WO2008125789A2 - Utilisation d'un extrait d'algue phaeodactylum pour depigmenter la peau - Google Patents

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WO2008125789A2
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Carine Nizard
Marielle Moreau
Robin Kurfurst
Bertrand Friguet
Anne-Laure Bulteau
Monique Gareil
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Lvmh Recherche
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/02—Preparations for care of the skin for chemically bleaching or whitening the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q5/00—Preparations for care of the hair
    • A61Q5/08—Preparations for bleaching the hair

Definitions

  • the present invention relates to the use of an extract of algae
  • Phaeodactylum tricomutum as a depigmenting cosmetic agent and a method of cosmetic skin care for reducing or eliminating pigment spots or lightening the complexion, hair or hair.
  • the proteasome is an intracellular multienzymatic proteolytic complex that is very important in cell maintenance since it mainly involves the elimination of damaged proteins (Friguet B. et al., Protein degradation by the proteasome and its involvement in aging, Ann NY Acad Sci ( 2000) 908: 143-154).
  • the proteasomal system consists of a catalytic complex, the proteasome 2OS and several regulatory components that affect its activity and specificity. The association of the regulator 19S with the proteasome 2OS forms the proteasome 26S which ensures the degradation of the ubiquitinated proteins.
  • the proteasome is localized in mammalian cells both in the cytosol and the nucleus, and there are interactions with the endoplasmic reticulum and the cell membrane.
  • the proteasome 2OS has a molecular weight of 700 kDa and is composed of 14 different subunits encoded by either ⁇ -type or ⁇ -type genes.
  • the 14 subunits are arranged as a cylindrical stack of 4 rings of 7 subunits, the apical rings consisting of ⁇ subunits and the central rings of subunits ⁇ .
  • This proteolytic complex preferentially cleaves proteins at the C-terminus of the basic residues ("trypsin-like” activity), hydrophobic (“chymotrypsin-like” activity) and acid residues ("peptidylglutamyl-peptide hydrolase” activity).
  • trypsin-like activity proteins at the C-terminus of the basic residues
  • chymotrypsin-like activity hydrophobic
  • acid residues peptidylglutamyl-peptide hydrolase
  • this cosmetic agent can be explained by the fact that this extract promotes the activation of the proteasome of the cells of the skin, in particular keratinocytes, thus leading to promote the degradation of the oxidized proteins.
  • WO 2006/008401 a process for preparing a clarified culture medium of at least one marine microorganism and / or fresh phytosynthetic water and the use of this clarified culture medium in particular in the field of cosmetics.
  • Tyrosinase is an enzyme that plays a vital role in this series of reactions. Tyrosinase catalyzes, in particular, the transformation reaction of tyrosine into Dopa (Dihydroxyphenylalanine) and the conversion reaction of Dopa into Dopaquinone leading to the formation of melanin pigments.
  • a substance is recognized as depigmenting if it acts directly on melanocytes by inhibiting the activity of these cells or if it blocks one of the stages of melanin biosynthesis. This is particularly the case when the substance in question inhibits one of the enzymes involved in melanogenesis.
  • the invention relates to the use in a cosmetic composition of an extract of the alga Phaeodactylum tricornutum, as a depigmenting active agent intended in particular to reduce or eliminate the pigment spots of the skin or to clear the complexion, the hair or the hair ..
  • the invention relates to a method of cosmetic care intended to reduce or eliminate the dark spots of the skin or to clear your complexion, hair or hair, characterized in that it comprises the application to at least one area of the skin of a cosmetic composition containing this extract.
  • the extract is used in an amount effective to obtain the desired effect and, in particular, to induce a stimulation of the degradation of tyrosinase in the skin.
  • the algae extract is used in the composition at a concentration preferably between 0.001 and 5% by weight, even more preferably between 0.001 and 1% by weight.
  • an extract of Phaeodactylum tricomutum which is as rich as possible in fatty acids and preferably an extract containing at least 40% by weight of fatty acids, preferably at least 60, will be used. % in weight.
  • any method for obtaining a lipid-rich extract may be used.
  • a process comprising at least one extraction step with a solvent or a solvent medium that is sufficiently apolar to extract the fatty acids.
  • Such a solvent or solvent medium will be designated hereinafter by apolar solvent.
  • nonpolar solvents By way of example of such nonpolar solvents, mention may be made of isopropanol, hexane, cyclohexane and heptane.
  • the purpose of such a step of extraction with a polar solvent is to cause the hydrolysis of esterified fatty acids, in particular glycerides, and to extract them in the form of salts.
  • such a process comprising at least one extraction step with an apolar solvent comprises in particular at least one extraction step with an extraction solvent chosen from the C 1 -C 6 alcohols, the hydroalcoholic mixtures of these alcohols, the C 2 -C 6 polyhydric alcohols such as ethylene glycol, the chlorinated solvents such as chloroform and dichloromethane, the C 3 -C 6 esters of organic acids such as ethyl acetate, C 6 -C 10 alkanes such as heptane, hexane or cyclohexane, C 8 -C 8 ethers such as diisopropyl ether, this solvent being optionally alkalinized.
  • an extraction solvent chosen from the C 1 -C 6 alcohols, the hydroalcoholic mixtures of these alcohols, the C 2 -C 6 polyhydric alcohols such as ethylene glycol, the chlorinated solvents such as chloroform and dichloromethane, the C 3 -C 6 esters of organic acids such as eth
  • a first extraction step is applied to the algae by an alkalized hydroalcoholic mixture, the alcohol of said hydroalcoholic mixture being preferably chosen from isopropanol. , ethanol and methanol, said step for recovering fatty acids in salified form in the hydroalcoholic phase.
  • the fraction thus recovered is subjected to various operations for recovering in a nonpolar phase a particularly enriched extract. in fatty acids.
  • the alkalized hydroalcoholic mixture is acidified before applying a liquid / liquid extraction step by means of an apolar solvent.
  • Such a process also comprises a step of recovering an oil containing said extract by removing said apolar solvent.
  • This apolar solvent is advantageously Theptane, hexane or cyclohexane.
  • the alga is advantageously frozen.
  • the freezing is carried out at a temperature of between -40 ° C. and -20 ° C. and for a duration of preferably between 1 and 7 days approximately.
  • This prior step is advantageously used to achieve a thermal shock by contact with the future extraction solvent in order to facilitate the decantation of the silica (from the skeleton of the cells of the algae).
  • the alga is then brought into contact with the extraction solvent.
  • the frozen algae is immersed directly in the heated extraction solvent. It is also advantageously carried out a maceration of the algae in the extraction solvent at room temperature.
  • a maceration of the algae is carried out at room temperature and preferably for a period of between approximately 5 minutes and 80 minutes, and more preferably for a period of between 20 minutes and approximately 40 minutes.
  • the extraction is carried out under reflux.
  • the extraction may be carried out under an inert atmosphere, preferably under a saturated nitrogen atmosphere. This makes it possible to avoid, in particular, pronounced oxidative degradation of the active molecules.
  • the conditioning of this extract is advantageously carried out under an inert gas such as nitrogen, and antioxidants may also be added in order to protect the active molecules.
  • the amount of extraction solvent used is between 0.1 liter and 20 liters, preferably between 2 liters and 10 liters, for a quantity of 100 g of the alga, expressed in dry weight of seaweed.
  • the extract of the aforementioned alga is obtained after the succession of the following stages, some of which described above: the alga is frozen as described above and then immersed in the extraction solvent b) A maceration of the alga is carried out c) the extraction solvent is alkalinized to a pH between 10 and 14, preferably at a pH of 13, for example with an aqueous solution of sodium hydroxide or with an aqueous solution of potassium hydroxide, d) the insolubles are removed from the hydroalcohol phase, e) from the distilled water is added to the hydroalcoholic phase, f) the hydro-alcoholic solution thus obtained is washed by a liquid / liquid method with an apolar solvent immiscible with the aqueous-alcoholic phase, such as for example heptane, hexane or cyclohexane, g) the phase containing
  • the extract of the aforementioned alga is obtained by extraction of the seaweed with supercritical CO 2 .
  • the use of this particular solvent implies that the algae has been lyophilized beforehand.
  • FIG. 1A similar chymotrypsin activity
  • FIG. 1B the similar hydrolase-post-glutamic activity
  • FIG. 1C similar trypsin activity
  • FIG. 2A the Westem-blot anti-proteasome results, obtained for lyses at 24 h,
  • FIG. 2B the results of the Western anti-proteasome blot, obtained for lyses at 72 h,
  • FIG. 3A the results of the Western-blot anti-ubiquitin, obtained for lyses at 24 h,
  • FIG. 3B the results of the Western-blot anti-ubiquitin, obtained for lyses at 72 h,
  • FIG. 4A the results of the anti-tyrosinase Western blot, for lyses at 24 h
  • FIG. 4B the results of the anti-tyrosinase Western blot, for lyses at 72 h
  • FIG. 5 measurement of tyrosinase activity
  • FIG. 6 the result of immunoprecipitation tests.
  • Example 1 Extraction with a polar solvent, such as i isopropanol (IPA) f according to a first method.
  • a polar solvent such as i isopropanol (IPA) f according to a first method.
  • the entire extraction is carried out under an inert atmosphere (nitrogen saturation) in order to avoid pronounced degradation of the active molecules.
  • the amount of solvent used is 10 liters of IPA per 1 liter of water contained in the biomass.
  • the aforementioned 250 kg of biomass are distributed as follows in a quantity of dry matter of 75 kg and 175 kg of water.
  • the amount of IPA used here is 1750 kg.
  • biomass + IPA The whole (biomass + IPA) is kept under reflux for half an hour with stirring at about 80 0 C, before being cooled to 50 ° C. After cooling the biomass and PIPA to 50 ° C., The whole is transferred to a GUEDU type filter in order to carry out the spent biomass / solubilized algae separation in I 1 IPA.
  • concentration factor 71.5
  • the concentrated extract has an oily appearance.
  • This oily extract is then taken up in cold IPA at the rate of 10 kg of solvent per 1 kg of oil. Stirring is prolonged for 20 minutes.
  • the juice is then filtered (this eliminates residual sticky mud).
  • a fading and deodorizing treatment is carried out in two batches in an 80 liter Schott reactor and lasts 30 minutes at ambient temperature by addition of zeolite and active charcoal.
  • the amount of zeolite (ABSENT 2000, UOP supplier) added is 0.94 kg and that of activated carbon (CXV, ECSC supplier) is 1.6 kg.
  • the ratio of coal to zeolite is 1.7.
  • the zeolite and the charcoal are then removed by filtration on paper.
  • Antioxidants (DL ⁇ -tocopherol at 0.05% final weight concentration and ascorbyl palmitate at 0.05% final weight concentration) are incorporated by a stock solution in IPA.
  • the filtrate containing the antioxidants is then concentrated batchwise, under inert gas te! than nitrogen until a brown oil is obtained.
  • the extraction starts with a dispersion of 49.8 kg of frozen dry mass from 250 kg of biomass (Phaeodactyium tricornutum), ie about 20% by dry mass in 539 kg of anhydrous ethanol at 96%, alkalized by 9 kg. of 30.5% sodium aqueous solution. After maceration for 30 minutes under reflux of ethanol and under a nitrogen atmosphere, the mixture is cooled to 18 ° C. The insolubles are then separated by spinning under nitrogen and are removed.
  • the oil produced is a homogeneous liquid and has a dark yellow color.
  • the E2 extract as obtained according to the above-mentioned method has the following fatty acid composition (% by weight): - myristic acid 4.16%
  • MNTl cells human meinocyte cell lines
  • Linoleic acid (Sigma; L1012)
  • Palmitic acid (Sigma, P5585) 2.56 mg / ml in EtOH (0.25% in medium)
  • Tris base (Sigma, TlSO 3 ) to be dissolved in 200 ml of distilled water, adjust the pH to 7.5 with 12N HCl then make up to 250 ml
  • IM sucrose solution (Merck, ref.7654) 8.55 g to dissolve in 20 ml of distilled water, then adjust to 25 ml.
  • Solution of MgSO 4 to 2mM (Sigma; réf.M7506) 6 mg dissolved in 25 ml of distilled water.
  • MgSO 4 ⁇ 7H 2 O (Sigma, ref.M5921) 12.4 mg to be dissolved in 25 ml of distilled water; keep at 4 ° C, 4% Triton X100 solution (Sigma, ref .X100)
  • Leupeptin solution at 0.5 mg / ml (Sigma, ref, L2884;
  • PNSF phenylmethane sulfonyl sulfide
  • leupeptin is not added because it inhibits proteasome activity.
  • each proteasome peptidase activity is determined using a fluorogenic peptide substrate specific for each of the activities, in the presence and absence of a specific proteasome inhibitor, MG 132 (Leu-Leu-
  • the peptide substrates are as follows: Leu-Leu-Val-Tyr-amc (LLVY-amc) for similar chymotrypsin activity, Leu-Leu-Glu-na (LLE-na) for post-glutamic hydrolase activity and Leu -Ser-Thr-Arg-amc (LSTR-amc) for similar trypsin activity.
  • LLVY-amc Leu-Leu-Val-Tyr-amc
  • LLE-na Leu-Leu-Glu-na
  • LSTR-amc Leu-Ser-Thr-Arg-amc
  • the procedure is as follows: In a 96-well plate, introduce in duplicate a fixed volume of cell lysate (determined from the lowest concentration of protein in the samples and which must correspond to 20 ⁇ g of proteins) and make up to 100 ⁇ l with TRIS buffer.
  • the raw results are expressed in U.F./min, UF denoting the value provided by the apparatus, expressed in fluorescence unit.
  • the assay is carried out on 200 .mu.l of reaction volume containing a volume V of fixed cellular iysate as a function of the protein concentrations of the lysates. Proteins dosed extemporaneously are expressed in ⁇ g / ⁇ l.
  • the activity can be expressed as follows, in pmol of MCA released / minute / mg of protein: FR2008 / 050394
  • NA - ⁇ -Naphtylamide
  • the procedure is as follows: In a 96-well plate, introduce in duplicate a fixed volume of cell lysate (determined from the lowest protein concentration of the samples and which must correspond to 20 ⁇ g of proteins) and make up to 100 ⁇ l with TRIS buffer,
  • the raw results are expressed in U.F./min.
  • the assay is carried out on 200 ⁇ l of reaction volume containing a volume V of cell lysate fixed as a function of the protein concentrations of the lysates.
  • Proteins dosed extemporaneously are expressed in ⁇ g / ⁇ l. From the standard range the activity can be expressed in pmol of MCA released / minute / mg of protein;
  • Proteasome inhibitor Mg 132 (Z-Leu-Leu-Leu-CHO) (Affinity,
  • the crude results are expressed in U.F./min.
  • the assay is carried out on 200 .mu.l of reaction volume, containing a volume V of cell lysate fixed according to the protein concentrations of the lysates. Proteins dosed extemporaneously are expressed in ⁇ g / ⁇ l.
  • the assay is based on the measurement of the dopa-oxidase activity of tyrosinase, The principle of the assay is based on the detection of dopachrorne which absorbs at 475 nm on the FLUOstar (BMG) Material:
  • Substrate L-DOPA (Sigma, D-9628, PM 197.2) at 10 mM in PBS, prepared extemporaneously due to auto-oxidation of L-Dopa.
  • Human melanocytes in culture were treated with 25 ⁇ M linoleic acid (+/- 120 nM Mgl32) or 25 ⁇ M palmitic acid (+/- 120 nM Mgl32) or 5 ⁇ g / mL Phaeodactylum (+/- 120 nM Mgl32) in MNT1 medium containing 1% BSA, 50 ⁇ M vitamin E and 1 M vitamin C.
  • the melanocytes were recovered and disrupted at 72 hours after treatment. 50 .mu.g of extract are then incubated with ImM of L-dopamine for one hour at 37.degree.
  • the measurement of the tyrosinase activity is carried out at 475 nm every 2 minutes using the microplate reader thermostated at 37 ° C.
  • the Dopa-oxidase activity is obtained in OD / min / mg of proteins.
  • Palmitic acid 25 ⁇ M - Phaeodactylum 5 ⁇ g / ml
  • BSA Bovine Serum Albumin
  • Vitamin E Vitamin E 50 ⁇ M
  • Vitamineamine C Vitamineamine C
  • Protein Assay (Bradford) and Western Blot The method of assaying the proteins is the same as that used previously as well as that of Western-Blot, Following the determination of the proteins in Eppendorf tubes, the samples are diluted in Laemmii 2X buffer in order to obtain 1 ⁇ g / ⁇ l of proteins. To these sample solutions are added bromophenol blue 1OX. Samples can be frozen at -2O 0 C.
  • Linoleic acid (Sigma; L1012)
  • Palmitic acid (Sigma; P5585)
  • the electrophoresis of the proteins is carried out in a polyacrylamide minigel of 1 mm to 1.5 mm thick, under denaturing and reducing conditions, in a discontinuous buffer according to the method of Laemmli (1970).
  • 12% T, 2.7% C gels make it possible to separate low molecular weight proteins ranging from 20 to 120 kDa.
  • the gels at 8% T; 2.7% C high molecular weight proteins from 35 to 250 kDa.
  • This gel can be poured either the day before or the same day but anyway one to two hours before the migration.
  • the pouring of the gel is carried out using a pipette up to about 0.5 mm from the bottom of the comb provided for the concentration gel. Absolute ethanol is slowly added to the surface to obtain a regular baseline ( ⁇ ImI / gel).
  • Ethanol is removed. 2.5 ml of gel is poured using a polyethylene transfer Pasteur pipette (Biorad, ref.223-9528) and the combs are inserted. After one hour the gel is polymerized.
  • a polyethylene transfer Pasteur pipette Biorad, ref.223-9528
  • the thawed lysates are heated at 95 ° C. for 10 minutes and the proteins are assayed.
  • the protein assay is carried out during the polymerization of the separation gel or the day before (see Annex C).
  • the samples are diluted in Laemmli 2X buffer in order to obtain identical solutions ⁇ 1 ⁇ g / ⁇ l of proteins.
  • To these sample solutions are added bromophenol blue 1OX.
  • the samples are heated at 95 ° C. for 5 minutes.
  • the combs are removed. 200 ml of migration buffer IX are poured on the gels, in the central compartment between the two gels, check the seal, then in the tank at quarter, The samples are deposited using a suitable tapered tip on the micropipette as well as 10 ⁇ l of precolored molecular weight controls (Biorad, Prestained SDS-PAGE Low Range Standard; ref. 161-0305) or (Amersham, FuIl Range). Rainbow, RPN800W).
  • Electrophoresis is carried out at room temperature, at 200V. This is stopped when the migration front is out of the gel (about 40 minutes of migration).
  • the concentration gel is removed and the separation gel is deposited on the cellulose membrane.
  • the membrane and the gel are deposited on the sheet of filter paper.
  • the second sheet of filter paper is deposited on the gel.
  • the apparatus is closed by a lid consisting of the cathode.
  • the proteins are stained with red Ponceau (Sigma, P7170).
  • the cellulose membrane is rinsed with milliQ water and then dipped in a Ponceau IX red bath for 10 min with stirring. It is then washed in several milliQ water baths until the staining remains only on the protein bands. The membrane is inserted into a plastic and scanned.
  • the protein bands can be quantified to determine all the proteins transferred.
  • the membrane is stirred overnight at 4 0 C or 1:30 at room temperature in a blocking solution aspecific binding sites consisting of 5% skim milk (Régilait) in PBS-T buffer prepared in Appendix B hereinafter (20ml / membrane).
  • this membrane is placed in the presence of the primary antibody diluted to the optimum concentration in PBS-T with or without milk 5% (w / v) according to the antibody, for one hour with stirring at room temperature or overnight. at 4 ° C. It is then rinsed rapidly and then three times for 10 min in PBS-T to remove the excess of free unbound antibody.
  • SARAN food film
  • the membrane is revealed using a highly sensitive chemiluminescent detection kit (Amersham, ECL Western biotting ref.RPN2209) using luminol as a substrate for peroxidase. Under the action of peroxidase and an amplifier, the luminol is oxidized and passes into a transient excited state. The return to the ground state is by emission of photons that impress an autoradiographic film placed on the membrane.
  • a highly sensitive chemiluminescent detection kit Amersham, ECL Western biotting ref.RPN2209
  • Linoleic acid (Sigma, L1012) 2.8 mg / ml in EtOH (0.25% in medium) - Palmitic acid (Sigma, P5585)
  • Tris base 45,375g (Sigma, T1503) dissolved in 200 ml! distilled water, adjust the pH to 7.5 with 12N HCl and then make up to 250 ml IM sucrose solution (Merck, ref.7654) 8.55 g to dissolve in 20 ml of distilled water, then adjust to 25 ml.
  • Solution of MgSO 4 at 2mM (Sigma, ref.M7506) 6 mg to be dissolved in 25 ml of distilled water.
  • Tetrasodium EDTA solution with SOOmM (Sigma, ref.ED4S) 3.8 g to be dissolved in 20 ml of distilled water; kept at 4 ° C. - PREPARATION OF LYSE TAMPON TPOUR 100MU
  • leupeptin is not added because it inhibits the proteasome activity.
  • the pellet is washed and resuspended with 200 ⁇ l of PBS, 1% NP40 (Amersham Pharmacia Biotech, US19628) and centrifuged at 1000 g for 5 minutes After three successive washes, the pellet was deposited on an SDS-PAGE gel and then transferred to a nitrocellulose membrane The membrane was then incubated with monoclonal anti-tyrosinase antibody for one hour (monoclonal antibody!
  • Tyrosinase Ab-I (clone T311) Lab vision corporation) (1/2000) .
  • the Westem-blot was revealed through to a peroxidase-coupled anti-mouse immunoglobulin antibody (1/5000), and to the ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech, ÎMA9310).
  • Phaeodactylum tricomutum on the synthesis of melanin different cultures of melanocyte cells of the MNT-I line were carried out (culture medium supplemented or not, by extracts of the alga Phaeodactylum tricomutum, by fatty acids, or by an inhibitor proteasome proteolysis Mgl32).
  • proteasome activities For the determination of proteasome activities, cells were lysed at 72h after cell processing and protein concentration was determined.
  • the concentrations are expressed as percentages by weight.
  • the extract used in the examples below is the E2 extract. 1. Cosmetic day cream depiqmentante form of emulsion-qei
  • composition prevents the appearance of pigment spots, in people predisposed to this phenomenon during exposure to intense sunlight. It should be noted that the presence of a high concentration of sunscreen makes it possible to compensate for the decrease in natural protection, as a consequence of the drop in the melanin content. Cosmetic lotion visa ⁇ e to lighten the complexion
  • This lotion for lightening complexion is used after cleansing and cleansing the skin.
  • a drop of this highly concentrated composition of serum is applied on the face generally before the application of a cream for
  • This serum is usually used for one to two weeks of treatment to obtain or maintain a lightening of the complexion, 5.
  • Cosmetic lotion for lightening body hair is usually used for one to two weeks of treatment to obtain or maintain a lightening of the complexion, 5.
  • This lotion is applied on the hairy areas to be lightened, especially the arms, for the duration sufficient to obtain a progressive lightening of the hairs.
  • Ammonium persulfate (NH 4 J 2 S 2 O 8 : (Sigma; A1433) at 10%, ie 100 mg / ml
  • Bromophenol blue 1OX saturated solution: put a spatula tip of bromophenol blue in 5 ml of 2X Laemmli Buffer, shake, sonicate, centrifuge and recover only the supernatant. These solutions are stored at room temperature
  • the Leamli buffer is not compatible with the reagent kit, it is essential to eliminate it to perform the assay by this method.
  • the tubes are placed at least 10 min. at -20 ° C. Then they are centrifuged at 17,000G, 10 min. at 4 ° C.
  • the supernatant is removed by inversion, after evaporation of acetone the pellet is dissolved in 50 ⁇ l of 0.1 M NaOH and the proteins are assayed by the Bradford method. (1/10 dilution of the sample).
  • this lysis buffer do not interfere with the reagent of the Biorad kit at this concentration (100 ⁇ l of sample / well). Only the sample must be diluted or not to fit in the range and preferentially in the upper part.
  • BSA mother solution 2mg / m! (Sigma, A2153, 4 ° C) The range is prepared in Eppendorf tubes and can be frozen or stored at 4 ° C.
  • the reagent (Coomassie Blue G250) is diluted extemporaneously to 1/5 (can be stored for 1 hour).

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Abstract

L'invention concerne l'utilisation dans une composition cosmétique d'un extrait de l'algue Phaeodactylum tricornutum, en tant qu'agent actif dépigmentant destiné en particulier à atténuer ou supprimer les taches pigmentaires de la peau ou à éclaircir le teint ou les poils ou les cheveux. L'extrait est de préférence un extrait lipidique. L'invention concerne également une méthode de soin cosmétique destinée à atténuer ou à supprimer les taches pigmentaires de la peau ou à éclaircir le teint ou les poils ou les cheveux, caractérisée en ce qu'elle comprend l'application sur au moins une zone concernée de la peau, d'une composition cosmétique contenant cet extrait.

Description

Utilisation d'un extrait d'algue Phaeodactylum pour dépigmenter la peau
La présente invention concerne l'utilisation d'un extrait de l'algue
Phaeodactylum tricomutum comme agent cosmétique dépigmentant ainsi qu'une méthode de soin cosmétique de la peau destinée à atténuer ou supprimer les taches pigmentaires ou à éclaircir le teint, les poils ou les cheveux.
De nombreux agents dépigmentants sont connus dans l'état de la technique antérieur. Le protéasome est un complexe protéolytique multienzymatique intracellulaire très important dans la maintenance cellulaire puisqu'en charge notamment de l'élimination des protéines endommagées (Friguet B. et al., Protein dégradation by the protéasome and its implication in ageing, Ann NY Acad Sci (2000) 908:143-154). Le système protéasomal est constitué d'un complexe catalytique, le protéasome 2OS et de plusieurs composants régulateurs qui influent sur son activité et sa spécificité. L'association du régulateur 19S au protéasome 2OS forme le protéasome 26S qui assure la dégradation des protéines ubiquitinées. Le protéasome est localisé dans les cellules de mammifères à la fois dans le cytosol et le noyau, et il existe des interactions avec le reticulum endoplasmique et la membrane cellulaire. Le protéasome 2OS a une masse moléculaire de 700 kDa et est composé de 14 sous-unités différentes codées par des gènes soit de type α, soit de type β. Les 14 sous-unités sont arrangées comme un empilement cylindrique de 4 anneaux de 7 sous-unités, les anneaux apicaux étant constitués de sous unités α et les anneaux centraux de sous-unités β. Ce complexe protéolytique clive préférentielfement les protéines à l'extrémité C-terminale des résidus basiques (activité "trypsine- similaire"), hydrophobes (activité "chymotrypsine-similaire") et acides (activité "peptidylglutamyl-peptide hydrolase"). Ces activités peptidases sont portées par 3 sous-unités β différentes et sont localisées à l'intérieur de la structure, évitant ainsi la dégradation intempestive des protéines cellulaires mais posant le problème de l'accessibilité des sites actifs à leurs substrats potentiels. Enfin, au cours du vieillissement cellulaire, on assiste à une accumulation de protéines endommagées porteuses de groupements carbonyles, signature de modifications des aminoaddes par oxydation, qui s'explique au moins en partie par une baisse de l'activité du protéasome (Petropoulos, I. et al,., Increase of oxidatively modifiée! protein is associated with a decrease of protéasome activity and content in aging epidermal cells. J Gerontol A Biol Sci. (2000) 55A : B220-227 et Friguet B., Oxidized protein dégradation and repair in ageing and oxidative stress, FEBS Letters (2006) 580:2910-2916).
Par ailleurs, Ando H. et a!., dans Fatty acids regulate pigmentation via proteasomal dégradation of tyrosinase ; a new aspect of ubiquitin- proteasome function. J Biol Chem. (2004). 279 : 15427-33, ont démontré que, dans des cellules B16F10, (lignée mélanocytaire de souris qui exprime la tyrosinase de manière stable et produit de la mélanine), la tyrosinase est dégradée par la voie de protéolyse dépendante du protéasome et que cette dégradation peut être stimulée à la suite d'un traitement par l'acide linoléique ou a contrario diminuée par un traitement par l'acide palmitique. L'algue Phaeodactylum tricornutum, est une algue unicellulaire diatomée qui fait partie du phytoplancton et qui provient des climats tempérés.
Il a été décrit dans la demande internationale WO 02/080876 au nom de la Demanderesse, l'utilisation d'un extrait de cette algue comme agent cosmétique destiné à protéger activement la peau contre les effets néfastes d'une exposition aux UV ou pour prévenir ou retarder les effets du vieillissement cutané.
Selon cette demande internationale, les propriétés de cet agent cosmétique s'expliquent par le fait que cet extrait favorise l'activation du protéasome des cellules de la peau, en particulier des kératinocytes, conduisant ainsi à favoriser la dégradation des protéines oxydées.
Il a également été décrit dans la demande internationale
WO 2006/008401 un procédé de préparation d'un milieu de culture clarifié d'au moins un micro-organisme marin et/ou d'eau douce phytosynthétiquβ et l'utilisation de ce milieu de culture clarifié notamment dans le domaine de la cosmétique.
Ce document, même s'il cite parmi les applications possibles des milieux de culture clarifiés des applications comme agent soit pigmentant, soit dépigmentant, ne s'intéresse nullement à l'utilisation de la biomasse en elle-même ou de ses extraits. Au surplus, il indique que Ie clarifié de l'algue Phaedodactylum tricornutum ne présente aucune propriété dépigmentante.
On rappelle que le mécanisme de formation de la pigmentation cutanée fait intervenir ia synthèse de la mélanine au sein des mélanocytes. Ce mécanisme fait intervenir schématiquement les principales étapes suivantes :
Tyrosine — * Dopa *- Dαpaquinone *- Dopachrome *- Mélanine
La tyrosinase est une enzyme qui joue un rôle essentiel dans cette suite de réactions. La tyrosinase catalyse notamment la réaction de transformation de la tyrosine en Dopa (Dihydroxyphénylalanine) et la réaction de transformation de la Dopa en Dopaquinone conduisant à la formation des pigments mélaniques.
Une substance est reconnue comme dépigmentante si elte agit directement sur les mélanocytes en inhibant l'activité de ces cellules ou si elle bloque l'une des étapes de la biosynthèse de la mélanine. C'est le cas notamment lorsque la substance considérée inhibe l'une des enzymes impliquées dans la mélanogénèse.
De façon surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que les extraits de l'algue Phaeodactylum tπcornutum présentent de remarquables propriétés dépigmentantes de la peau, alors même que cette algue est réputée contenir des quantités substantielles d'acide palmitique connu d'après la publication scientifique citée ci-dessus (Ando et al., 3. Biol.
Chern. (2004) 279, 15427-33), pour son activité inhibitrîce de la dégradation de la tyrosinase.
Ainsi, selon un premier aspect, l'invention concerne l'utilisation dans une composition cosmétique d'un extrait de l'algue Phaeodactylum tricornutum, en tant qu'agent actif dépigmentant destiné en particulier à atténuer ou à supprimer les taches pigmentaires de la peau ou à édaircir le teint, les poils ou les cheveux..
Elle concerne plus particulièrement selon ce premier aspect, une utilisation selon laquelle l'agent actif est destiné à dépigmenter ou à blanchir la peau.
Selon un deuxième aspect, l'invention concerne une méthode de soin cosmétique destinée à atténuer ou supprimer les taches pigmentaires de la peau ou à édaircir te teint, les poils ou les cheveux, caractérisée en ce qu'elle comprend l'application sur au moins une zone concernée de la peau, d'une composition cosmétique contenant cet extrait.
Selon ce deuxième aspect, l'extrait est utilisé en quantité efficace pour obtenir l'effet recherché et, en particulier, induire une stimulation de la dégradation de la tyrosinase dans la peau.
Dans les deux aspects ci-dessus, l'extrait d'algue est utilisé dans la composition à une concentration comprise de préférence entre 0,001 et 5% en poids, encore plus préférentieilement entre 0,001 et 1% en poids.
Les essais réalisés par les inventeurs de la présente invention ont montré que l'extrait est d'autant plus actif qu'il contient davantage d'acides gras.
C'est pourquoi on utilisera selon chacun des deux aspects de l'invention, un extrait de Phaeodactylum tricomutum aussi riche que possible en acides gras et de préférence un extrait contenant au moins 40% en poids d'acides gras, de préférence au moins 60% en poids.
Pour obtenir un teî extrait, on pourra utiliser tout procédé permettant l'obtention d'un extrait riche en lipides.
Selon une première variante, afin d'obtenir un extrait riche en lipides, on utilisera un procédé comprenant au moins une étape d'extraction par un solvant ou un milieu solvant suffisamment apolaire pour extraire les acides gras.
Un tel solvant ou milieu solvant sera désigné ci-après par solvant apolaire.
A titre d'exemple de tels solvants apolaires, on citera l'isopropanol, l'hexane, le cyclohexane et l'heptane.
Toutefois, il est avantageux de ne pas se limiter à une telle étape de traitement de l'algue par un solvant apolaire mais d'utiliser dans bien des cas, une succession d'étapes d'extraction parmi lesquelles on trouve en plus de l'étape d'extraction par un solvant apolaire, au moins une étape d'extraction par un solvant polaire.
La finalité d'une telle étape d'extraction par un solvant polaire est de provoquer l'hydrolyse d'acides gras estérifiés, en particulier des glycérides, et de les extraire sous forme de sels.
D'une façon avantageuse, un tel procédé comprenant au moins une étape d'extraction par un solvant apolaire, comprend en particulier au moins une étape d'extraction par un solvant d'extraction choisi parmi les alcools en Ci-Ce, les mélanges hydroalcooliques de ces alcools, les polyalcools en C2-C6 tels que l'éthylèneglycol, les solvants chlorés tels que le chloroforme et le dichlorométhane, les esters en C3-C6 d'acides organiques tels que l'acétate d'éthyle, les alcanes en Ce-Cio tels que l'heptane, l'hexane ou le cyclohexane, les éthers en Cs-C8 tels que le diisopropyléther, iedit solvant étant éventuellement alcalinisé.
Selon une variante particulièrement avantageuse du procédé utilisé pour préparer l'extrait de l'invention, on applique à l'algue une première étape d'extraction par un mélange hydroalcoolique alcalinisé, l'alcool dudit mélange hydroalcoolique étant de préférence choisi parmi l'isopropanol, l'éthanol et le méthanol, ladite étape permettant de récupérer les acides gras sous forme salifiée dans la phase hydroalcoolique.
Selon une variante particulièrement avantageuse du procédé ci- dessus selon lequel on traite l'algue dans une première étape par un mélange hydroalcooîîque alcalinisé, on fait subir à la fraction ainsi récupérée, différentes opérations visant à récupérer dans une phase apolaire, un extrait particulièrement enrichi en acides gras.
En particulier, on acidifie le mélange hydroalcoolique alcalinisé avant de lui appliquer une étape d'extraction liquide/liquide au moyen d'un solvant apolaire.
Un tel procédé comprend également une étape de récupération d'une huile contenant ledit extrait par élimination dudit solvant apolaire.
Ce solvant apolaire sera avantageusement Theptane, l'hexane ou le cyclohexane.
D'une manière générale avant toute opération d'extraction, l'algue est avantageusement congelée. De préférence la congélation est réalisée à une température située entre - 400C et - 200C environ et pendant une durée comprise de préférence entre 1 et 7 jours environ. Cette étape préalable est avantageusement utilisée pour réaliser un choc thermique par contact avec le futur solvant d'extraction afin de faciliter la décantation de la silice (issue du squelette des cellules de l'algue). L'algue est ensuite mise en contact avec le solvant d'extraction.
Selon une variante de réalisation avantageuse, l'algue congelée est plongée directement dans Se solvant d'extraction chauffé. On réalise également avantageusement une macération de l'algue dans le solvant d'extraction à température ambiante.
Selon une variante de réalisation avantageuse, on réalise une macération de l'algue à température ambiante et de préférence pendant une durée comprise entre 5 minutes et 80 minutes environ, et de préférence encore, pendant une durée comprise entre 20 minutes et 40 minutes environ.
Selon encore une variante de réalisation avantageuse, l'extraction est réalisée sous reflux. Selon encore une autre variante de réalisation avantageuse, l'extraction peut-être réalisée sous atmosphère inerte, de préférence sous atmosphère saturée en azote. Ceci permet d'éviter en particulier une dégradation oxydative prononcée des molécules actives.
Le conditionnement de cet extrait est réalisé avantageusement sous gaz inerte tel que de l'azote, des antioxydants pouvant être également ajoutés afin de protéger les molécules actives.
Selon une variante de réalisation avantageuse, la quantité de solvant d'extraction utilisée est comprise entre 0,1 litre et 20 litres environ, de préférence comprise entre 2 litres et 10 litres environ, pour une quantité de 100 g de l'algue, exprimée en poids sec d'algue.
Selon encore une variante avantageuse d'un procédé où l'étape d'extraction par un solvant apolaire est précédée d'une extraction avec un mélange hydroalcoolique alcalinisé, l'extrait de l'algue précité est obtenu après la succession des étapes suivantes dont certaines sont décrites ci- dessus : aï l'algue est congelée comme décrit précédemment puis plongée dans le solvant d'extraction b) Une macération de l'algue est effectuée c) le solvant d'extraction est alcalinisé jusqu'à un pH compris entre 10 et 14, de préférence à un pH égal à 13, par exemple avec une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium ou avec une solution aqueuse d'hydroxyde de potassium, d) les insolubles sont éliminés de la phase hydroalcooiique, e) de l'eau distillée est ajoutée à la phase hydroalcoolique, f) la solution hydro-alcoolique ainsi obtenue est lavée par un procédé îiquide/liquide avec un solvant apolaire non miscible avec la phase hydroalcoolique, tel que par exemple l'heptane, l'hexane ou le cyclohexane, g) la phase contenant le solvant apolaire est éliminée, h) la phase hydro-alcoolique récupérée après élimination de la phase contenant le solvant apolaire, est acidifiée jusqu'à un pH compris entre 1 et 3, de préférence à un pH égal à 2, par exemple avec une solution aqueuse d'acide sulfurique ou avec une solution aqueuse d'acide chlorhydrique, i) la solution obtenue après acidification subit une extraction liquide-liquide avec un solvant apolaire non miscible avec la phase alcoolique ou hydro-alcoolique, tel que par exemple l'heptane, l'hexane ou le cyclohexane, j) la phase hydro-alcoolique est ensuite éliminée, k) la phase contenant le solvant apolaire récupérée après élimination de la phase hydro-alcoolique subit une évaporation afin d'obtenir une huile exempte de solvant apolaire, cette huile étant l'extrait recherché selon l'invention.
L'empioi d'un alcool alcalinisé, puis acidifié permet d'obtenir un extrait aux caractéristiques visuelles et olfactives acceptables dans des compositions cosmétiques (couleur jaune, et odeur acceptable).
Selon un deuxième mode de réalisation avantageux de l'invention, l'extrait de l'algue précité est obtenu par extraction de l'algue au CO2 supercritique. L'usage de ce solvant particulier implique que l'algue ait été au préalable lyophilisée.
D'autres caractéristiques, buts et avantages de la présente invention apparaîtront clairement à la lumière de la description explicative qui va suivre faite en référence à plusieurs exemples de réalisation de l'invention, ainsi qu'à des essais d'activité comparatifs, et des exemples de formulation de compositions cosmétiques, donnés simplement à titre d'illustration et qui ne sauraient donc en aucune façon limiter la portée de l'invention. Dans les exemples, sauf indication contraire, les proportions données sont exprimées en pourcentage en poids. La température est en degré Celsius et la pression est la pression atmosphérique.
Les figures sont données en référence aux tests présentés dans la partie II des exemples.
Elles illustrent respectivement, de façon comparative :
- figure IA : l'activité chymotrypsine similaire,
- figure IB : l'activité hydrolase-post-glutamique similaire,
- figure IC : l'activité trypsine similaire, - figure 2A : les résultats du Westem-blot anti-protéasome, obtenu pour des lyses à 24 h,
- figure 2B : les résultats du Western-blot anti-protéasome, obtenu pour des lyses à 72 h,
- figure 3A : les résultats des Western-blot anti-ubiquitine, obtenu pour des lyses à 24 h,
- figure 3B : les résultats des Western-blot anti-ubiquitine, obtenu pour des lyses à 72 h,
- figure 4A : les résultats du Western-blot anti-tyrosinase, pour des lyses à 24 h, - figure 4B : les résultats du Western-blot anti-tyrosinase, pour des lyses à 72 h,
- figure 5 : la mesure de l'activité tyrosinase,
- figure 6 : le résultat âes tests d'immunoprécipitation.
EXEMPLES
I. PREPARATION DΕXTRAITS SELON L'INVENTION
Exemple 1 Extraction avec un solvant polaire, tel que i isopropanoi (IPA)f suivant un premier procédé.
Selon le mode préféré du procédé, l'ensemble de l'extraction est réalisé sous atmosphère inerte (saturation en azote) afin d'éviter une dégradation prononcée des molécules actives.
Dans cet exemple, on utilise 250 kg de biomasse (Phaeodactylum tricornutum). Cette biomasse, qui est congelée à -2Q°Cf puis plongée dans de l'isopropanol (IPA) porté au reflux à 80-830C, et ce, sous agitation. Le choc thermique permet de faciliter la décantation de la silice (issue du squelette des cellules de l'algue).
La quantité de solvant utilisée est de 10 litres d'IPA pour 1 litre d'eau contenue dans la biomasse. Ainsi, pour un pourcentage de matière sèche de 30%, les 250 kg précités de biomasse se répartissent comme suit en une quantité de matière sèche de 75 kg et 175 kg d'eau. La quantité d'IPA utilisée est ici de 1750 kg.
L'ensemble (biomasse + IPA) est maintenu au reflux pendant une demi-heure sous agitation à environ 800C, avant d'être refroidi vers 500C. Après le refroidissement de la biomasse et de PIPA vers 5O0C, l'ensemble est transféré dans un filtre de type GUEDU afin de réaliser la séparation biomasse épuisée/extrait d'algue solubilisé dans I1IPA.
L'extrait est concentré dans un réacteur batch (facteur de concentration = 71,5). L'extrait concentré présente un aspect huileux. Cet extrait huileux est ensuite repris dans de l'IPA à froid à raison de 10 kg de solvant pour 1 kg d'huile. L'agitation est prolongée pendant 20 minutes. Le jus est ensuite filtré (ceci permet d'éliminer la boue collante résiduelle).
Un traitement de décoloration et de désodorisation est réalisé en deux batchs dans un réacteur Schott de 80 litres et dure 30 minutes à température ambiante par addition de zéolithe et de charbon actif. La quantité de zéolithe (ABSENT 2000, fournisseur UOP) ajoutée est de 0,94 kg et celle de charbon actif (CXV, fournisseur CECA) est de 1,6 kg. Le rapport charbon sur zéolithe est de 1,7. La zéolithe et le charbon sont ensuite éliminés par filtration sur papier.
Des antioxydants (DL α-tocophérol à 0,05% de concentration finale en poids et palmitate d'ascorbyle à 0,05% de concentration finale en poids) sont incorporés par une solution mère dans de l'IPA. Le filtrat contenant les antioxydants est ensuite concentré en batch, sous gaz inerte te! que de l'azote jusqu'à l'obtention d'une huile de couleur brune.
Cette huile sera nommée ci-après : l'extrait El selon l'invention de l'algue Phaeodactylum trîcornutum. R2008/050394
10
Exemple 2 Extraction suivant un second procédé en deux étapes.
L'extraction débute par une dispersion de 49,8 kg de masse sèche 5 congelée issue de 250 kg de biomasse (Phaeodactyium tricornutum), soit environ 20% en masse sèche dans 539 kg d'éthanol anhydre à 96%, alcalinisé par 9 kg de solution aqueuse sodique à 30,5%. Après une macération de 30 minutes au reflux de l'éthanol et sous atmosphère azotée, l'ensemble est refroidi à 180C. io Les insolubles sont alors séparés par essorage sous azote et sont éliminés.
Les 573,9 kg de filtrat sont additionnés de 151 kg d'eau distillée. Cette phase hydro-alcoolique est agitée lentement pendant 10 minutes pour être ensuite lavée grâce à un procédé liquide/liquide avec 162 kg
)5 d'heptane. L'épiphase heptanique de la partition liquide/liquide est éliminée. L'hypophase est récupérée car elle contient les acides gras sous forme saline, en raison de l'alcalinisation pratiquée au début de l'extraction. L'opération de lavage heptanique est répétée deux autres fois et l'hypophase est récupérée systématiquement. 0 Les 720 kg d'hypophase ainsi obtenus sont acidifiés par ajout de
2,8 kg d'acide sulfurique pour amener le pH à une valeur de 2,2 et obtenir ainsi les acides gras sous forme acide. L'ensemble de la solution est agité 10 minutes sous azote pour être ensuite soumis à une extraction liquide/liquide avec un solvant apolaire, ledit solvant apolaire étant5 constitué ici par une fraction de 158 kg d'heptane. L'opération de lavage à l'heptane est répétée cinq fois pour récupérer au total 697 kg de phase heptanique issus des cinq fractions contenant les acides gras libres. Cette phase évaporée à sec à l'évaporateur rotatif puis par distillation moléculaire fournit l'extrait actif selon l'invention soit une quantité0 représentant 0,65 kg d'huile.
L'huile produite est un liquide homogène et présente une couleur jaune foncée.
Cette huile sera nommée ci-après l'extrait E2 selon l'invention de l'algue Phaeodactyîum Tricornutum. 5 L'extrait E2 tel qu'obtenu selon (a procédé sus-mentionné, présente la composition suivante en acide gras (% en poids) : - acide myristique 4,16%
- acide palmitique 13,82%
- acide palmitoléique 16,48%
- acide eicosapentaènoïque 24,75%
- acide docosahexaènoïque 1,75%
II. TESTS DE MISE EN EVIDENCE DE L'ACTIVITE DES EXTRAITS DE LINVENTÏON SUR LE PRQTEASOME DE MELANOCYTES ET SUR L7ACTIVITE TYROSINASE DE CES MELANOCYTES
1. Principes des tests
Les tests décrits ci-après ont pour but de caractériser l'influence des extraits de l'invention sur les différentes activités du protéasome des mélanocytes, en mesurant les différentes activités de ce protéasome.
Ils ont également pour but de caractériser l'influence des extraits de l'invention sur la quantité de protéines ubiquitinées.
Ils ont également pour but de caractériser l'effet des extraits de l'invention sur la quantité et l'activité de la tyrosinase.
Tous les essais décrits dans cette partie ont été réalisés en utilisant l'extrait E2 préparé selon l'exemple 2 ci-dessus.
2. Matériel et méthodes
2.1 Traitements des cellules MNTl (lignées cellulaires de méîanocytes humains) en vue de doser les activités du protéasome et de la tyrosinase
2.1A: Culture cellulaire
Les réactifs utilisés sont définis ci-après dans fe texte.
a) £ffîtoçjθie_suivi Ensemencement à JO
* MNTl, 10 6 cellules/boîte de diamètre 35mm en tripficate • Milieu de culture MNTl, 2 ml/boîte (voir composition ci-après)
Traitement à Jt
- Acide linoléique 25 μM
- Acide palmitique 25 μM
- Phaeodactylum 5 μg/mi
dans milieu MNTl + 1% BSA + Vitamine E 50 μM + Vitamine C ImM
- Acide linoléique 25 μM
- Acide palmitique 25 μM
- Phaeodactylum 5 μg/ml
dans milieu MNTl
+ 1% BSA (sérum d'albumine bovine) + Vitamine E 50 μM + Vitamine C
ImM
Agitation au barreau magnétique à 37° pendant Ih
- 2ème traitement à 34
+Cycloheximide 1 μg/ml (inhibiteur de la synthèse des protéines)
+ 120 nM Mgl32 pour le dosage de l'activité tyrosinase.
- Préparation lysats après 4h
2 rinçages au PBS (tampon phosphate salin)
Sur lit de glace ; récupération dans 150μl de tampon de lyse par grattage.
Congélation à -2O0C
- Dosage des protéines par la méthode de Bradford
- Dosage des activités du protéasome
b) Milieux et réactifs
- Milieu de culture MNTl
DMEM 4,5g/ml de glucose (Gibco ;61965-026) +20% SVF
+ 10% complément AIMV(Gibco :12055-091)
+1% Pyruvate de Na 100mM(Gïbco : 12360-039)
+ 1% d'acides aminés non essentiels, NEAA(Gibco : 11140-035)
- Solutions mères
-Acide linoléique (Sigma ;L1012)
2,8 mg/m! dans EtOH (0,25% dans milieu)
- Acide palmitique (Sigma ;P5585) 2,56 mg/ml dans EtOH (0,25% dans milieu)
- Phaeodactylum
2 mg/ml dans EtOH (0,25% dans milieu)
- Vitamine C
25,6 mg/ml dans PBS (1% dans milieu) - Vitamine E
21,55 mg/ml dans EtOH (0,1% dans milieu)
-Mgl32(Sigma ;C2211)
120μM dans DMSO (0,1% dans milieu)
-Cyclohexîmide (Sigma ;C7698)
- Tampon de Ivse
Tris-HCI 1,5 M, pH7,5
45,375g de Tris base (Sigma; TlSO3) à dissoudre dans 200 ml d'eau distillée, ajuster le pH à 7,5 avec HCI 12N puis compléter à 250 ml
Solution de saccharose à IM (Merck; réf.7654) 8,55g à dissoudre dans 20 ml d'eau distillée, puis ajuster à 25ml. Solution de MgSO4 à 2mM (Sigma; réf.M7506) 6 mg à dissoudre dans 25 ml d'eau distillée. Ou MgSO4,7H2O (Sigma; réf.M5921) 12,4 mg à dissoudre dans 25 ml d'eau distillée ; conserver à 4°C, Solution de Triton XlOO à 4% (Sigma; réf .XlOO)
0,8g à dissoudre dans 20 ml d'eau distillée. (très long) Aliquoter à 0,5 ml et conserver à -200C
Solution de PMSF à 4OmM '(Sigma; réf,P7626) 14mg à dissoudre dans 2 ml d'éthanol absolu. Aliquoter à 50 ml et conserver à 40Q 9 mois
Solution de leupeptine à 0,5 mg/ml (Sigma; réf,L2884; conservé à -
200C)
Solubie dans Peau.Aliquoter à 50 μl et conserver à -2O0C, 1 mois.
Solution de DL-Dithiothréitol à IM (Sigma; réf.D0632 conservé à 4°C) 0,154g à dissoudre dans 1 ml d'eau distillée. Aliquoter à 10 μl et conserver à -2O0C.
Solution EDTA tétrasodique à 50OmM (Sigma; réf.ED4S) 3,8g à dissoudre dans 20 ml d'eau distillée ; conservée à 40C.
- Préparation du tampon de lyse f pour IQOmD
Préparation d'une solution incomplète aliquotée à 4,39 ml et conservée à -2O0C ;
Solutions Volumes Concentrations finales
Tris-HCl 1 ,5M pH 7,5 0,33ml 5mM
Saccharose IM 25 ml 0.25M
MgSO4 2mM 10 ml 0,2mM
EDTA 50OmM 4 ml 2OmM
Eau distillée 48,47 ml
La solution complète est préparée extemporanément avec:
4,39 ml de solution incomplète + 500 μl de triton Î00X à 4% 0394
15
+ 10 μl de DTT (dithiothérîtol), IM
+ 50 μl de leupeptine 0,5mg/ml
+ 50 μl de PNSF (sulfure de phénylméthane sulfonyte) à 4OmM
5 pour le dosage d'activités enzymatiques la leupeptine n'est pas ajoutée car elle inhibe l'activité du protéasome.
2.1B: Dosage des protéines par la méthode de Bradford
(se reporter à la publication "A Rapid and Sensitive Method for the o Quantitation of Microgram Quantifies of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding", Bradford M. Anal. Biochem, (1976) 72:248-254
a) Préparation de la gamme étalon: 5 Solution mère de BSA; 50μg/ml (BIORAD; protéine standard; réf.500-
0006))
Figure imgf000016_0001
Dans chaque tube; addition de 200μl de bleu de Coomassie G250. Le bleu de Coomassie, est préparé extemporanément par dilution au 1/5 de la solution mère. b) Préparation des échantillons;
On procède comme suit :
- récupération des cellules dans le tampon de lyse puis traiter aux ultrasons avant de doser la concentration en protéines 5 Si la concentration protéique> 3mg/ml, les diluer au 1/100, puis prendre lOOμl d'extrait cellulaire dilué +700μl d'eau mQ + 200μl de bleu ou, si la concentration est faible, lOμl d'extrait cellulaire 10 +790μl d'eau mQ
+20ûμl de bleu
~ Agitation au vortex, attendre 5 minutes et lire à 595nm
15 2- IC : Dosage des activités du protéasome
Les cellules sont rincées deux fois avec du PBS puis chaque activité peptidase du protéasome est déterminée en utilisant un substrat peptidique fluorogène spécifique de chacune des activités, en présence et en absence d'un inhibiteur spécifique du protéasome, le MG 132 (Leu-Leu-
20 Leucinal). Les substrats peptidiques sont les suivants: Leu-Leu-Val-Tyr- amc (LLVY-amc) pour l'activité chymotrypsine similaire, Leu-Leu~Glu-na (LLE-na) pour l'activité hydrolase post-glutamique et Leu-Ser-Thr-Arg-amc (LSTR-amc) pour l'activité trypsine similaire. Le principe du dosage consiste à suivre au cours du temps l'augmentation de fluorescence dû à
25 la libération des fluorophores aminomethylcoumarine ou β-naphthylamine à partir des peptides fluorogènes.
a) Activité LLVY fChvmotrypsme simUaire)
30 i a.l - Principe
Protéasome (activité LLVY (chymotrypsînβ-sïmϋaïrβ)) N-Succinyl-LLVY-MCA ----» N-Sucαnyl- LLVY + MCA fluorescent
3.") 394
Lecture au spectrofluorimètre à la Songueur d'onde d'excitation de 350 nm et la longueur d'onde d'émission de 440nm.
a.2 - Réactifs
- Tampon TRIS 25mM pH 7,5
- 7- amino- 4-méthylcσumarine (MCA) (Sigma : A9891) Solution stock à 2OmM (3,5mg /ImI DMSO)
- Substrat fluorogénique : N-Sucdnyl-Leu-Leu-Val-Tyr~7-amido-4-Méthyt coumarine (Sigma : S6510)
Solution stock à 1OmM dans le DMSO
I a.3- Gamme étalon de MCA (7- amino- 4-méthγlcoumarine)
On procède comme suit :
- Diluer la solution stock de MCA à 4μM dans le tampon TRIS. - Dans une plaque 96 puits, distribuer chaque quantité en double
Figure imgf000018_0001
- Faire un blanc ; 200μl de tampon TRIS.
- Lire au spectroffuorimètre à une longueur d'onde d'excitation de 350nrn et une longueur d'onde d'émission de 440nm. Avec le FLUOstar (BMG) à 355nm et 460nm au gain 40.
Figure imgf000019_0001
On procède comme suit : - Dans une plaque 96 puits, introduire en double un volume fixe de lysat cellulaire (déterminé à partir de la concentration la plus faible en protéine des échantillons et qui doit correspondre à 20μg de protéines) et compléter à lOOμl avec du tampon TRIS.
-Ajouter lOOμl de substrat LLVY-MCA dilué préalablement à 25μM dans Ie tampon TRIS (12,5μM finale).
- Faire les lectures au spectrofluorimêtre à une longueur d'onde d'excitation de 355nm et une longueur d'onde d'émission de 460nm au gain 40 toutes les 2 minutes et ceci pendant 30 minutes.
Figure imgf000019_0002
Les résultats bruts sont exprimés en U.F./min, UF désignant la valeur fournie par l'appareil, exprimée en unité de fluorescence. Le dosage est réalisé sur 200μl de volume réactionnel contenant un volume V de iysat cellulaire fixé en fonction des concentrations de protéine des lysats. Les protéines dosées extemporanément sont exprimées en μg/μl.
A partir de la gamme étalon, l'activité peut-être exprimée comme suit, en pmol de MCA libéré /minute/mg de protéines : FR2008/050394
19
Vitesse moyenne U. F. /min x 200 x 10 6 x 10""° x 10i2 Protéine μg/μl x V.10 6 x coefficient de la pente a
avec a = 4,568.10*
b - Activité LLE (hydrolase post-qlutamîαue))
b.l - Principe
On étudie la réaction de clivage suivante
Protéasome (activité LLE (hydrolase post-glutamique)
N-CBZ-LLE-NA - > N-CBZ-LLE-+ NA fluorescent
Lecture au spectrofluorimètre à une longueur d'onde d'excitation de 333nm et une longueur d'onde d'émission de 410nm,
b.2 - Réactifs
- Tampon TRIS 25mM pH 7,5
- β-Naphtylamide (NA) (Sigma : N8381) Solution stock à 2OmM (5,73mg /2m! DMSO)
-Substrat fluorogénique N - CBZ- Leu-I_eu-G!u~β-Naphtylamine (Sigma : C0788)
Solution stock à 1OmM dans Ie DMSO
Figure imgf000020_0001
L'étalonnage est traité comme suit :
- Diluer la solution stock de NA à 4 μM dans le tampon TRIS. - Dans une plaque 96 puits, distribuer chaque quantité en double
Comme indiqué dans le tableau ci-dessous.
Figure imgf000021_0001
- Faire un blanc : 200 μl de tampon TRIS.
- Lire au spectrofluorimètre à une longueur d'onde d'excitation de 333nm et une longueur d'onde d'émission de 410 nm. Avec le FLUOstar (BMG) à 340 nm et 410 nm au gain 83.
' b=4 - Dosage de l'activité LLE (hydrofase post-gfutamîque)
On procède comme suit : - Dans une plaque 96 puits, introduire en double un volume fixe de lysat cellulaire (déterminé à partir de la concentration la plus faible en protéines des échantillons et qui doit correspondre à 20 μg de protéines) et compléter à lOOμl avec du tampon TRIS,
- Ajouter lOOμl de substrat LLE-NA dilué préalablement à 300μM dans le tampon TRIS (150μM finale). FR2008/050394
21
- Faire les lectures au spectrofluorimètre à une longueur d'onde d'excitation de 340nm et une longueur d'onde d'émission de 410nm au gain 83 toutes les 2 minutes et ceci pendant 35 minutes.
b.5 - Résultats
Les résultats bruts sont exprimés en U.F./min. Le dosage est réalisé sur 200μl de volume réactionnel contenant un volume V de lysat cellulaire fixé en fonction des concentrations de protéine des lysats.
Les protéines dosées extemporanément sont exprimées en μg/μl. A partir de la gamme étalon l'activité peut-être exprimée en pmol de MCA libéré/minute/mg de protéines ;
Vitesse moyenne U.FJmin x 200 x 1Û~6 x 10 "6 x 1012
Protéines μg/μl x V.10 ! x coefficient de la pente a
avec a = 0.966.104
c) Activité LSTR (trypsine-similaire)
Figure imgf000022_0001
Protéasome(activité LSTR (trypsine similaire))
Nt Boc LSTR-MCA - » Nt Boc LSTR + MCA fluorescent
Lecture au spectrofluorimètre à la longueur d'onde d'excitation de
350nm et la longueur d'onde d'émission de 440nm.
c.2 - Réactifs 050394
22
- Tampon TRIS 25mM pH 7,5
- 7- amino- 4-méthylcoumarine (MCA) (Sigma : A9891) Solution stock à 2OmM (3,5mg /ImI DMSO)
- Substrat fluorogénique : N-t-BOC-Leυ-Ser-Thr-Arg7-7-amido-4-Méthyl coumarine (Sigma : B4636)
Solution stock à 1OmM dans le DMSO
Inhibiteur du protéasome : Mg 132 (Z- Leu- Leu-Leu- CHO) (Affinity,
ZW8440)
Solution stock à 2OmM dans (e DMSO
c.3 - Gamme étalon de MCA
Le tracé de la courbe d'étalonnage est fait comme suit : (voir tableau ci- dessous)
- Diluer la solution stock de MCA à 4μM dans le tampon TRIS
- Dans une plaque 96 puits, distribuer chaque quantité en double :
Figure imgf000023_0001
- Faire un blanc ; 200μ! de tampon TRIS - Lire au spectrofluori mètre à une longueur d'onde d'excitation de 350nm et une longueur d'onde d'émission de 440nm. Avec le FLUOstar (BMG) à 355nm et 460nm au gain 30,
c.4 - Dosage de l'activité LSTR
-Dans une plaque 96 puits, introduire en double un volume fixe de lysat cellulaire (déterminé à partir de la concentration la plus faible en protéines des échantillons et qui doit correspondre à 50μg de protéines) et compléter à lOOμl avec du tampon TRIS.
-Ajouter lOOμ) de substrat LSTR-MCA dilué préalablement à 80μM dans le tampon TRIS (40μM finale). -En parallèle, vérifier qu'il s'agit bien de l'activité du protéasome en testant l'inhibiteur Mgl32.
- Ajouter au 50μg de protéines iOμl de solution de Mgl32 diluée préalablement à 400μM dans le tampon TRïS(20μM finale) et compléter à lOOμ! avec du tampon TRIS. Puis ajouter lOOμl de substrat LSTR dilué préalablement à 80μM dans le tampon TRIS (40μM finale). -Faire les lectures au spectrofluorimêtre à une longueur d'onde d'excitation de 355nm et une longueur d'onde d'émission de 460nm au gain 30 toutes les 2 minutes et ceci pendant 30 minutes.
j c.5 - Résultats
1 . _
Les résultats bruts sont exprimés en U.F./min, Le dosage est réalisé sur 200μl de volume réactionnel.contenant un volume V de lysat cellulairefixé en fonction des concentrations de protéine des lysats. Les protéines dosées extemporanément sont exprimées en μg/μl.
A partir de la gamme étalon l'activité peut-être exprimée en pmol de MCA libéré/minute/mg de protéines ; Vitesse moyenne U.F. 'min x 200 x 10 c x 10"6 x 1012 Protéine μg.-μl x VM O"' x coefficient de la pente a avec a = 1 ,728.10 '
2.1D : Mesure de l'activité tyrosiπase
Principe du dosage
Le dosage est basé sur la mesure de l'activité dopa-oxydase de la tyrosinase, Le principe du dosage est basé sur la détection de dopachrorne qui absorbe à 475 nm sur le FLUOstar (BMG) Matériel :
- Tampon de lyse
- Substrat : L-DOPA (Sigma, D-9628, PM 197,2) à 10 mM dans le PBS, préparé extemporanément du fait d'une auto-oxydation de la L- Dopa.
Des mélanocytes humains en culture ont été traités par 25 μM d'acide linoléique (+/- 120 nM Mgl32) ou 25 μM d'acide palmitique (+/- 120 nM Mgl32) ou 5 μg/mL de Phaeodactylum (+/- 120 nM Mgl32) dans un milieu MNTl contenant 1 % BSA, 50 μM vitamine E et ImM vitamine C. Les mélanocytes ont été récupérés et îysés à 72 heures après traitement. 50μg d'extrait sont ensuite incubés avec ImM de L-Dopamine pour une heure à 37°C. La mesure de l'activité tyrosinase s'effectuant à 475 nm toutes les 2 minutes à l'aide du lecteur de microplaques thermostaté à 370C. L'activité Dopa-oxydase est obtenue en DO/min/mg de protéines.
Le blanc étant réalisé avec du tampon de lyse en présence de L-DOPA.
2.2 Traitements des cellules MNTl en vue de doser le protéasome, les protéines ubiquitinées et la tvrosinase par Western Blot
2.2ÂΞ Culture cellulaire a) EEÔÎoçρJei Ensemencement à 30
MNTl 10 6 cellules/boîte de diamètre 35mm en quadruplate dans le milieu MNTl, 2 ml/boite
Traitement à 31
- Acide linoléïque 25 μM
- Acide palmitique 25 μM - Phaeodactylum 5 μg/ml
dans milieu MNTl
+ 1% sérum albumine bovine (BSA)+ Vitamine E (Vitamine E) 50 μM + Vitamineamine C (Vitamine C) ImM
- Acide linoléïque 25 μM
- Acide palmitique 25 μM
- Phaeodactylum 5 μg/ml
dans le milieu MNTl
+ 1% BSA+ Vitamine E 50 μM + Vitamine C ImM + 120 nM Mgl32
Agitation au barreau magnétique 37° pendant Ih
Préparation lysats à 12, 33 et 34
2 rinçages au PBS
Récupération du tapis cellulaire dans 150μl de Tampon Leamli 2X +DTT à 1% (1OmM) par grattage. 2 btes/tube Ependorf Congélation à -20 1e0C
Dosage des protéines (Bradford) et Western Blot La méthode de dosage des protéines est la même que celle utilisée précédemment de même que celle de Western-Blot, Suite au dosage des protéines dans des tubes Eppendorf, les échantillons sont dilués dans du tampon Laemmii 2X afin d'obtenir lμg/μl de protéines. A ces solutions d'échantillons sont ajoutés du bleu de bromophénol 1OX. Les échantillons peuvent être congelés à -2O0C.
b) Milieux et réactifs
- Milieu de culture MNTl
DMEM 4,5g/ml de glucose (Gibco :61965-026) +20% SVF
+10% complément AIMV(Gibco :12055-091) +1% Pyruvate de IMa 100mM(Gibco : 12360-039) + 1% NEAA(GiDCO : 11140-035)
- Solutions mères
-Acide linoléique (Sigma ;L1012)
2,8 mg/ml dans EtOH (0,25% dans milieu)
- Acide palmitique (Sigma ;P5585)
2,56 mg/ml dans EtOH (0,25% dans milieu) - Phaeodactylum
2 mg/ml dans EtOH (0,25% dans milieu)
- Vitamine C
25,6 mg/ml dans PBS (1% dans milieu)
- Vitamine E 21,55 mg/ml dans EtOH (0,1% dans milieu) -Mgl32(Sigma ;C2211) 120μM dans DMSO (0,1% dans milieu)
- Tampon de lyse
Solution de DL-Dithiothréitol à IM (Sigma; réf. D0632 conservé à 40C) 0,154g à dissoudre dans 1 ml d'eau distillée.
Aliquoter à 10 μl et conserver à -2O0C.
» Tampon d'échantillon réducteur Laemmlï 2X (dénaturant) Tris-HCL 0,06M pH6,8 ; SDS 2,3% ; Glycérol 10% - tampon de gel de concentration Tris 0,5M pH 6,8
6,25ml
- SDS 10% 1 1.50 ml
- Glycérol 5 ml
- Eau distillée compléter à 50 ml
2.2B: Western-biot
5 a) Préparation des échantillons et électrophorèse
L'électrophorèse des protéines est réalisée en minigel de polyacrylamide de lmm à 1,5mm d'épaisseur, en conditions dénaturantes et réductrices, en tampon discontinu selon la méthode de Laemmli (1970). Les gels à 12% T, 2.7% C permettent de séparer les protéines à faibles 10 poids moléculaires variant de 20 à 120 kDa. Et les gels à 8% T ; 2,7%C les protéines à hauts poids moléculaires de 35 à 250 kDa.
Toutes les solutions nécessaires à l'élaboration des gels sont présentées en annexe A ci-après.
] 5 - GeI de séparation
Ce gel peut être coulé soit la veille soit le jour même mais de toute façon une à deux heures avant la migration.
Le coulage du gel est réalisé à l'aide d'une pipette jusqu'à environ 0,5 mm du bas du peigne prévu pour le gel de concentration. De l'éthanol0 absolu est ajouté doucement en surface pour obtenir une ligne de base régulière (± ImI /gel).
- Gel de concentration (Stacking GeI)
L'éthanol est éliminé. 2,5ml de gel est coulé à l'aide d'une pipette Pasteur de transfert en polyéthylène (Biorad, réf.223-9528) puis les peignes sont insérés. Après une heure le gel est polymérisé.
Préparation des échantillons
Avant de récupérer tes cellules des boîtes elles sont rincées au PBS 2 fois. Après le dernier rinçage le PBS est éliminé au maximum. Les cellules sont récupérées dans le tampon Laemmli 2X + 10 mM de DTT
(voir Annexe A ci-après) par grattage (5.10.6 cellules / ml de tampon de lyse minimum). Les lysats récupérés dans des tubes Eppendorf 1,5ml sont congelés à -2O0C
Avant de réaliser l'électrophorèse les lysats décongelés sont chauffés à 95°C pendant 10 min et les protéines sont dosées.
Le dosage des protéines est réalisé pendant la polymérisation du gel de séparation ou la veille (voir annexe C).
Dans des tubes Eppendorf, les échantillons sont dilués dans du tampon Laemmli 2X afin d'obtenir des solutions identiques <lμg/μl de protéines. A ces solutions d'échantillons sont ajoutés du bleu de bromophénol 1OX.
Dépôts
Les échantillons sont chauffés à 950C pendant 5 min.
Le volume à déposer est fonction de la quantité de protéine désirée (vol. maxî= 25 μL pour un gel de 1mm et 40μL pour un gel de 1,5mm). 10 μg de protéines soit 10 μl. est fa quantité de référence, ensuite elle est adaptée selon l'expression de la protéine ciblée.
Les peignes sont retirés. 200 ml de tampon de migration IX sont versés sur les gels, dans le compartiment central entre les deux gels, vérifier l'étanchéité, puis dans la cuve au quart, Les échantillons sont déposés à S'aide d'une pointe effilée adaptée sur la micropipette ainsi que 10 μl de témoins de masse moléculaire précolorés (Biorad, Prestained SDS-PAGE standards Low Range ; réf.161- 0305 ) ou (Amersham, FuIl Range Rainbow ; réf. RPN800W).
Migration
L'électrophorèse est réalisée à température ambiante, à 200V. Celle-ci est arrêtée lorsque le front de migration est sorti du gel (environ 40 min. de migration).
b) Transfert semi-sec des protéines sur membrane
Deux feuilles de papier filtre épaisses (Biorad, réf.17033960) et les membranes de cellulose (Biorad, réf.162-0115) sont trempées dans le tampon de transfert de Towbin ét al. (1979) à l'origine de cette méthode (voir annexe B).
Dans l'appareil de transfert semi-sec (Biorad) une feuille de papier filtre épaisse humidifiée est déposée sur l'anode.
Une fois la migration terminée, le gel de concentration est éliminé et le gel de séparation est déposé sur la membrane de cellulose. La membrane, Ie gel sont déposés sur la feuille de papier filtre. La deuxième feuille de papier filtre est déposée sur le gel.
Au cours de la fabrication du "sandwich", il faut éliminer toutes bulles d'air à l'aide d'une tige en verre car elles gêneraient le transfert. L'appareil est fermé par un couvercle constitué de la cathode.
Le transfert de protéines est réalisé à 10 V pendant lh30 min. c) Marquage au rouge Ponceau
Pour vérifier la qualité du transfert les protéines sont colorées au rouge Ponceau (Sigma ; P7170).
La membrane de cellulose est rincée à l'eau milliQ puis trempée dans un bain au rouge Ponceau IX pendant 10 min sous agitation. Elle est ensuite lavée dans plusieurs bains d'eau milliQ jusqu'à ce que la coloration ne subsiste que sur les bandes protéiques. La membrane est insérée dans un plastique et scannée.
Les bandes protéiques peuvent être quantifiées pour déterminer la totalité des protéines transférées.
d) Biocage des sites de liaisons aspécifiques
La membrane est placée sous agitation pendant une nuit à 40C ou lh30 à température ambiante dans une solution de blocage des sites de liaisons aspécifiques constituées de 5% de lait écrémé (Régilait) dans du tampon PBS-T préparé dans l'annexe B ci-après (20ml/membrane).
e) Immunodétection
Les références et les dilutions optimales des anticorps se trouvent en annexe D ci-après. Après blocage des sites non spécifiques, la membrane est rincée rapidement dans du PBS-T.
Ensuite, cette membrane est mise en présence de l'anticorps primaire dilué à la concentration optimale dans du PBS-T avec ou sans lait 5% (m/v) selon l'anticorps, pendant une heure sous agitation à température ambiante ou une nuit à 40C. Elle est ensuite rincée rapidement puis trois fois 10 min dans du PBS-T afin d'éliminer l'excès d'anticorps libre non fixé.
Puis elle est mise en contact avec l'anticorps secondaire adéquat couplé à la peroxydase dilué dans le PBS-T ou Ie lait 5% (5ml) sous agitation à température ambiante.
Après 45 min d'incubation, elle est rincée rapidement deux fois, puis lavée 5 fois pendant 5 min avec du tampon PBS-T et une dernière fois dans du PBS IX.
Egouttée, elle est placée sur un film alimentaire (SARAN), coté « protéines » vers le haut.
La membrane est révélée à l'aide d'un kit de détection par chimioluminescence (Amersham; ECL Western biotting réf.RPN2209), hautement sensible utilisant le luminol comme substrat de la peroxydase. Sous l'action de la peroxydase et d'un amplificateur, le luminol est oxydé et passe dans un état excité transitoire. Le retour à l'état fondamental se fait par émission de photons qui impressionnent un film autoradiographique placé sur la membrane.
1 ml de chacune des deux solutions du kit de détection sont mélangés, (2 ml, volume minimum nécessaire au recouvrement de la membrane).
Aussitôt, le mélange est versé uniformément sur la membrane et laissé en contact pendant exactement une minute à température ambiante. La membrane egouttée est enfermée sous film alimentaire Saran et mise sous cassette à l'abri de la lumière, puis recouverte d'un film autoradiographique pré-flashé (Amersham, Hyperfilm ECL réf RPN2103K). Après 5 minutes d'exposition, le film auto radiographique est révélé. Un nouveau film est réexposé si nécessaire, pour optimiser le signal désiré (jusqu'à Ih). Les bandes sont quantifiées grâce au logiciel Gels Analysts 3,01. 2.3 Préparation d'extraits protéiques de MNTl en vue de réaliser des immunoprécipitations de la tyrosinase
S 2.3A: Culture cellulaire
a) Protocole
Ensemencement à JO MNTl 10 6 cellules/boîte de diamètre 35mm, en triplicate Dans le milieu MNTl 2 ml/boites
Traitement à Jl
- Acide linoléique 25 μM - Acide palmitique 25 μM
- Phaeodactylum 2,5 et 5 μg/ml
dans milieu MNTl
+ 1% BSA+ Vitamine E 50 μM + Vitamine C ImM
- Acide linoléique 25 μM
- Acide palmitique 25 μM
- Phaeodactylum 2,5 et 5 μg/ml
dans milieu MNTl
+ 1% BSA+ Vitamine E 50 μM + Vitamine C ImM + 120 nM Mgî32
Agitation au barreau magnétique à 37° pendant Ih
Préparation des lysats et comptage à 32
2 rinçages au PBS Sur lit de glace ; récupération dans 150μl de Tampon de lyse par grattage. Congélation à -200C Rinçage au PBS
+0,5 ml Trypsine/EDTA
+0,5 ml PBS+10%SVF
Comptage compteur Z2
Sur 0,5 ml de suspension+ 10 ml Isoton
b) Milieux et réactifs
- Milieu de culture MNTl
DMEM 4,5g/ml de glucose (Gibco :61965-026) +20% SVF
+10% complément AIMV(Gibco : 12055-091) +1% Pyruvate de Na 100mM(Gibco : 12360-039) + 1% NEAA(Gibco : 11140-035)
- Solutions mères
-Acide linoléique (Sigma ;L1012) 2,8 mg/ml dans EtOH (0,25% dans milieu) - Acide palmitique (Sigma ;P5585)
2,56 mg/ml dans EtOH (0,25% dans milieu)
- Phaeodactylum
2 mg/ml dans EtOH (0,25% dans milieu)
- Vitamine C 25,6 mg/ml dans PBS (1% dans milieu)
- Vit E
21,55 mg/ml dans EtOH (0,1% dans milieu) -Mgl32(Sigma ;C2211) 120μM dans DMSO (0,1% dans milieu)
- Tampon de lyse
Tris-HC! 1,5 'M, pH7f5
45,375g de Tris base (Sigma; T1503) à dissoudre dans 200 ml d!eau distillée, ajuster le pH à 7,5 avec HCI 12N puis compléter à 250 ml Solution de saccharose à IM (Merck; réf.7654) 8,55g à dissoudre dans 20 ml d'eau distillée, puis ajuster à 25ml. Solution de MgSO4 à 2mM (Sigma; réf.M7506) 6 mg à dissoudre dans 25 ml d'eau distillée.
Ou MgSO4/7H2O (Sigma; réf.M5921) 12,4 mg à dissoudre dans 25 ml d'eau distillée ; conserver à 4°C. Solution de Triton XlOO à 4% (Sigma; réf. XlOO) 0,8g à dissoudre dans 20 ml d'eau distillée. (très long) Aliquoter à 0,5 ml et conserver à -2O0C
Solution de PMSF à 4OmM {Sigma; réf,P7626) 14mg à dissoudre dans 2 ml d'éthanol absolu. Aliquoter à 50 μl et conserver à 4°C, 9 mois Solution de leupeptine à 0,5 mg/ml (Sigma; réf.L2884; conservé à - 2O0C) Soiuble dans Peau.Aϋquoter à 50 μl et conserver à -200C, 1 mois.
Solution de DL-Dithiothréitol à IM (Sigma; réf.D0632 conservé à 40C) 0,154g à dissoudre dans 1 ml d'eau distillée. Aliquoter à 10 μl et conserver à -2O0C.
Solution EDTA tétrasodique à SOOmM (Sigma; réf.ED4S) 3,8g à dissoudre dans 20 ml d'eau distillée ; conservée à 4°C. - PREPARATION DU TAMPON DE LYSE TPOUR 100MU
Préparation d'une solution incomplète aliquotée à 4,39 ml et conservée à -2O0C :
Solutions Volumes Concentrations finales
Tris-HCl 1 ,5M, pH 7.5 0,33ml 5mM
Saccharose IM 25 ml 0.25M
MgSO4 2mM 10 ml 0,2mM
EDTA 50OmM 4 ml 2OmM
Eau distillée 48,47 ml
La solution complète est préparée extemporanément avec:
4,39 ml de solution incomplète + 500 μl de triton 100X à 4% + 10 μl de DTT IM
+ 50 μl de leupeptine û,5mg/ml + 50 μl de PMSF à 4OmM
pour le dosage d'activités enzymatiques la leupeptine n'est pas ajoutée car elle inhibe l'activité du protéasome.
2.3B: Protocole d'immunoprécipitation
Des mélanocytes humains en culture ont été traités par 25 μM d'acide linoléique (+/- 120 nM Mgl32) ou 25 μM d'acide palmitique (+/-
120 nM Mgl32) ou 5 μg/mL de Phaeodactylum (+/- 120 nM Mgl32) dans un milieu MNTl contenant 1 % BSA, 50 μM vitamine E et ImM vitamine C.
Les mélanocytes ont été récupérés et iysés à 24 ou 72 heures après traitement. Le lysat (500 μg de protéines) a été ensuite incubé avec 10 pL d'anticorps anti-tyrosinase (anticorps monocionai Tyrosinase Ab-I (cione T311) Lab vision corporation) ou anti-ubiquitine (Anti-monoubiquitine monoclonal (SC-8017, Santa Cruz)), pendant 1 heure à 4 0C. Ce mélange a été ensuite traité avec 50 μl de protéine A-Sepharase (Amersham Pharmacia Biotech, 17-5280-01) et incubé pendant 16 heures à 40C. Le mélange est ensuite centrifugé à 1000g pendant 5 min. Le culot est lavé et resuspendu avec 200μL de PBS, 1% NP40 ((Amersham Pharmacia Biotech, US19628) et centrifugé à 1000g pendant 5 min. Après trois lavages successifs, le culot a été déposé sur un gel SDS-PAGE puis transféré sur une membrane de nitrocellulose. La membrane a été ensuite incubée avec un anticorps monocional anti-tyrosinase pendant une heure (anticorps monoclona! Tyrosinase Ab-I (clone T311) Lab vision corporation) (1/2000). Le Westem-blot a été révélé grâce à un anticorps anti-immunoglobuiine de souris couplé à la peroxydase (1/5000), et au kit ECL (Amersham Pharmacia Biotech, ÎMA9310).
3. Résultats
3.1 Modulation de l'activité du protéasome induite par ajout d'extraits de l'algue Phaeodactylum tricomutum dans la lignée mélanocytaire MNT-I De manière à caractériser l'influence des extraits de l'algue
Phaeodactylum tricomutum sur la synthèse de la mélanine, différentes cultures de cellules mélanocytaires de la lignée MNT-I ont été réalisées (milieu de culture supplémenté ou non, par des extraits de l'algue Phaeodactylum tricomutum, par des acides gras, ou par un inhibiteur de la protéolyse protéasome dépendante Mgl32).
Comme exposé précédemment une étude antérieure a révélé que la culture de mélanocytes en présence d'acide linoléique conduisait à une diminution de la quantité de mélanine, en favorisant la dégradation de la tyrosinase par le protéasome ; et que la même culture réalisée en présence d'acide palmitique provoquait un effet inverse. Ces deux composés (acide linoléique et acide palmitique) ont été utilisés respectivement comme témoin positif et négatif pour caractériser l'effet des extraits de l'algue Phaeodactylum tricomutum sur l'activité de la tyrosinase, enzyme limitante de la synthèse de (a mélanine qui régit la pigmentation de la peau. A partir de ces mêmes extraits cellulaires de la lignée mélanocytaire MNT-I, une étude de l'activité du protéasome a été réalisée. A l'aide de peptides substrats synthétiques fluorogènes, spécifiques des trois sites catalytiques du protéasome 2OS, les activités du protéasome ont été mesurées.
En parallèle, à l'aide d'anticorps spécifiques les formes 2OS et 26S du protéasome ont été quantifiées par Western Blot.
Pour le dosage des activités du protéasome, les cellules ont été lysées à 72h après le traitement des cellules et la concentration en protéines a été déterminée.
Les résultats présentés dans les figures IAJB, remontrent que 72 heures après l'addition de l'extrait d'algue (Ph),ou d'acide linoléique les 3 activités peptidases du protéasome, mesurées à l'aide de peptides fluorogènes, augmentent et ceci, de manière significative (activités chymotrypsine similaire, hydrolase post-glutamique et trypsine similaire).
Par ailleurs, dans les mélanocytes traités par l'acide palmitique pendant 72 heures, les deux activités peptidases sont diminuées (activités chymotrypsine similaire et hydrolase post-glutamique). Les activités du protéasome mesurées à partir d'extraits cellulaires de lignée MNT-I cultivés en présence d'un inhibiteur de la protéolyse protéasome dépendante Mg 132 servent de contrôle positif. Tous ces résultats sont rassemblés dans le tableau 1 en annexe.
Dans le but de déterminer la cause de cette activation des activités peptidases du protéasome, nous avons évalué par la technique de Western Blot la quantité de protéasome dans les homogénats issus de la lyse de MNT-I 24 h et 72 h après leur traitement par des extraits de l'algue Phaeodacty/um tricornutum, par des acides gras, ou par un inhibiteur de Sa protéolyse protéasome dépendante Mgl32), Les résultats présentés en figures 2A et 2B montrent que ces traitements ne modifient pas la quantité de protéasome dans les extraits cellulaires.
Ces résultats indiquent que la stimulation de l'activité du protéasome par les extraits de l'algue Phaeodactylum tricornutum ou par l'acide linoléique ne modifie pas l'expression ni la distribution des formes
2OS et 26S du protéasome, dans les cellules de la lignée mélanocytaire
MNT-I.
3.2 Statut des protéines modifiées par l'ubiquitine suite à un ajout d'extraits de l'algue Phaeodactylum tricornutum dans la lignée mélanocytaire MNT-I
Nous avons montré que, 24h ou 72 heures après traitement par les acides gras ou l'extrait d'algue, le niveau de protéines ubiquitinées {fιgυre3A,3B) n'était pas modifié sauf lorsque les cellules étaient cultivées en présence d'un inhibiteur du protéasome le Mgl32.
Ces observations démontrent que la machinerie d'ubiquitination n'est pas touchée par les traitements par l'algue ou l'acide linoléique.
3.3 Modulations de l'expression et de l'activité de la tyrosinase, induite par ajout d'extraits de l'algue Phaeodactylum tricornutum dans la lignée mélanocytaire MNT-I
A partir des extraits cellulaires de mélanocytes MNT-I cultivés dans ces différentes conditions, avec les protocoles définis dans la partie "matériel et méthodes", les effets des extraits de l'algue Phaeodactylum tricornutum sur la quantité et l'activité de la tyrosinase ont été caractérisés.
Nous avons montré que, 24 heures ou 72 heures après traitement de mélanocytes MNT-I par Phaeodactylum tricornutum ou l'acide linoléique, on observe une diminution significative de la tyrosinase {figures 4A et 4B), et que cette diminution peut être réversée lorsque l'on traite les cellules par le Mgl32 qui est un inhibiteur du protéasome.
Nous avons quantifié cette diminution à l'aide du logiciel Image master ID (Amersham Pharmacia) et les résultats sont présentés dans les tableaux 2 et 3.
Ces observations préliminaires démontrent que la tyrosinase est un substrat physiologique du protéasome; et que sa dégradation peut-être activée par des extraits de l'algue Phaeodactylum tricornutum.
Dans un premier temps, la mise au point d'une technique spécifique de dosage l'activité de la tyrosinase, applicable aux extraits cellulaires de la lignée MNT-I, a été entreprise. Nous avons mesuré l'activité tyrosinase dans les cellules 72 heures après traitement de mélanocytes MNT-I par Phaeodactylum tricornutum ou par l'acide linoléique et nous avons observé une diminution significative de cette dernière {figure 5 et tableau 4).
Figure imgf000040_0001
Figure imgf000040_0002
Tableau 2 : Quantification de la tyrosinase à 24 heures
Contrôle \cidc Aude Phaedactvlum L oniroK Acide Acide Phdcdachlum C*) patmitique Imoleique tπcϋrnutum +MgI 32 pdlmttique linoleique 1 πcormitum
+Mg 132 r\îg! 32
100 62 13 (00 !32 107 I 15 !
100 88 24 1 I Tableau 3 : Quantification de la tvrosinase à 72heures
Figure imgf000041_0001
Tableau 4 : Activité de la tyrosinase à 72 heures
Pour vérifier que la tyrosinase substrat du protéasome était mieux dégradée dans des extraits de cellules mélanocytaires de la lignée MNT- 1 traités par des extraits de l'algue Phaeodactylum tricornutum, une étude qualitative et quantitative de la tyrosinase et des formes conjuguées à l'ubiquitine de la tyrosinase a été réalisée par détection immuno-chimique et immuno-précipitation à 72 heures. {Figure 6). Ces résultats montrent que dans les cellules traitées par des extraits de l'algue Phaeodactylum tricornutum, la tyrosinase ne s'accumule pas sous forme ubiquitinée car elle est rapidement dégradée.
III. EXEMPLES DE COMPOSITIONS COSMETIQUES
Les concentrations sont exprimées en pourcentages en poids. L'extrait utilisé dans les exemples ci-dessous est l'extrait E2. 1. Crème cosmétique de jour dépiqmentante sous forme d'émulsion-qei
Glycérine 5,00% triglycérides caprylique/caprique/succinique 5,00%
Méthoxycinnamate d'octyle 1,00%
Diméthicone copolyo! 0,50%
Acrylates / C10-30 aîkyl acrylate crosspolymer 0,50%
Extrait lipidique E2 de Phaeodactylum tricornutum
Neutralisant
Conservateurs, parfum, colorants Eau qsp. 100%
L'utilisation de l'émulsion-gel ci-dessus permettra aux personnes soumises au rayonnement plus ou moins intense de la lumière du jour, voire du soleil directement, de conserver un teint clair et d'éviter l'apparition de taches pigmentées.
2. Composition cosmétique fluide protectrice du rayonnement solaire (SPF 301
Figure imgf000042_0001
Cette composition prévient l'apparition de taches pigmentaires, chez les personnes prédisposées à ce phénomène lors d'une exposition à un rayonnement solaire intense. Il est à noter que la présence d'une concentration élevée en filtre solaire permet de compenser la diminution de la protection naturelle, conséquence de la baisse du taux de mélanine. Lotion cosmétique visaαe pour éclaircir le teint
Figure imgf000043_0001
Cette lotion pour éclaircir le teint s'utilise après le démaquillage et le nettoyage de la peau.
4. Sérum cosmétique éclaircissant pour le visaoe
Figure imgf000043_0002
Une goutte de cette composition très concentrée de sérum, s'applique sur le visage généralement avant ('application d'une crème pour
Ie visage. Ce sérum s'utilise habituellement par cures d'une à deux semaines pour obtenir ou entretenir un éclaircissement du teint, 5. Lotion cosmétique pour éclaircir la pilosité corporelle
Figure imgf000044_0001
Cette lotion s'applique sur les zones pileuses à éclaircir, notamment les bras, pendant la durée suffisante pour obtenir un éclaircissement progressif des poils.
6. Gel crème cosmétique anti-taches pour les mains
Figure imgf000044_0002
Cette crème doit être appliquée directement sur les taches (lentigos solaires et/ou séniles) des mains pour en atténuer la coloration. ANNEXE A
I - Tampons et solutions utilisées pour les gels d'électrophorèse en conditions dénaturantes et réductrice en tampon discontinu
Solution de monomères; acrylamide / Bis-acrylamide, 30% T, 2,67% C ( Biorad; réf.161-0158)
Tampon de gel de résolution; Tris-HCL 1,5M pH 8,8.
- 18,15g de Tris base(Sigma; Tl 503) pour 100 m! d'eau distillée - ajuster le pH à 8,8 avec de I1HCL 12N
Tampon dégel de concentration; Tris-HCL 0,5M pH 6,8.
- 6g de Tris base pour 100 ml d'eau distillée - ajuster le pH à 6,8 avec de i'HCL 12N
Tampon de migration 10JKr Tris 0,25M pH 8,3 , glycine 1,92M; SDS 1%
Figure imgf000045_0001
Persuifate d'ammonium (NH4J2S2O8: (Sigma; A1433) à 10% soit 100 mg/ml
Aliquotée et conservée à -200C Tampon d'échantillon réducteur Laemmli 2X; Tris-HCL 0,06M pH6,8 ; SDS 2,3% ; Glycérol 10% ; Bleu de bromophéπol 0,02%
- tampon de gel de concentration Tris 0,5M pH 6,8 6,25 ml
- SDS 10% 11,50 ml
- Glycéroi 5 ml
- Eau distillée compléter à 50 ml
Bleu de bromophénol 1OX (solution saturée) : mettre une pointe de spatule de bleu de bromophénol dans 5 ml de Tampon Laemmli 2X, agiter, soniquer, centrifuger et récupérer seulement le surnageant. Ces solutions se conservent à température ambiante
Standards précolorés-
- à bas poids moléculaires (Biorad; réf.161-0305) Ils sont composés de : - Phosphorylase B 104 kDa - Bovine sérum albumin 82 kDa
- Ovalbumin 48,3 kDa
- Carbonic anhydrase 33,4 kDa
- Soybean trypsin inhibitor 28,3 kDa
- Lysosyme 19,4 kDa - à haut poids moléculaires (Amersham ; réf.RPN800) de 10 à
250 kDa
II - Gels d'électrophorèse -Préparation du gel de résolution à 12% T
Figure imgf000047_0001
- Préparation du gel de concentration à 12% T
Figure imgf000047_0002
ANNEXE B
Solutions pour le transfert et l'immunodétection
Tampon de transfert de Towbin :
Tris-HCL 25mM, pH 8,3 ; Glycine 192 mM ; 20% Méthanol
- Tris base 3, 03g
- Glycine(Research Organics Inc; 5037G) 14,4 g à dissoudre dans 100ml d'eau distillée
- Méthanol 200 ml
- Eau distillée compléter à 1000 ml
Tampon PBS-T
Dilution au 1/10 du PBS 10X (Invitrogen ; 14200-067 ) y ajouter du Tween 20 à 0,1% (Sigma ; P1379)
Ces solutions sont conservées à 4°C
Rouge Ponceau (Sigma ; P717O)
Solution à 0,1% (p/v) dans une solution d'acide acétique à 5%
ANNEXE C
Dosage des protéines (Kit Biorad ; protéine standard; réf.500-0006)
Méthode de Bradford
Avant de réaliser l'électrophorèse tes lysats décongelés sont chauffés à 950C pendant 10 min.
Pour les lysats dans le tampon de lyse dénaturant (tampon Laβmli 2X+ DTT IQmM)
Le tampon Leamli n'est pas compatible avec le réactif du kit, il est donc indispensable de l'éliminer pour réaliser le dosage par cette méthode.
Dans un tube Eppendorf, 500μl d'acétone sont ajoutés à 5μl de lysat (volume à adapter en fonction de la concentration en protéines).
Les tubes sont placés au moins 10 min. à -200C. Puis ils sont centrifugés à 17 000G, 10 min. à 4°C.
Le surnageant est éliminé par retournement, après évaporation de l'acétone le culot est dissout dans 50μl de NaOH à 0,1 M et les protéines sont dosées par la méthode Bradford. (Dilution au 1/10 de l'échantillon).
Pour les lysats dans le tampon Lyse non dénaturant
Les constituants de ce tampon de lyse n'interfèrent pas avec le réactif du kit Biorad à cette concentration (lûμl d'échantillon/puit). Seulement l'échantillon doit être ou non dilué pour se placer dans la gamme et préférentieliement dans la partie supérieure.
Préparation de Ia gamme étalon:
Solution mère de BSA: 2mg/m! (Sigma ; A2153 ; 4°C) La gamme est préparée dans des tubes Eppendorf et peut être congelée ou conservée à 4°C.
Figure imgf000050_0001
Le réactif (bleu de Coomassie G250) est dilué extemporanément au 1/5 (se conserve 1 heure).
Dans une plaque 96 puits, additionner 200μl de réactif dilué à :
-10 μl de solution stock pour la gamme
-10 μl d'H20 pour le blanc
-10 μl de NaOH 0,1M pour le blanc échantillon
- 10 μl d'échantillon à doser (en triplicate ou quadruplicate)
Agiter la plaque et laisser la coloration se développer 10min.
Mesurer les absorbances à 595nm, La coloration est stable jusqu'à 0 minutes. 2008/050394
50
ANNEXE D
Liste anticorps primaires et secondaires
Figure imgf000051_0001
TABLEAU 1
Figure imgf000052_0001
Tableau 1 : Mesures des activités du protéasome

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation dans une composition cosmétique d'un extrait de l'algue Phaeodactylum tricornutum, en tant qu'agent actif dépigmentant destiné en particulier à atténuer ou supprimer les taches pigmentaires de la peau ou à éclaircir le teint ou les poils ou les cheveux.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit extrait d'algue est utilisé dans ladite composition à une concentration comprise entre 0,001 % et 5 % en poids, de préférence entre 0,001 et 1 % en poids, par rapport au poids total de la composition finale.
3. Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit extrait contient au moins 40 % en poids d'acides gras, de préférence au moins 60% en poids.
4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit extrait est obtenu à partir de ladite algue dans un procédé comprenant au moins une étape d'extraction par un solvant suffisamment apolaire pour extraire les acides gras.
5. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que ledit solvant est l'isopropanol, l'hexane, la cyclohexane ou l'heptane
6. Utilisation selon la revendication 4 ou 5, caractérisée en ce que ledit procédé d'extraction comprend au moins une étape d'extraction par un solvant d'extraction choisi parmi les alcools en CI-CÔ, les mélanges hydroalcooliques de ces alcools, les polyalcools en C2-Ce tels que l'éthylèneglycol, les solvants chlorés tels que le chloroforme et le dichlorométhane, les esters en C3-C6 d'acides organiques tels que l'acétate d'éthyle, les alcanes en Cg-Cio tels que l'heptane, l'hexane ou le cyclohexane, les éthers en Cs-Cg tels que le diisopropyléther, ledit solvant d'extraction étant éventuellement alcalinisé.
7. Utilisation selon l'une des revendications 4 à 6, caractérisée en ce que ledit extrait est obtenu dans un procédé d'extraction comprenant une première étape d'extraction de l'algue par un mélange hydroalcoolique alcalinisé, î'alcool dudit mélange hydroalcoolique étant de préférence choisi dans le groupe de l'isopropanol, de i'éthanol et du méthanol, ladite étape permettant de récupérer tes acides gras sous forme salifiée dans Ia phase hydroalcoolique.
8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit procédé d'extraction comprend en outre une étape de récupération des acides gras dans une phase apolaire, consistant à acidifier ledit mélange hydroalcoolique puis à procéder à une extraction liquide-liquide au moyen
5 d'un solvant apolaire et enfin à éliminer ledit solvant apolaire pour obtenir ledit extrait sous forme d'une huile.
9. Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que ledit solvant apolaire est choisi dans le groupe constitué de l'heptane, de l'hexane et du cyclohexane.
10 10. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit extrait de l'algue est obtenu par extraction au moyen du CO2 supercritique.
11. Méthode de soin cosmétique destinée à atténuer ou à supprimer les taches pigmentaires de la peau ou à éclaircir le teint ou les
] 5 poils ou les cheveux, caractérisée en ce qu'elle comprend l'application sur au moins une zone concernée de la peau, d'une composition cosmétique telle que définie dans l'une des revendications 1 à 10.
12. Méthode selon la revendication 11, caractérisée en ce que ladite composition contient une quantité efficace dudit extrait pour obtenir 0 l'effet recherché.
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