的金属硫蛋白启动子。病毒启动子例如SV40大T抗原启动子或腺病毒启动子也可使用。所有这些启动子在本领域都易得。

载体可包含其它序列(使得作为融合物产生所述多肽)和/或编码分泌信号的核酸(使得宿主细胞产生的多肽从细胞中分泌出)。例如，在一个实施方案中，所述多肽经修饰，例如通过添加组氨酸残基，以有助于其纯化。

可将载体引入如上所述的合适宿主细胞中，以提供1K1多肽的表达。可选择与所述载体相容的细胞，并且所述细胞可以是例如细菌、酵母(例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))、昆虫或哺乳动物。

将载体引入宿主细胞，然后引起或允许所述核酸表达，例如通过在表达所述基因的条件下培养宿主细胞，使所编码多肽得以产生。如果所述多肽与合适的信号前导肽一起表达，它可从细胞内分泌到培养基中。经表达产生之后，可从宿主细胞和/或培养基中分离和/或纯化多肽。在一个实施方案中，1K1多肽呈基本纯化的形式，在这种情况下通常在以下制剂中含有所述多肽，其中超过90%、例如95%、98%或99%所述多肽在制剂中。然后可测定IK1多肽的血管生成活性。

本文所用的“有效量”包括允许进行其预定功能(例如在本文所述的新血管形成不足相关病症中刺激血管生成)的试剂(例如1K1多肽)量。有效量将取决于多种因素，包括递送方式、生物活性、年龄、体重、性别、一般健康、待治疗病症的严重程度、以及合适的药物动力学特性。理解的是，当一种试剂例如1K1片段单用时，与该试剂与另一血管生成剂联用时相比，其有效量可以是不同量。

术语“药物组合物”是指配制在本领域通常接受的用于将生物活性化合物递送到哺乳动物例如人的介质中的化合物的制剂。因此，这样的介质包括所有药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

本文所用的术语“纳米粒”是指经例如光散射方法测定的尺寸不大于1,000 nm的颗粒。在一个实施方案中，所述纳米粒的平均粒度为约2.5至约999 nm。在一个实施方案中，所述纳米粒的平均粒度为约.5至约500 nm。在某些实施方案中，大小范围为约25至约300 nm、约50至约200 nm。在某些实施方案中，纳米粒大小不大于500 nm、不大于300 nm、不大于200 nm、不大于160 nm、或不大于150 nm、或不大于140 nm。

本文所述的药物组合物的纳米粒包含包裹蛋白片段1K1的生物相容性(例如生物可降解)聚合物。本文所用的术语“包裹”或“包入”是指生物相容性聚合物覆盖或包住1K1蛋白。在一个实施方案中，所述生物可降解聚合物用例如外部球形聚合物层完全覆盖即包住1K1蛋白。在一个实施方案中，所述1K1蛋白仅被生物相容性聚合物部分覆盖。在一个实施方案中，所述1K1蛋白在生物相容性聚合物表面上。在一个实施方案中，所述1K1蛋白存在于生物相容性聚合物内。

在某些实施方案中，在所述组合物中聚合物与1K1的比例范围可为约1:20至约20:1。比例范围可为约1:120至约10:1、约1:30至约5:1、或约1:20至约1:1。在某些实施方案中，比例范围为约1:20至约1:5。在某些实施方案中，比例为约1:13。在一个实施方案中，比例范围为约1:1至约3:1。应当知道，该比例可基于重量、体积和/或摩尔。

在某些实施方案中，与纳米粒缔合的至少约5% 1K1、至少约10% 1K1、至少约15% 1K1、至少约20% 1K1、至少约30% 1K1、至少约40% 1K1、至少约50% 1K1、至少约60% 1K1、至少约70% 1K1、至少约80% 1K1、至少约90% 1K1、至少约95% 1K1、或至少约97%、约98%、或约99% 1K1、或100% 1K1，可在预定时间周期内从所述纳米粒中释放出来。在这样的实施方案中，所需量的1K1可在至少约6小时、至少约12小时、至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约1周、至少约2周、至少约1月或至少约2月的时期内从所述纳米粒中释放出来。在一个实施方案中，所述1K1在至少约1周的时期内从所述纳米粒中释放出来。

在一个实施方案中，在规定时间周期内从纳米粒中释放的治疗有效量的1K1在规定释放时间周期内足以导致细胞ERK的持续磷酸化。测定ERK磷酸化的方法是本领域技术人员众所周知的。在一个实施方案中，ERK磷酸化经蛋白质印迹分析来测定，参见例如实施例1。在一个实施方案中，与使用不与纳米粒缔合的相当浓度的IK1所观察到的ERK磷酸化相比，细胞ERK的磷酸化增加至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、或至少约90%。

在一个实施方案中，在规定时间周期内释放的治疗有效量的1K1足以与所述化合物不存在时的血管生成相比，增加受试者的血管生成至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、或至少约90%。

合适的生物相容性聚合物(其中许多是生物可降解的)包括例如：聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、乙交酯-丙交酯共聚物、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、乳酸-乙醇酸共聚物、聚己内酯、聚碳酸酯、聚酯酰胺、聚酐、聚(酰胺)、聚(氨基酸)、聚乙二醇及其衍生物、聚原酸酯、聚缩醛类、聚氰基丙烯酸酯、聚醚酯、聚二氧杂环己酮、聚(亚烷基烷基酯)、聚乙二醇和聚原酸酯的共聚物、生物可降解的聚氨酯。其它聚合物包括聚(醚)例如聚(氧化乙烯)、聚(乙二醇)、和聚(四亚甲基氧化物)；乙烯聚合物-聚(丙烯酸酯)和聚(甲基丙烯酸酯)例如甲基、乙基、其它烷基、羟乙基甲基丙烯酸酯、丙烯酸和甲基丙烯酸，和其它例如聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)和聚(乙酸乙烯酯)；聚(氨酯)；纤维素及其衍生物例如烷基、羟基烷基、醚类、酯类、硝基纤维素和不同醋酸纤维素；聚(硅氧烷)等。其它聚合材料包括基于天然存在的材料的那些，例如多糖(例如藻酸盐)、脱乙酰壳多糖、琼脂糖、透明质酸、明胶、胶原和/或其它蛋白、及其混合物和/或其修饰形式。也包括本文所公开的任何聚合物的化学衍生物(取代、化学基团(例如烷基、亚烷基)的添加、羟化、氧化和本领域技术人员常规进行的其它修饰)。聚合物可具有不同的平均链长，导致多种固有粘度和聚合特性，所述平均链长例如5,000-200,000，优选15,000-25,000分子量。此外，混合物、接枝聚合物和共聚物，包括任何这些聚合物的嵌段共聚物，都可使用。可以理解，大量不同聚合物变化是可得到的。可以理解，这些聚合物中的某些需要使用合适的引发剂或交联剂，以导致聚合。

在一个实施方案中，用于本文所述聚合物的生物相容性聚合物是生物可降解的，使得在给予受试者之后，所述基质被降解和代谢，从而在延长的时间周期内释放出1K1蛋白。本发明所用生物可降解聚合物的某些实例包括羟基脂族羧酸，其为均聚物或共聚物，例如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(dl-丙交酯/乙交酯、聚(乙二醇)；多糖、例如凝集素、糖胺聚糖、例如脱乙酰壳多糖；纤维素、丙烯酸酯聚合物等。聚合物的选择可通过给予所需组织之后的所需降解率而确定。

一般而言，以下标准对于用于递送活性剂的材料的选择而言是重要的：(1) 最小细胞毒性或无细胞毒性，(2) 最小限度引发或不引发免疫应答和炎症，(3) 与水溶液和生理条件相容，(4) 所述材料及其加工方法与1K1蛋白或所掺入的其它试剂的稳定性的相容性。在本文所述的方法中，合意的是使用具有受控的生物降解率的材料。可选择交联和单体浓度等特征，以提供所述试剂的降解和释放的所需速率。可通过本领域技术人员众所周知的方法或通过本文所述的方法(参见例如实施例1)来监测试剂的释放。

在一个实施方案中，所述聚合物是生物相容性聚酯。术语“生物相容性聚酯”包括通过聚合一种或多种单体而制备的任何聚酯，所述单体包括但不限于D,L-丙交酯、D-丙交酯、L-丙交酯、D,L-乳酸、D-乳酸、L-乳酸、乙交酯、乙醇酸、ε-己内酯、ε-羟基己酸、γ-丁内酯、γ-羟基丁酸、δ-戊内酯、δ-羟基戊酸、羟基丁酸、苹果酸等。

在一个实施方案中，所述生物相容性聚合物是聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物或乳酸-天冬酰胺共聚物、例如PLGA或PEG/CS-PLGA (PLGA的聚乙二醇/脱乙酰壳多糖衍生物)。本文所用的术语“PLGA”意指以任何比例例如1:99至99:1、优选3:1的乳酸或丙交酯和乙醇酸或乙交酯的共聚物。它们也被称为聚丙交酯-乙交酯共聚物。可使用常规方法自任何单体合成制备PLGA或可市购获得PLGA。可市购的PLGA包括例如PLGA 7520 (乳酸:乙醇酸=75:25，平均分子量：20,000, Wako Junyaku, Japan)。在一个实施方案中，所述PLGA含有25-65%(重量)乳酸和乙醇酸。

在一个实施方案中，所述生物相容性聚合物的表面经修饰，例如经聚乙二醇(PEG)修饰，导致水溶性蛋白与所述聚合物的亲和力增加，这使得更容易包裹。其它修饰方法是本领域技术人员已知的。

在某些实施方案中，所述纳米粒还包含用于将所述纳米粒靶向目标位置(例如组织、细胞等)的靶特异性标签(靶标部分)。本文所用的“靶向部分”是指能特异性结合特定靶分子并形成结合复合物的所有分子。因此，配体及其相应靶分子构成特异性结合对。

术语“特异性结合”是指发生在诸如酶/底物、受体/激动剂、抗体/抗原、以及凝集素/碳水化合物等配对物之间的结合，其可以经共价或非共价相互作用或者共价和非共价相互作用的组合而介导。当两种物质相互作用产生非共价结合的复合物时，发生的结合通常是静电、氢键合、或亲脂性相互作用的结果。因此，"特异性结合"发生在配对物之间，其中在这两种物质之间有相互作用，其产生具有抗体/抗原或酶/底物相互作用的特征的结合复合物。具体地讲，特异性结合的特征在于配对物的一个成员与特定物质结合，而不与该结合成员的相应成员所属的化合物家族内的其它物质结合。因此，例如，抗体优选与蛋白家族内的单一表位、而非另一表位结合。

靶向部分的实例包括但不限于抗体、淋巴因子、细胞因子、受体蛋白质例如CD4和CD8、溶解的受体蛋白例如可溶性CD4、激素、生长因子、肽模拟物、合成配体等(其特异性结合所需靶细胞)以及核酸(其通过碱基对互补而结合相应核酸)。特别感兴趣的靶向部分包括肽模拟物、肽、抗体和抗体片段(例如Fab'片段)。例如，β-D-乳糖已经连接在表面以靶向肝细胞中存在的去唾液酸糖蛋白(aloglysoprotein，ASG)，所述肝细胞与循环血池接触。

细胞靶标包括组织特异性细胞表面分子，用于靶向特异性目标位点，例如神经组织、肝组织、肌肉细胞等。内皮细胞是特别感兴趣的靶标，尤其是血管中或缺血组织附近或伤口附近存在的内皮细胞。内皮细胞上存在的标记中有整联蛋白，已经表征了多种不同亚型的整联蛋白。整联蛋白可对参与特定生理过程的内皮细胞具有特异性，例如某些整联蛋白与炎症和白细胞运输有关(参见Alon & Feigelson (2002) Semin Immunol. 14(2):93-104；和Johnston & Butcher (2002) Semin Immunol 14(2):83-92，通过引用结合到本文中)。对ICAM-1、VCAM-1等分子具有特异性的靶向部分可用于靶向发炎组织中的血管。靶向纳米粒描述于例如美国专利申请2004/0126900。

纳米粒的制备

可用本领域技术人员熟知的和实施的多种方法来制备本文所述的纳米粒。形成包裹生物活性材料的纳米粒的实例方法包括但不限于单体的乳液聚合、界面聚合、界面缩聚、乳化/溶剂蒸发、相分离、溶剂置换和界面沉积、乳化/溶剂扩散(ESD)、盐析方法、喷雾干燥和冷冻干燥，合适的方法和指南在以下文献中提供：例如Reis等，Nano capsulation I. “Methods for the preparation of drug-loaded polymeric nanoparticles (用于制备装载有药物的聚合纳米粒的方法)”, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2 (2006) 8-21；和Muthu, “Nanoparticles based on PLGA and its co-polymer: an overview (基于PLGA及其共聚物的纳米粒：综述)” Asian J. Pharmaceutics 2009年10月-12月,第266-273页。另见美国专利申请顺序号20080095856和20080131513。特定特性(例如流动性、溶出率、分散性、化学反应性、生物功效和亲水性)至纳米粒中的工程改造可用于于多种应用。(参见Davies等，Adv. Mater. 1998, 10, 1264-1270；Wang等，J. Controlled Release, 1999, 57, 9-18和Zambaux M等，Influence of experimental parameters on the characteristics of poly(lactic acid) nanoparticles prepared by double emulsion method (实验参数对通过双重乳剂方法制备的聚(乳酸)纳米粒的特征的影响). J. Control. Release 1998；50: 31-40)。

形成纳米粒的一种方法是溶剂蒸发法。在该方法中，将聚合物溶于有机溶剂例如二氯甲烷、氯仿或乙酸乙酯中，其也可用作溶解疏水性药物的溶剂。再将聚合物和药物溶液的混合物在含表面活性剂或乳化剂的水溶液中乳化，形成水包油(o/w)乳剂。在形成稳定乳剂之后，有机溶剂经减压或经持续搅拌而蒸发。稳定剂的种类和浓度、匀浆器速度和聚合物浓度可影响粒度。为了产生小粒度，通常可使用高速匀浆或超声处理。

自发乳化或溶剂扩散方法是溶剂蒸发法的改良形式。在该方法中，可与水混溶的溶剂以及少量不与水混溶的有机溶剂用作油相。因为溶剂自发扩散，两相之间产生界面扰动，导致形成小颗粒。随着可与水混溶的溶剂浓度增加，粒度可下降。溶剂蒸发和溶剂扩散法都可用于疏水性药物或亲水性药物。就亲水性药物的情况而言，需要形成将药物溶于内部水相的多重w/o/w乳剂。

在一个实施方案中，通过本领域实施良好的双重乳剂-溶剂扩散方法(参见例如Rocha等, (2008) Biomaterials, 29:2884-2890)制备包含1K1蛋白和生物相容性聚合物的纳米粒。例如，水包油包水(w/o/w)溶剂蒸发系统用于形成纳米粒。将生物相容性聚合物与有机溶剂混合，所述有机溶剂例如乙酸乙酯、二甲基氯(也称为亚甲基氯和二氯甲烷)、乙腈、丙酮、氯仿等。可提供在有机溶剂中呈2-15%溶液的聚合物。聚合物越粘稠，活性剂例如IK1从纳米粒中释放得越慢。加入大致等量的药物/试剂溶液并用例如超声处理使聚合物溶液乳化。

活性剂(例如1K1和任选额外的活性剂)和聚合物的浓度、以及活性剂/聚合物的比例，允许控制粒度和包裹得率。选择浓度以通过经本领域已知的优化而提供所需终产物。一般而言，对于较小粒度而言选择较低浓度的活性剂，对于较大粒度而言则选择较高浓度的活性剂。聚合物与活性剂的比例较高，将会提供较厚的聚合物包裹，而聚合物与活性剂的比例较低则将提供较薄的包衣，其进而影响释放。1K1浓度通常为至少约0.001 mg/ml、更通常至少约0.01 mg/ml、至少约0.1 mg/ml、或1 mg/ml、和不超过约100 mg/ml，通常不超过约10 mg/ml。聚合物浓度通常为至少约0.01 mg/ml，更通常为至少约0.1 mg/ml、至少约1 mg/ml、和不超过约100 mg/ml、通常不超过约50 mg/ml。按照重量百分比的化合物与聚合物的比例可不同，为约1:1000；约1:500；约1:100、约1:50；约1:10；约1:20、约1:5等。

然后将乳剂与较大体积的乳化稳定剂例如聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯吡咯烷酮的水溶液混合。通常提供呈约2-15%溶液、更通常约4-10%溶液的乳化稳定剂。然后将所得混合物匀浆，得到稳定的w/o/w双重乳剂。然后蒸发有机溶剂；例如，参见实施例1。纳米粒可经离心收集。

可操纵制备参数以调节粒度和1K1释放率。参见Zambaux M等，Influence of experimental parameters on the characteristics of poly(lactic acid) nanoparticles prepared by double emulsion method (实验参数对通过双重乳剂方法制备的聚(乳酸)纳米粒的特征的影响).. J. Control. Release 1998；50: 31-40, 通过引用全部结合到本文中。通过低水相体积和高浓度PVA而产生小颗粒。

可通过冻干等，经粉末化(powderization)，将纳米粒转化为可再分散的聚集粉末(纳米复合物(nanocomposit))。在一个实施方案中，将纳米粒与有机物或无机物经再分散混合(redispersiably complexed)并干燥。例如，通过使用糖醇或蔗糖，可有效控制负荷速率的变化。由于充当填充剂的糖醇所致，可改善处理的容易性。糖醇包括但不限于甘露醇、海藻糖、山梨醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、木糖醇等，优选海藻糖。纳米粒向聚集物的转化简化处理，并可在使用前通过将其与水接触而将它们重构为高反应性纳米粒(。或者，不用冻干，可通过流动床干燥制粒方法(使用例如Aggromaster AGM, Hosokawamicron, Japan)将纳米粒转化为复合物，形成可再分散的聚集物。

在一个实施方案中，所述纳米粒含有生物活性物(例如1K1蛋白)的比例为0.1-99% (w/v)，优选0.1-30% (w/v)，和更优选1-10% (w/v)。在一个实施方案中，所述生物活性物包括1K1蛋白和一种或多种额外治疗剂。可用于药物组合物的额外治疗剂的实例包括但不限于新血管剂(neovascular agent)(例如已知增加血管形成的其它试剂)、抗生素、抗炎药和维生素。另外，可将所述药物组合物与额外治疗剂一起配制，配制成纳米粒或非纳米粒。一般而言，额外试剂不应与1K1的血管生成促进作用发生抵触。

本文所述的术语“治疗剂”是指用于疾病的诊断、治疗或预防的物质。本领域普通技术人员已知在疾病的诊断、治疗或预防中有益的任何治疗剂都预期为本发明情况中的治疗剂。治疗剂包括药物活性化合物、激素、生长因子、酶、DNA、质粒DNA、RNA、siRNA、病毒、蛋白、脂质、促炎分子、抗体、抗生素、抗炎药、反义核苷酸和转化核酸或其组合。任何治疗剂都可混合到这类组合是生物相容的程度。

药物组合物

在一个实施方案中，使用作为持续释放制剂例如并非纳米粒的持续释放制剂的药物组合物，将1K1蛋白递送给受试者。适于持续释放的制剂的载体包括但不限于胶囊剂、微球体、颗粒、凝胶剂、包衣、基质、糯米纸囊剂、丸剂或其它药物递送组合物。这类持续释放制剂的实例先前已描述于例如美国专利号6,953,593、6,946,146、6,656,508、6,541,033、6,451,346，其内容都通过引用结合到本文中。制备持续释放制剂的许多方法都是本领域已知的并公开于Remington's Pharmaceutical Sciences (第18版；Mack Publishing Company, Eaton, Pa., 1990)，其通过引用结合到本文中，是本领域技术人员众所周知的。

例如，可将1K1包入固体疏水性聚合物的半透性基质中。所述基质可成形为薄膜剂或微胶囊剂。这类基质的实例包括但不限于聚酯、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等, Biopolymers 22:547-556 (1983))、聚丙交酯(美国专利号3,773,919和EP 58,481)、聚乳酸聚乙醇酸(polylactate polyglycolate,PLGA)例如乙交酯-丙交酯共聚物(参见例如美国专利号4,767,628和5,654,008)、水凝胶(参见例如Langer等(1981) J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277；Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982))、非降解性乙烯-醋酸乙烯酯(例如乙烯醋酸乙烯酯盘和乙烯-醋酸乙烯酯共聚物)、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如Lupron Depot™、聚-D-(−)-3-羟基丁酸(EP 133,988)、透明质酸凝胶(参见例如美国专利号4,636,524)、藻酸悬液、聚原酸酯(POE)等。

能够包裹1K1的合适微胶囊剂也可包括羟甲基纤维素或明胶的微胶囊剂以及经凝聚技术或经界面聚合制备而成的聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊剂。另外，也可使用微乳剂或胶态药物递送系统例如脂质体和白蛋白微球体。参见Remington's Pharmaceutical Sciences (第18版；Mack Publishing Company Co., Eaton, Pa., 1990)。其它优选的持续释放组合物使用生物粘合剂，以将1K1保留在给药部位。

所述持续释放制剂可包含1K1试剂置于其中的生物可降解聚合物，其可提供非立即释放。适于持续释放制剂的生物可降解聚合物的非限制性实例包括聚(α-羟酸)、丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)、聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PG)、聚(α-羟酸)的聚乙二醇(PEG)缀合物、聚原酸酯、聚阿司匹林(polyaspirin)、聚磷腈(polyphosphagene)、胶原、淀粉、脱乙酰壳多糖、明胶、藻酸盐、葡聚糖、乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇(PVA)、PVA-g-PLGA、PEGT-PBT共聚物(polyactive)、甲基丙烯酸酯类、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、PEO-PPO-PEO (pluronics)、PEO-PPO-PAA共聚物、PLGA-PEO-PLGA、聚原酸酯(POE)、或其任何组合，如以下文献所述：例如美国专利号6,991,654和美国专利申请号20050187631，其各自通过引用全部结合到本文中。

普通技术人员将会理解，持续释放制剂的不同组合也适合本发明。例如，从业人员可配制1K1蛋白作为装载至少一种1k1的凝胶剂和微球体的组合，其中将凝胶剂和微球体的组合放置在靶部位。根据载体、持续释放制剂和1K1总量的不同，可在约1天至约6个月的时间周期范围内释放1K1。

在一个实施方案中，在规定时间周期内从所述持续释放制剂中释放的1K1的量，在规定时间周期内足以导致细胞ERK的持续磷酸化。评价ERK磷酸化的方法是本领域技术人员众所周知的，并且可容易地确定剂量。在一个实施方案中，使用持续释放制剂，与用在规定时间周期内并非以持续方式释放的相同剂量的1K1所观察到的小管形成相比，受试者的小管形成增加至少5%、至少10%、至少30%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%。在规定时间周期内释放的有效量的1K1的范围为约0.01 mg/kg至约1000 mg/kg、约.1 mg/kg至约100mg/kg、约0.1 mg/kg至约200 mg/kg、约0.2 mg/kg至约20 mg/kg。

本发明的纳米粒可配制在药物组合物中，用于给予受试者。根据所需制剂的不同，药物组合物可包含药学上可接受的、无毒稀释剂载体，其限定为常用于配制供动物或人类给药用的药物组合物的溶媒。选择稀释剂，使其不影响组合的生物活性。这类稀释剂的实例是蒸馏水、缓冲水、生理盐水、PBS、林格液、葡萄糖溶液和Hank氏溶液。另外，所述药物组合物或制剂可包含其它载体、或无毒、无治疗性、非免疫原性的稳定剂、赋形剂等。所述组合物也可包含接近生理条件的额外物质，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂、润湿剂和去垢剂。

可使用本领域技术人员众所周知的方法配制所述药物组合物。所述药物组合物可包含0.1%至99%(重量)的活性成分，例如包含1K1片段的纳米粒。在一个实施方案中，所述组合物包含约1%至约80%、约1%至约70%、或约1%至约50%、或约1%至约20%(重量)的活性成分。有关适合不同给药类型的制剂的进一步指南可参见Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, Pa., 第17版(1985)。关于药物递送方法的简要综述，参见Langer, Science 249:1527-1533 (1990)。

本文所述的药物组合物可以各种不同方式给予。本发明的药物组合物可经特别配制，用于以固体或液体形式给药，包括适用于以下给予的那些形式：(1)口服给药，例如，灌服剂(水性或非水性的溶液剂或混悬剂)、锭剂、糖锭剂、胶囊剂、丸剂、片剂(例如针对口腔、舌下和系统吸收靶向的那些)、大丸剂、粉剂、颗粒剂、用于施用于舌头的贴剂；(2)胃肠外给药，例如通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射，例如以无菌溶液剂或混悬剂、或持续释放制剂的形式；(3)局部施应，例如，以乳膏剂、软膏剂或控制释放贴剂或施应于皮肤的喷雾剂的形式；(4)阴道内或直肠内，例如以子宫栓剂、乳膏剂或泡沫剂的形式；(5)舌下；(6)眼部；(7)透皮；(8)跨黏膜；或(9)鼻腔。

对于口服给药，活性成分可以固体剂型(例如胶囊剂、片剂和粉剂)或液体剂型(例如酏剂、糖浆剂和混悬剂)给予。可将所述活性成分与无活性成分和粉末状载体一起包裹在明胶胶囊中，所述无活性成分和粉末状载体例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、纤维素或纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸、糖精钠、滑石粉、碳酸镁。可为了提供所需颜色、味道、稳定性、缓冲能力、分散性或其它已知所需特征而添加的额外无活性成分的实例是红色氧化铁、硅胶、月桂基硫酸钠、二氧化钛和可食用白色墨水。类似的稀释剂可用于制造压缩片剂。可将片剂和胶囊剂制备成持续释放产品，以提供在几小时的时间周期内的持续释放药物。可将压缩片剂包糖衣或薄膜衣，以掩蔽任何令人不快的味道并保护片剂免遭空气破坏，或者包肠溶衣，用于在胃肠道中选择性崩解。用于口服给药的液体剂型可含有着色剂和矫味剂，以增加患者的接受性。

可将所述活性成分(单用或与其它合适成分联用)制备成经吸入给药的气溶胶制剂(即它们可以被“雾化”)。可将气溶胶制剂放入加压的可接受抛射剂例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气中。

适于胃肠外给药(例如经关节内(在关节中)、静脉内、肌内、皮内、腹膜内和皮下途径)的制剂，包括水性和非水性的等渗无菌注射用溶液剂(其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和赋予制剂与预期受体的血液等渗的溶质)和水性和非水性无菌混悬剂(其可包含助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂)。

用于配制所述药物组合物的成分优选是高纯度的并且基本不含潜在有害的污染物(例如至少是国家食品(National Food，NF)级，通常至少是分析级，更通常至少是药用级)。此外，预期用于体内使用的组合物是无菌的。在必须在使用之前合成给定化合物方面来说，所得产物通常基本不含在合成或纯化工艺期间可存在的任何潜在毒性剂，尤其是任何内毒素。用于胃肠外给药(parental administration)的组合物也是无菌的，基本上是等渗的并在GMP条件下制备。

在血管形成不足受试者中促进血管生成的方法。

所述药物组合物可用于治疗或预防以受累组织的血管形成不足(或有其倾向性)为特征的病症，即其中在受累组织中需要新血管形成以达到充足的血管形成的病症。

在某些实施方案中，本发明的方法和组合物用于在生物体(biological matter)中治疗或预防受益于刺激血管生成或增加血管生成的多种疾病和障碍中的任一种。例如，本发明的组合物和方法可用于在体外或离体(例如在适用于移植到生物体例如哺乳动物中的组织或器官的培养、存储或产生中)促进、增强或增加生物体中的血管生成。

本发明的组合物和方法也可用于在体内(例如在伤口部位或者在经历缺血或低氧或处于缺血或低氧危险之中的生物体内的部位)促进、增强或增加血管生成，从而在经历缺血或处于缺血危险之中的组织中增加血流和氧化并减少或预防所述部位的组织损伤。

在某些实施方案中，本发明包括用于治疗或预防受益于增加血流的病理性病症、疾病和障碍的组合物和方法。这类病症的实例包括缺血相关疾病。缺血相关疾病的实例包括心肌缺血、周围缺血、脑缺血和深静脉血栓形成。

此外，在相关实施方案中，本发明包括治疗伤口愈合、糖尿病(例如糖尿病性足溃疡)、眼病或眼障碍、心脏病、充血性心力衰竭、心肌缺血、周围缺血、淋巴脉管障碍、冠状动脉病、中风、心绞痛和周围血管病的组合物和方法。在一个实施方案中，本发明的组合物和方法用于伤口愈合或重建手术。

在一个实施方案中，本发明包括通过给予有需要的受试者、得自所述受试者的细胞、组织或器官包含本文所述的1K1-纳米粒的药物组合物，治疗新血管形成不足相关病症的方法。所述给予呈有效刺激或增加血管生成的量。在具体实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在某些实施方案中，所述组合物局部给予例如需要血管生成的受试者体内的部位。受试者体内的这些部位的实例包括伤口和经历缺血或低氧或处于缺血或低氧危险之中的组织或器官。在其它实施方案中，1K1-纳米粒经系统给予。在进一步的实施方案中，将1K1纳米粒离体给予得自所述受试者的细胞、组织或器官，并使所述细胞、组织或器官与所述纳米粒接触，再移植回所述受试者。

本文所用的“促进血管生成”、“增强血管生成”和“增加血管生成”是指新血管的数量和形成增加。

疾病或障碍的“治疗”、“预防”或“改善”意指延迟或预防所述疾病或障碍的发作，逆转、减轻、改善、抑制、减缓或终止所述疾病或障碍的进展、恶化或变坏、所述疾病或障碍相关病症的进展或严重程度。在一个实施方案中，疾病或障碍的症状减轻至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、或至少50%。

本文所用的短语“治疗有效量”意指以适用于任何医学治疗的合理的利益/危险比，在受试者细胞的至少亚群体中有效产生某些所需治疗效果的1K1蛋白或包含本发明1K1蛋白的组合物的量。例如，给予受试者的化合物的量足以在与血管形成减少的病症相关的至少一个症状方面产生统计学意义的可检测的变化。症状可因受累组织的不同而异。一般而言，组织缺血与受累组织的氧减少、不适和疼痛以及组织死亡相关；脑缺血，一种流向脑部的血流不足的病症，可能与视力、身体运动和讲话的损害相关；心肌缺血可能与泵送效率下降、心脏病发作和异常心律相关；当流向肠或胃肠系统(肠)的血流减少时发生的肠系膜缺血综合征，与腹部疼痛、恶心和/或呕吐和血便有关；等。技术人员可以容易地确定合适的症状，用于测定治疗有效量。治疗有效量的测定完全在本领域技术人员的能力范围之内。通常，治疗有效量可因受试者的病史、年龄、条件、性别以及受试者的医学病症的严重程度和种类和其它药物活性剂的给予的不同而异。

在一个实施方案中，当与所述化合物不存在时的血管生成相比，所述治疗有效量足以在受试者中增加血管生成(如在所述受试者中检测，或如通过已建立的血管生成测定而检测)达至少约5%、至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或约100%。可在体外(例如增殖测定、体外管测定)或体内(例如CAM测定、角膜测定、斑马鱼模型)评价血管生成的%增加。测定人的血管生成的一个实例方法是通过瞬时氧测定(transient oxygen assay)。

治疗有效量通常范围为约0.01 mg/kg至约1000 mg/kg、约.1 mg/kg至约100mg/kg、约0.1 mg/kg至约200 mg/kg、约0.2 mg/kg至约20 mg/kg，每天给予一个或多个剂量，持续一天或多天。在某些实施方案中，治疗有效量在某时间周期(例如数小时、数天或数周)内从所述组合物中释放。在一个实施方案中，治疗有效量在约2天、约3天、约4天、约5天、或约7天内释放。

在一个实施方案中，本发明包括在生物体中促进、增强或增加血管生成的方法，所述方法包括使所述生物体接触有效量的包含1K1的纳米粒。在具体的实施方案中，所述生物体是哺乳动物，例如哺乳动物的细胞、组织、器官或动物(例如人类受试者)。在具体的实施方案中，所述生物体是动物例如哺乳动物。在具体的实施方案中，与不存在用包含1K1的纳米粒进行的治疗相比，血管生成量增加至少5%、至少10%、至少25%、至少50%、至少100%、至少200%、至少500%或至少1000%。类似地，与不存在用包含1K1的纳米粒进行的治疗相比，血管生成量可增加至至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、或至少10倍。用本领域中的常规测定并如本文所述，可容易地测定血管生成量。

用于体内采用包含1K1-纳米粒的组合物的额外应用包括缺血组织例如缺血性心脏组织和缺血性周围组织的血管形成，以及慢性伤口、烧伤和移植组织的血管形成。

本文所用的术语“缺血”是指与充氧的血流向身体部分的不足流动相关的任何病症。缺血发生在流向组织的血减少至低于临界水平的任何时间。这种血流减少可因以下非限制性情况所致：(i) 因栓塞(血凝块)所致的血管堵塞；(ii)因动脉粥样硬化所致的血管堵塞；(iii) 血管破裂(出血性中风)；(iv) 因血管收缩(例如血管痉挛期间和可能在短暂性脑缺血发作(TIA)期间和蛛网膜下出血之后发生的血管收缩)而导致的血管堵塞。发生缺血的其它情况包括(i) 在心肌梗塞期间(当心脏停止，流向器官的血流减少并导致缺血)；(ii) 创伤；(iii) 在心脏手术和神经手术期间(需要减少或停止血流，以达到手术的目的)；和iv) 糖尿病性相关缺血。

可给予所述药物组合物用于预防性和/或治疗性治疗。可按照标准药学方法，在细胞培养和/或实验动物中测定所述活性成分的毒性和疗效，包括例如测定LD₅₀ (50%群体致死的剂量)和ED₅₀ (50%群体治疗有效的剂量)。毒性作用和疗效间的剂量比就是治疗指数并可表示为LD₅₀/ED₅₀之比。优选具有大治疗指数的化合物。

得自细胞培养和/或动物研究的数据可用于配制人用剂量范围，例如包括使用非血管化小鼠眼(例如Kenyon等, Invest Opthalmol. Vis. Sci. 37:625, 1996)或兔眼(例如参见Gaudric等, Ophthal. Res. 24:181, 1992)的角膜囊袋测定。该测定具有的优势是，容易测定新血管并且该新血管基本上必须是正常无血管角膜中的新形成的血管。另一测定包括使用鸡绒毛膜尿囊膜(CAM测定；参见Wilting等, Anat. Embryol. 183:259, 1991)。在大鼠例如大鼠主动脉环模型中的其它测定，提供可重现的测定，其通常用于鉴定血管生成激动剂(例如参见Lichtenberg等, Pharmacol Toxicol. 84:34, 1999)。活性成分的剂量通常限制在包括具有低毒性的ED₅₀的循环浓度范围之内。剂量在该范围内可以变动，这取决于所用剂型和所用的给药途径。在某些实施方案中，将所述1K1纳米粒局部递送，例如局部注射。

待给予具体受试者的治疗组合物的有效量可因多种因素的不同而异，这些因素中的若干在不同患者之间是不同的。有能力的临床医生能够确定治疗剂的有效量。可将所述组合物多次给予受试者，例如在一系列不止一次的给予中。对于治疗组合物，常规周期性给予(例如每2-3天一次)有时是需要的，或者可望降低毒性。可采用重复剂量方案，例如以不同频率每天给予1-4次，例如每天一次、每两天一次、每周一次、每两周一次、每月一次等。这样的频率可取决于本领域技术人员已知的因素并且容易由医生确定。技术人员容易理解，剂量水平可因症状的严重程度和受试者对副作用的敏感性的不同而异。

在一个实施方案中，本发明的药物组合物用于治疗糖尿病性足溃疡。可将药用1K1-纳米粒组合物直接施加在伤口部位或所述组合物可呈药学上可接受的伤口愈合药的形式。所述组合物可通过各种方式局部给予和递送，所述方式例如通过喷雾、局部注射、局部输注、乳膏剂、洗剂、混悬剂、乳剂、凝胶剂、软膏剂、药膏剂、贴条(stick)、肥皂、液体气雾剂、粉末气雾剂、滴剂、贴剂、经内窥镜或抗微生物敷料剂例如绷带。

对于适于表面损伤(例如糖尿病性足溃疡)的局部给药，采用使用例如10 ng/ml-100 mg/ml溶液剂的标准局部制剂；优选范围为10 ug/ml-10 mg/ml。这样的溶液剂每天可向受累区域施用多达6次。在某些应用例如烧伤中，优选单个剂量。在其它应用例如溃疡中，可优选多个剂量。软膏剂或其它制剂的浓度当然取决于伤口的严重程度或疾病分期和受试者性质。在大多数方案中，剂量随时间而降低，以减少瘢痕形成的可能性。例如，最严重的伤口，例如3度烧伤，通常用100 ug/ml组合物治疗，但是随着愈合开始，剂量逐步降至大约10 ug/ml或更低，随着伤口愈合。

在伤口(例如糖尿病性足溃疡)的治疗中，治疗有效量可为这样的量：其足以减少伤口大小达至少约5%、至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%。

技术人员将会知道，存在可将人类受试者以持续方式或其它方式暴露给蛋白、肽、纳米粒、组合物、小分子和/或其它试剂以对所述受试者进行有效治疗的多种方式。进行这类暴露的示例性方法和装置描述于W. Mark Saltzman, Drug Delivery: Engineering Principles for Drug Therapy (Topics in Chemical Engineering), 第1版, Oxford University Press (USA), 2001；L.V. Allen等, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 第9版, Lippincott Williams & Wilkins, 2010；B. Wang等, Drug Delivery: Principles and Applications, 第1版, Wiley-Interscience, 2007；和K.K. Jain, Drug Delivery Systems, 第1版, Humana Press, 2008，其各自通过引用全部结合到本文中。这些参考文献也提供示例性的赋形剂(exipient)，其任选可与本发明的蛋白、肽、纳米粒、组合物、小分子和/或其它试剂一起包括在内。

本申请所公开的各参考文献都通过引用全部结合到本文中。

定义

除非本文另外定义，否则结合本申请使用的科技术语都应具有本领域普通技术人员公知的含义。此外，除非上下文另外需要，否则单数术语应包括复数，而复数术语应包括单数。

本文所用的术语“包含”或“包括”用于提及对本发明必不可少的组合物、方法及其相应成分，但开放成包括未指明要素，无论其是否是必不可少的。

本文所用的术语“基本由...组成”是指给定实施方案所需的那些要素。该术语允许本质上不影响本发明该实施方案的基本的和新的或功能性的特征的额外要素的存在。

术语“由...组成”是指本文所述的组合物、方法及其相应成分，其不包括在所述实施方案的描述中未记载的任何要素。

除了工作实施例或另外指出的地方之外，本文所用的表示成分量或反应条件的所有数字都应理解为在所有情况下用术语“约”来修饰。术语“约”当结合百分率使用时可意指±1%。此外，术语“约”可意指值的±1%之内。

除非上下文另外明确指出，否则单数术语“一”“一个”和“所述”都包括复数所指物。同样，除非上下文另外明确指出，单词“或”旨在包括“和”。还应理解，对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值，都是近似值，并且为了描述而提供。

尽管在本说明书的实践或检测中可使用类似于或等同于本文所述的那些的方法和材料，但合适的方法和材料在下文描述。术语“包含”意指“包括”。缩略语“例如(e.g.)”源自拉丁文例如(exempli gratia)，在本文中用于表示非限制性实例。因此，缩略语“例如(e.g.)”是术语“例如(for example)”的同义词。

术语“降低”、“降低的”、“减轻”、“降低”或“抑制”通常在本文中都用于意指统计学显著量的降低。然而，为了避免疑惑，“降低的”、“减轻”或“降低”或“抑制”意指与参考水平相比降低至少10%，例如与参考水平相比降低至少约20%、或至少约30%、或至少约40%、或至少约50%、或至少约60%、或至少约70%、或至少约80%、或至少约90%或至多并包括100%降低(例如与参考样品相比，水平为零)或介于10-100%之间的任何降低。

术语“增加的”、“增加”或“增强”或“活化”通常在本文中都用于意指统计学显著量的增加；为了避免任何疑惑，术语“增加的”、“增加”或“增强”或“活化”意指与参考水平相比增加至少10%，例如与参考水平相比增加至少约20%、或至少约30%、或至少约40%、或至少约50%、或至少约60%、或至少约70%、或至少约80%、或至少约90%或至多并包括100%增加或介于10-100%之间的任何增加，或与参考水平相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍增加或介于2倍和10倍或更高倍之间的任何增加。

术语“统计学显著性”或“显著地”是指统计学显著性并且通常意指参考水平之上或之下的两个标准差(2SD)。该术语是指存在差异的统计学证据。它被定义为当无效假说实际为真时作出否决无效假说的决策的概率。通常用p值作出决策。

本文所用的术语“聚合物”旨在包括寡聚物和聚合物，即包含两个或更多个单体单元的化合物，其可以是均聚物或共聚物。术语“均聚物”是含有单一种单体单元的聚合物。术语“共聚物”是由两种或更多种化学上不同种类的单体单元在同一聚合物链中构建的聚合物。“嵌段共聚物”是含有两种或更多种不同种类的均聚物或共聚物的两个或更多个区段的聚合物。

术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是直链或支链的，其可包含经修饰的氨基酸，并且其可被非氨基酸间断。该术语也包括已经例如通过以下修饰的氨基酸聚合物：二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化；或任何其他操纵，例如与带标记的成分缀合。

本文所用的术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成氨基酸，包括但不限于甘氨酸以及D型旋光异构体或L型旋光异构体，以及氨基酸类似物和肽类似物。标准的单字母或三字母码用于命名氨基酸。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，并优选经纯化而同质。

术语“分离的”意指将材料从其原有环境(例如天然环境，如果是天然存在的话)中移出。例如，活的动物中存在的天然存在的多核苷酸或多肽就不是分离的，而从天然体系中的某些或所有共存的材料中分离出来的同样的多核苷酸或DNA或多肽就是分离的。这样的多核苷酸可以是载体的组成部分和/或这样的多核苷酸或多肽可以是组合物的组成部分，并且仍是分离的，因为这样的载体或组合物并不是其天然环境的组成部分。

本文所用的术语“接头”意指连接化合物的两个部分的有机部分。接头通常包括直接的键或例如氧或硫等原子，例如以下的单元：NH、C(O)、C(O)NH、SO、SO₂、SO₂NH或原子链，例如取代或未取代的C₁-C₆烷基、取代或未取代的C₂-C₆烯基、取代或未取代的C₂-C₆炔基、取代或未取代的C₆-C₁₂芳基、取代或未取代的C₅-C₁₂杂芳基、取代或未取代的C₅-C₁₂杂环基、取代或未取代的C₃-C₁₂环烷基，其中一个或多个亚甲基可被O、S、S(O)、SO₂、NH、C(O)间断或终止。

疾病或障碍的“治疗”、“预防”或“改善”意指延迟或预防所述疾病或障碍的发作，逆转、减轻、改善、抑制、减缓或终止所述疾病或障碍的进展、恶化或变坏、所述疾病或障碍相关病症的进展或严重程度。在一个实施方案中，疾病或障碍的症状减轻至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、或至少50%。

本文所用的术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围之内适用于与人类和动物组织接触而无过度毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症且与合理的利益/危险比例相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

本文所用的术语“药学上可接受的载体”意指药学上可接受的材料、组合物或溶媒，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造辅料(例如润滑剂、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、或硬脂酸)、或溶剂包封材料(solvent encapsulating material)，其涉及将主题化合物从某器官或身体的某部分携带或转运到另一器官或身体的另一部分。每种载体都必需是在与制剂的其它成分相容并且对患者无害的意义上“可接受的”。可用作药学上可接受的载体的材料的某些实例包括：(1) 糖类，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2) 淀粉类，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3) 纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素；(4) 粉状西黄蓍胶；(5) 麦芽；(6) 明胶；(7) 润滑剂，例如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石粉；(8) 赋形剂，例如可可脂和栓剂用蜡；(9) 油类，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10) 二醇类，例如丙二醇；(11) 多元醇，例如丙三醇、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(12) 酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13) 琼脂；(14) 缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15) 藻酸；(16) 无热原水；(17) 等渗盐水；(18) 林格液；(19) 乙醇；(20) pH缓冲液；(21) 聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；(22) 填充剂，例如多肽和氨基酸；(23) 血清成分，例如血清白蛋白、HDL和LDL；(22) C₂-C₁₂醇，例如乙醇；和(23) 用于药物制剂的其它无毒的相容性物质。润湿剂、着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于所述制剂中。术语例如“赋形剂”、“载体”、“药学上可接受的载体”等在本文中可互换使用。

本文所用的术语“给予”是指通过导致组合物至少部分定位于所需部位使得产生所需效果的方法或途径，将组合物放入受试者中。本文所述的组合物可经本领域已知的任何合适途径来给予，所述途径包括但不限于口服或胃肠外途径，包括静脉内、肌内、皮下、透皮、气道(气溶胶)、肺部、鼻腔、直肠和局部(包括含服和舌下)给予。

本文所用的“受试者”意指人或动物。受试者的实例包括灵长类(例如人和猴)。通常所述动物是脊椎动物，例如灵长类、啮齿类、家畜或狩猎动物。灵长类包括黑猩猩、食蟹猴(cynomologous monkey)、蜘蛛猴和短尾猴，例如恒河猴。啮齿类包括小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔和仓鼠。家畜和狩猎动物包括牛、马、猪、鹿、野牛(bison)、水牛(buffalo)、猫科动物物种例如家猫、犬物种(例如狗、狐狸、狼)、禽物种(例如鸡、鸸鹋、鸵鸟)和鱼(例如鳟鱼、猫鱼和鲑鱼)。患者或受试者包括前述任何亚类，例如上述所有，但不包括一组或多组或一种或多种，例如人、灵长类、啮齿类。在本文所述方面的某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如灵长类，例如人。术语“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。术语“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。受试者可以是雄性或雌性。

优选地，所述受试者是哺乳动物。所述哺乳动物可以是人、非人类灵长类、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。非人类哺乳动物可有利地用作受试者，其代表与减少的脊柱/兴奋性突触形成和/或数量相关的病症或障碍的动物模型。另外，本文所述的方法和组合物可用于治疗家畜和/或宠物。

本发明可在任何以下编号的段落中定义：

段落1. 一种包含含有生物相容性聚合物和有效量的肝细胞生长因子/分散因子的1K1蛋白片段的纳米粒的药物组合物，其中所述生物可降解聚合物包裹所述1K1蛋白。

段落2. 段落1的药物组合物，其中所述1K1蛋白包含SEQ ID. NO:1。

段落3. 段落1-2中任一个的药物组合物，其中所述纳米粒的平均粒度为约50 nm至约500 nm。

段落4. 段落1-2中任一个的药物组合物，其中纳米粒的平均粒度为约60 nm至约150 nm。

段落5. 段落1-4中任一个的药物组合物，其中所述生物相容性聚合物是生物可降解聚合物和所述生物可降解聚合物选自：聚酯、羟基脂族羧酸、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(dl-丙交酯/乙交酯、聚(乙二醇)、多糖、凝集素、糖胺聚糖、脱乙酰壳多糖、纤维素和丙烯酸酯聚合物。

段落6. 段落1-5中任一个的药物组合物，其中所述生物相容性聚合物是聚酯。

段落7. 段落6的药物组合物，其中所述聚酯包括聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)。

段落8. 段落1-7中任一个的药物组合物，其中所述纳米粒在规定的天、周或月的时间周期内释放治疗有效量的1K1蛋白。

段落9. 段落1-8中任一个的药物组合物，其中所述纳米粒在约2天、约3天、约4天、约5天、约7天、或约14天的规定时间周期内释放治疗有效量的1K1蛋白。

段落10. 段落8-9中任一个的药物组合物，其中在规定时间周期内释放的所述治疗有效量足以在规定的释放时间周期内导致细胞ERK的持续磷酸化。

段落11. 段落8-10中任一个的药物组合物，其中与所述化合物不存在时的血管生成相比，所述治疗有效量足以增加受试者的血管生成达至少约5%、约10%、约20%、约30%、约40%、约50%或约60%。

段落12. 段落8-11中任一个的药物组合物，其中所述治疗有效量是约0.1mg/kg至约1000 mg/kg的剂量。

段落13. 段落1-12中任一个的药物组合物，其中所述组合物经配制用于通过选自以下的方法给予：局部给药、肠内给药和胃肠外给药。

段落14. 段落13的药物组合物，其中经配制用于局部给药的所述组合物是软膏剂、洗剂、喷雾剂、乳膏剂或凝胶剂。

段落15. 一种治疗血管形成不足相关病症的方法，所述方法包括给予受试者治疗有效量的段落1-14中任一个的药物组合物。

段落16. 段落15的方法，其中所述治疗有效量是约0.1mg/kg至约1000 mg/kg 1k1蛋白的剂量。

段落17. 段落15-16中任一个的方法，其中所述血管形成不足相关病症选自：脑血管缺血、肾缺血、肺缺血、肢体缺血、心肌缺血、组织缺血、冠状动脉缺血、周围动脉病、肢体缺血、糖尿病性溃疡、坏疽、需要新血管形成以促进愈合的伤口以及Buerger综合征。

段落18. 段落15-17中任一个的方法，其中所述病症是糖尿病性足溃疡。

段落19. 段落15-18中任一个的方法，其中所述药物组合物经局部给药、肠内给药或胃肠外给药而给予。

段落20. 段落15-19中任一个的方法，其中所述药物组合物给予多次。

段落21. 段落1-14中任一个的药物组合物在治疗血管形成不足相关病症中的用途。

段落22. 段落21的用途，其中所述血管形成不足相关病症选自：脑血管缺血、肾缺血、肺缺血、肢体缺血、心肌缺血、组织缺血、冠状动脉缺血、周围动脉病、肢体缺血、糖尿病性溃疡、坏疽、需要新血管形成以促进愈合的伤口、以及Buerger综合征。

段落23. 段落21的用途，其中所述病症是糖尿病性足溃疡。

就尚未指出的方面来说，本领域普通技术人员将会理解，本文所描述和说明的多个实施方案中的任一个都可被进一步修改，以结合本文所公开的任何其它实施方案所示的特征。

段落24. 一种治疗血管形成不足相关病症的方法，所述方法包括给予受试者有效量的1K1蛋白，其中以持续释放制剂的形式给予所述1K1蛋白，所述制剂例如具有这样的剂量：所述剂量足以导致ERK的持续磷酸化并增强小管形成，从而在受试者中显著增加血管生成。

以下实施例说明本发明的某些实施方案和方面。对相关领域技术人员显而易见的是，在不改变本发明的精神和范围的情况下可进行多种修改、添加、取代等，并且这样的修改和变动都包括在所附权利要求书中限定的本发明范围之内。以下实施例并不以任何方式限制本发明。

实施例

本文给出的实施例涉及诱导血管生成的方法和组合物。正如本文所表明，将蛋白质工程与纳米技术结合起来，以使HGF/SF的治疗潜力最大化。蛋白质工程实验靶向NK1 (一种HGF/SF转录物的可变剪接变体)，得到蛋白1K1 (一种稳定的和非糖基化的Met受体激动剂)，其发挥强烈的血管生成活性。此外，1K1被包裹在自生物可降解D,L-乳酸-共-乙醇酸共聚物工程改造的纳米粒中，使其能持续释放。本文已证明，短暂释放(temporal release)使通过MAPK途径的独特下游信号转导能够进行，在体外和体内导致增强的血管生成结果。我们的发现开启了结合蛋白质工程与纳米载体的独特方法用于在受损的缺血性病症中调节血管形成的可能性。

实施例 1. 工程化 1K1, 一种非糖基化 HGF/SF 变体。

在硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)或肝素存在下，NK1表现为部分受体激动剂(14)。为了开发1K1，采用基于NK1 (15)、NK1-肝素复合物(16)和单个N结构域和K1结构域(17)的结构和功能研究的一种合理的蛋白质工程方法。NK1通过以下两个不同位点与肝素结合：位于N结构域内并由R73、K60、T61、R76、K62和K58的侧链和T61、K63和G79的主链原子形成的高亲和力位点(18)，以及在包括K132、R134、K170和R181的侧链的K1结构域内的低亲和力位点。突变1K1携带在K132和R134的两个反转电荷突变(1K1: K132E:R134E)，其破坏肝素与三环结构域的结合(图1A至1H)并在若干细胞种类上表现出与野生型相比增加的信号转导活性 (16)。不希望受到理论的束缚，1K1相对于NK1更高的生物活性可能因为以下两个原因：第一，作为K1中缺失肝素结合位点的结果，肝素仅与N结构域中的第一结合位点相互作用并导致邻近1K1二聚体结合同一平面上的肝细胞生长因子受体(MNNG (N-甲基-N'-硝基-N亚硝基-胍) HOS转化基因) (MET) (图1C)，不同于NK1，其中K1结构域的肝素结合位点导致肝素对齐不同平面上的邻近NK1二聚体(图1B)。因此，1K1可比NK1更容易形成寡聚配体-受体复合物。第二，与NK1-肝素复合物相比，预先形成的1K1-肝素复合物对MET具有更大的结合亲和力，这是因为这两种蛋白质与肝素结合的方式不同的结果，正如表面等离振子共振(图1E和1F)和速度和沉降实验(图1G和1H)所表明。

实施例 2. 1K1 通过与 MET 激酶结合而在体外诱导血管生成。

血管生成表型是以内皮细胞化学入侵(chemoinvasion)、增殖和小管形成为特征的不连续的细胞步骤的顶点(culmination) (18)。如图2A至2D所示，HGF/SF和1K1都诱导内皮细胞增殖。此外，1K1-诱导的内皮细胞增殖以浓度依赖性方式受到MET激酶抑制剂PHA 665752的抑制(图2C)，这证实1K1通过Met受体而诱导血管生成。先前的研究已经揭示出HGF/SF配体的MET结合通过PI3K和MAPK而导致下游信号转导(10)。然而，尚不知道PI3K途径和MAPK途径在1K1介导的内皮细胞增殖中是否被激活。因此，将所述细胞用分别抑制PI3K和MAPK的LY294002或PD98059进行预处理。如图2A至2D所示，LY294002和PD98059都以浓度依赖性方式抑制1K1-诱导的细胞增殖，表明PI3K途径和MAPK途径都牵连于1K1-诱导的内皮细胞增殖中。

然后再探索评价1K1是否能诱导内皮小管形成。如图3A至3C所示，与溶媒处理相比，HGF/SF和1K1都诱导显著的小管形成，当将内皮细胞接种在三维基质胶基质上时。与HGF/SF相比，1K1-诱导的管在表型上更长并具有更多结节(图未显示)。与细胞增殖结果一致，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)用10^{− 6} M PHA665752预处理，完全阻断1K1-诱导的小管形成(图3A至3B；HUVEC管形成的形态学图像在本文中未显示)。另外，PD98059和LY294002在该过程中都抑制牵涉这些信号转导途径的1K1-诱导的小管形成(图3A至3B；HUVEC管形成的形态学图像在本文中未显示)。正如蛋白质印迹(图3C)所示，将内皮细胞与1K1一起温育，导致MAPK和PI3K信号转导途径的下游效应物ERK和Akt都快速磷酸化，MAPK和PI3K信号转导途径分别被LY294002和PD98059阻断。蛋白质印迹也表明，用10^{− 6} M PHA665752预处理细胞，阻断1K1-诱导的ERK和Akt的磷酸化。这些结果证实1K1通过经由被HGF/SF激活的相同Met依赖性途径的信号转导而在体外诱导血管生成(10)。

实施例 3. 1K1- 纳米粒的合成和表征。

治疗性血管生成的一个关键性挑战是在所需作用部位局部和持续递送血管生成因子(6)。在先前的研究中，Richardson等人证明，VEGF-165和PDGF-BB从单一结构性聚合物支架中持续释放(各自具有不同动力学)，导致成熟血管网络的快速形成(19)。此外，已经报道血小板衍生的生长因子的受控的心肌内递送，用增加的血管形成改善梗塞后的心室功能(20)。类似地，在最近的研究中，肌内注射装载pivastatin的纳米粒(其能持续释放药物)导致增强的血管生成(21)。然而，并无先前研究证明1K1的持续释放制剂。因此，纳米粒自聚乳酸-乙醇酸(PLGA)共聚物工程改造而来以便使1K1的持续释放制剂成为可能，所述共聚物是生物相容的和生物可降解的并被FDA批准。使用双重乳剂/溶剂提取技术制备所述1K1纳米粒(22)。透射电镜数据证实纳米粒为球形并证实纳米粒直径为60nm–140 nm (图4A)，其经动态光散射测定来验证(图4B)。1K1在纳米粒中的总装载效率经测定为54.27 ± 7.12%。生物活性形式的治疗用蛋白的持续释放和随后降解对于生物活性而言是至关重要的，并且取决于表面结合分子的解吸附、通过纳米粒基质的扩散以及后者的侵蚀。通过酶联免疫吸附测定来检测1K1在7天时期内从纳米粒释放的动力学。如图4C所示，纳米粒在初始阶段有特征性爆发式释放(22, 23)，然后在7天的时期内是稳态释放。该发现与其中包裹在PLGA微球体中的VEGF在30天时期内显示类似的释放动力学的先前报道一致(22)。

实施例 4. 1K1-NP 在体外诱导血管生成。

用HUVEC增殖作为生物学读出测定1K1纳米粒(1K1-NP)的血管生成活性。如图4D至4F所示，与用溶媒相比，用1K1-NP处理导致明显的内皮细胞增殖，表明工程改造纳米粒的过程不改变1K1的生物活性。此外，在MET抑制剂PHA 665752 (图4D)、PI3K抑制剂LY294002 (图4E)和MAPK抑制剂PD98059 (图4F)存在下，1K1-NP-诱导的细胞增殖受到抑制，表明在包裹在纳米粒中之后，通过由可溶性1K1激活的相同途径介导信号转导。

与空载体或游离1K1相比，发现工程改造的1K1-NP诱导显著更多的小管形成，表明血管生成因子的持续释放明显影响了血管生成反应(图5A至5C)。为了机械地将表型差异与短暂释放关联，使用蛋白质印迹来评价1K1-NP对下游信号转导途径的作用。如图5B所示，将内皮细胞与1K1-NP和1K1两者一起温育，导致在10 min内快速磷酸化。用PHA665752预处理所述细胞，阻断由1K1-NP诱导的ERK和Akt的磷酸化。用50 μM LY29400预处理所述细胞，制止了Akt的磷酸化，而PD98059减少ERK的磷酸化，所述磷酸化与先前在本文所述的1K1活性一致。然而，不同于用1K1处理，就1K1-NP的情况而言，注意到持续活性，正如在治疗后8.5 h ERK磷酸化增加所示(图5C)。先前已经报道，MAPK信号转导途径的持续激活对管形成而言是至关重要的，而瞬时激活则不足以诱导这样的形态学变化(8, 24, 25)。血管的表型定量测定也证实用PHA665752 (10^{− 7} M)、PD98059 (50 μM)或LY294002 (50 μM)预处理HUVEC，阻断1K1-NP-诱导的小管形成(图5A；HUVEC管形成的形态学图像在本文中未显示)。

实施例 5. 在体内血管生成和植入物测定

斑马鱼血管生成测定。斑马鱼(Danio rerio)正在快速出现为用于研究新血管形成的良好模型(26, 27)。为了证实1K1和1K1-NP在体内的血管生成活性，将1K1或1K1-NP与生长因子减少的基质胶(Mgel)混合并注射到紧挨肠下血管的卵黄囊中。如图6A至6F所示，如通过肠下血管出芽期间所形成的结节所定量测定的，与空载体相比，1K1诱导明显的血管生成。在48 h时间点，1K1-NP表现出比1K1更大的血管生成，这证实了先前在本文中描述的体外发现：血管生成因子的持续释放可导致血管生成增强。

鼠基质胶植入物测定。为了进一步证实1K1在体内的血管生成功效，与生长因子减少的基质胶混合的1K1或1K1-NP，经皮下注射到小鼠中，剂量为200 纳克(ng) 1K1/支架。将所述支架维持12 d，然后处死动物并将皮肤外翻以观察血管生成反应。用1K1处理，导致强烈血管生成反应，如图7A至7D所示。与1K1相比，1K1-NP显著诱导更大的血管生成反应(将鼠皮外翻之后的植入物的总体形态学图未显示)。为了进一步证实总体形态学，将植入物横切，针对冯维勒布兰德因子进行免疫标记，所述因子是用于内皮细胞的标记。如图7A至7D所示，1K1-NP处理(图7D)导致相对于游离1K1更好的血管生成结果，这与在斑马鱼中的观察结果一致。这些发现证明生长因子的持续释放可发挥优良的血管生成结果。

结论

尽管针对在病理例如癌症情况下对血管生成的抑制方面取得了显著进步，但是在以血管形成不足为特征的疾病(例如冠状动脉缺血、周围动脉病或糖尿病性溃疡)中的治疗性血管生成(4, 28–30)，仍然还处于初期。本发明人和其他人先前已经证明HGF/SF可引发强烈血管生成反应(12)，这两者独立于其它生长因子(10)并通过诱导VEGF的表达来实现(31)。此外，评价经肌内注射HGF/SF质粒以改善严重肢体缺血患者的肢体灌注的安全性的研究(HGF-STAT试验)目前已经证明，肌内注射HGF质粒是安全和良好耐受的，并且发现在严重肢体缺血患者中，通过经皮氧张力测定的肢体组织灌注在所用的最高剂量下具有显著改善(32)。这些观察结果建立了在缺血性疾病的处理中使用HGF/SF的坚固的临床基本原理。然而，尽管血管生成剂的持续释放在限定治疗性血管生成的临床结果中已经被认为是至关重要的，但是并没有开发HGF/SF的持续释放模型。本文所示的是整合到纳米载体中的合理工程改造的HGF/SF变体，其改变了生长因子向靶细胞的暂时呈递，并因此通过修饰下游信号转导级联而增强血管生成结果。

将生长因子转化到临床的关键障碍通常在于多肽生长因子的异质性(这是因广泛的蛋白糖基化所致)，其对制备而言带来法规的挑战。就HGF/SF的情况而言，额外挑战是天然蛋白的复杂的多结构域结构，其导致低生产得率和在生理缓冲液中蛋白质倾向于聚集。如本文所表明，研究了HGF/SF的截短突变体，其可被酵母细胞以高得率表达(不同于天然HGF/SF)，缺乏糖基化序列并保留强烈的信号转导活性。通过将所述蛋白掺入到来自PLGA共聚物的纳米粒中，进一步改进了1K1的生物活性和治疗潜力。尽管游离1K1和1K1-NP在早期时间点诱导类似水平的ERK磷酸化，但所述纳米粒导致MAPK信号转导的持续激活，与游离1K1大不相同。在先前的研究中，报道了MAPK的持续激活对小管形成而言是至关重要的，尽管已经证明瞬时激活足以诱导细胞增殖(8, 24–25)。该观察结果可能解释，尽管1K1和1K1-NP表现出类似的细胞增殖水平，但是后者在体内基质胶植入物和斑马鱼血管生成测定中导致增强的新血管形成。本文所示的这一发现也突出了纳米技术通过受控释放而瞬时改变信号转导途径的潜在用途，因此使剖析生物学现象之下的不同调节控制成为可能。这些结果表明不断出现的范例，即活性剂的持续的焦点浓度对于治疗性血管生成而言是至关重要的，并且可提供用于处理缺血性疾病的稳健策略。

材料与方法

1K1 和 HGF/SF 的表达 . HGF/SF是自转染了全长HGF/SF cDNA的小鼠骨髓瘤细胞系NS0的衍生物制备而来的。1K1是自转染了1K1 cDNA的巴斯德毕赤酵母的衍生物制备而来。将这两种蛋白质用肝素-琼脂糖色谱接着在Mono S上的阳离子交换色谱自培养上清液纯化，得到蛋白质纯度>90% (经SDS凝胶电泳判定)。

表面等离振子共振实验。对应于氨基酸25-567的Met胞外结构域的片段(MET567)用于固定在CM5芯片的单个流动池上，所述芯片用以下试剂平衡：20 mM磷酸盐(pH 7.4)、150 mM NaCl、50 μM EDTA、0.005%表面活性剂P20。芯片表面首先在BIACore Control软件中使用CM5胺偶联的固定化方法激活(100 μL 0.2 M 1-乙基-3-(3二甲氨基-丙基)碳二亚胺并混合100 μL 0.05 M N-羟基琥珀酰亚胺，以提供反应性琥珀酰亚胺酯基团)。将Met567H在10 mM乙酸钠中稀释至终浓度为400 nM并注射，直到达到ΔRU为约1,500。残余活性基团通过注射70 μL 1 M 乙醇胺(pH 8.5)而封闭。作为阴性对照，CM5芯片的另一流动池用同样程序处理，但无蛋白。再将芯片用10 mM Hepes、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.005% Tween 20 (HBS-EP) (10 mM Hepes (pH 7.4)；150 mM NaCl；50 μM EDTA；0.005%表面活性剂P20) + 0.2 mg/ml BSA重新平衡，然后将一系列蛋白浓度(在HBS-EP + BSA中稀释)以20 μL∕ min速率注射60 min，接着是300 s离解时间。芯片用HBS-EP和1 M NaCl再生。

分析型超速离心。野生型NK1、1K1和MET567蛋白针对25 mM磷酸盐、150 mM NaCl、pH 7.4透析，然后离心。用Beckman Optima XLA分析型超速离心，利用中速沉降速度方法进行测定。以连续方式获取数据并用程序Sedfit分析，其中计算最小二乘方g(s*)沉降系数分布，其中c是浓度(以吸光度单位计)，r是半径(以cm计)，t是时间(以秒计)，c0是装载浓度(以吸光度单位计)，w是转子的角速度(以弧度/秒计)和r_m是在新月形(meniscus)的半径(以cm计)。用设定在278 nm处的入射光采集数据。使用ProFit（一种非线性最小二乘法拟合包(Quantum Soft)），用正态(高斯)分布来拟合g(s*)曲线。

工程改造的 1K1 纳米粒 . 使用双重乳剂/溶剂提取技术制备1K1纳米粒(22)。使用溶于10 mL乙腈的50 mg PLGA (50:50) (MW 40–75 KDa)制备乳剂1。通过超声处理将约104 μg 1K1包裹在50 mg PLGA中。使用0.5 g PVA (聚乙烯醇, Sigma, MW 9,000–10,000)制备乳剂2，并将其溶于9.3 mL双蒸水和0.7 mL乙腈。通过将0.2 g PVA溶于186 mL双蒸水和14 mL乙腈制备有机提取缓冲液。将1 mL乳剂2加入到乳剂1中并将所得溶液涡旋震荡约1 min，再加入到上述有机缓冲液中。将该溶液搅拌12 h以蒸发乙腈，将该溶液以193,190 x 4 g (Sorvall Ultra Pro 80)离心1 h，以沉淀纳米粒，将该纳米粒再次用水洗涤后，用Nano-zetasizer (Malvern)和透射电镜(TEM)表征其大小和形态学。将样品在铜网上进行点样并用乙酸双氧铀染色，用于TEM。

细胞增殖测定 . 将HUVEC在96孔板中生长并在0.1% FBS中同步，然后用生长因子处理24、48或72 h。细胞用信号转导抑制剂处理2 h，然后加入生长因子。用使用Versamax读板器在490 nm处测量的来自Cell Titer 96 Aqueous One Solution试剂盒的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2 (4-磺基-苯基)-2H-四唑(MTS)，定量测定活细胞百分率。从每个数据点中减去背景值之后，对对应于细胞增殖的最终吸光度作图。

HUVEC管测定 . 将HUVEC (25,000个细胞/孔)接种到包被有生长因子减少的基质胶的96孔板中。细胞用抑制剂处理2 h，然后加入生长因子。8 h之后，在倒置光学显微镜下以10×放大倍数获取图像(Nikon Eclipse)。

免疫印迹。将HUVEC (70%汇合)用1K1、1K1-NP和HGF/SF (阳性对照)处理10 min并在3×上样缓冲液中直接裂解。所述细胞用信号转导抑制剂预处理至少2 h，然后用生长因子处理。将蛋白质在10% SDS-PAGE凝胶上解析。探测膜上的MET、Akt和Erk的磷酸化形式和总体形式。用辣根过氧化物酶缀合的抗兔第二抗体和Lumi-LightPLUS蛋白质印迹底物(Western Blotting Substrate) (Roche Applied Science)检测蛋白质。用GeneSnap使印迹显影并用Gene Tools定量测定光密度(这两者都来自SynGene)。使用预定分子量标准品作为标记。蛋白质针对肌动蛋白标准化。

斑马鱼血管生成测定 . 将斑马鱼(Tΰbingen AB) (受精后2 d)在三卡因(MESAB-间-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐、1% Na₂HPO₄、pH 7.0)中麻醉并侧放于1%琼脂糖注射模(injection mold)，再使用Nanoject II注射装置(Drummond Scientific)将9.2 nL各样品注射到肠下血管(SIV)附近的卵黄囊中。对注射了生长因子减少的基质胶和1 μM 1K1 (游离的或在纳米粒中的)的斑马鱼监测24 h和48 h。用Nikon SMZ1500立体显微镜和SPOT Flex相机进行明视野成像。

小鼠体内基质胶血管生成测定 . 将与生长因子混合的生长因子减少的基质胶(BD)经皮下注射到balb/c小鼠中。将小鼠分为4组：(A)溶媒对照加生长因子减少的基质胶，(B)溶媒对照加空PLGA和生长因子减少的基质胶，(C)基质胶塞加200 ng游离1K1和(D)基质胶塞加200 ng 1K1-NP。在第12天，用高分辨率数字相机(Canon)记录呈形成的血管(血管生成)形式的总体反应。在最佳切割温度化合物下切离植入物并冷冻(cryofrozen)，用于免疫组织化学。

免疫组织化学 . 将基质胶冷冻切片(18 μm)在−20℃中用冰冷甲醇固定并用针对冯维勒布兰德因子的第一兔抗体(Dako)在4℃在封闭缓冲液中探测过夜。然后，样品用Alexa fluor 594缀合的抗兔第二抗体在室温下探测2 h。核用DAPI复染。用免疫荧光显微镜(Nikon Eclipse)以10×放大倍数获取图像。

统计学分析 . 通过使用单侧ANOVA接着Dunnett或Friedman事后检验，来检验统计学显著性。Bonferroni检验用于检验总体剂量-反应效应(Graphical Prism 3软件)。认为P值<0.05就是显著的。

序列

SEQ ID NO: 1 - 检索 3mkp_b, 版本3mkp_b GI:303325025, 具有粗体的突变氨基酸的人(Homo sapiens) 1K1片段，氨基酸号105从赖氨酸变为谷氨酸，氨基酸号107从精氨酸变为谷氨酸

SEQ ID NO:2 -人的NK1片段

SEQ ID NO: 3 全长肝细胞生长因子分散因子 检索P14210, 版本P14210.2 GI:123116

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融入本说明书中的所有专利和其它出版物都通过引用全部结合到本文中，用于所有目的。仅因其公开内容先于本申请的提交日而提供这些出版物。在此方面的所有内容都不应理解为承认本发明人无资格通过在先发明或任何其它理由而先于这样的公开内容。关于这些文件的日期的所有陈述或关于这些文件内容的描述都基于本申请人可获得的信息并且不构成对这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。

Claims (23)

1.一种包含含有生物相容性聚合物和有效量的肝细胞生长因子/分散因子的1K1蛋白片段的纳米粒的药物组合物，其中所述生物可降解聚合物包裹所述1K1蛋白。

2.权利要求1的药物组合物，其中所述1K1蛋白包括SEQ ID. NO:1。

3.权利要求1-2中任一项的药物组合物，其中所述纳米粒的平均粒度为约50 nm至约500 nm。

4.权利要求1-2中任一项的药物组合物，其中纳米粒的平均粒度为约60 nm至约150 nm。

5.权利要求1-4中任一项的药物组合物，其中所述生物相容性聚合物是生物可降解聚合物和所述生物可降解聚合物选自：聚酯、羟基脂族羧酸、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(dl-丙交酯/乙交酯、聚(乙二醇)、多糖、凝集素、糖胺聚糖、脱乙酰壳多糖、纤维素和丙烯酸酯聚合物。

6.权利要求1-5中任一项的药物组合物，其中所述生物相容性聚合物是聚酯。

7.权利要求6的药物组合物，其中所述聚酯包括聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)。

8.权利要求1-7中任一项的药物组合物，其中所述纳米粒在规定的天、周或月的时间周期内释放治疗有效量的1K1蛋白。

9.权利要求1-8中任一项的药物组合物，其中所述纳米粒在约2天、约3天、约4天、约5天、约7天或约14天的规定时间周期内释放治疗有效量的1K1蛋白。

10.权利要求8-9中任一项的药物组合物，其中在规定时间周期内释放的所述治疗有效量足以在规定的释放时间周期内导致细胞ERK的持续磷酸化。

11.权利要求8-10中任一项的药物组合物，其中与所述化合物不存在时的血管生成相比，所述治疗有效量足以增加受试者的血管生成达至少约5%、约10%、约20%、约30%、约40%、约50%或约60%。

12. 权利要求8-11中任一项的药物组合物，其中所述治疗有效量是约0.1mg/kg至约1000 mg/kg的剂量。

13.权利要求1-12中任一项的药物组合物，其中所述组合物经配制用于通过选自以下的方法给予：局部给药、肠内给药和胃肠外给药。

14.权利要求13的药物组合物，其中经配制用于局部给药的组合物是软膏剂、洗剂、喷雾剂、乳膏剂或凝胶剂。

15.一种治疗血管形成不足相关病症的方法，所述方法包括给予受试者治疗有效量的权利要求1-14中任一项的药物组合物。

16. 权利要求15的方法，其中所述治疗有效量是约0.1mg/kg至约1000 mg/kg 1k1蛋白的剂量。

17.权利要求15-16中任一项的方法，其中所述血管形成不足相关病症选自：脑血管缺血、肾缺血、肺缺血、肢体缺血、心肌缺血、组织缺血、冠状动脉缺血、周围动脉病、肢体缺血、糖尿病性溃疡、坏疽、需要新血管形成以促进愈合的伤口以及Buerger综合征。

18.权利要求15-17中任一项的方法，其中所述病症是糖尿病性足溃疡。

19.权利要求15-18中任一项的方法，其中所述药物组合物经局部给药、肠内给药或胃肠外给药而给予。

20.权利要求15-19中任一项的方法，其中所述药物组合物给予多次。

21.权利要求1-14中任一项的药物组合物在治疗血管形成不足相关病症中的用途。

22.权利要求21的用途，其中所述血管形成不足相关病症选自：脑血管缺血、肾缺血、肺缺血、肢体缺血、心肌缺血、组织缺血、冠状动脉缺血、周围动脉病、肢体缺血、糖尿病性溃疡、坏疽、需要新血管形成以促进愈合的伤口以及Buerger综合征。

23.权利要求21的用途，其中所述病症是糖尿病性足溃疡。

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