EP3902518A1 - Extract of chlamydomonas acidophila, method for preparing same and cosmetic compositions and dermatological compositions comprising same - Google Patents

Extract of chlamydomonas acidophila, method for preparing same and cosmetic compositions and dermatological compositions comprising same

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EP3902518A1
EP3902518A1 EP19835309.6A EP19835309A EP3902518A1 EP 3902518 A1 EP3902518 A1 EP 3902518A1 EP 19835309 A EP19835309 A EP 19835309A EP 3902518 A1 EP3902518 A1 EP 3902518A1
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EP
European Patent Office
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extract
advantageously
skin
acidophila
composition
Prior art date
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Pending
Application number
EP19835309.6A
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German (de)
French (fr)
Inventor
Sophie Leclere-Bienfait
Stéphanie BREDIF
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Laboratoires Expanscience SA
Original Assignee
Laboratoires Expanscience SA
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Filing date
Publication date
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    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor

Definitions

  • the invention relates to a peptide extract of the microalga Chlamydomonas acidophila and to a cosmetic, dermatological or pharmaceutical composition comprising such an extract.
  • the invention also relates to a method of extracting a peptide extract of Chlamydomonas acidophila, as well as the extract capable of being obtained by said method.
  • the invention also relates to a composition or such an extract for its use in the prevention or treatment of disorders or pathologies of the skin, mucous membranes or integuments, for its use in the prevention or treatment of vascular disorders, or also for its use in the prevention or treatment of adipose tissue alterations.
  • the invention relates to a cosmetic care process for the skin, integuments or mucous membranes, with a view to improving their condition or their appearance, consisting in administering such a composition or such an extract.
  • Micro-algae are single-celled, eukaryotic organisms, endowed with photosynthesis and which are therefore capable, like higher plants, of using CO2 from the air for their metabolism but also other nutrients such as phosphorus, nitrates, etc. They were among the first species to colonize the earth. There are around 30,000 species described but it is assumed that there are many more. Microalgae are found in their natural state, both in fresh and brackish to salt water around the world.
  • Microalgae can be cultivated according to methods known to those skilled in the art, such as photo-reactors in environments controlled in light, pH and nutrients, and they have many outlets. Like the higher organisms, they are capable of synthesizing proteins, carbohydrates and lipids. Certain lipids are specific such as complex fatty acids or pigments with specific biological properties (xanthophylls). They have experienced a particular craze for a possible production of biofuel and their production in bioreactor has expanded. The other outlets are diverse: food for fish (aquarium and fish farms), food and human health (asthaxanthin extracted from Haematococcus pluvialis, spirulina proteins) and some outlets in the cosmetic industry.
  • Chlamydomonas acidophila of the class Chlorophyceae (Family: Chlamydomonadaceae) is a green freshwater microalgae that proliferates in very acidic waters (pH 2.3 to 3.4) and adapted to environments loaded with heavy metals. In particular, it was identified and removed for the first time from volcanic lakes in Argentina. It is said to be rich in phytochelatins, special structures capable of chelating metals and in carotenoids (beta-carotene, lutein). Apart from publications, concerning its possible conditions of culture and development (tolerance to extreme pH, and heavy metals), there is little about its composition and its use. Its “cousin” Chlamydomonas reinhardii is used as a model organism in various scientific fields such as genetics.
  • the subject of the invention is a peptide extract of the microalga Chlamydomonas acidophila.
  • peptide extract is meant, within the meaning of the present invention, an extract comprising predominantly peptides.
  • peptide is meant, within the meaning of the present invention, a polymer of amino acids linked together by peptide bonds.
  • a peptide is in particular characterized by a molecular mass of between 200 and 10,000 Daltons (Da), limits included.
  • the extract of Chlamydomonas acidophila according to the invention comprises at least 20% by weight of peptides, the percentages being expressed relative to the total weight of said extract.
  • the extract according to the invention comprises from 20% to 90%, advantageously from 20% to 75%, more advantageously from 30% to 70%, typically 65%, by weight of peptides, the percentages being expressed relative to the total weight of said extract.
  • the extract of Chlamydomonas acidophila according to the invention is substantially free of any protein, in particular any residual native protein. This makes it possible in particular to avoid allergic reactions, and to improve the solubility and the bioavailability of the extract according to the invention.
  • protein is meant, within the meaning of the present invention, biological macromolecules formed from one or more polypeptide chains. Each of these chains consists of the chain of amino acid residues linked together by peptide bonds.
  • a protein is notably characterized by a molecular mass greater than 10,000 Daltons (Da).
  • the extract of Chlamydomonas acidophila according to the invention is substantially free of free amino acids. Free amino acids have a molecular weight of less than 200 Da.
  • the peptides advantageously have a molecular mass of less than 3500 Daltons (Da).
  • these peptides cover all of the amino acid-based compounds initially present in the extract.
  • At least 80%, more advantageously at least 90%, of the peptides have a molecular mass of less than 1000 Da.
  • At least 30% of the peptides more advantageously at least 35%, more advantageously at least 40% of the peptides, have a molecular mass of less than 500 Da.
  • the distribution of the molecular weights of the peptides is expressed as a percentage relative to the total concentration of peptides.
  • the peptide extract of Chlamydomonas acidophila is advantageously obtained by enzymatic hydrolysis, more advantageously in the presence of at least one protease.
  • the extract according to the invention is more advantageously obtainable by the process described later in the description.
  • the invention also relates to a process for the preparation of a peptide extract of the microalga Chlamydomonas acidophila, comprising at least one step of enzymatic hydrolysis.
  • This step is advantageously carried out under the optimal conditions of pH and temperature, known to those skilled in the art, in particular under the optimal conditions of pH and temperature linked to the enzyme used.
  • said enzymatic hydrolysis step is carried out in the presence of at least one protease.
  • Said protease can advantageously be an alkaline protease or an acid protease, advantageously it is an alkaline protease.
  • the process for preparing a peptide extract of Chlamydomonas acidophila comprises at least the following steps:
  • step a) recovery of the peptide extract at the end of step c).
  • the aqueous phase is advantageously water.
  • the content of Chlamydomonas acidophila microalga in the aqueous dispersion is advantageously between 0.1% and 20%, more advantageously 1% and 10%, equivalent dry extract of the microalga.
  • the enzymatic treatment (step b) is advantageously carried out by adding at least one protease, advantageously under the optimal pH and temperature conditions known to those skilled in the art, for example at a pH between 3.0 and 9.0 and typically at a temperature between 20 ° C and 90 ° C.
  • the enzymatic treatment comprises the addition of an alkaline or acidic protease, advantageously an alkaline protease.
  • the enzymatic hydrolysis step of the process according to the invention is very important, since it allows the native proteins present in Chlamydomonas acidophila to be transformed or "cut out" to obtain peptides.
  • the enzymatic hydrolysis step is advantageously followed by a heat treatment step in order to denature the enzymes.
  • This heat treatment step is advantageously carried out at a temperature above 40 ° C, typically between 80 ° C and 100 ° C.
  • step d) the peptide extract is advantageously recovered by extraction of the dispersion obtained at the end of step c), advantageously with stirring, and advantageously at a pH of between 3.0 and 9.0 and at a temperature between 20 ° C and 90 ° C.
  • the method comprises an additional filtration or centrifugation step, located between steps c) and d), optionally followed by an ultrafiltration, diafiltration, or nanofiltration.
  • the filtration or centrifugation steps, optionally followed by ultrafiltration or diafiltration on membranes make it possible in particular to remove the residual proteins.
  • the nanofiltration stages make it possible in particular to remove mineral salts or free amino acids for example.
  • the method according to the invention advantageously comprises an ultrafiltration step at 15 kDa, advantageously between 10 and 15 kDa, carried out between steps c) and d), which makes it possible to eliminate any residual protein which is potentially allergenic.
  • the method according to the invention also comprises a nanofiltration step with, for example, a cutoff threshold of between 100 Daltons and 300 Daltons, advantageously between 130 and 300 Daltons, typically between 200 Daltons and 300 Daltons, to remove part of the acids. amino or mineral salts, following the ultrafiltration stage.
  • a nanofiltration step is carried out on a 200 Da membrane.
  • the aqueous hydrolyzate obtained, ie the peptide extract according to the invention, can then be physically and microbiologically stabilized by adding a solvent such as glycerol or glycols like 1,3-propanediol in different proportions adapted to such stabilization.
  • a solvent such as glycerol or glycols like 1,3-propanediol
  • the glycerol will be present alone or in combination with water or a glycol, advantageously in a proportion of between 40 and 95% and preferably between 50 and 90%, by mass relative to the total mass of the peptide extract and solvent.
  • the glycol and preferably 1,3-propanediol will advantageously be present alone or in combination with water or glycerol, advantageously in a proportion of between 40% and 95% and preferably between 50% and 90%, in mass relative to the total mass of the peptide extract and the solvent.
  • the present invention further relates to a composition comprising the peptide extract of Chlamydomonas acidophila according to the invention, a solvent chosen from glycerol, glycols and their mixtures in an amount effective for a physical and microbiological stabilization action, and optionally some water.
  • the effective amounts for a physical and microbiological stabilization action are as described above.
  • the peptide extract can be stabilized by drying, by methods known to those skilled in the art, in the presence or absence of a support of the type, for example, maltodextrins or acacia fibers.
  • a support of the type for example, maltodextrins or acacia fibers.
  • the content of support typically varies according to a ratio ranging from 0% to 80% of support relative to the percentage of dry matter obtained in the liquid form of the extract.
  • the extract can be dried by atomization, lyophilization or any process known to those skilled in the art and is preferably dried by lyophilization in order to obtain a final powder.
  • the final powder advantageously comprises 30% to 70% by weight of dry matter of the extract, the complement to 100% being the lyophilization support. More advantageously, the final powder comprises 50% of dry matter obtained from the extract and 50% of lyophilization support, said lyophilization support preferably being of maltodextrin or acacia fiber type.
  • the peptide extract can be obtained according to the following method:
  • said microalgae used as a raw material comes from a culture in photobioreactor, in particular in photobioreactor in an agitated medium.
  • said microalgae used as raw material comes from a culture in horizontal tubular photobioreactors ventilated in waves in an agitated medium, such as for example those developed by the company Microphyt and in particular described in patent application FR 2 943 685 and international application WO 2011/058267.
  • the present invention also relates to an extract of Chlamydomonas acidophila, capable of being obtained by the process mentioned above.
  • Such an extract meets the specifications defined above
  • the subject of the invention is also a cosmetic, dermatological or pharmaceutical composition
  • a cosmetic, dermatological or pharmaceutical composition comprising a peptide extract of Chlamydomonas acidophila, as active ingredient, and if appropriate an appropriate excipient.
  • the peptide extract of Chlamydomonas acidophila is as defined above or is capable of being obtained by the process mentioned above.
  • said extract is advantageously as defined in the above paragraphs relating to the extract according to the invention as such or those relating to the extract capable of being obtained by the process according to the invention.
  • composition is advantageously formulated to be administered by external topical, vaginal or oral route.
  • the composition according to the invention comprises from 0.001 to 10%, advantageously 0.01 to 5%, of said peptide extract of Chlamydomonas acidophila, by weight expressed as dry extract, relative to the total weight of the composition.
  • composition according to the invention can also comprise one or more other active ingredients.
  • the various preparations are suitable for topical administration and include in particular creams, emulsions, milks, ointments, lotions, oils, aqueous or hydro-alcoholic or glycolic solutions, powders, patches, sprays, shampoos, varnishes or any other product for external application.
  • the various preparations notably include intimate hygiene care, oral care, such as, for example, toothpaste, oral solutions, gingival gels.
  • the composition according to the invention can also comprise at least one cosmetically, pharmaceutically or dermatologically acceptable excipient.
  • composition according to the present invention can also comprise at least one cosmetically, pharmaceutically or dermatologically known adjuvant known to those skilled in the art, chosen from surfactants, thickeners, preservatives, perfumes, dyes, chemical filters or minerals, moisturizers, thermal waters, etc.
  • cosmetically, pharmaceutically or dermatologically known adjuvant known to those skilled in the art, chosen from surfactants, thickeners, preservatives, perfumes, dyes, chemical filters or minerals, moisturizers, thermal waters, etc.
  • compositions according to the invention can be determined according to the criteria generally taken into account in the establishment of a pharmacological, dermatological or cosmetic treatment suitable for a patient or an animal, such as for example the age or body weight of the patient or animal, the severity of his general condition, the tolerance to treatment, the side effects observed, the type of skin.
  • the subject of the invention is also an extract according to the invention or extract capable of being obtained by the process according to the invention or a composition according to the invention, for its use for preventing and / or treating:
  • the subject of the invention is also the use of an extract according to the invention or of an extract capable of being obtained by the process according to the invention or of a composition according to the invention, for the manufacture of a cosmetic, pharmaceutical or dermatological composition for preventing and / or treating:
  • the invention further relates to a method for preventing and / or treating: - disorders or pathologies of the skin and / or mucous membranes (for example the gums, periodonts, genital mucosa) and / or integuments (for example the hair and nails);
  • - disorders or pathologies of the skin and / or mucous membranes for example the gums, periodonts, genital mucosa
  • / or integuments for example the hair and nails
  • composition according to the invention comprising the administration, in particular the topical administration, of an effective amount of an extract according to the invention or of an extract capable of being obtained by the process according to the invention or of a composition according to the invention , to a subject in need.
  • the extract according to the invention or the extract capable of being obtained by the process according to the invention or the composition according to the invention is intended for the prevention and / or treatment of allergic, inflammatory reactions or pathologies , irritants or disorders of the barrier or homeostasis of the skin, appendages (hair and nails) and / or mucous membranes (gums, periodonts, genital mucosa) immature (normal) or mature (s) ) / aged (s).
  • composition or the extract according to the invention can be used for the prevention and / or the treatment of reactions, disorders or pathologies:
  • mucous membranes such as the gums and periodonts which can present gingivitis (sensitive gums of newborns, hygiene problems, due to smoking or others), periodontopathies, or genital mucous membranes which can present irritations of the external male or female genital spheres or internal and / or
  • integuments such as nails (brittle, fragile nails ...) and hair (alopecia, dandruff, hirsutism, seborrheic dermatitis, folliculitis) immature, normal or mature, presenting in particular scalp disorders such as alopecia (or alopecia areata) androgenetic, acute, localized, scarring, congenital, occipital of the infant, aerata, due to chemotherapy / radiotherapy or telogen effluvium, anagen effluvium, hair dystrophy, trichotillomania, ringworm or oily or dry dandruff.
  • the invention also relates to a method of cosmetic care of the skin and / or the integuments and / or mucous membranes, with a view to improving their condition and / or their appearance, consisting in administering an extract according to the invention or an extract capable to be obtained by the process according to the invention or a composition according to the invention.
  • the cosmetic care process makes it possible to firm the skin and to reduce the “orange peel” effect advantageously topically on the skin and / or integuments and / or mucous membranes.
  • the invention relates to a cosmetic care process for the skin and / or integuments, to act on the elasticity or firmness of the skin, in particular as a tightening or anti-wrinkle agent, to act on sensitive skin. , or also to act against pollution, consisting in applying to the skin and / or the integuments a composition or an extract according to the present invention.
  • the invention relates to a cosmetic care process for the skin and / or the appendages, with a view to preventing alterations of the barrier and its dehydration, consisting in applying to the skin and / or the appendages a composition or an extract according to the present invention.
  • the invention relates to a cosmetic skin care process, with a view to preventing aging thereof, consisting in applying to the skin a composition or an extract according to the present invention.
  • composition or extract according to the present invention can also be advantageously used in the prevention and / or treatment of vascular disorders, in particular redness and rosacea.
  • composition or extract according to the present invention can also be advantageously used in the prevention and / or treatment of alterations in adipose tissue.
  • the adipose tissue alterations are in particular cellulite or the "orange peel” effect.
  • the composition according to the invention makes it possible to firm the skin.
  • Figure 1 represents the measurement results of erythema intensity: Active / Placebo / Untreated Zone comparisons. NS: non-significant difference. *: p ⁇ 0.05 (Example 3B).
  • Figure 2 shows the evolution over time of the blood flow (Example 3B).
  • FIG. 3 shows the illustrations of the PIE results obtained at D0 and D28 (Example 3C).
  • Figure 4 shows the illustrations of the hydration results obtained at D0 and D28 (Example 3C).
  • Figure 5 shows the illustrations of the quantity of NMFs quantified at D0 and D28 (Example 3C).
  • Figure 6 represents the illustrations of the quantity of ceramides quantified with DO and D28 (Example 3C).
  • Figure 7 shows the illustrations of the amount of ILIRA quantified at DO and D28 (Example 3C).
  • Figure 8 shows the illustrations of the Nile red / lnvolucrine ratio at DO and D28 (Example 3C).
  • Example 1 extract according to the invention
  • a peptide extract is obtained according to the following process:
  • Example 2 Tests of biological activities of the extract according to the invention in vitro) The biological activity of the extract of Chlamydomonas acidophila (CAP) obtained in Example 1 was demonstrated in vitro as described below.
  • CAP Chlamydomonas acidophila
  • CAP Chlamydomonas acidophila
  • the GBA / GBAP1 gene encoding the enzyme Glucosylceramidase or b-glucocerebrosidase is over expressed after 6 hours of treatment with CAP.
  • RAB11A codes for a GTPase (Ras-related protein Rab-llA) involved in the biogenesis of lamellar bodies in keratinocytes. This underlines the importance of RAB11A in the homeostasis of the epidermal barrier.
  • GTPase Ras-related protein Rab-llA
  • Hyaluronan synthases-2 and -3 are enzymes responsible for the synthesis of hyaluronic acid (HA).
  • the PADI1, BLMH, CASP14 genes code for enzymes involved in the production of natural hydration factors (or NMF for Natural Moisturizing Factors).
  • Table 2 below presents the most significant results of the CAP extract on the expression of genes in fibroblasts.
  • Table 2 Variations in the expression of genes of interest in normal human dermal fibroblasts (NHDFs) Relative quantity (QR) compared to the equal control 1 / p value determined following a Student test
  • HAS1, HAS2 5.76 0.008
  • HAS3, produced by fibroblasts in the dermis are responsible for the biosynthesis of hyaluronic acid (AH).
  • NAD (P) H dehydrogenase, quinone 1 (NQOl) is a cytosolic flavoprotein under the control of the transcription factor Nrf-2. NQOl promotes, by reduction, the formation of hydroquinones from quinones, preventing the production of radical species.
  • the HSP70 protein encoded by the HSPA1A gene
  • is a chaperone molecule heat shock protein 70 which inhibits the aggregation of denatured proteins, promotes their renaturation (refolding) and controls essential mediators of the apoptotic machinery.
  • the thioredoxin system is one of the major antioxidant defense systems. Among the 3 isoforms of thioredoxine reductase, isoform 1 encoded by the TXNRD1 gene regulated by the CAP extract is the most studied.
  • peroxyredoxin-6 PRDX6
  • PRDX6 peroxyredoxin-6
  • the CAP extract stimulates the GLOl gene, which is part of the GLO system which detects and neutralizes certain carbonyls, and thus prevents them from attacking cells and their components.
  • the CAP extract stimulates the expression of PSMB1, a gene coding for the beta 1 subunit of the proteasome.
  • the proteasome plays a major role in the maintenance of protein homeostasis by eliminating damaged or malformed proteins that could alter cell functioning.
  • LOXL2 The gene expression of LOXL2 is also increased, this gene is part of the family of Lysyl oxidases, enzymes involved in the assembly of elastin and collagen fibers.
  • the inflammatory response is the normal, immediate and transient response of the body to any attack on the environment.
  • the keratinocyte is one of the first cells participating in the initiation of the inflammatory reaction in response to an attack on the environment.
  • PGE prostaglandins
  • the anti-inflammatory activity of the extract of Chlamydomonas acidophila according to the invention was evaluated on a model of inflammation induced on keratinocytes by treatment with PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate). The release of TNF ⁇ and Prostaglandin E2 (PGE2) cytokines was analyzed.
  • PMA Phorbol 12-Myristate 13-Acetate
  • PGE2 Prostaglandin E2
  • the inflammation was then induced by adding PMA at 10 pg / mL overnight.
  • the PMA at 10 pg / ml significantly increased the release of TNF ⁇ into the supernatants of keratinocytes and therefore induced inflammation well.
  • 0.1 pM dexamethasone and 0.1 pM indomethacin, 24 h pretreatment significantly reduced the release of TNFa, thus demonstrating their anti-inflammatory effect and validating the test.
  • the extract of Chlamydomonas acidophila in 24h pre-treatment at different concentrations, significantly reduced the release of TNFa and therefore showed an anti-inflammatory action against PMA.
  • Nickel is the major cause of allergic contact dermatitis in the population, with a global prevalence of around 8.6%
  • the objective of the study described below is to assess the effect of the CAP extract on the release of IL8 by nickel-stimulated keratinocytes.
  • Normal human epidermal keratinocytes were pretreated for 24 hours with the extract of CAP at 0.01% and 0.05% of dry matter or with the anti-inflammatory reference molecule Dexamethasone at 1 mM.
  • the keratinocytes were then treated for 24 hours with Nickel: NiS0 4 at 10 mM.
  • the amount of IL8 produced by the cells was evaluated by an ELISA test in the supernatants.
  • the IL8 concentration assayed was normalized with respect to the amount of total intracellular proteins evaluated by BC Assay.
  • the CAP extract induces a significant reduction in the release of IL8 induced by nickel stress in keratinocytes.
  • the extract of Chlamydomonas acidophila inhibits the release of a major cytokine, IL8, against the background of inflammatory stress induced by Nickel.
  • the extract is therefore of interest in the context of contact allergy or skin hypersensitivity linked by Nickel.
  • the objective of this study is to evaluate the anti-inflammatory activity of the extract Chlamydomonas acidophila (CAP) vis-à-vis a stress with heavy metals, represented by Cadmium, on normal human keratinocytes.
  • CAP Chlamydomonas acidophila
  • the PGE2 concentration assayed was normalized with respect to the amount of total intracellular proteins evaluated by BC Assay.
  • the CAP extract induces a decrease in the release of PGE2 induced by Cadmium stress in keratinocytes.
  • the extract of Chlamydomonas acidophila inhibits the production of Prostaglandin E2 (PGE2) induced by Cadmium stress.
  • the extract therefore provides protection for the skin against heavy metal stress, for example in the context of environmental pollution.
  • the anti-inflammatory activity of the extract of Chlamydomonas acidophila was evaluated on a model of inflammation induced by treatment with SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) on reconstituted epidermis.
  • Reconstructed Human Epidermis were preincubated for 24 hours in the presence of 0.01% CAP and 0.05% dry matter. 0.025% SDS was then applied to the surface of the epidermis which was again incubated for 24 hours, still in the presence of the CAP extract.
  • TNF ⁇ cytokine Tumor Necrosis Factor alpha
  • the gene expression of inflammatory markers and of the barrier was evaluated by qRT-PCR.
  • the CAP extract significantly inhibited the overproduction of TNF ⁇ and increased the expression of keratin 1.
  • the antioxidant effect of the active ingredient is evaluated by the incorporation of DCFH-DA (2 ′, 7 ′ - Dichlorofluorescin diacetate) in cultured keratinocytes.
  • DCFH-DA (2 ′, 7 ′ - Dichlorofluorescin diacetate)
  • This molecule is a non-fluorescent marker in the non-oxidized state.
  • oxidative conditions here H2O2 stress
  • DCFH-DA will be degraded into DCF, a molecule which will emit fluorescence.
  • the fluorescence thus measured will be proportional to the quantity of reactive oxygen species produced by the cell in the presence of H2O2 and / or of the extract.
  • the cells are then treated for 1 h in the presence of DCFH-DA at 0.5 mM. Oxidation is induced by adding H2O2 at 100 mM for 20 minutes. A second treatment with the tested products is carried out simultaneously with H2O2 stress (at the same concentrations as the pre-treatment).
  • DFU fluorescence density
  • the extract of Chlamydomonas acidophila has demonstrated an antioxidant effect against stress induced by H 2 0 2 .
  • the gene expression of the markers of the barrier function and of the hydration was evaluated by qRT-PCR.
  • the extract of Chlamydomonas acidophila also stimulated the expression of the markers SLC6A6 and SLC5A3, coding for TAUT (taurine membrane transport channel) and SMIT (myoinositol transport channel) respectively.
  • the extract of Chlamydomonas acidophila modulates the inflammation induced by Th2 stress in keratinocytes by inhibiting the gene expression of the chemoattractant factors CCL5 and CCL27.
  • the basophil activation test was carried out using the Flow CAST ® kit (BÜHLMANN, ref. FKCCR).
  • the stimulant, fM LP at 1 mM was then added and the blood was incubated for an additional 15 minutes in the presence of the labeling buffer containing a mixture of monoclonal antibodies (anti-CD63-FITC and anti-CCR3-PE).
  • Cromoglycate a known anti-allergic, the mechanism of action of which involves stabilizing the plasma membrane at which it inhibits intracellular penetration of Ca ++ , this ion being essential for mast cell degranulation.
  • SB202190 tested at 30 mM, as well as cromoglycate, tested at 10 mM, both showed a significant inhibitory effect on the activation of basophils induced by fMLP (respectively, 26% and 46% inhibition).
  • the CAP extract tested at 0.033% and 0.1%, showed a clear and concentration-dependent inhibitory effect on the activation of basophils induced by fMLP (respectively, 22% and 39% inhibition).
  • Chlamydomonas acidophila extract inhibits the activation of basophils.
  • Chlamydomonas extract acidophila could help modulate the processes involved in initiating the allergic response.
  • the CAP active ingredient (3% active ingredient) has demonstrated significant effectiveness on the following parameters:
  • the intensity of blood flow measured by TiVi is significantly lower over the area treated with the active ingredient compared to the untreated area.
  • the redness measured by spectrocolorimetry is significantly lower on the area treated with the active ingredient compared to the untreated area.
  • the decrease in the intensity of the blood flow measured by Tivi is significantly greater over the area treated with the active ingredient compared to the untreated area.
  • the reduction in redness measured by spectrocolorimetry is significantly greater in the area treated with the active ingredient compared to the untreated area.
  • the CAP active ingredient (3% active ingredient) has demonstrated significant effectiveness on the following parameters: Instrumental measurements
  • the people recruited for this study are subjects:
  • the method used by the TiVi 700 is based on the fact that green light is strongly absorbed by the cells of blood vessels, while red light is moderately absorbed.
  • the method eliminates specular reflection to take into account only the light returned by the skin tissue.
  • the device thus produces an intensity map with each pixel representing a concentration of blood cells in the skin.
  • a decrease in the intensity of the concentration of blood cells in the skin indicates an anti-inflammation effect.
  • the graphs of Figures IA, IB and IC represent the pair-to-pair comparisons between the active, the placebo and the untreated zone on the intensity of the erythema 20 minutes after application of Methyl-Nicotinate measured by TiVi.
  • the ordinate parameter represents the intensity of the blood flow (concentration of red blood cells).
  • Tables 13A and 13B below (Tables 13A and B: mean and standard deviation of the measurements with% of subjects with a positive effect% difference and p value (exact value of significance).
  • the graph Figure 2 shows the evolution over time of the blood flow values.
  • the results show that the active ingredient significantly reduces the intensity of the erythema created compared to the untreated area.
  • the intensity of the erythema on the placebo area does not differ from the area treated.
  • the intensity of the erythema on the active area is significantly lower compared to placebo.
  • the people recruited for this study are subjects:
  • the skin barrier helps regulate water loss through evaporation. When this barrier is damaged, the insensible water loss increases. Conversely, a reinforced barrier corresponds to an insensible loss of water less.
  • the insensible water loss was measured by a Tewameter TM 300.
  • the principle is to measure the temperature and the relative humidity in a tube with one of the openings applied to the skin by 2 sensors located at 2 different heights. Fick's law is then used to determine the insensible water loss.
  • Table 14 values at D0 and D28 of the insensible water loss. Evolution percentages and statistics.
  • the hydration of the skin was measured by a CM 825 corneometer. This device is based on the principle of capacitance measurement, allowing a measurement of the hydration of the surface layers of the skin (10 to 20 ⁇ m of depth).
  • Table 15 values at D0 and D28 of hydration. Evolution percentages and statistics.
  • NMFs Natural Hydration Factors
  • the quantity of NMFs includes urocanic acid (UCA), Pyrrolidone carboxylic acid (PCA) and serine.
  • UCA urocanic acid
  • PCA Pyrrolidone carboxylic acid
  • serine serine
  • Ceramides by Liquid Chromatography coupled with detection by mass spectroscopy (LC / MS).
  • the amount of ceramides includes ceramides with bases [S], [DS] and [P]
  • the content of ceramides provides information on the state of the skin barrier.
  • Table 16 values at DO and D28 of the quantity of NMFs. Evolution percentages and statistics.
  • Table 17 values at DO and D28 of the quantity of ceramides. Evolution percentages and statistics.
  • Table 18 values at DO and D28 of the amount of ILIRA. Evolution percentages and statistics.
  • Table 19 DO and D28 values of the Nile red / lnvolucrine ratio. Evolution percentages and statistics.

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Abstract

The invention relates to a peptide extract of the microalga Chlamydomonas acidophila, and to a method for the preparation thereof. The invention also relates to a composition, advantageously a cosmetic or dermatological composition, comprising such an extract. The invention also relates to such a composition or such an extract for use in the prevention or treatment of disorders or diseases affecting the skin, mucous membranes or skin appendages, for use in the prevention or treatment of vascular disorders, or else for use in the prevention or treatment of adipose tissue modifications. The invention finally relates to a cosmetic care process for the skin, the skin appendages or the mucous membranes, with a view to improving the condition thereof or the appearance thereof, which process consists in administering such a composition or such an extract.

Description

DESCRIPTION DESCRIPTION
EXTRAIT DE CHLAMYDOMONAS ACIDOPHILA, SON PROCEDE DE PREPARATION ET LES EXTRACT OF CHLAMYDOMONAS ACIDOPHILA, PROCESS FOR THE PREPARATION THEREOF AND THEIR
COMPOSITIONS COSMETIQUES, ET DERMATOLOGIQUES LE COMPRENANT COSMETIC AND DERMATOLOGICAL COMPOSITIONS COMPRISING THE SAME
DOMAINE DE L'INVENTION FIELD OF THE INVENTION
L'invention se rapporte à un extrait peptidique de la microalgue Chlamydomonas acidophila et à une composition cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique comprenant un tel extrait. L'invention a également pour objet un procédé d'extraction d'un extrait peptidique de Chlamydomonas acidophila, ainsi que l'extrait susceptible d'être obtenu par ledit procédé. L'invention concerne également une composition ou un tel extrait pour son utilisation dans la prévention ou le traitement des troubles ou pathologies de la peau, des muqueuses ou des phanères, pour son utilisation dans la prévention ou le traitement des troubles vasculaires, ou encore pour son utilisation dans la prévention ou le traitement des altérations du tissu adipeux. L'invention concerne enfin un procédé de soin cosmétique de la peau, des phanères ou des muqueuses, en vue d'améliorer leur état ou leur aspect, consistant à administrer une telle composition ou un tel extrait. The invention relates to a peptide extract of the microalga Chlamydomonas acidophila and to a cosmetic, dermatological or pharmaceutical composition comprising such an extract. The invention also relates to a method of extracting a peptide extract of Chlamydomonas acidophila, as well as the extract capable of being obtained by said method. The invention also relates to a composition or such an extract for its use in the prevention or treatment of disorders or pathologies of the skin, mucous membranes or integuments, for its use in the prevention or treatment of vascular disorders, or also for its use in the prevention or treatment of adipose tissue alterations. Finally, the invention relates to a cosmetic care process for the skin, integuments or mucous membranes, with a view to improving their condition or their appearance, consisting in administering such a composition or such an extract.
LES MICROALGUES MICROALGAE
Les micro-algues sont des organismes unicellulaires, eucaryotes, doués de photosynthèse et qui sont donc capables comme les végétaux supérieurs d'utiliser le CO2 de l'air pour leur métabolisme mais également d'autres nutriments comme le phosphore, les nitrates, etc. Elles ont été parmi les premières espèces à coloniser la terre. Il existe environ 30 000 espèces décrites mais on suppose qu'il en existe bien plus. On trouve les microalgues à l'état naturel, aussi bien en eau douce que saumâtre à salée à travers le monde. Micro-algae are single-celled, eukaryotic organisms, endowed with photosynthesis and which are therefore capable, like higher plants, of using CO2 from the air for their metabolism but also other nutrients such as phosphorus, nitrates, etc. They were among the first species to colonize the earth. There are around 30,000 species described but it is assumed that there are many more. Microalgae are found in their natural state, both in fresh and brackish to salt water around the world.
Les microalgues sont cultivables selon des procédés connus de l'homme de l'art, comme en photo réacteurs dans des milieux contrôlés en lumière, pH et nutriments, et elles connaissent de nombreux débouchés. Elles sont capables comme les organismes supérieurs de synthétiser des protéines, carbohydrates et lipides. Certains lipides sont particuliers comme des acides gras complexes ou des pigments à propriétés biologiques particulières (xanthophylles). Elles ont connu un engouement particulier pour une éventuelle production de biocarburant et leur production en bioréacteur s'est étendue. Les autres débouchés sont divers : alimentation pour poissons (aquarium et piscicultures), alimentation et santé humaine (asthaxanthine extraite d'Haematococcus pluvialis, protéines de la spiruline) et quelques débouchés dans l'industrie cosmétique. Microalgae can be cultivated according to methods known to those skilled in the art, such as photo-reactors in environments controlled in light, pH and nutrients, and they have many outlets. Like the higher organisms, they are capable of synthesizing proteins, carbohydrates and lipids. Certain lipids are specific such as complex fatty acids or pigments with specific biological properties (xanthophylls). They have experienced a particular craze for a possible production of biofuel and their production in bioreactor has expanded. The other outlets are diverse: food for fish (aquarium and fish farms), food and human health (asthaxanthin extracted from Haematococcus pluvialis, spirulina proteins) and some outlets in the cosmetic industry.
ART ANTERIEUR - Chlamydomonas acidophila PRIOR ART - Chlamydomonas acidophila
Chlamydomonas acidophila de la classe des Chlorophyceae (Famille : Chlamydomonadaceae) est une microalgue verte d'eau douce qui prolifère dans les eaux très acides (pH 2,3 à 3,4) et adaptées à des milieux chargés en métaux lourds. Elle a été notamment identifiée et prélevée la première fois dans des lacs volcaniques en Argentine. Elle serait riche en phytochélatines, structures particulières capables de chélater les métaux et en caroténoïdes (béta-carotène, lutéine). En dehors des publications, concernant ses conditions éventuelles de culture et développement (tolérance aux pH extrêmes, et aux métaux lourds), il existe peu de choses concernant sa composition et son utilisation. Sa « cousine » Chlamydomonas reinhardii est utilisée comme organisme modèle dans différents secteurs scientifiques comme la génétique. Chlamydomonas acidophila of the class Chlorophyceae (Family: Chlamydomonadaceae) is a green freshwater microalgae that proliferates in very acidic waters (pH 2.3 to 3.4) and adapted to environments loaded with heavy metals. In particular, it was identified and removed for the first time from volcanic lakes in Argentina. It is said to be rich in phytochelatins, special structures capable of chelating metals and in carotenoids (beta-carotene, lutein). Apart from publications, concerning its possible conditions of culture and development (tolerance to extreme pH, and heavy metals), there is little about its composition and its use. Its “cousin” Chlamydomonas reinhardii is used as a model organism in various scientific fields such as genetics.
DESCRIPTION DE L'INVENTION DESCRIPTION OF THE INVENTION
La Demanderesse a découvert que les extraits peptidiques de la microalgue Chlamydomonas acidophila présentent des propriétés cosmétiques, pharmacologiques et dermatologiques jamais décrites jusqu'à présent. En particulier, c'est la première fois que de tels extraits de Chlamydomonas acidophila sont utilisés en tant que tels, pour leurs propriétés spécifiques. The Applicant has discovered that the peptide extracts of the microalga Chlamydomonas acidophila have cosmetic, pharmacological and dermatological properties never described until now. In particular, this is the first time that such extracts of Chlamydomonas acidophila have been used as such, for their specific properties.
L'invention a pour objet un extrait peptidique de la microalgue Chlamydomonas acidophila. The subject of the invention is a peptide extract of the microalga Chlamydomonas acidophila.
Par « extrait peptidique » on entend, au sens de la présente invention un extrait comprenant majoritairement des peptides. By “peptide extract” is meant, within the meaning of the present invention, an extract comprising predominantly peptides.
Par « peptide » on entend, au sens de la présente invention, un polymère d'acides aminés reliés entre eux par des liaisons peptidiques. Un peptide est notamment caractérisé par une masse moléculaire comprise entre 200 et 10 000 Daltons (Da), bornes incluses. By “peptide” is meant, within the meaning of the present invention, a polymer of amino acids linked together by peptide bonds. A peptide is in particular characterized by a molecular mass of between 200 and 10,000 Daltons (Da), limits included.
Avantageusement, l'extrait de Chlamydomonas acidophila selon l'invention comprend au moins 20 % en poids de peptides, les pourcentages étant exprimés par rapport au poids total dudit extrait. En particulier, l'extrait selon l'invention comprend de 20 % à 90 %, avantageusement de 20 % à 75 %, plus avantageusement de 30 % à 70 %, typiquement 65 %, en poids de peptides, les pourcentages étant exprimés par rapport au poids total dudit extrait. Advantageously, the extract of Chlamydomonas acidophila according to the invention comprises at least 20% by weight of peptides, the percentages being expressed relative to the total weight of said extract. In particular, the extract according to the invention comprises from 20% to 90%, advantageously from 20% to 75%, more advantageously from 30% to 70%, typically 65%, by weight of peptides, the percentages being expressed relative to the total weight of said extract.
Avantageusement, l'extrait de Chlamydomonas acidophila selon l'invention est substantiellement débarrassé de toute protéine, notamment de toute protéine native résiduelle. Ceci permet notamment d'éviter des réactions allergiques, et d'améliorer la solubilité et la biodisponibilité de l'extrait selon l'invention. Advantageously, the extract of Chlamydomonas acidophila according to the invention is substantially free of any protein, in particular any residual native protein. This makes it possible in particular to avoid allergic reactions, and to improve the solubility and the bioavailability of the extract according to the invention.
Par « protéine » on entend, au sens de la présente invention, des macromolécules biologiques formées d'une ou de plusieurs chaînes polypeptidiques. Chacune de ces chaînes est constituée de l'enchaînement de résidus d'acides aminés liés entre eux par des liaisons peptidiques. Une protéine est notamment caractérisée par une masse moléculaire supérieure à 10 000 Daltons (Da). Avantageusement, l'extrait de Chlamydomonas acidophila selon l'invention est substantiellement débarrassé des acides aminés libres. Les acides aminés libres ont une masse moléculaire inférieure à 200 Da. By “protein” is meant, within the meaning of the present invention, biological macromolecules formed from one or more polypeptide chains. Each of these chains consists of the chain of amino acid residues linked together by peptide bonds. A protein is notably characterized by a molecular mass greater than 10,000 Daltons (Da). Advantageously, the extract of Chlamydomonas acidophila according to the invention is substantially free of free amino acids. Free amino acids have a molecular weight of less than 200 Da.
Dans l'extrait peptidique de Chlamydomonas acidophila selon l'invention, les peptides ont avantageusement une masse moléculaire inférieure à 3500 Daltons (Da). De manière avantageuse, ces peptides recouvrent tous les composés à base d'aminoacides initialement présents dans l'extrait. In the peptide extract of Chlamydomonas acidophila according to the invention, the peptides advantageously have a molecular mass of less than 3500 Daltons (Da). Advantageously, these peptides cover all of the amino acid-based compounds initially present in the extract.
Avantageusement, dans l'extrait selon l'invention, au moins 80 %, plus avantageusement au moins 90 %, des peptides ont une masse moléculaire inférieure à 1000 Da. Advantageously, in the extract according to the invention, at least 80%, more advantageously at least 90%, of the peptides have a molecular mass of less than 1000 Da.
Avantageusement, dans l'extrait selon l'invention, au moins 30 % des peptides, plus avantageusement au moins 35 %, plus avantageusement au moins 40 % des peptides, ont une masse moléculaire inférieure à 500 Da. Advantageously, in the extract according to the invention, at least 30% of the peptides, more advantageously at least 35%, more advantageously at least 40% of the peptides, have a molecular mass of less than 500 Da.
La répartition des masses moléculaires des peptides est exprimée en pourcentage par rapport à la concentration totale de peptides. The distribution of the molecular weights of the peptides is expressed as a percentage relative to the total concentration of peptides.
Dans le cadre de la présente invention, l'extrait peptidique de Chlamydomonas acidophila est avantageusement obtenu par hydrolyse enzymatique, plus avantageusement en présence d'au moins une protéase. L'extrait selon l'invention est plus avantageusement susceptible d'être obtenu par le procédé décrit plus loin dans la description. In the context of the present invention, the peptide extract of Chlamydomonas acidophila is advantageously obtained by enzymatic hydrolysis, more advantageously in the presence of at least one protease. The extract according to the invention is more advantageously obtainable by the process described later in the description.
L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'un extrait peptidique de la microalgue Chlamydomonas acidophila, comprenant au moins une étape d'hydrolyse enzymatique. Cette étape est avantageusement effectuée dans les conditions optimales de pH et de température, connues de l'homme de l'art, notamment dans les conditions optimales de pH et de température liées à l'enzyme utilisée. The invention also relates to a process for the preparation of a peptide extract of the microalga Chlamydomonas acidophila, comprising at least one step of enzymatic hydrolysis. This step is advantageously carried out under the optimal conditions of pH and temperature, known to those skilled in the art, in particular under the optimal conditions of pH and temperature linked to the enzyme used.
Avantageusement, ladite étape d'hydrolyse enzymatique est effectuée en présence d'au moins une protéase. Ladite protéase peut être avantageusement une protéase alcaline ou une protéase acide, avantageusement il s'agit d'une protéase alcaline. Advantageously, said enzymatic hydrolysis step is carried out in the presence of at least one protease. Said protease can advantageously be an alkaline protease or an acid protease, advantageously it is an alkaline protease.
Avantageusement selon l'invention, le procédé de préparation d'un extrait peptidique de Chlamydomonas acidophila comprend au moins les étapes suivantes : Advantageously according to the invention, the process for preparing a peptide extract of Chlamydomonas acidophila comprises at least the following steps:
a) dispersion en phase aqueuse de la microalgue Chlamydomonas acidophila ; a) dispersion in aqueous phase of the microalga Chlamydomonas acidophila;
b) hydrolyse enzymatique de la dispersion aqueuse obtenue à l'étape a) ; b) enzymatic hydrolysis of the aqueous dispersion obtained in step a);
c) traitement thermique du mélange obtenu à l'étape b) ; et c) heat treatment of the mixture obtained in step b); and
d) récupération de l'extrait peptidique à la fin de l'étape c). A l'étape a), la phase aqueuse est avantageusement de l'eau. En outre, la teneur en microalgue Chlamydomonas acidophila dans la dispersion aqueuse est avantageusement comprise entre 0,1 % et 20 %, plus avantageusement 1 % et 10 %, équivalent extrait sec de la microalgue. d) recovery of the peptide extract at the end of step c). In step a), the aqueous phase is advantageously water. In addition, the content of Chlamydomonas acidophila microalga in the aqueous dispersion is advantageously between 0.1% and 20%, more advantageously 1% and 10%, equivalent dry extract of the microalga.
Le traitement enzymatique (étape b) est avantageusement réalisé par ajout d'au moins une protéase, avantageusement dans les conditions optimales de pH et de température connues de l'homme de l'art, par exemple à un pH compris entre 3,0 et 9,0 et typiquement à une température comprise entre 20 °C et 90 °C. En particulier, le traitement enzymatique comprend l'ajout d'une protéase de type alcaline ou acide, avantageusement d'une protéase alcaline. The enzymatic treatment (step b) is advantageously carried out by adding at least one protease, advantageously under the optimal pH and temperature conditions known to those skilled in the art, for example at a pH between 3.0 and 9.0 and typically at a temperature between 20 ° C and 90 ° C. In particular, the enzymatic treatment comprises the addition of an alkaline or acidic protease, advantageously an alkaline protease.
L'étape d'hydrolyse enzymatique du procédé selon l'invention est très importante, puisqu'elle permet de transformer ou de « découper » les protéines natives présentes dans Chlamydomonas acidophila pour obtenir des peptides. The enzymatic hydrolysis step of the process according to the invention is very important, since it allows the native proteins present in Chlamydomonas acidophila to be transformed or "cut out" to obtain peptides.
Dans le cadre de la présente invention, l'étape d'hydrolyse enzymatique est avantageusement suivie d'une étape de traitement thermique afin de dénaturer les enzymes. Cette étape de traitement thermique est avantageusement effectuée à une température supérieure à 40°C, typiquement entre 80 °C et 100°C. In the context of the present invention, the enzymatic hydrolysis step is advantageously followed by a heat treatment step in order to denature the enzymes. This heat treatment step is advantageously carried out at a temperature above 40 ° C, typically between 80 ° C and 100 ° C.
Lors de l'étape d), l'extrait peptidique est avantageusement récupéré par extraction de la dispersion obtenue à la fin de l'étape c), avantageusement sous agitation, et avantageusement à un pH compris entre 3,0 et 9,0 et à une température comprise entre 20 °C et 90°C. During step d), the peptide extract is advantageously recovered by extraction of the dispersion obtained at the end of step c), advantageously with stirring, and advantageously at a pH of between 3.0 and 9.0 and at a temperature between 20 ° C and 90 ° C.
De manière avantageuse, le procédé comprend une étape supplémentaire de filtration ou centrifugation, située entre les étapes c) et d), éventuellement suivie d'une ultrafiltration, diafiltration, ou nanofiltration. Advantageously, the method comprises an additional filtration or centrifugation step, located between steps c) and d), optionally followed by an ultrafiltration, diafiltration, or nanofiltration.
Les étapes de filtration ou de centrifugation, suivies éventuellement d'une ultrafiltration ou diafiltration sur membranes permettent notamment d'éliminer les protéines résiduelles. Les étapes de nanofiltration permettent notamment d'éliminer des sels minéraux ou des acides aminés libres par exemple. The filtration or centrifugation steps, optionally followed by ultrafiltration or diafiltration on membranes make it possible in particular to remove the residual proteins. The nanofiltration stages make it possible in particular to remove mineral salts or free amino acids for example.
Le procédé selon l'invention comprend avantageusement une étape d'ultrafiltration à 15 kDa, avantageusement entre 10 et 15 kDa, effectuée entre les étapes c) et d), ce qui permet d'éliminer toute protéine résiduelle potentiellement allergisante. The method according to the invention advantageously comprises an ultrafiltration step at 15 kDa, advantageously between 10 and 15 kDa, carried out between steps c) and d), which makes it possible to eliminate any residual protein which is potentially allergenic.
Avantageusement, le procédé selon l'invention comprend également une étape de nanofiltration avec par exemple un seuil de coupure compris entre 100 Daltons et 300 Daltons, avantageusement entre 130 et 300 Daltons, typiquement entre 200 Daltons et 300 Daltons, pour éliminer une partie des acides aminés ou les sels minéraux, suite à l'étape d'ultrafiltration. Avantageusement, ladite étape de nanofiltration est réalisée sur membrane 200 Da. Advantageously, the method according to the invention also comprises a nanofiltration step with, for example, a cutoff threshold of between 100 Daltons and 300 Daltons, advantageously between 130 and 300 Daltons, typically between 200 Daltons and 300 Daltons, to remove part of the acids. amino or mineral salts, following the ultrafiltration stage. Advantageously, said nanofiltration step is carried out on a 200 Da membrane.
L'hydrolysat aqueux obtenu, i.e. l'extrait peptidique selon l'invention, peut ensuite être stabilisé physiquement et microbiologiquement par ajout de solvant tel que le glycérol ou les glycols comme le 1,3-propanediol dans différentes proportions adaptées à une telle stabilisation. Avantageusement, le glycérol sera présent seul ou en combinaison avec l'eau ou un glycol, avantageusement dans une proportion comprise entre 40 et 95% et préférentiellement entre 50 et 90%, en masse par rapport à la masse totale de l'extrait peptidique et du solvant. De même, le glycol et préférentiellement le 1,3-propanediol, sera avantageusement présent seul ou en combinaison avec l'eau ou le glycérol, avantageusement dans une proportion comprise entre 40 % et 95 % et préférentiellement entre 50 % et 90 %, en masse par rapport à la masse totale de l'extrait peptidique et du solvant. Ainsi, la présente invention porte en outre sur une composition comprenant l'extrait peptidique de Chlamydomonas acidophila selon l'invention, un solvant choisi parmi le glycérol, les glycols et leurs mélanges en quantité efficace pour une action de stabilisation physique et microbiologique, et éventuellement de l'eau. Les quantités efficaces pour une action de stabilisation physique et microbiologique sont telles que décrites ci-dessus. The aqueous hydrolyzate obtained, ie the peptide extract according to the invention, can then be physically and microbiologically stabilized by adding a solvent such as glycerol or glycols like 1,3-propanediol in different proportions adapted to such stabilization. Advantageously, the glycerol will be present alone or in combination with water or a glycol, advantageously in a proportion of between 40 and 95% and preferably between 50 and 90%, by mass relative to the total mass of the peptide extract and solvent. Likewise, the glycol and preferably 1,3-propanediol will advantageously be present alone or in combination with water or glycerol, advantageously in a proportion of between 40% and 95% and preferably between 50% and 90%, in mass relative to the total mass of the peptide extract and the solvent. Thus, the present invention further relates to a composition comprising the peptide extract of Chlamydomonas acidophila according to the invention, a solvent chosen from glycerol, glycols and their mixtures in an amount effective for a physical and microbiological stabilization action, and optionally some water. The effective amounts for a physical and microbiological stabilization action are as described above.
Il existe une variante dans laquelle, l'extrait peptidique peut être stabilisé par séchage, par des procédés connus de l'homme de l'art, en présence ou non d'un support de type, par exemple, maltodextrines ou fibres d'acacia (Fibregum(R) société CNI). La teneur en support varie typiquement selon un ratio allant de 0 % à 80 % de support par rapport au pourcentage de matière sèche obtenue dans la forme liquide de l'extrait. L'extrait peut être séché par atomisation, lyophilisation ou tout procédé connu de l'homme de l'art et est préférentiellement séché par lyophilisation afin d'obtenir une poudre finale. La poudre finale comprend avantageusement 30 % à 70% en poids de matière sèche de l'extrait, le complément à 100 % étant le support de lyophilisation. Plus avantageusement la poudre finale comprend 50 % de matière sèche issue de l'extrait et 50 % de support de lyophilisation, ledit support de lyophilisation étant de préférence de type maltodextrines ou fibres d'acacia. There is a variant in which the peptide extract can be stabilized by drying, by methods known to those skilled in the art, in the presence or absence of a support of the type, for example, maltodextrins or acacia fibers. (Fibregum (R) company CNI). The content of support typically varies according to a ratio ranging from 0% to 80% of support relative to the percentage of dry matter obtained in the liquid form of the extract. The extract can be dried by atomization, lyophilization or any process known to those skilled in the art and is preferably dried by lyophilization in order to obtain a final powder. The final powder advantageously comprises 30% to 70% by weight of dry matter of the extract, the complement to 100% being the lyophilization support. More advantageously, the final powder comprises 50% of dry matter obtained from the extract and 50% of lyophilization support, said lyophilization support preferably being of maltodextrin or acacia fiber type.
Préférentiellement, à titre d'exemple, l'extrait peptidique peut être obtenu selon le procédé suivant : Preferably, by way of example, the peptide extract can be obtained according to the following method:
a) mise en solution de la microalgue, Chlamydomonas acidophila dans de l'eau à une teneur d'environ 10 % équivalent extrait sec de la microalgue ; a) dissolving the microalga, Chlamydomonas acidophila in water at a content of approximately 10% equivalent dry extract of the microalga;
b) hydrolyse enzymatique par une protéase alcaline (l'alcalase de la société Lyven) ; b) enzymatic hydrolysis with an alkaline protease (the alkalase from the company Lyven);
c) traitement thermique afin de dénaturer les enzymes ; c) heat treatment in order to denature the enzymes;
c') centrifugation, ultrafiltration et diafiltration sur membranes 15 kDa afin d'éliminer les protéines résiduelles potentiellement allergisantes ; c ') centrifugation, ultrafiltration and diafiltration on 15 kDa membranes in order to remove residual proteins which are potentially allergenic;
c") nanofiltration sur membrane 200 Da afin d'éliminer des sels minéraux ou des acides aminés libres par exemple ; et c ") nanofiltration on a 200 Da membrane in order to remove mineral salts or free amino acids for example; and
d) récupération de l'extrait peptidique obtenu à la fin de l'étape c"). d) recovery of the peptide extract obtained at the end of step c ").
Dans le cadre du procédé selon l'invention, la microalgue Chlamydomonas acidophila utilisée en tant que matière première peut être issue d'une culture en milieu extérieur, par exemple dans des « raceways » (= bac en forme de circuit utilisé pour l'élevage en écloserie), ou d'une culture en milieu fermé, dans des photobioréacteurs. Avantageusement, ladite microalgue utilisée en tant que matière première est issue d'une culture en photobioréacteur, notamment en photobioréacteur en milieu agité. Plus avantageusement, ladite microalgue utilisée en tant que matière première est issue d'une culture en photobioréacteurs tubulaire horizontaux ventilé à vagues en milieu agité, tels par exemple ceux développés par la société Microphyt et notamment décrits dans la demande de brevet FR 2 943 685 et la demande internationale WO 2011/058267. In the context of the process according to the invention, the microalga Chlamydomonas acidophila used as a raw material can come from an outdoor culture, for example in "raceways" (= circuit-shaped tank used for hatchery breeding), or from a culture in a closed environment, in photobioreactors. Advantageously, said microalgae used as a raw material comes from a culture in photobioreactor, in particular in photobioreactor in an agitated medium. More advantageously, said microalgae used as raw material comes from a culture in horizontal tubular photobioreactors ventilated in waves in an agitated medium, such as for example those developed by the company Microphyt and in particular described in patent application FR 2 943 685 and international application WO 2011/058267.
La présente invention a également pour objet un extrait de Chlamydomonas acidophila, susceptible d'être obtenu par le procédé mentionné ci-dessus. Un tel extrait répond aux spécifications définies précédemment The present invention also relates to an extract of Chlamydomonas acidophila, capable of being obtained by the process mentioned above. Such an extract meets the specifications defined above
L'invention a également pour objet une composition cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique comprenant un extrait peptidique de Chlamydomonas acidophila, en tant que principe actif, et le cas échéant un excipient approprié. The subject of the invention is also a cosmetic, dermatological or pharmaceutical composition comprising a peptide extract of Chlamydomonas acidophila, as active ingredient, and if appropriate an appropriate excipient.
Avantageusement, dans la composition selon l'invention, l'extrait peptidique de Chlamydomonas acidophila est tel que défini ci-dessus ou est susceptible d'être obtenu par le procédé mentionné ci-dessus. Ainsi, ledit extrait est avantageusement tel que défini dans les paragraphes ci- dessus concernant l'extrait selon l'invention en tant que tel ou ceux concernant l'extrait susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention. Advantageously, in the composition according to the invention, the peptide extract of Chlamydomonas acidophila is as defined above or is capable of being obtained by the process mentioned above. Thus, said extract is advantageously as defined in the above paragraphs relating to the extract according to the invention as such or those relating to the extract capable of being obtained by the process according to the invention.
Ladite composition est avantageusement formulée pour être administrée par voie topique externe, vaginale ou par voie orale. Said composition is advantageously formulated to be administered by external topical, vaginal or oral route.
Avantageusement, la composition selon l'invention comprend de 0,001 à 10 %, avantageusement 0,01 à 5 %, dudit extrait peptidique de Chlamydomonas acidophila, en poids exprimé d'extrait sec, par rapport au poids total de la composition. Advantageously, the composition according to the invention comprises from 0.001 to 10%, advantageously 0.01 to 5%, of said peptide extract of Chlamydomonas acidophila, by weight expressed as dry extract, relative to the total weight of the composition.
La composition selon l'invention peut comprendre en outre un ou plusieurs autres principes actifs. The composition according to the invention can also comprise one or more other active ingredients.
Selon une première variante, les différentes préparations sont adaptées à l'administration topique et incluent notamment les crèmes, les émulsions, les laits, les pommades, les lotions, les huiles, les solutions aqueuses ou hydro-alcooliques ou glycoliques, les poudres, les patchs, les sprays, les shampooings, les vernis ou tout autre produit pour application externe. Et selon les variantes suivantes, les différentes préparations incluent notamment les soins d'hygiène intime, les soins bucco- dentaires, comme par exemple, les dentifrices, solutions buccales, gels gingivaux. Selon sa nature (cosmétique, pharmaceutique ou dermatologique), la composition selon l'invention peut en outre comprendre au moins un excipient cosmétiquement, pharmaceutiquement ou dermatologiquement acceptable. Notamment, la composition selon la présente invention peut en outre comprendre au moins un adjuvant cosmétiquement, pharmaceutiquement ou dermatologiquement connu de l'homme du métier, choisi parmi les tensioactifs, les épaississants, les conservateurs, les parfums, les colorants, des filtres chimiques ou minéraux, les agents hydratants, les eaux thermales, etc. L'homme du métier sait adapter la formulation de la composition selon l'invention en utilisant ses connaissances générales. According to a first variant, the various preparations are suitable for topical administration and include in particular creams, emulsions, milks, ointments, lotions, oils, aqueous or hydro-alcoholic or glycolic solutions, powders, patches, sprays, shampoos, varnishes or any other product for external application. And according to the following variants, the various preparations notably include intimate hygiene care, oral care, such as, for example, toothpaste, oral solutions, gingival gels. Depending on its nature (cosmetic, pharmaceutical or dermatological), the composition according to the invention can also comprise at least one cosmetically, pharmaceutically or dermatologically acceptable excipient. In particular, the composition according to the present invention can also comprise at least one cosmetically, pharmaceutically or dermatologically known adjuvant known to those skilled in the art, chosen from surfactants, thickeners, preservatives, perfumes, dyes, chemical filters or minerals, moisturizers, thermal waters, etc. A person skilled in the art knows how to adapt the formulation of the composition according to the invention using his general knowledge.
Les posologies et les formes galéniques optimales des compositions selon l'invention peuvent être déterminées selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement pharmacologique, dermatologique ou cosmétique adapté à un patient ou à un animal, comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient ou de l'animal, la gravité de son état général, la tolérance au traitement, les effets secondaires constatés, le type de peau. The optimal dosage and dosage forms of the compositions according to the invention can be determined according to the criteria generally taken into account in the establishment of a pharmacological, dermatological or cosmetic treatment suitable for a patient or an animal, such as for example the age or body weight of the patient or animal, the severity of his general condition, the tolerance to treatment, the side effects observed, the type of skin.
L'invention a aussi pour objet un extrait selon l'invention ou extrait susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention ou une composition selon l'invention, pour son utilisation pour prévenir et/ou traiter : The subject of the invention is also an extract according to the invention or extract capable of being obtained by the process according to the invention or a composition according to the invention, for its use for preventing and / or treating:
- des troubles ou pathologies de la peau et/ou des muqueuses (par exemples les gencives, parodontes, muqueuses génitales) et/ou des phanères (par exemples les cheveux et ongles) ; - disorders or pathologies of the skin and / or mucous membranes (for example the gums, periodonts, genital mucosa) and / or integuments (for example the hair and nails);
- des troubles vasculaires ; et - vascular disorders; and
- des altérations du tissu adipeux. - alterations in adipose tissue.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un extrait selon l'invention ou d'un extrait susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention ou d'une composition selon l'invention, pour la fabrication d'une composition cosmétique, pharmaceutique ou dermatologique pour prévenir et/ou traiter : The subject of the invention is also the use of an extract according to the invention or of an extract capable of being obtained by the process according to the invention or of a composition according to the invention, for the manufacture of a cosmetic, pharmaceutical or dermatological composition for preventing and / or treating:
- des troubles ou pathologies de la peau et/ou des muqueuses (par exemples les gencives, parodontes, muqueuses génitales) et/ou des phanères (par exemples les cheveux et ongles) ; - disorders or pathologies of the skin and / or mucous membranes (for example the gums, periodonts, genital mucosa) and / or integuments (for example the hair and nails);
- des troubles vasculaires ; et - vascular disorders; and
- des altérations du tissu adipeux. - alterations in adipose tissue.
L'invention a en outre pour objet une méthode pour prévenir et/ou traiter : - des troubles ou pathologies de la peau et/ou des muqueuses (par exemples les gencives, parodontes, muqueuses génitales) et/ou des phanères (par exemples les cheveux et ongles) ; The invention further relates to a method for preventing and / or treating: - disorders or pathologies of the skin and / or mucous membranes (for example the gums, periodonts, genital mucosa) and / or integuments (for example the hair and nails);
- des troubles vasculaires ; et - vascular disorders; and
- des altérations du tissu adipeux, - alterations in adipose tissue,
comprenant l'administration, notamment l'administration topique, d'une quantité efficace d'un extrait selon l'invention ou d'un extrait susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention ou d'une composition selon l'invention, à un sujet en ayant besoin. comprising the administration, in particular the topical administration, of an effective amount of an extract according to the invention or of an extract capable of being obtained by the process according to the invention or of a composition according to the invention , to a subject in need.
En particulier, l'extrait selon l'invention ou l'extrait susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention ou la composition selon l'invention est destiné à la prévention et/ou au traitement des réactions ou pathologies allergiques, inflammatoires, irritatives ou des troubles de la barrière ou de l'homéostasie de la peau, des phanères (cheveux et ongles) et/ou des muqueuses (gencives, parodontes, muqueuses génitales) immature(s), normale(s) ou mature(s)/âgée(s). In particular, the extract according to the invention or the extract capable of being obtained by the process according to the invention or the composition according to the invention is intended for the prevention and / or treatment of allergic, inflammatory reactions or pathologies , irritants or disorders of the barrier or homeostasis of the skin, appendages (hair and nails) and / or mucous membranes (gums, periodonts, genital mucosa) immature (normal) or mature (s) ) / aged (s).
Avantageusement, la composition ou l'extrait selon l'invention peut être utilisé(e) pour la prévention et/ou le traitement des réactions, troubles ou pathologies : Advantageously, the composition or the extract according to the invention can be used for the prevention and / or the treatment of reactions, disorders or pathologies:
de la peau, telles que l'acné, la rosacée ou érythrocouperose, le psoriasis, les troubles vasculaires, la dermite du siège, la dermatite atopique, l'eczéma, la dermatite de contact, la dermatite irritative, la dermatite allergique, la dermite séborrhéique (croûte de lait), le psoriasis, la peau sensible, la peau réactive, la peau sèche (xérose), la peau déshydratée, la peau avec rougeur, l'érythème cutané, la peau âgée ou photoâgée, la peau photosensibilisée, la peau pigmentée (mélasma, pigmentation post-inflammatoire...), la peau dépigmentée (vitiligo), la peau avec cellulite, la peau relâchée, la peau avec vergetures, les dartres, les gerçures, les piqûres, les crevasses en particulier des seins, les coups de soleil, les inflammations dues aux rayons de toutes sortes, les irritations par agents chimiques, physiques (par exemple contrainte de tension pour les femmes enceintes), bactériologiques, fongiques ou viraux, parasitaires (poux, gale, teigne, acariens, dermatophytes), radiologiques ou par déficit de l'immunité innée (peptides antimicrobiens) ou acquise (cellulaire, humorales, cytokines), et/ou of the skin, such as acne, rosacea or erythrocouperosis, psoriasis, vascular disorders, seat dermatitis, atopic dermatitis, eczema, contact dermatitis, irritant dermatitis, allergic dermatitis, dermatitis seborrheic (crust of milk), psoriasis, sensitive skin, reactive skin, dry skin (xerosis), dehydrated skin, skin with redness, cutaneous erythema, aged or photoaged skin, photosensitized skin, pigmented skin (melasma, post-inflammatory pigmentation ...), depigmented skin (vitiligo), skin with cellulite, sagging skin, skin with stretch marks, scabs, chapped skin, bites, especially cracks in the breasts , sunburns, inflammations due to rays of all kinds, irritations by chemical, physical agents (for example tension stress for pregnant women), bacteriological, fungal or viral, parasitic (lice, scabies, ringworm, mites, dermatophytes), radiologi ques or by deficit of innate immunity (antimicrobial peptides) or acquired (cellular, humoral, cytokines), and / or
des muqueuses telles que les gencives et parodontes pouvant présenter des gingivites (gencives sensibles des nouveaux nés, problèmes d'hygiène, dus au tabagisme ou autres), des parodontopathies, ou des muqueuses génitales pouvant présenter des irritations des sphères génitales males ou femelles externes ou internes et/ou mucous membranes such as the gums and periodonts which can present gingivitis (sensitive gums of newborns, hygiene problems, due to smoking or others), periodontopathies, or genital mucous membranes which can present irritations of the external male or female genital spheres or internal and / or
des phanères tels que les ongles (ongles cassants, fragiles ...) et des cheveux (alopécie, pellicules, hirsutisme, dermites séborrhéiques, folliculites) immatures, normaux ou matures, présentant en particulier des troubles du cuir chevelu tels que les alopécies (ou pelade) androgénétiques, aiguës, localisées, cicatricielles, congénitales, occipitales du nourrisson, aerata, dues à la chimiothérapie/radiothérapie ou encore l'effluvium télogène, l'effluvium anagène, la dystrophie pilaire, la trichotillomanie, la teigne ou les pellicules grasses ou sèches. integuments such as nails (brittle, fragile nails ...) and hair (alopecia, dandruff, hirsutism, seborrheic dermatitis, folliculitis) immature, normal or mature, presenting in particular scalp disorders such as alopecia (or alopecia areata) androgenetic, acute, localized, scarring, congenital, occipital of the infant, aerata, due to chemotherapy / radiotherapy or telogen effluvium, anagen effluvium, hair dystrophy, trichotillomania, ringworm or oily or dry dandruff.
L'invention concerne également un procédé de soin cosmétique de la peau et/ou des phanères et/ou des muqueuses, en vue d'améliorer leur état et/ou leur aspect, consistant à administrer un extrait selon l'invention ou un extrait susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention ou une composition selon l'invention. The invention also relates to a method of cosmetic care of the skin and / or the integuments and / or mucous membranes, with a view to improving their condition and / or their appearance, consisting in administering an extract according to the invention or an extract capable to be obtained by the process according to the invention or a composition according to the invention.
En particulier, le procédé de soin cosmétique permet d'affermir la peau et de diminuer l'effet « peau d'orange » avantageusement par voie topique sur la peau et/ou phanères et/ou muqueuses. In particular, the cosmetic care process makes it possible to firm the skin and to reduce the “orange peel” effect advantageously topically on the skin and / or integuments and / or mucous membranes.
En particulier, l'invention concerne un procédé de soin cosmétique de la peau et/ou des phanères, pour agir sur l'élasticité ou la fermeté de la peau, en particulier comme agent tenseur ou anti-rides, pour agir sur les peaux sensibles, ou encore pour agir contre la pollution, consistant à appliquer sur la peau et/ou les phanères une composition ou un extrait selon la présente invention. In particular, the invention relates to a cosmetic care process for the skin and / or integuments, to act on the elasticity or firmness of the skin, in particular as a tightening or anti-wrinkle agent, to act on sensitive skin. , or also to act against pollution, consisting in applying to the skin and / or the integuments a composition or an extract according to the present invention.
En particulier, l'invention concerne un procédé de soin cosmétique de la peau et/ou des phanères, en vue d'en prévenir les altérations de la barrière et sa déshydratation, consistant à appliquer sur la peau et/ou les phanères une composition ou un extrait selon la présente invention. In particular, the invention relates to a cosmetic care process for the skin and / or the appendages, with a view to preventing alterations of the barrier and its dehydration, consisting in applying to the skin and / or the appendages a composition or an extract according to the present invention.
L'invention concerne un procédé de soin cosmétique de la peau, en vue d'en prévenir le vieillissement, consistant à appliquer sur la peau une composition ou un extrait selon la présente invention. The invention relates to a cosmetic skin care process, with a view to preventing aging thereof, consisting in applying to the skin a composition or an extract according to the present invention.
La composition ou l'extrait selon la présente invention peut également être avantageusement utilisée dans la prévention et/ou le traitement des troubles vasculaires, en particulier les rougeurs et les couperoses. The composition or extract according to the present invention can also be advantageously used in the prevention and / or treatment of vascular disorders, in particular redness and rosacea.
La composition ou l'extrait selon la présente invention peut également être avantageusement utilisée dans la prévention et/ou le traitement des altérations du tissu adipeux. Les altérations des tissus adipeux sont en particulier la cellulite ou l'effet « peau d'orange ». La composition selon l'invention permet d'affermir la peau. The composition or extract according to the present invention can also be advantageously used in the prevention and / or treatment of alterations in adipose tissue. The adipose tissue alterations are in particular cellulite or the "orange peel" effect. The composition according to the invention makes it possible to firm the skin.
La présente invention peut être illustrée de manière non-limitative par les exemples qui suivent. The present invention can be illustrated in a nonlimiting manner by the examples which follow.
DESCRIPTION DES FIGURES DESCRIPTION OF THE FIGURES
La Figure 1 représente les résultats de mesure d'intensité de l'érythème : comparatifs Actif/Placebo/Zone Non traitée. NS: différence non significative. *: p<0,05 (Exemple 3B). Figure 1 represents the measurement results of erythema intensity: Active / Placebo / Untreated Zone comparisons. NS: non-significant difference. *: p <0.05 (Example 3B).
La Figure 2 représente l'évolution dans le temps du flux sanguin (Exemple 3B). Figure 2 shows the evolution over time of the blood flow (Example 3B).
La Figure 3 représente les illustrations des résultats de PIE obtenus à D0 et D28 (Exemple 3C). Figure 3 shows the illustrations of the PIE results obtained at D0 and D28 (Example 3C).
La Figure 4 représente les illustrations des résultats d'hydratation obtenus à D0 et D28 (Example 3C). La Figure 5 représente les illustrations de la quantité de NMFs quantifiée à D0 et D28 (Example 3C). La Figure 6 représente les illustrations de la quantité de céramides quantifiée à DO et D28 (Example 3C). Figure 4 shows the illustrations of the hydration results obtained at D0 and D28 (Example 3C). Figure 5 shows the illustrations of the quantity of NMFs quantified at D0 and D28 (Example 3C). Figure 6 represents the illustrations of the quantity of ceramides quantified with DO and D28 (Example 3C).
La Figure 7 représente les illustrations de la quantité d'ILIRA quantifiée à DO et D28 (Example 3C). Figure 7 shows the illustrations of the amount of ILIRA quantified at DO and D28 (Example 3C).
La Figure 8 représente les illustrations du ratio Nile red/lnvolucrine à DO et D28 (Exemple 3C). Figure 8 shows the illustrations of the Nile red / lnvolucrine ratio at DO and D28 (Example 3C).
EXEMPLES EXAMPLES
Exemple 1 : extrait selon l'invention Example 1: extract according to the invention
Un extrait peptidique est obtenu selon le procédé suivant : A peptide extract is obtained according to the following process:
a) mise en solution de la micro-algue Chlamydomonas acidophila, à 10 % de matière sèche dans l'eau ; b) hydrolyse par une protéase alcaline (Alcalase de la société Lyven) ; a) dissolving the micro-alga Chlamydomonas acidophila, at 10% of dry matter in water; b) hydrolysis with an alkaline protease (Alcalase from the company Lyven);
c) traitement thermique à température comprise entre 80 °C et 100 °C afin de dénaturer les enzymes; c') centrifugation, ultrafiltration et diafiltration sur membranes 15 kDa afin d'éliminer les protéines résiduelles potentiellement allergisantes c) heat treatment at a temperature between 80 ° C and 100 ° C in order to denature the enzymes; c ') centrifugation, ultrafiltration and diafiltration on 15 kDa membranes in order to remove residual proteins which are potentially allergenic
c") nanofiltration sur membrane 200 Da afin d'éliminer des sels minéraux ou des acides aminés ou monosaccharides libres c ") nanofiltration on a 200 Da membrane in order to remove mineral salts or free amino acids or monosaccharides
d) récupération de l'extrait peptidique d) recovery of the peptide extract
e) Stabilisation dans un mélange glycérol / 1, 3 - propanediol e) Stabilization in a glycerol / 1, 3 - propanediol mixture
L'extrait peptidique liquide ainsi obtenu présente les caractéristiques suivantes : The liquid peptide extract thus obtained has the following characteristics:
1 - Analyse physico-chimique (% / matière sèche totale) 1 - Physico-chemical analysis (% / total dry matter)
Extrait sec (2h, 105 °C, étuve ventilée) : 1,2 % Dry extract (2h, 105 ° C, ventilated oven): 1.2%
pH : 5,1 pH: 5.1
Azote a-aminé (OPA, équivalent leucine) : 29 % Amino nitrogen (OPA, leucine equivalent): 29%
Peptides (Kjeldahl, N x 6.25) : 70 % Peptides (Kjeldahl, N x 6.25): 70%
Cendres totales : 4 % Total ash: 4%
2 - Profil des répartitions des masses molaires des peptides 2 - Profile of the molecular weight distributions of the peptides
Inférieur à 500 Da : 40 % Less than 500 Da: 40%
Entre 500 - 1000 Da : 55 % Between 500 - 1000 Da: 55%
Entre 1000 - 3500 Da : 4 % Between 1000 - 3500 Da: 4%
Supérieur à 3500 Da : 1 % Greater than 3500 Da: 1%
Exemple 2 : Tests d'activités biologiques de l'extrait selon l'invention lin vitro) L'activité biologique de l'extrait de Chlamydomonas acidophila (CAP) obtenu à l'exemple 1 a été démontrée in vitro comme décrit ci-après. Example 2: Tests of biological activities of the extract according to the invention in vitro) The biological activity of the extract of Chlamydomonas acidophila (CAP) obtained in Example 1 was demonstrated in vitro as described below.
Ces études in vitro ont permis de mettre en évidence le potentiel de l'extrait CAP sur : le renforcement de la barrière cutanée (en particulier la barrière lipidique) ; These in vitro studies made it possible to highlight the potential of the CAP extract on: the strengthening of the skin barrier (in particular the lipid barrier);
l'hydratation cutanée via la synthèse d'acide hyaluronique, la production des NMF et les voies de transport des osmolytes ; skin hydration via the synthesis of hyaluronic acid, the production of NMFs and the osmolyte transport routes;
les défenses anti-oxydantes et anti-inflammatoires vis-à-vis de stress aspécifiques ou liés à la pollution atmosphérique ; antioxidant and anti-inflammatory defenses against non-specific stresses or those linked to air pollution;
un effet anti-âge, notamment via la préservation de l'homéostasie de la matrice dermique ; les mécanismes de l'allergie. an anti-aging effect, in particular via the preservation of the homeostasis of the dermal matrix; mechanisms of allergy.
I. Screening préliminaire d'activité sur fibroblastes dermiques et épidermes reconstruits mélanisés I. Preliminary activity screening on dermal fibroblasts and melanized reconstructed epidermis
Les activités biologiques potentielles de l'extrait de Chlamydomonas acidophila ont été recherchées par un test de modulation d'expression de gènes sur fibroblastes dermiques et épidermes reconstruits mélanisés. Ainsi, l'expression de 96 gènes d'intérêts majeurs en physiologie cutanée et cosmétique a été étudiée par PCR-array sur des fibroblastes et des épidermes reconstruits mélanisés. The potential biological activities of the extract of Chlamydomonas acidophila were investigated by a test for modulation of gene expression on dermal fibroblasts and reconstructed melanized epidermis. Thus, the expression of 96 genes of major interest in skin and cosmetic physiology was studied by PCR-array on fibroblasts and reconstructed melanized epidermis.
a. Matériel et Méthodes : at. Material and methods :
L'extrait de Chlamydomonas acidophila (CAP) à 0,05 % de matière sèche a été ajouté dans le milieu de culture de fibroblastes dermiques humains normaux (NHDFs) ou d'épidermes humains mélanisés reconstitués. The extract of Chlamydomonas acidophila (CAP) at 0.05% dry matter was added to the culture medium for normal human dermal fibroblasts (NHDFs) or reconstituted melanized human epidermis.
Après 6 heures ou 24 heures d'incubation, l'expression des marqueurs sélectionnés a été évaluée par RT-PCR quantitative (carte microfluidique TaqMan). La variation d'expression des marqueurs étudiés par rapport au témoin a été exprimée en quantité relative (QR, QR > 1 : augmentation, QR < 1 : diminution). After 6 hours or 24 hours of incubation, the expression of the selected markers was evaluated by quantitative RT-PCR (TaqMan microfluidic card). The variation in expression of the markers studied compared to the control was expressed in relative quantity (QR, QR> 1: increase, QR <1: decrease).
b. Résultats : b. Results:
Les résultats les plus significatifs montrant l'effet de l'extrait CAP sur l'expression de gènes dans des épidermes reconstruits sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous. The most significant results showing the effect of the CAP extract on the expression of genes in reconstructed epidermis are presented in Table 1 below.
Tableau 1 : Variations de l'expression de gènes d'intérêt dans des épidermes humains reconstruits mélanisés Table 1: Variations in the expression of genes of interest in reconstructed melanized human epidermis
Quantité Relative (QR) par rapport au contrôle = 1 / p value déterminée suite à un test de Student Relative quantity (QR) compared to the control = 1 / p value determined following a Student test
Ces résultats tendent à montrer que l'extrait de Chlamydomonas acidophila, en faisant varier l'expression génique de certains marqueurs, pourrait avoir un intérêt particulier dans les activités suivantes : These results tend to show that the extract of Chlamydomonas acidophila, by varying the gene expression of certain markers, could have a particular interest in the following activities:
La synthèse et le remodelage des lipides dans la fonction barrière de l'épiderme : The synthesis and reshaping of lipids in the barrier function of the epidermis:
Le gène GBA/GBAP1 encodant l'enzyme Glucosylcéramidase ou b-glucocérébrosidase est sur exprimé après 6h de traitement avec CAP. The GBA / GBAP1 gene encoding the enzyme Glucosylceramidase or b-glucocerebrosidase is over expressed after 6 hours of treatment with CAP.
RAB11A code pour une GTPase (Ras-related protein Rab-llA) impliquée dans la biogenèse des corps lamellaires au sein de kératinocytes. Ceci souligne l'importance de RAB11A dans l'homéostasie de la barrière épidermique. RAB11A codes for a GTPase (Ras-related protein Rab-llA) involved in the biogenesis of lamellar bodies in keratinocytes. This underlines the importance of RAB11A in the homeostasis of the epidermal barrier.
La biosynthèse de l'acide hyaluronique et l'hydratation de l'épiderme : Biosynthesis of hyaluronic acid and hydration of the epidermis:
Les hyaluronan-synthases-2 et -3 (HAS2 et HAS3) sont des enzymes responsables de la synthèse d'acide hyaluronique (AH). Hyaluronan synthases-2 and -3 (HAS2 and HAS3) are enzymes responsible for the synthesis of hyaluronic acid (HA).
- L'expression graduelle de SLC6A6 dans les couches spineuse et granuleuse de l'épiderme permet de maintenir l'hydratation nécessaire au niveau de l'épiderme dans un environnement sec. - The gradual expression of SLC6A6 in the spinous and granular layers of the epidermis makes it possible to maintain the necessary hydration at the level of the epidermis in a dry environment.
Les gènes PADI1, BLMH, CASP14 codent pour des enzymes impliquées dans la production des facteurs naturels d'hydratation (ou NMF pour Natural Moisturizing Factors). The PADI1, BLMH, CASP14 genes code for enzymes involved in the production of natural hydration factors (or NMF for Natural Moisturizing Factors).
Le tableau 2 ci-après présente les résultats les plus significatifs de l'extrait CAP sur l'expression de gènes dans des fibroblastes. Table 2 below presents the most significant results of the CAP extract on the expression of genes in fibroblasts.
Tableau 2 : Variations de l'expression de gènes d'intérêt dans des fibroblastes dermiques humains normaux (NHDFs) Quantité Relative (QR) par rapport au contrôle égal 1 / p value déterminée suite à un test de Student Table 2: Variations in the expression of genes of interest in normal human dermal fibroblasts (NHDFs) Relative quantity (QR) compared to the equal control 1 / p value determined following a Student test
Ces résultats montrent un potentiel d'activité de l'extrait CAP dans les axes suivants : Anti-vieillissement cutané : These results show the activity potential of the CAP extract in the following areas: Skin anti-aging:
- Les trois hyaluronan-synthases, HAS1, HAS2 (5,76 0,008) et HAS3, produites par les fibroblastes au niveau du derme sont responsables de la biosynthèse de l'acide hyaluronique (AH). - The three hyaluronan synthases, HAS1, HAS2 (5.76 0.008) and HAS3, produced by fibroblasts in the dermis are responsible for the biosynthesis of hyaluronic acid (AH).
- Par ailleurs, il est démontré que le vieillissement cutané est associé à la diminution de la prolifération des fibroblastes. On observe une diminution d'expression du facteur de prolifération Ki-67 liée à l'âge [Ma et al., 2011 Br. J. Dermatol., 164(3), pp. 479-482], L'actif CAP augmente l'expression de MKI67 après 24h de traitement témoignant d'une possible augmentation de la prolifération des cellules, ce qui renforce son effet anti-âge. - Furthermore, it has been shown that skin aging is associated with a decrease in the proliferation of fibroblasts. A decrease in expression of the proliferation factor Ki-67 is observed, linked to age [Ma et al., 2011 Br. J. Dermatol., 164 (3), pp. 479-482], the active CAP increases the expression of MKI67 after 24 hours of treatment, testifying to a possible increase in cell proliferation, which reinforces its anti-aging effect.
- Il a été montré que l'expression de la lamine B1 (LMNB1) au sein de la peau diminue avec l'âge. Les défenses anti-oxydantes : - It has been shown that the expression of lamin B1 (LMNB1) within the skin decreases with age. Antioxidant defenses:
- La NAD(P)H déshydrogénase, quinone 1 (NQOl) est une flavoprotéine cytosolique sous le contrôle du facteur de transcription Nrf-2. NQOl favorise, par réduction, la formation des hydroquinones à partir des quinones, empêchant la production d'espèces radicalaires. - La protéine HSP70 (encodée par le gène HSPA1A) est une molécule chaperone (heat shock protein 70) qui inhibe l'agrégation des protéines dénaturées, favorise leur renaturation (refolding) et contrôle des médiateurs essentiels de la machinerie apoptotique. - NAD (P) H dehydrogenase, quinone 1 (NQOl) is a cytosolic flavoprotein under the control of the transcription factor Nrf-2. NQOl promotes, by reduction, the formation of hydroquinones from quinones, preventing the production of radical species. - The HSP70 protein (encoded by the HSPA1A gene) is a chaperone molecule (heat shock protein 70) which inhibits the aggregation of denatured proteins, promotes their renaturation (refolding) and controls essential mediators of the apoptotic machinery.
- Le système thiorédoxine est un des systèmes majeurs de défense anti-oxydante. Parmi les 3 isoformes de la thioredoxine réductase, l'isoforme 1 codée par le gène TXNRD1 régulé par l'extrait CAP est la plus étudiée. - The thioredoxin system is one of the major antioxidant defense systems. Among the 3 isoforms of thioredoxine reductase, isoform 1 encoded by the TXNRD1 gene regulated by the CAP extract is the most studied.
- A côté du système thiorédoxine, on retrouve également le système peroxyrédoxine / sulfirodoxine. Parmi les peroxyrédoxines, la peroxyrédoxine-6 (PRDX6) est surexprimée par l'extrait CAP après 24h de traitement. Ceci témoigne d'une action détoxifiante de l'actif vis-à-vis de la présence de peroxydes. - Besides the thioredoxin system, there is also the peroxyredoxin / sulfirodoxin system. Among the peroxyredoxins, peroxyredoxin-6 (PRDX6) is overexpressed by the CAP extract after 24 hours of treatment. This shows a detoxifying action of the active ingredient vis-à-vis the presence of peroxides.
- Enfin l'extrait CAP stimule le gène GLOl, qui fait partie du système GLO qui détecte et neutralise certains carbonyles, et les empêche ainsi d'attaquer les cellules et leurs composants. - Finally, the CAP extract stimulates the GLOl gene, which is part of the GLO system which detects and neutralizes certain carbonyls, and thus prevents them from attacking cells and their components.
L'homéostasie de la matrice dermique : Homeostasis of the dermal matrix:
- L'extrait CAP stimule l'expression de PSMB1, gène codant pour la sous-unité béta 1 du protéasome. Le protéasome joue un rôle majeur dans le maintien de l'homéostasie protéique en éliminant les protéines endommagées ou malformées qui pourraient altérer le fonctionnement cellulaire. - The CAP extract stimulates the expression of PSMB1, a gene coding for the beta 1 subunit of the proteasome. The proteasome plays a major role in the maintenance of protein homeostasis by eliminating damaged or malformed proteins that could alter cell functioning.
- L'expression génique de LOXL2 est également augmentée, ce gène fait partie de la famille des Lysyl oxidases, enzymes impliquées dans l'assemblage des fibres d'élastine et de collagène. - The gene expression of LOXL2 is also increased, this gene is part of the family of Lysyl oxidases, enzymes involved in the assembly of elastin and collagen fibers.
II. Action anti-inflammatoire II. Anti-inflammatory action
A. Activité anti-inflammatoire vis-à-vis d'un stress chimique au PMA A. Anti-inflammatory activity against chemical stress at PMA
a. Introduction : at. Introduction:
La réponse inflammatoire est la réponse normale, immédiate et transitoire de l'organisme vis à vis de toute agression de l'environnement. The inflammatory response is the normal, immediate and transient response of the body to any attack on the environment.
Cependant, dans certaines conditions pathologiques ou physiologiques, cette réaction inflammatoire peut être exacerbée et, mal contrôlée, peut conduire à des dommages tissulaires. However, under certain pathological or physiological conditions, this inflammatory reaction can be exacerbated and, if poorly controlled, can lead to tissue damage.
Au niveau de la peau, le kératinocyte est l'une des premières cellules participant à l'initiation de la réaction inflammatoire en réponse à une agression de l'environnement. In the skin, the keratinocyte is one of the first cells participating in the initiation of the inflammatory reaction in response to an attack on the environment.
Le kératinocyte « agressé » va alors relarguer : The “attacked” keratinocyte will then release:
- des cytokines primaires (ILla, Iίΐb ou TNFa) ou secondaires (IL8) qui vont induire une cascade de réactions impliquant le système immunitaire. - des prostaglandines (PGE), qui font partie de la famille des prostanoïdes. La voie de synthèse des prostaglandines qui aboutit à la synthèse de la PGE2 et d'autres PGEs est induite par des stimuli inflammatoires. - primary (ILla, Iίΐb or TNFa) or secondary (IL8) cytokines which will induce a cascade of reactions involving the immune system. - prostaglandins (PGE), which are part of the prostanoid family. The prostaglandin synthesis pathway that leads to the synthesis of PGE2 and other PGEs is induced by inflammatory stimuli.
L'activité anti-inflammatoire de l'extrait de Chlamydomonas acidophila selon l'invention a été évaluée sur un modèle d'inflammation induite sur kératinocytes par un traitement au PMA (Phorbol 12- Myristate 13-Acetate). Le relargage des cytokines TNFa et Prostaglandine E2 (PGE2) a été analysé. b. Matériels et Méthodes : The anti-inflammatory activity of the extract of Chlamydomonas acidophila according to the invention was evaluated on a model of inflammation induced on keratinocytes by treatment with PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate). The release of TNFα and Prostaglandin E2 (PGE2) cytokines was analyzed. b. Materials and methods :
Des kératinocytes épidermiques humaines normaux ont été pré-traités pendant 24 h par l'extrait de Chlamydomonas acidophila (CAP) selon l'exemple 1, à des concentrations comprises entre 0,0001 % et 0,05 % de matière sèche, ou par les molécules de références anti-inflammatoires dexaméthasone à 0,1 mM ou indométacine à 0,1 pM (ces deux dernières références servant de référence anti inflammatoire pour les cytokines et prostaglandines respectivement). Normal human epidermal keratinocytes were pretreated for 24 h with the extract of Chlamydomonas acidophila (CAP) according to Example 1, at concentrations of between 0.0001% and 0.05% of dry matter, or with anti-inflammatory reference molecules dexamethasone at 0.1 mM or indomethacin at 0.1 pM (the latter two references serving as anti-inflammatory reference for cytokines and prostaglandins respectively).
L'inflammation a ensuite été induite par ajout de PMA à 10 pg/mL pendant une nuit. The inflammation was then induced by adding PMA at 10 pg / mL overnight.
Un dosage de TNFa et PGE2 a ensuite été réalisé dans les surnageants de culture cellulaire. An assay of TNFα and PGE2 was then carried out in the cell culture supernatants.
La significativité des résultats a été vérifiée par une analyse de variance à un facteur suivie d'un test de Tuckey (logiciel GraphPad Prism version 5.02, GraphPad Software, San Diego California USA). c. Résultats : The significance of the results was verified by a one-factor analysis of variance followed by a Tuckey test (GraphPad Prism software version 5.02, GraphPad Software, San Diego California USA). vs. Results:
Le PMA à 10 pg/ml a significativement augmenté le relargage de TNFa dans les surnageants des kératinocytes et a donc bien induit une inflammation. La dexaméthasone à 0,1 pM et l'indométacine 0,1 pM, en prétraitement 24 h, ont bien diminué le relargage de TNFa, démontrant ainsi leur effet anti-inflammatoire et validant le test. The PMA at 10 pg / ml significantly increased the release of TNFα into the supernatants of keratinocytes and therefore induced inflammation well. 0.1 pM dexamethasone and 0.1 pM indomethacin, 24 h pretreatment, significantly reduced the release of TNFa, thus demonstrating their anti-inflammatory effect and validating the test.
L'extrait de Chlamydomonas acidophila, en prétraitement 24h aux différentes concentrations, a diminué significativement le relargage de TNFa et donc a montré une action anti-inflammatoire face au PMA. The extract of Chlamydomonas acidophila, in 24h pre-treatment at different concentrations, significantly reduced the release of TNFa and therefore showed an anti-inflammatory action against PMA.
Tableau 3 : Dosage de TNF-alpha dans des kératinocytes humains normaux stimulés par du PMATable 3: Determination of TNF-alpha in normal human keratinocytes stimulated by PMA
$$$p < 0,001 vs Contrôle / ***p < 0,001 vs PMA- ANOVA à un facteur suivi d'un test de Tukey $$$ p <0.001 vs Control / *** p <0.001 vs PMA- ANOVA to a factor followed by a Tukey test
Le PMA à 10 pg/ml a significativement augmenté le relargage de la PGE2 dans les surnageants des kératinocytes donc le PMA a bien induit une inflammation. L'indométacine et la dexaméthasone à 0,1 mM, en prétraitement 24 h, ont significativement diminué le relargage de PGE2. L'effet anti inflammatoire de ces deux références a donc bien été validé. PMA at 10 pg / ml significantly increased the release of PGE2 in the supernatants of keratinocytes, therefore PMA did induce inflammation. Indomethacin and dexamethasone 0.1 mM, in 24 h pretreatment, significantly reduced the release of PGE2. The anti-inflammatory effect of these two references has therefore been validated.
L'extrait de Chlamydomonas acidophila, en prétraitement 24 h aux deux concentrations, a diminué significativement le relargage de PGE2 et donc a montré une action anti-inflammatoire face au PMA. The extract of Chlamydomonas acidophila, as a 24-hour pretreatment at the two concentrations, significantly reduced the release of PGE2 and therefore showed an anti-inflammatory action against PMA.
Tableau 4 : Dosage de PGE2 dans des kératinocytes humains normaux stimulés par du PMA Table 4: Determination of PGE2 in normal human keratinocytes stimulated by PMA
$$$ p < 0,001 vs contrôle/ **p < 0,01 ; ***p < 0,001 vs PMA - ANOVA à 1 facteur suivi d'un test Tukey $$$ p <0.001 vs control / ** p <0.01; *** p <0.001 vs PMA - 1-factor ANOVA followed by a Tukey test
d. Conclusion : d. Conclusion:
L'effet anti-inflammatoire de l'extrait de Chlamydomonas acidophila a été mis en évidence grâce à son action sur le relargage de TNFa et de la prostaglandine E2 en condition inflammatoire. The anti-inflammatory effect of the extract of Chlamydomonas acidophila was highlighted thanks to its action on the release of TNFa and prostaglandin E2 in inflammatory conditions.
B. Activité anti-inflammatoire vis-à-vis d'un stress au Nickel B. Anti-inflammatory activity against nickel stress
a. Introduction at. Introduction
Le Nickel est la cause majeure de dermatite allergique de contact dans la population, avec une prévalence mondiale d'environ 8,6 % L'objectif de l'étude décrite ci-après est d'évaluer l'effet de l'extrait CAP sur le relargage d'IL8 par des kératinocytes stimulés au Nickel. Nickel is the major cause of allergic contact dermatitis in the population, with a global prevalence of around 8.6% The objective of the study described below is to assess the effect of the CAP extract on the release of IL8 by nickel-stimulated keratinocytes.
b. Matériel et méthodes b. Material and methods
Des kératinocytes épidermiques humains normaux ont été pré-traités 24 heures par l'extrait CAP à 0,01 % et 0,05 % de matière sèche ou par la molécule de référence anti-inflammatoire Dexaméthasone à 1 mM. Les kératinocytes ont ensuite été traités pendant 24 heures par du Nickel : NiS04 à IOmM. A la fin de l'incubation, la quantité d'IL8 produite par les cellules a été évaluée par un test ELISA dans les surnageants. Normal human epidermal keratinocytes were pretreated for 24 hours with the extract of CAP at 0.01% and 0.05% of dry matter or with the anti-inflammatory reference molecule Dexamethasone at 1 mM. The keratinocytes were then treated for 24 hours with Nickel: NiS0 4 at 10 mM. At the end of the incubation, the amount of IL8 produced by the cells was evaluated by an ELISA test in the supernatants.
La concentration en IL8 dosée a été normalisée par rapport à la quantité de protéines totales intracellulaires évaluée par BC Assay. The IL8 concentration assayed was normalized with respect to the amount of total intracellular proteins evaluated by BC Assay.
La significativité des résultats a été analysée statistiquement par un test t de Student. The significance of the results was analyzed statistically by a Student's t-test.
c. Résultats vs. Results
L'extrait CAP induit une diminution significative du relargage d'IL8 induit par un stress au Nickel dans des kératinocytes. The CAP extract induces a significant reduction in the release of IL8 induced by nickel stress in keratinocytes.
Tableau 5 : Dosage d'IL8 dans des kératinocytes humains normaux stimulés par du NiS04 Table 5: Determination of IL8 in normal human keratinocytes stimulated with NiS0 4
d. Conclusion L'extrait de Chlamydomonas acidophila (CAP) inhibe le relargage d'une cytokine majeure, l'IL8, dans le contexte d'un stress inflammatoire induit par le Nickel. L'extrait présente donc un intérêt dans le contexte de l'allergie de contact ou de l'hypersensibilité cutanée liée par le Nickel. d. Conclusion The extract of Chlamydomonas acidophila (CAP) inhibits the release of a major cytokine, IL8, against the background of inflammatory stress induced by Nickel. The extract is therefore of interest in the context of contact allergy or skin hypersensitivity linked by Nickel.
C. Activité anti-inflammatoire vis-à-vis d'un stress au Cadmium C. Anti-inflammatory activity against Cadmium stress
a. Introduction at. Introduction
L'objectif de cette étude est d'évaluer l'activité anti-inflammatoire de l'extrait Chlamydomonas acidophila (CAP) vis-à-vis d'un stress aux métaux lourds, représenté par le Cadmium, sur des kératinocytes humains normaux. The objective of this study is to evaluate the anti-inflammatory activity of the extract Chlamydomonas acidophila (CAP) vis-à-vis a stress with heavy metals, represented by Cadmium, on normal human keratinocytes.
b. Matériel et méthodes b. Material and methods
Des kératinocytes épidermiques humains normaux ont été pré-traités 24 heures par l'extrait CAP à 0,001 % et 0,01 % de matière sèche ou par la molécule de référence anti-inflammatoire Indométhacine à 0,1 mM. Les kératinocytes ont ensuite été traités pendant 48 heures par du Cadmium : CdCI2 à 100 pM. A la fin de l'incubation, la quantité de PGE2 produite par les cellules a été évaluée par un test ELISA dans les surnageants. Normal human epidermal keratinocytes were pretreated for 24 hours with the extract of 0.001% CAP and 0.01% of dry matter or with the anti-inflammatory reference molecule Indomethacin at 0.1 mM. The keratinocytes were then treated for 48 hours with Cadmium: CdCI 2 at 100 pM. At the end of the incubation, the amount of PGE2 produced by the cells was evaluated by an ELISA test in the supernatants.
La concentration en PGE2 dosée a été normalisée par rapport à la quantité de protéines totales intracellulaires évaluée par BC Assay. The PGE2 concentration assayed was normalized with respect to the amount of total intracellular proteins evaluated by BC Assay.
c. Résultats vs. Results
L'extrait CAP induit une diminution du relargage de PGE2 induit par un stress au Cadmium dans des kératinocytes. The CAP extract induces a decrease in the release of PGE2 induced by Cadmium stress in keratinocytes.
Tableau 6 : Dosage de PGE2 dans des kératinocytes humains normaux stimulés par du Cadmium Table 6: Determination of PGE2 in normal human keratinocytes stimulated by Cadmium
d. Conclusion d. Conclusion
L'extrait de Chlamydomonas acidophila (CAP) inhibe la production de Prostaglandine E2 (PGE2) induite par un stress au Cadmium. L'extrait apporte donc une protection de la peau vis-à-vis d'un stress aux métaux lourds, dans le cadre de la pollution environnementale par exemple. D. Activité anti-inflammatoire vis-à-vis d'un stress au SDS The extract of Chlamydomonas acidophila (CAP) inhibits the production of Prostaglandin E2 (PGE2) induced by Cadmium stress. The extract therefore provides protection for the skin against heavy metal stress, for example in the context of environmental pollution. D. Anti-inflammatory activity against stress in the SDS
a. Introduction at. Introduction
L'activité anti-inflammatoire de l'extrait de Chlamydomonas acidophila (CAP) a été évaluée sur un modèle d'inflammation induite par un traitement au SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) sur épidermes reconstitués. The anti-inflammatory activity of the extract of Chlamydomonas acidophila (CAP) was evaluated on a model of inflammation induced by treatment with SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) on reconstituted epidermis.
b. Matériel et méthodes b. Material and methods
Des épidermes humains reconstruits (ou RHE pour Reconstructed Human Epidermis) ont été pré incubés pendant 24 heures en présence de CAP à 0,01 % et 0,05 % de matière sèche. Du SDS à 0,025 % a ensuite été appliqué à la surface des épidermes qui ont de nouveau été incubés 24 heures, toujours en présence de l'extrait CAP. Reconstructed Human Epidermis (RHE) were preincubated for 24 hours in the presence of 0.01% CAP and 0.05% dry matter. 0.025% SDS was then applied to the surface of the epidermis which was again incubated for 24 hours, still in the presence of the CAP extract.
A l'issue de l'incubation, la cytokine TNFa (Tumor Necrosis Factor alpha) a été dosée par ELISA dans les surnageants. After the incubation, the TNFα cytokine (Tumor Necrosis Factor alpha) was assayed by ELISA in the supernatants.
L'expression génique de marqueurs inflammatoires et de la barrière a été évaluée en qRT-PCR. The gene expression of inflammatory markers and of the barrier was evaluated by qRT-PCR.
La significativité des résultats a été analysée statistiquement par une Analyse de Variance à un facteur suivie par un test de Tukey. The significance of the results was analyzed statistically by a one-factor Variance Analysis followed by a Tukey test.
c. Résultats vs. Results
Le traitement des épidermes reconstruits par le SDS induit une augmentation de l'expression du TNFa au niveau génique (qRT-PCR, tableau 8) et protéique (ELISA, tableau 7). Cet effet pro-inflammatoire s'accompagne également d'une diminution de l'expression de la kératine 1 (KRT1) (tableau 8), témoignant d'une altération de la fonction de barrière épidermique. The treatment of epidermis reconstructed by SDS induces an increase in TNFα expression at the gene (qRT-PCR, table 8) and protein (ELISA, table 7) level. This pro-inflammatory effect is also accompanied by a decrease in the expression of keratin 1 (KRT1) (Table 8), reflecting a deterioration in the epidermal barrier function.
Dans ces conditions, l'extrait CAP a significativement inhibé la surproduction de TNFa et a augmenté l'expression de la kératine 1. Under these conditions, the CAP extract significantly inhibited the overproduction of TNFα and increased the expression of keratin 1.
Tableau 7 : Dosage du TNFa produit par des épidermes humains reconstruits stimulés par du SDS Table 7: Determination of TNFα produced by reconstructed human epidermis stimulated by SDS
Tableau 8 : Expression génique dans des épidermes humains reconstruits stimulés par du SDS Table 8: Gene expression in reconstructed human epidermis stimulated by SDS
*p < 0,05 ; ***p < 0,001 - ANOVA à un facteur suivi d'un test de Tukey * p <0.05; *** p <0.001 - One-factor ANOVA followed by a Tukey test
d. Conclusion d. Conclusion
Ces résultats confirment le potentiel anti-inflammatoire de l'extrait de Chlamydomonas acidophila et montrent sa capacité à protéger la barrière d'un stress externe. These results confirm the anti-inflammatory potential of the extract of Chlamydomonas acidophila and show its capacity to protect the barrier from external stress.
III. Action anti-oxydante III. Antioxidant action
a. Introduction at. Introduction
Le screening d'expression génique réalisé sur l'extrait de Chlamydomonas acidophila selon l'exemple 1 ayant montré un potentiel dans la stimulation des défenses anti-oxydantes ; la capacité à protéger la cellule d'un stress oxydatif a été évalué par mesure de la production d'espèces réactives de l'oxygène (ERO ou ROS pour Reactive Oxygen Species) dans des kératinocytes soumis à un stress oxydatif induit par IΉ2O2. The gene expression screening carried out on the extract of Chlamydomonas acidophila according to Example 1 having shown a potential in the stimulation of antioxidant defenses; the ability to protect the cell from oxidative stress was evaluated by measuring the production of reactive oxygen species (ERO or ROS for Reactive Oxygen Species) in keratinocytes subjected to oxidative stress induced by IΉ2O2.
L'évaluation de l'effet anti-oxydant de l'actif se fait grâce à l'incorporation de DCFH-DA (2', 7'- Dichlorofluorescin diacétate) dans des kératinocytes en culture. Cette molécule est un marqueur non fluorescent à l'état non oxydé. En condition oxydante (ici stress H2O2), le DCFH-DA va être dégradé en DCF, molécule qui va émettre de la fluorescence. La fluorescence ainsi mesurée sera proportionnelle à la quantité d'espèces réactives de l'oxygène produites par la cellule en présence de H2O2 et/ou de l'extrait. The antioxidant effect of the active ingredient is evaluated by the incorporation of DCFH-DA (2 ′, 7 ′ - Dichlorofluorescin diacetate) in cultured keratinocytes. This molecule is a non-fluorescent marker in the non-oxidized state. In oxidative conditions (here H2O2 stress), DCFH-DA will be degraded into DCF, a molecule which will emit fluorescence. The fluorescence thus measured will be proportional to the quantity of reactive oxygen species produced by the cell in the presence of H2O2 and / or of the extract.
b. Matériels et Méthodes b. Materials and methods
Des kératinocytes épidermiques humains normaux ont été pré-incubés pendant 24 heures en présence de l'extrait CAP à 0,0001% de matière sèche, de Quercétine à 10 mM ou de Vitamine C à 500 pM (ces deux dernières molécules servant de référence anti-oxydante). Normal human epidermal keratinocytes were pre-incubated for 24 hours in the presence of the extract CAP at 0.0001% of dry matter, Quercetin at 10 mM or Vitamin C at 500 pM (these last two molecules serving as anti reference -oxidizing).
Les cellules sont ensuite traitées lh en présence de DCFH-DA à 0,5 mM. L'oxydation est induite par ajout de H2O2 à 100 mM pendant 20 minutes. Un deuxième traitement par les produits testés est effectué simultanément au stress H2O2 (aux mêmes concentrations que le pré traitement). The cells are then treated for 1 h in the presence of DCFH-DA at 0.5 mM. Oxidation is induced by adding H2O2 at 100 mM for 20 minutes. A second treatment with the tested products is carried out simultaneously with H2O2 stress (at the same concentrations as the pre-treatment).
Enfin, une mesure de la densité de fluorescence (DFU) correspondant à la quantité d'ERO est réalisée à l'aide d'un lecteur microplaque. Finally, a measurement of the fluorescence density (DFU) corresponding to the quantity of ERO is carried out using a microplate reader.
La significativité des résultats a été vérifiée par une analyse de variance à un facteur suivie d'un test de Tuckey (logiciel GraphPad Prism version 5.02, GraphPad Software, San Diego California USA). c. Résultats The significance of the results was verified by a one-factor analysis of variance followed by a Tuckey test (GraphPad Prism software version 5.02, GraphPad Software, San Diego California USA). vs. Results
Une augmentation de la production des ERO a été observée après traitement par IΉ2O2 validant ainsi le modèle. La Quercétine et la Vitamine C ont significativement diminué la production des ERO suite au traitement par H2O2. L'effet anti-oxydant de ces deux références a bien été validé sur le modèle. L'extrait de Chlamydomonas acidophila a significativement diminué la production des ERO induits par un stress H2O2. An increase in the production of ERO was observed after treatment with IΉ2O2 thus validating the model. Quercetin and Vitamin C significantly reduced the production of ERO following treatment with H2O2. The antioxidant effect of these two references has been validated on the model. The extract of Chlamydomonas acidophila significantly decreased the production of ERO induced by H2O2 stress.
Tableau 9 : Production d'espèces réactives de l'oxygène (ERO) dans des kératinocytes traités par le peroxyde d'hydrogène (H2O2) Table 9: Production of reactive oxygen species (ERO) in keratinocytes treated with hydrogen peroxide (H 2 O 2 )
*** p < 0,001 - ANOVA à un facteur suivie d'un test de Tuckey *** p <0.001 - One-factor ANOVA followed by a Tuckey test
d. Conclusion : d. Conclusion:
L'extrait de Chlamydomonas acidophila a démontré un effet anti-oxydant face un stress induit par H202. The extract of Chlamydomonas acidophila has demonstrated an antioxidant effect against stress induced by H 2 0 2 .
IV. Activité sur la barrière et l'hydratation IV. Barrier and hydration activity
a. Introduction at. Introduction
Le screening d'expression génique réalisé sur l'extrait de Chlamydomonas acidophila et présenté précédemment a montré un potentiel effet sur la stimulation de l'expression des marqueurs géniques impliqués dans la barrière et l'hydratation. Nous avons cherché à confirmer cet effet sur des kératinocytes. The gene expression screening performed on the extract of Chlamydomonas acidophila and presented previously showed a potential effect on the stimulation of the expression of gene markers involved in barrier and hydration. We sought to confirm this effect on keratinocytes.
b. Matériel et méthodes b. Material and methods
Des kératinocytes épidermiques humains normaux ont été incubés pendant 48 heures en présence de l'extrait CAP à 0,001 % de matière sèche. Normal human epidermal keratinocytes were incubated for 48 hours in the presence of the extract CAP at 0.001% dry matter.
L'expression génique des marqueurs de la fonction barrière et de l'hydratation a été évaluée par qRT- PCR. The gene expression of the markers of the barrier function and of the hydration was evaluated by qRT-PCR.
Les résultats ont été analysés statistiquement par une Analyse de Variance à un facteur suivie d'un test de Dunnett. The results were analyzed statistically by a one-factor Variance Analysis followed by a Dunnett test.
c. Résultats vs. Results
L'extrait de Chlamydomonas acidophila a stimulé l'expression génique des marqueurs GBA (Beta- Glucocérébrosidase) et HAS3 (Hyaluronane Synthase 3) impliqués respectivement dans la synthèse des lipides épidermiques et dans la synthèse de l'acide hyaluronique. Ces résultats, en faveur d'un effet de renforcement de la barrière perméable épidermique et de l'hydratation, confirment les tendances observées dans le cadre du screening d'expression génomique. The extract of Chlamydomonas acidophila stimulated the gene expression of the markers GBA (Beta-Glucocerebrosidase) and HAS3 (Hyaluronane Synthase 3) involved respectively in the synthesis of epidermal lipids and in the synthesis of hyaluronic acid. These results, in favor of a strengthening effect of the permeable epidermal barrier and of hydration, confirm the trends observed in the context of genomic expression screening.
Par ailleurs, l'extrait de Chlamydomonas acidophila a également stimulé l'expression des marqueurs SLC6A6 et SLC5A3, codant respectivement pour TAUT (canal transporteur membranaire de la taurine) et SMIT (canal transporteur du myoinositol). Furthermore, the extract of Chlamydomonas acidophila also stimulated the expression of the markers SLC6A6 and SLC5A3, coding for TAUT (taurine membrane transport channel) and SMIT (myoinositol transport channel) respectively.
Ces deux gènes codent pour des transporteurs d'osmolytes, ils sont donc impliqués dans le maintien de l'hydratation de la peau et la protection des cellules vis-à-vis de stress externes. These two genes code for osmolyte transporters, they are therefore involved in maintaining skin hydration and protecting cells from external stress.
Enfin l'extrait a induit une augmentation de l'expression génique de la Filagrine (FLG) et de PADI1 (Peptidyl Arginine Deiminase), protéine et enzyme impliqués dans la synthèse des éléments des facteurs naturels d'hydratation (NMF). Tableau 10 : Expression génique de marqueurs de la barrière et de l'hydratation dans des kératinocytes Finally, the extract induced an increase in the gene expression of Filagrine (FLG) and PADI1 (Peptidyl Arginine Deiminase), protein and enzyme involved in the synthesis of elements of natural hydration factors (NMF). Table 10: Gene expression of barrier and hydration markers in keratinocytes
*p < 0,05 - ANOVA à un facteur suivi d'un test de Dunnett * p <0.05 - One-factor ANOVA followed by a Dunnett test
d. Conclusion d. Conclusion
Ces résultats montrent que l'extrait de Chlamydomonas acidophila a un potentiel dans le renforcement de la barrière cutanée et le maintien de l'hydratation cutanée. These results show that the extract of Chlamydomonas acidophila has a potential in strengthening the skin barrier and maintaining skin hydration.
V. Evaluation des effets de l'extrait de Chlamydomonas acidophila dans les mécanismes de l'allergie A. Introduction V. Evaluation of the effects of the extract of Chlamydomonas acidophila in the mechanisms of allergy A. Introduction
Les potentiels effets anti-allergiques de l'extrait de Chlamydomonas acidophila ont été recherchés sur : The potential anti-allergic effects of Chlamydomonas acidophila extract have been researched on:
- L'expression génique de chimiokines pro-inflammatoires dans des kératinocytes épidermiques humains normaux (NHEK) stimulés par un mélange de cytokines Th2 (IL-4 + IL-13 + IL-22 + TNF-a) reproduisant un phénotype de type « dermatite atopique » de phase tardive (inflammation chronique). - Gene expression of pro-inflammatory chemokines in normal human epidermal keratinocytes (NHEK) stimulated by a mixture of Th2 cytokines (IL-4 + IL-13 + IL-22 + TNF-a) reproducing a phenotype of the "dermatitis" type atopic "late phase (chronic inflammation).
- L'activation de basophiles humains induite par le fMLP. Cette activation a été mesurée à l'aide d'un kit spécifique et d'une analyse par cytométrie en flux en quantifiant un marqueur spécifique des cellules basophiles activées (CD63) dans la population totale des basophiles identifiés par l'expression du marqueur CCR3. En parallèle, une activation par l'anticorps anti-FCeRI a été réalisée comme contrôle positif. - Activation of human basophils induced by fMLP. This activation was measured using a specific kit and analysis by flow cytometry by quantifying a specific marker for activated basophil cells (CD63) in the total population of basophils identified by the expression of the CCR3 marker. In parallel, an activation by the anti-FCeRI antibody was carried out as a positive control.
B. Inhibition de facteurs chémoattractants suite à un stress TH2 B. Inhibition of chemoattractants following TH2 stress
a. Matériel et méthodes at. Material and methods
Des kératinocytes épidermiques humains normaux ont été pré-incubés pendant 24 heures en présence de l'extrait CAP à 0,01 % de matière sèche (ms) ou de la référence JAK Inhibitor I à 10 mM. Après la pré incubation, le traitement des cellules par l'extrait CAP ou la référence a été renouvelé puis les cellules ont été stimulées par un cocktail de cytokines Th2 (IL4+IL13+IL22+TNFa à 10 ng/ml) pendant 24 heures. A l'issue de l'incubation, l'expression génique des marqueurs d'intérêt a été évaluée par qRT-PCR. b. Résultats Dans des kératinocytes soumis à un stress Th2, l'extrait de Chlamydomonas acidophila a inhibé l'expression génique de CCL5 (C-C motif chemokine ligand 5 ou RANTES) et CCL27 (C-C motif chemokine ligand 27), codant pour des chimiokines impliquées dans l'amplification de la réaction inflammatoire et allergique cutanée. Normal human epidermal keratinocytes were pre-incubated for 24 hours in the presence of the extract CAP at 0.01% dry matter (ms) or the reference JAK Inhibitor I at 10 mM. After the pre-incubation, the cells were treated with the CAP extract or the reference was renewed, then the cells were stimulated with a cocktail of Th2 cytokines (IL4 + IL13 + IL22 + TNFa at 10 ng / ml) for 24 hours. At the end of the incubation, the gene expression of the markers of interest was evaluated by qRT-PCR. b. Results In keratinocytes subjected to Th2 stress, the extract of Chlamydomonas acidophila inhibited the gene expression of CCL5 (CC motif chemokine ligand 5 or RANTES) and CCL27 (CC motif chemokine ligand 27), coding for chemokines involved in amplification of the inflammatory and allergic skin reaction.
Tableau 11 : Expression génique dans des kératinocytes épidermiques soumis à un stress Th2 Table 11: Gene expression in epidermal keratinocytes subjected to Th2 stress
c. Conclusion vs. Conclusion
L'extrait de Chlamydomonas acidophila module l'inflammation induite par un stress Th2 dans des kératinocytes en inhibant l'expression génique des facteurs chémoattractants CCL5 et CCL27. The extract of Chlamydomonas acidophila modulates the inflammation induced by Th2 stress in keratinocytes by inhibiting the gene expression of the chemoattractant factors CCL5 and CCL27.
C. Inhibition de l'activation de basophiles C. Inhibition of basophil activation
a. Matériel et méthodes at. Material and methods
Le test d'activation de basophiles (BAT) a été réalisé à l'aide du kit Flow CAST® (BÜHLMANN, réf. FKCCR). The basophil activation test (BAT) was carried out using the Flow CAST ® kit (BÜHLMANN, ref. FKCCR).
Du sang total a été pré-incubé pendant 15 minutes en présence de l'extrait CAP à 0,033 % et 0,1 % de matière sèche (ms) ou des références (SB202190 à 30 mM ; ou cromoglycate à 10 mM). Whole blood was pre-incubated for 15 minutes in the presence of the extract of CAP at 0.033% and 0.1% of dry matter (ms) or references (SB202190 at 30 mM; or cromoglycate at 10 mM).
Le stimulant, fM LP à 1 mM a ensuite été ajouté et le sang a été incubé pendant 15 minutes supplémentaires en présence du tampon de marquage contenant un mélange d'anticorps monoclonaux (anti-CD63-FITC et anti-CCR3-PE). The stimulant, fM LP at 1 mM was then added and the blood was incubated for an additional 15 minutes in the presence of the labeling buffer containing a mixture of monoclonal antibodies (anti-CD63-FITC and anti-CCR3-PE).
Une analyse en cytométrie de flux a ensuite été réalisée afin de comptabiliser la population totale de basophiles (CCR3+) et basophiles activés (CCR3+/CD63+). A flow cytometry analysis was then carried out in order to count the total population of basophils (CCR3 +) and activated basophils (CCR3 + / CD63 +).
b. Résultats b. Results
La stimulation par le peptide fM LP a entraîné une très nette activation des basophiles (40,1 % de cellules activées, soit 4527 % de stimulation). Stimulation by the peptide fM LP resulted in a very clear activation of the basophils (40.1% of activated cells, ie 4527% of stimulation).
Dans le cadre de cette étude, 2 composés de référence potentiels ont été testés en présence de fMLP: Le SB202190, un inhibiteur de la p38 MAPkinase ; l'activation de cette kinase est indispensable dans le mécanisme d'activation des basophiles conduisant à la dégranulation ; As part of this study, 2 potential reference compounds were tested in the presence of fMLP: SB202190, a p38 MAPkinase inhibitor; activation of this kinase is essential in the mechanism of activation of basophils leading to degranulation;
Le cromoglycate, un anti-allergique connu, dont le mécanisme d'action passe par une stabilisation de la membrane plasmique au niveau de laquelle il inhibe la pénétration intracellulaire de Ca++, cet ion étant indispensable à la dégranulation mastocytaire. Cromoglycate, a known anti-allergic, the mechanism of action of which involves stabilizing the plasma membrane at which it inhibits intracellular penetration of Ca ++ , this ion being essential for mast cell degranulation.
Le SB202190, testé à 30 mM, ainsi que le cromoglycate, testé à 10 mM, ont tous deux présenté un effet inhibiteur significatif sur l'activation des basophiles induites par le fMLP (respectivement, 26 % et 46 % d'inhibition). SB202190, tested at 30 mM, as well as cromoglycate, tested at 10 mM, both showed a significant inhibitory effect on the activation of basophils induced by fMLP (respectively, 26% and 46% inhibition).
Dans les conditions expérimentales de cette étude, l'extrait CAP, testé à 0,033 % et 0,1 %, a présenté un effet inhibiteur net et dépendant de la concentration sur l'activation des basophiles induites par le fMLP (respectivement, 22 % et 39 % d'inhibition). Under the experimental conditions of this study, the CAP extract, tested at 0.033% and 0.1%, showed a clear and concentration-dependent inhibitory effect on the activation of basophils induced by fMLP (respectively, 22% and 39% inhibition).
Tableau 12 : Effet des composés sur l'activation de basophiles humains en condition stimulée avec fMLP Table 12: Effect of the compounds on the activation of human basophils in conditions stimulated with fMLP
Analyse en cytométrie en flux après double marquage anti-CCR3 et anti-CD63 Flow cytometry analysis after double anti-CCR3 and anti-CD63 labeling
Test t de Student Student's t-test
c. Conclusion vs. Conclusion
L'extrait de Chlamydomonas acidophila inhibe l'activation de basophiles. Chlamydomonas acidophila extract inhibits the activation of basophils.
D. Conclusion D. Conclusion
En inhibant, d'une part l'expression génique de cytokines chémoattractantes dans des kératinocytes soumis à un stress Th2, et d'autre part, l'activation de basophiles ; l'extrait de Chlamydomonas acidophila pourrait contribuer à moduler les processus impliqués dans l'initiation de la réponse allergique. By inhibiting, on the one hand the gene expression of chemoattractant cytokines in keratinocytes subjected to a Th2 stress, and on the other hand, the activation of basophils; Chlamydomonas extract acidophila could help modulate the processes involved in initiating the allergic response.
Exemple 3 : Tests cliniques de l'extrait selon l'invention Example 3 Clinical Tests of the Extract According to the Invention
L'activité biologique de l'extrait de Chlamydomonas acidophila (CAP) obtenu à l'exemple 1 a été démontrée par études cliniques comme décrit ci-après. The biological activity of the extract of Chlamydomonas acidophila (CAP) obtained in Example 1 has been demonstrated by clinical studies as described below.
L'ensemble de ces résultats démontre ainsi des effets significatifs de l'actif "CAP", tels qu'un : All of these results thus demonstrate significant effects of the "CAP" asset, such as:
effet protecteur ; protective effect;
effet barrière ; barrier effect;
effet hydratant ; et moisturizing effect; and
effet anti inflammatoire/ anti rougeur. anti inflammatory / anti redness effect.
Ces études cliniques ont permis de mettre en évidence le potentiel de l'extrait CAP sur la prévention ou le traitement : These clinical studies have highlighted the potential of the CAP extract for prevention or treatment:
Des peaux sensibles ; Sensitive skin;
Des rougeurs ; Redness;
Des inflammations ; et Inflammations; and
Des allergies. Allergies.
A. Synthèse des résultats cliniques A. Summary of clinical results
Etude érythème chimique Chemical erythema study
L'actif CAP (3% matière active) a démontré une efficacité significative sur les paramètres suivants : The CAP active ingredient (3% active ingredient) has demonstrated significant effectiveness on the following parameters:
Intensité de l'érythème maximal 20 minutes après application d'une solution à 0.1% de Méthyl-Maximum erythema intensity 20 minutes after application of a 0.1% solution of Methyl-
Nicotinate Nicotinate
L'intensité du flux sanguin mesurée par TiVi est significativement plus faible sur la zone traitée par l'actif comparé à la zone non traitée. The intensity of blood flow measured by TiVi is significantly lower over the area treated with the active ingredient compared to the untreated area.
La rougeur mesurée par spectrocolorimétrie est significativement inférieure sur la zone traitée par l'actif comparé à la zone non traitée. The redness measured by spectrocolorimetry is significantly lower on the area treated with the active ingredient compared to the untreated area.
Evolution de l'érythème 30 minutes après l'érythème d'intensité maximale Evolution of erythema 30 minutes after erythema of maximum intensity
La diminution de l'intensité du flux sanguin mesuré parTivi est significativement plus élevée sur la zone traitée par l'actif comparé à la zone non traitée. La diminution de la rougeur mesurée par spectrocolorimétrie est significativement plus importante sur la zone traitée par l'actif comparé à la zone non traitée. The decrease in the intensity of the blood flow measured by Tivi is significantly greater over the area treated with the active ingredient compared to the untreated area. The reduction in redness measured by spectrocolorimetry is significantly greater in the area treated with the active ingredient compared to the untreated area.
Etude Peau Sensible Sensitive Skin Study
L'actif CAP (3% matière active) a démontré une efficacité significative sur les paramètres suivants : Mesures instrumentales The CAP active ingredient (3% active ingredient) has demonstrated significant effectiveness on the following parameters: Instrumental measurements
L'actif : The assets:
- diminue significativement la Perte Insensible en Eau après 28 jours d'application. - significantly reduces the Insensible Water Loss after 28 days of application.
- diminue significativement la rougeur après 28 jours d'application. - significantly reduces redness after 28 days of application.
- augmente significativement l'hydratation après 28 jours d'application. - significantly increases hydration after 28 days of application.
Evaluations biochimiques Biochemical assessments
L'actif : The assets:
- augmente significativement la quantité de NMFs après 28 jours d'application. - significantly increases the quantity of NMFs after 28 days of application.
- compense significativement la baisse de Céramides observée sur la zone placebo après 28 jours d'application. - significantly compensates for the drop in Ceramides observed in the placebo area after 28 days of application.
- diminue significativement la quantité de d'ILIRA après 28 jours d'application. - significantly reduces the amount of ILIRA after 28 days of application.
- diminue significativement la quantité de d'ILla après 28 jours d'application. - significantly reduces the amount of ILla after 28 days of application.
- diminue significativement le ratio ILIRA/ILla après 28 jours d'application. - significantly reduces the ILIRA / ILla ratio after 28 days of application.
- diminue significativement la quantité d'IL8 après 28 jours d'application. - significantly reduces the amount of IL8 after 28 days of application.
B. Evaluation de l'efficacité protectrice/anti rougeur/anti inflammation d'un actif versus placebo par évaluation du flux sanguin par tivi et évaluation de la couleur par spectrocolorimètre B. Evaluation of the protective / anti-redness / anti-inflammation efficacy of an active ingredient versus placebo by evaluation of the blood flow by tivi and evaluation of the color by spectrocolorimeter
Design de l'étude : Study design:
- Etude en double aveugle. - Double blind study.
- Etude comparative actif vs placebo, randomisée - Active comparative study vs placebo, randomized
Population : Population:
19 sujets ont été analysés pour cette étude. Les 19 sujets ont appliqué l'actif et le placebo sur 2 zones définies. Une zone non traitée a également été définie. 19 subjects were analyzed for this study. The 19 subjects applied the active ingredient and the placebo on 2 defined areas. An untreated area has also been defined.
Les personnes recrutées pour cette étude sont des sujets : The people recruited for this study are subjects:
sains de sexe féminin, âgés entre 18 et 60 ans âge moyen 38±3 min :18 max :60 healthy females, aged between 18 and 60 years average age 38 ± 3 min: 18 max: 60
ayant la peau de type caucasien, phototype de I à III having Caucasian skin type, phototype from I to III
Modalités d'utilisation et déroulement de l'étude : Terms of use and course of the study:
Applications des produits réalisées par les sujets eux-mêmes, à leur domicile, 2 fois par jour (matin et soir) pendant 14 jours de D-14 à DOtO sur chaque zone définie au niveau de l'avant-bras. Au bout de 14 jours, les sujets reviennent à l'unité clinique. Les mesures basales DOtO sont alors réalisées. Une dernière application des produits est réalisée. Un érythème chimique est ensuite induit sur chaque zone avec une solution à 0.1% de Méthyl-Nicotinate. Les mesures sur chaque zone sont ensuite réalisées après 20 minutes (intensité maximale) noté D0t20 et 50 minutes (30 minutes après l'érythème maximal) noté D0t50 suivant l'induction de l'érythème. Applications of the products carried out by the subjects themselves, at their home, twice a day (morning and evening) for 14 days from D-14 to DOtO on each zone defined at the level of the forearm. At the end of 14 days, subjects return to the clinical unit. The basal DOtO measurements are then performed. A final application of the products is carried out. A chemical erythema is then induced on each zone with a 0.1% solution of Methyl-Nicotinate. The measurements on each zone are then carried out after 20 minutes (maximum intensity) noted D0t20 and 50 minutes (30 minutes after the maximum erythema) noted D0t50 following the induction of erythema.
Deux paramètres sont analysés pour chaque paramètre évalué : Two parameters are analyzed for each parameter evaluated:
- La variation entre D0t20 et DOtO traduisant l'effet préventif sur l'apparition de l'érythème de chaque produit. - The variation between D0t20 and DOtO reflecting the preventive effect on the appearance of the erythema of each product.
- La variation entre D0t50 et D0t20 traduisant l'effet préventif sur l'évolution de l'érythème de chaque produit. - The variation between D0t50 and D0t20 reflecting the preventive effect on the development of the erythema of each product.
EVALUATION DU FLUX SANGUIN PAR TIVI EVALUATION OF BLOOD FLOW BY TIVI
La méthode utilisée par le TiVi 700 repose sur le fait que la lumière verte est fortement absorbée par les cellules des vaisseaux sanguins, alors que la lumière rouge l'est modérément. En utilisant une source de luminosité polarisée, la méthode s'affranchit de la réflexion spéculaire pour ne prendre en compte que la lumière renvoyée par le tissu cutanée. L'appareil produit ainsi une cartographie d'intensité avec chaque pixel représentant une concentration en cellules sanguines de la peau. The method used by the TiVi 700 is based on the fact that green light is strongly absorbed by the cells of blood vessels, while red light is moderately absorbed. By using a polarized light source, the method eliminates specular reflection to take into account only the light returned by the skin tissue. The device thus produces an intensity map with each pixel representing a concentration of blood cells in the skin.
Une diminution de l'intensité de la concentration en cellules sanguines de la peau traduit un effet anti inflammation. A decrease in the intensity of the concentration of blood cells in the skin indicates an anti-inflammation effect.
Résultats : Effet préventif sur l'apparition de l'érythème Results: Preventive effect on the appearance of erythema
Les graphiques des Figures IA, IB et IC représentent les comparaisons paire-à-paire entre l'actif, le placebo et la zone non traitée sur l'intensité de l'érythème 20 minutes après application de Méthyl- Nicotinate mesuré par TiVi. Le paramètre en ordonné représente l'intensité du flux sanguin (concentration en globules rouges). Les valeurs numériques exactes sont dans les tableaux 13A et 13B ci-dessous (Tableaux 13A et B : moyenne et écart type des mesures avec % de sujets présentant un effet positif % de différence et p value (valeur exacte de significativité). The graphs of Figures IA, IB and IC represent the pair-to-pair comparisons between the active, the placebo and the untreated zone on the intensity of the erythema 20 minutes after application of Methyl-Nicotinate measured by TiVi. The ordinate parameter represents the intensity of the blood flow (concentration of red blood cells). The exact numerical values are in Tables 13A and 13B below (Tables 13A and B: mean and standard deviation of the measurements with% of subjects with a positive effect% difference and p value (exact value of significance).
Le graphique Figure 2 montre l'évolution dans le temps des valeurs de flux sanguin. The graph Figure 2 shows the evolution over time of the blood flow values.
Les résultats montrent que l'actif diminue significativement l'intensité de l'érythème créé en comparaison à la zone non traitée. L'intensité de l'érythème sur la zone placebo ne diffère pas de la zone traitée. L'intensité de l'érythème sur la zone actif est significativement plus faible en comparaison au placebo. The results show that the active ingredient significantly reduces the intensity of the erythema created compared to the untreated area. The intensity of the erythema on the placebo area does not differ from the area treated. The intensity of the erythema on the active area is significantly lower compared to placebo.
Tableau 13A Table 13A
Tableau 13B Table 13B
C. Evaluation de l'efficacité d'un actif versus placebo par évaluation de la perte insensible en eau par tewamètre, évaluation de l'hydratation par cornéométrie, évaluation des propriétés biochimiques par prélèvement écouvillon C. Evaluation of the effectiveness of an active ingredient versus placebo by evaluation of the insensible water loss by tewameter, evaluation of hydration by corneometry, evaluation of biochemical properties by swab sampling
Design de l'étude : Study design:
- Etude en double aveugle. - Double blind study.
- Etude comparative actif vs placebo, randomisée, en hémi visage - Active comparative study vs placebo, randomized, in hemi face
Population : Population:
Concernant la mesure d'hydratation, de la perte insensible en eau, de la couleur et du questionnaire, 36 sujets ont été inclus dans l'analyse. Regarding the measurement of hydration, insensible water loss, color and the questionnaire, 36 subjects were included in the analysis.
Concernant les analyses biochimiques, 10 sujets ont été inclus dans l'analyse. Regarding biochemical analyzes, 10 subjects were included in the analysis.
Les personnes recrutées pour cette étude sont des sujets : The people recruited for this study are subjects:
sains de sexe féminin, âgés entre de plus de 18, âge moyen 51±3 min :21 max :68 healthy females, aged over 18, average age 51 ± 3 min: 21 max: 68
ayant la peau de type caucasien, phototype de I à IV having Caucasian skin type, phototype from I to IV
ayant la peau sensible au niveau du visage (la peau du sujet doit réagir à au moins 2 des 3 stress suivants : environnemental, chimique ou mécanique) with sensitive skin on the face (the subject's skin must react to at least 2 of the following 3 stresses: environmental, chemical or mechanical)
Modalités d'utilisation et déroulement de l'étude : Terms of use and course of the study:
A D0 : At D0:
• Vérification des critères d'inclusion et de non inclusion • Verification of inclusion and non-inclusion criteria
• Acclimatation pendant 30 minutes • Acclimatization for 30 minutes
• Définition des zones de mesures sur chaque hémi visage • Definition of measurement areas on each half face
• Mesures instrumentales et prélèvements biologiques • Instrumental measurements and biological samples
Entre DO et D28 : Between DO and D28:
Application de l'actif et du placebo en hémivisage 2 fois par jour (matin et soir) A D28 : Application of the active ingredient and the placebo in hemivisage twice a day (morning and evening) At D28:
• Acclimatation pendant 30 minutes • Acclimatization for 30 minutes
• Mesures instrumentales et prélèvements biologiques • Instrumental measurements and biological samples
EVALUATION DE LA PERTE INSENSIBLE EN EAU ASSESSMENT OF INSENSITIVE WATER LOSS
La barrière cutanée permet de réguler la perte en eau par évaporation. Lorsque cette barrière est endommagée, la perte insensible en eau augmente. A l'inverse, une barrière renforcée correspond à une perte insensible en eau plus faible. The skin barrier helps regulate water loss through evaporation. When this barrier is damaged, the insensible water loss increases. Conversely, a reinforced barrier corresponds to an insensible loss of water less.
La perte insensible en eau a été mesurée par un Tewamètre TM 300. Le principe est de mesurer dans un tube dont une des ouvertures est appliquée sur la peau la température et l'humidité relative par 2 capteurs situés à 2 hauteurs différentes. La loi de Fick est ensuite utilisée pour déterminer la perte insensible en eau. The insensible water loss was measured by a Tewameter TM 300. The principle is to measure the temperature and the relative humidity in a tube with one of the openings applied to the skin by 2 sensors located at 2 different heights. Fick's law is then used to determine the insensible water loss.
Les résultats obtenus pour la mesure de PIE à DO et D28 sont donnés dans le tableau 14. L'illustration des évolutions est donnée figure 3. The results obtained for the measurement of PIE at DO and D28 are given in table 14. The illustration of the changes is given in FIG. 3.
Tableau 14 : valeurs à D0 et D28 de la perte insensible en eau. Pourcentages d'évolution et statistiques. Table 14: values at D0 and D28 of the insensible water loss. Evolution percentages and statistics.
Les résultats obtenus montrent que la PIE diminue significativement entre DO et D28 avec l'actif et le placebo. La comparaison de l'évolution entre DO et D28 observée avec l'actif par rapport à l'évolution observée avec le placebo est statistiquement significative en faveur de l'actif. The results obtained show that the PIE decreases significantly between DO and D28 with the active ingredient and the placebo. The comparison of the evolution between DO and D28 observed with the active versus the evolution observed with the placebo is statistically significant in favor of the active.
EVALUATION DE L'HYDRATATION HYDRATION ASSESSMENT
La mesure de l'hydratation de la peau a été réalisée par un Cornéomètre CM 825. Cet appareil est basé sur le principe de la mesure de capacitance, permettant une mesure de l'hydratation des couches superficielles de la peau (10 à 20 pm de profondeur). The hydration of the skin was measured by a CM 825 corneometer. This device is based on the principle of capacitance measurement, allowing a measurement of the hydration of the surface layers of the skin (10 to 20 μm of depth).
Les résultats obtenus pour l'hydratation à D0 et D28 sont donnés dans le tableau 15. L'illustration des évolutions est donnée Figure 4. The results obtained for the hydration at D0 and D28 are given in Table 15. The illustration of the changes is given in Figure 4.
Les résultats obtenus montrent que l'hydratation augmente significativement entre D0 et D28 avec l'actif alors qu'elle ne varie pas avec le placebo. La comparaison de l'évolution entre D0 et D28 observée avec l'actif par rapport à l'évolution observée avec le placebo est statistiquement significative en faveur de l'actif. The results obtained show that the hydration significantly increases between D0 and D28 with the active ingredient while it does not vary with the placebo. The comparison of the evolution between D0 and D28 observed with the active compared to the evolution observed with the placebo is statistically significant in favor of the active.
Tableau 15 : valeurs à D0 et D28 de l'hydratation. Pourcentages d'évolution et statistiques. Table 15: values at D0 and D28 of hydration. Evolution percentages and statistics.
EVALUATIONS BIOCHIMIQUES BIOCHEMICAL ASSESSMENTS
Les évaluations biochimiques suivantes ont été réalisées : The following biochemical evaluations were carried out:
A partir du prélèvement de type écouvillon : From the swab type sample:
• Les Facteurs Naturels d'Hydratation (NMFs) par chromatographie Liquide couplée à une détection UV (LC/UV). La quantité de NMFs regroupe l'acide urocanique (UCA), l'acide Pyrrolidone carboxylique (PCA) et la sérine. La teneur en NMFs permet de renseigner sur l'état d'hydratation de la peau. • Natural Hydration Factors (NMFs) by Liquid Chromatography coupled with UV detection (LC / UV). The quantity of NMFs includes urocanic acid (UCA), Pyrrolidone carboxylic acid (PCA) and serine. The NMFs content provides information on the state of hydration of the skin.
• Les céramides par chromatographie Liquide couplée à une détection par spectroscopie de masse (LC/MS). La quantité de céramides regroupe les céramides présentant des bases [S], [DS] et [P] La teneur en céramides permet de renseigner sur l'état de la barrière cutanée. • Ceramides by Liquid Chromatography coupled with detection by mass spectroscopy (LC / MS). The amount of ceramides includes ceramides with bases [S], [DS] and [P] The content of ceramides provides information on the state of the skin barrier.
• L'état inflammatoire via la quantification des Cytokines (par ELISA): • The inflammatory state via the quantification of Cytokines (by ELISA):
o IL1RA o IL1RA
o ILla where he is
o I LS o I LS
A partir du prélèvement de type D-squames : From the D-scales type sample:
Marquage Nile Red/lnvolucrine Nile Red / lnvolucrine marking
NMFs NMFs
Les résultats obtenus pour les NMFs à DO et D28 sont donnés dans le tableau 16. L'illustration des évolutions est donnée Figure 5. The results obtained for the NMFs at DO and D28 are given in Table 16. The illustration of the changes is given in Figure 5.
Les résultats obtenus montrent que la quantité de NMFs augmente significativement entre DO et D28 avec l'actif alors que le placebo diminue significativement cette quantité. La comparaison de l'évolution entre DO et D28 observée avec l'actif par rapport à l'évolution observée avec le placebo est statistiquement significative en faveur de l'actif. The results obtained show that the quantity of NMFs increases significantly between DO and D28 with the active ingredient whereas the placebo significantly decreases this quantity. The comparison of the evolution between DO and D28 observed with the active compared to the evolution observed with the placebo is statistically significant in favor of the active.
Tableau 16 : valeurs à DO et D28 de la quantité de NMFs. Pourcentages d'évolution et statistiques. Table 16: values at DO and D28 of the quantity of NMFs. Evolution percentages and statistics.
Céramides Ceramides
Les résultats obtenus pour les céramides à DO et D28 sont donnés dans le tableau 17. L'illustration des évolutions est donnée Figure 6. The results obtained for the ceramides with DO and D28 are given in table 17. The illustration of the changes is given in FIG. 6.
Les résultats obtenus montrent que la quantité de céramides diminue avec le placebo, et que l'actif compense cette diminution (les évolutions entre DO et D28 pour le placebo et l'actif ne sont cependant pas significatives). La comparaison de l'évolution entre DO et D28 observée avec l'actif par rapport à l'évolution observée avec le placebo est statistiquement significative en faveur de l'actif. The results obtained show that the quantity of ceramides decreases with the placebo, and that the active ingredient compensates for this reduction (the changes between DO and D28 for the placebo and the active are not significant, however). The comparison of the evolution between DO and D28 observed with the active versus the evolution observed with the placebo is statistically significant in favor of the active.
Tableau 17 : valeurs à DO et D28 de la quantité de céramides. Pourcentages d'évolution et statistiques. Table 17: values at DO and D28 of the quantity of ceramides. Evolution percentages and statistics.
IL1RA IL1RA
Les résultats obtenus pour IL1RA à DO et D28 sont donnés tableau 18. L'illustration des évolutions est donnée Figure 7. The results obtained for IL1RA at DO and D28 are given in Table 18. The illustration of the changes is given in Figure 7.
Les résultats obtenus montrent que la quantité d'ILIRA diminue de manière significative entre DO et D28 avec l'actif et le placebo. La comparaison de l'évolution entre DO et D28 observée avec l'actif par rapport à l'évolution observée avec le placebo est statistiquement significative en faveur de l'actif. The results obtained show that the amount of ILIRA decreases significantly between DO and D28 with the active ingredient and the placebo. The comparison of the evolution between DO and D28 observed with the active versus the evolution observed with the placebo is statistically significant in favor of the active.
Tableau 18 : valeurs à DO et D28 de la quantité d'ILIRA. Pourcentages d'évolution et statistiques. Table 18: values at DO and D28 of the amount of ILIRA. Evolution percentages and statistics.
Ratio Nile red/lnvolucrine Nile red / lnvolucrine ratio
Les résultats obtenus pour le ratio Nile red/lnvolucrine à DO et D28 sont donnés dans le tableau 19. L'illustration des évolutions est donnée Figure 8. The results obtained for the Nile red / lnvolucrine ratio at DO and D28 are given in Table 19. The illustration of the changes is given in Figure 8.
Les résultats obtenus montrent que le ratio Nile red/lnvolucrine ne varie pas de manière significative entre DO et D28 avec l'actif et pour le placebo. La comparaison de l'évolution entre DO et D28 observée avec l'actif par rapport à l'évolution observée avec le placebo est statistiquement significative en faveur de l'actif. The results obtained show that the Nile red / lnvolucrine ratio does not vary significantly between OD and D28 with the active ingredient and for the placebo. The comparison of the evolution between DO and D28 observed with the active versus the evolution observed with the placebo is statistically significant in favor of the active.
Tableau 19 : valeurs à DO et D28 du ratio Nile red/lnvolucrine. Pourcentages d'évolution et statistiques. Table 19: DO and D28 values of the Nile red / lnvolucrine ratio. Evolution percentages and statistics.

Claims

REVENDICATIONS
1. Extrait peptidique de la microalgue Chlamydomonas acidophila obtenu par un procédé de préparation comprenant au moins une étape d'hydrolyse enzymatique, comprenant au moins 20 % en poids de peptides, les pourcentages étant exprimés par rapport au poids total dudit extrait. 1. Peptide extract of the microalga Chlamydomonas acidophila obtained by a preparation process comprising at least one step of enzymatic hydrolysis, comprising at least 20% by weight of peptides, the percentages being expressed relative to the total weight of said extract.
2. Extrait selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend de 20 % à 90 %, avantageusement de 20 % à 75 %, typiquement de 30 % à 70 %, en poids de peptides, les pourcentages étant exprimés par rapport au poids total dudit extrait. 2. Extract according to claim 1, characterized in that it comprises from 20% to 90%, advantageously from 20% to 75%, typically from 30% to 70%, by weight of peptides, the percentages being expressed relative to the total weight of said extract.
3. Extrait selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les peptides ont une masse moléculaire inférieure à 3500 Daltons (Da). 3. Extract according to claim 1 or 2, characterized in that the peptides have a molecular mass of less than 3500 Daltons (Da).
4. Extrait selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'au moins 80 % en poids des peptides ont une masse moléculaire inférieure à 1000 Da. 4. Extract according to any one of claims 1 to 3, characterized in that at least 80% by weight of the peptides have a molecular mass of less than 1000 Da.
5. Extrait selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'au moins 30 %, avantageusement au moins 35 %, en poids des peptides, ont une masse moléculaire inférieure à 500 Da. 5. Extract according to any one of claims 1 to 4 characterized in that at least 30%, advantageously at least 35%, by weight of the peptides, have a molecular mass of less than 500 Da.
6. Procédé de préparation d'un extrait peptidique de chlamydomonas acidophila, comprenant au moins une étape d'hydrolyse enzymatique. 6. Method for preparing a peptide extract of chlamydomonas acidophila, comprising at least one step of enzymatic hydrolysis.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'étape d'hydrolyse enzymatique est effectuée en présence d'au moins une protéase, avantageusement d'au moins une protéase alcaline. 7. Method according to claim 6, characterized in that the enzymatic hydrolysis step is carried out in the presence of at least one protease, advantageously at least one alkaline protease.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : 8. Method according to any one of claims 6 to 7, characterized in that it comprises at least the following steps:
a) dispersion en phase aqueuse de la microalgue Chlamydomonas acidophila ; a) dispersion in aqueous phase of the microalga Chlamydomonas acidophila;
b) hydrolyse enzymatique de la dispersion aqueuse obtenue à l'étape a), avantageusement en présence d'au moins une protéase, b) enzymatic hydrolysis of the aqueous dispersion obtained in step a), advantageously in the presence of at least one protease,
c) traitement thermique du mélange obtenu à l'étape b), et c) heat treatment of the mixture obtained in step b), and
d) récupération de l'extrait peptidique à la fin de l'étape c). d) recovery of the peptide extract at the end of step c).
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend une étape supplémentaire de filtration ou centrifugation, située entre les étapes c) et d), éventuellement suivie d'une ultrafiltration, diafiltration, ou nanofiltration. 9. Method according to any one of claims 6 to 8, characterized in that it comprises an additional filtration or centrifugation step, located between steps c) and d), optionally followed by an ultrafiltration, diafiltration, or nanofiltration .
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape d'ultrafiltration à 15 kDa, effectuée entre les étapes c) et d), ou après l'étape de filtration ou centrifugation supplémentaire. 10. Method according to any one of claims 6 to 9, characterized in that it further comprises a step of ultrafiltration at 15 kDa, carried out between steps c) and d), or after the filtration step or additional centrifugation.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de nanofiltration avec un seuil de coupure compris entre 100 Daltons et 300 Daltons, effectuée après l'étape d'ultrafiltration à 15 kDa. 11. The method of claim 10, characterized in that it further comprises a nanofiltration step with a cutoff threshold between 100 Daltons and 300 Daltons, performed after the ultrafiltration step at 15 kDa.
12. Composition comprenant un extrait peptidique de la microalgue Chlamydomonas acidophila obtenu par un procédé de préparation comprenant au moins une étape d'hydrolyse enzymatique, en tant que principe actif, et un excipient approprié. 12. Composition comprising a peptide extract of the microalga Chlamydomonas acidophila obtained by a preparation process comprising at least one step of enzymatic hydrolysis, as active principle, and an appropriate excipient.
13. Composition selon la revendication 12, caractérisé en ce que ledit extrait est tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou est susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 11. 13. Composition according to claim 12, characterized in that said extract is as defined according to any one of claims 1 to 5 or is capable of being obtained by the process according to any one of claims 6 to 11.
14. Composition selon l'une quelconque des revendications 12 ou 13, comprenant 0,001 % à 10 %, avantageusement 0,01 % à 5 %, dudit extrait peptidique de Chlamydomonas acidophila, en poids exprimé d'extrait sec, par rapport au poids total de la composition. 14. Composition according to any one of claims 12 or 13, comprising 0.001% to 10%, advantageously 0.01% to 5%, of said peptide extract of Chlamydomonas acidophila, by weight expressed as dry extract, relative to the total weight of the composition.
15. Extrait selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou extrait susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 11 ou composition selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, pour son utilisation pour prévenir et/ou traiter : 15. Extract according to any one of claims 1 to 5 or extract obtainable by the process according to any one of claims 6 to 11 or composition according to any one of claims 12 to 14, for its use for prevent and / or treat:
- des troubles ou pathologies de la peau et/ou des muqueuses et/ou des phanères, avantageusement des réactions ou pathologies allergiques, inflammatoires, irritatives ou des troubles de la barrière ou de l'homéostasie de la peau, des phanères et/ou des muqueuses immature(s), normale(s) ou mature(s)/âgée(s), et/ou - disorders or pathologies of the skin and / or mucous membranes and / or appendages, advantageously allergic, inflammatory, irritative reactions or pathologies or disorders of the barrier or homeostasis of the skin, appendages and / or immature, normal or mature / aged mucosa (es), and / or
- des troubles vasculaires, notamment les rougeurs ou les couperoses, et/ou - vascular disorders, in particular redness or rosacea, and / or
- des altérations du tissu adipeux. - alterations in adipose tissue.
16. Extrait selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou un extrait susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 11 ou une composition selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, pour son utilisation pour améliorer l'état et/ou l'aspect de la peau et/ou des phanères et/ou des muqueuses. 16. Extract according to any one of claims 1 to 5 or an extract capable of being obtained by the process according to any one of claims 6 to 11 or a composition according to any one of claims 12 to 14, for its use to improve the condition and / or appearance of the skin and / or integuments and / or mucous membranes.
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