IT201600124434A1 - Estratto grezzo di microalga verde Tetraselmis suecica e suoi usi - Google Patents

Description

Titolo: Estratto grezzo di microalga verde Tetraselmis suecica e suoi usi

Campo dell’invenzione

La presente invenzione si riferisce all’attività biologica di un estratto di alcol/acqua di microalga verde marina contenente molti pigmenti attivi e sostanze come i carotenoidi aventi attività antiossidante, protettiva e di riparazione su cellule umane. Quindi Tinvenzione si riferisce all’utilizzo di detto estratto nelle composizioni cosmetiche, supplementi nutraceutici, composizioni mediche.

Lo stato dell’arte.

Le specie reattive dell’ossigeno (ROS) sono state collegate alla patogenesi di diverse malattie dell’uomo come l’aterosclerosi, il diabete mellito, l’infiammazione cronica, i disordini neurodegenerativi e molti tipi di cancro. Le specie ROS possono essere parzialmente neutralizzate dai composti antiossidanti che possono ridurre il rischio di molte malattie correlate allo stress ossidativo<1>(vedere Carballo-Càrdenas, E.C., Tuan, P.M., Janssen, M., Wijffels, R.H. Vitamin E (alpha-tocopherol) production by thè marine microalgae Dunaliella tertiolecta and Tetraselmis suecica in batch cultivation. Biomol. Eng. 20(4-6), 139-147, 2003).

Quindi, la preferenza dei consumatori per i prodotti naturali sta aumentando l’interesse nella scoperta di nuovi antiossidanti derivanti da risorse naturali, in quanto i prodotti sintetici possono determinare effetti tossici a lungo termine. La maggior parte, se non tutti, degli antiossidanti naturali disponibili sul mercato derivano da piante terrestri (ad esempio rosmarino, té, caffè, vinaccioli, pomodoro e cacao). Molti di questi antiossidanti sono carotenoidi che sono una classe di oltre 700 pigmenti che avvengono in natura sintetizzati dalle piante, alghe e batteri fotosintetici. E’ noto che i carotenoidi sono potenti agenti di estinzione fisica e chimica di ossigeno singoletto (*02) e purificatori di altre specie reattive dell’ossigeno (ROS). Tuttavia, l’esatto meccanismo che è alla base della funzione protettiva e i bersagli molecolari specifici dei carotenoidi in vivo e in vitro sono ancora scarsamente compresi<3>(vedere Dall'Osto, L., Cazzaniga, S., North, H., Marion-Poll, A., Bassi, R. “The Arabidopsis aba4-l mutant reveals a specific function for neoxantina in protection against photooxi dative stress.” Plant Celi.

19(3), 1048-1064, 2007).

Tetraselmis suecica è una microalga verde marina appartenente alla classe delle Cloroficee, ampiamente utilizzata nell’ acquacoltura per Γ alimentazione di molluschi e larve di crostacei<4>(vedere Sindhu, E.R., Preethi, K.C., Kuttan, R. Antioxidant activity of carotenoid lutein in vitro and in vivo. Indian ,/. Exp. Biol. 48, 843-848, 2010). e come un probiotico nei pesci<5>(vedere Horvàth, G., et al. Effects of Some Naturai Carotenoids on TRPA1 and TRPVl-Induced Neurogenic Inflammatory Processes In: Vivo in thè Mouse Skin. ,/. Mol. Neurosci. 56, 113-121, 2015).

T. suecica è ricca di vitamina E, carotenoidi, clorofilla e tocoferoli<6>(vedere McNulty, H., Jacob, R.F., Mason, R.P. Biologie activity of carotenoids related to distinct membrane physicochemical interactions. Am. J. Cardiol. 101, 20D-29D, 2008) ed è stato suggerito essere un integratore alimentare nelle diete dell’uomo e degli animali<1>(see Carballo-Càrdenas, supra).

T. suecica rappresentano una sorgente scarsamente sfruttata di composti naturali per la salute umana.

II brevetto europeo EP 2193785 20-A2 descrive estratti di pigmento da T. suecica. Il mezzo di estrazione secondo EP 2193785 sono solventi organici puri (etilacetato, esano, metanolo, etanolo, isopropanolo) oppure acqua, normalmente utilizzata in passi successivi, in cui l’estrazione con acqua è sempre preceduta da una o più estrazione con un solvente organico. Gli estratti descritti hanno la capacità di migliorare la pigmentazione cutanea e capillare, per ridurre lesioni di psoriasi e per aumentare la crescita capillare<1>(vedere Carballo-Càrdenas, E.C. et al. supra).

In uno studio precedente, un estratto acquoso di una digestione enzimatica di Tetraselmis suecica sonicata ha mostrato una forte attività di purificazione contro 2,2-difenil- 1 -picrilidrazil (DPPH) e peroxil radicali piuttosto che contro gli anioni superossidi dal sistema xantina/xantina ossidasi<2>(vedere Jo, W.S. et al. Effect of Microalgal Extracts of Tetraselmis suecica against UVB-Induced Photoaging in Human Skin Fibroblasts. Toxicol. Res. 28(4), 241-248, 2012)

I singoli pigmenti di xantofilla (luteina, violaxantina, neoxantina, anteraxantina ed esteri di loroxantina) sono ben noti per le loro attività biologiche come antiossidanti e sono precursori di altri pigmenti o vitamine<3>(vedere Dall'Osto, L. et al. supra). La luteina possiede pronunciata capacità di purificazione da radicali liberi grazie alla sua polarità e numero di doppi legami coniugati<4>, (vedere Sindhu, E.R., et al. supra) ed è stato dimostrato diminuire significativamente la risposta infiammatoria neurogenica nella pelle del topo<5>(vedere Horvàth, G., et al. supra). L’attività antiossidante della violaxantina e neoxantina è anche ben documentata<6>, (McNulty, H. et al. supra ) mentre l’attività biologica dell’anteraxantina e degli esteri di loroxantina recentemente caratterizzata in T. suecica<7>_(ye dere Garrido, J.L., Rodriguez, F., Zapata, M. Occurrence of loroxanthin, loroxanthin decenoate, and loroxanthin dodecenoate in Tetraselmis species (Prasinophyceae, Chlorophyta). ./. Phycol. 45(2), 366-374, 2009) non è stata ancora esaminata.

Tuttavia, oggigiorno, gli esperimenti con frazioni antiossidanti singole o purificate di T. suecica nelle formulazioni cosmetiche o nutraceutiche non hanno mostrato effetto di riparazione significativo nell’essere umano (vedere Horvàth, G., et al. Effects of Some Naturai Carotenoids on TRPA1 and TRPVl-Induced Neurogenic Inflammatory Processes In: Vivo in thè Mouse Skin. ,/. Mol. Neurosci. 56, 113-121. 2015).

Quindi, lo scopo della presente invenzione è esaminare nuove applicazioni efficaci di estratti di microalga verde marina, specificamente T. suecica , nei confronti dei danni ossidativi delle cellule e dei tessuti.

Sommario dell’invenzione

La presente invenzione si basa sul nuovo concetto inventivo che tutte le principali sostanze antiossidanti contenute nelle cellule di Tetraselmis species possono formare una rete e che l’utilizzo del “contenuto totale di antiossidanti” può essere un approccio migliore dell’utilizzo di antiossidanti individuali.

Quindi, la presente invenzione si basa sulla scoperta che tutti i componenti dell’estratto grezzo totale, a prescindere se bioattivi o inattivi, aventi strutture chimiche diverse e, se esistenti, attività biologiche, contribuiscono ad ottenere un effetto sinergetico rendendo detto estratto adatto per applicazioni cosmetiche, farmaceutiche e nutrizionali efficaci e sicure. Detta attività biologica include una forte attività antiossidante, attività di sequestrante di di radicali perossido, anti-infiammatoria, attività anti -mutagenica, attivazione di meccanismi di riparazione di cellule danneggiate e ricostruzione e rigenerazione di tessuti epidermici.

Di conseguenza, un primo oggetto della presente invenzione è un estratto idroalcolico grezzo di Tetraselmis suecica per l’utilizzo nel trattamento curativo o trattamento preventivo di disordini o malattie relative a danni ossidativi delle cellule o dei tessuti. In una forma di realizzazione preferita, il trattamento è l’azione di riparare o prevenire la lesione cellulare causata da perossido o la ricostruzione o rigenerazione di tessuti epidermici dopo la lesione da perossido o impedire lesioni da perossidi dei tessuti epidermici.

In un’altra forma di realizzazione preferita, il disordine o la malattia viene selezionata da cancro, malattie infiammatorie o invecchiamento precoce della pelle.

In un’altra ancora forma di realizzazione preferita, l’estratto idroalcolico grezzo è una miscela di acqua e di un alcool selezionato da etanolo, metanolo, n-propanolo, isopropanolo, n-butanolo, iso-butanolo, ter-butanolo o alcool polari equivalenti aventi rapporto di alcool/acqua (percentuale in volume) nell’intervallo di 4: 1-1:1, preferibilmente 2:1, più preferibilmente 3:1.

In una forma di realizzazione maggiormente preferita, l’estratto idroalcolico grezzo è la miscela di etanolo-acqua avente rapporto di etanolo/acqua (percentuale in volume) di 3:1, opzionalmente in forma secca.

Un secondo oggetto dell’invenzione è una composizione farmaceutica per l’utilizzo in un trattamento secondo l’invenzione, comprendente un estratto idroalcolico grezzo di Tetraselmis suecica, opzionalmente in forma secca, un eccipiente farmaceuticamente accettabile e, opzionalmente, uno o più additivi e/o uno o più agenti attivi aggiuntivi. In una forma di realizzazione preferita l’estratto idroalcolico grezzo incluso nella composizione è una miscela di acqua e di un alcool selezionato da etanolo, metanolo, npropanolo, isopropanolo, n-butanolo, iso-butanolo, ter-butanolo o alcool polari equivalenti aventi rapporto di alcool/acqua (percentuale in volume) nell’intervallo di 4: 1-1:1, preferibilmente 2:1, più preferibilmente 3:1.

Nella forma di realizzazione maggiormente preferita, l’estratto idroalcolico grezzo incluso nella composizione è una miscela etanolo/acqua, avente rapporto di etanolo/acqua di circa 3:1.

Un terzo oggetto dell’invenzione è una composizione cosmetica comprendente estratto idroalcolico grezzo di Tetraselmis suecica, opzionalmente in forma secca, un eccipiente cosmeticamente accettabile e, opzionalmente, uno o più additivi e/o uno o più agenti attivi aggiuntivi, per riparare o prevenire cosmeticamente la lesione cellulare causata da perossido o per la ricostruzione o rigenerazione di tessuti epidermici dopo la lesione da perossido o per impedire lesioni da perossidi dei tessuti epidermici o per il trattamento di infiammazioni della pelle o invecchiamento della pelle.

In una forma di realizzazione preferita l’estratto idroalcolico incluso nella composizione cosmetica è una miscela di etanolo-acqua avente rapporto di etanolo/acqua (percentuale in volume) nell’intervallo di 4: 1-1:1, preferibilmente 2:1, più preferibilmente 3:1.

Un quarto oggetto dell’invenzione sono un supplemento nutrizionale o prodotto nutraceutico comprendente un estratto idroalcolico grezzo di Tetraselmis suecica, opzionalmente in forma secca, almeno un additivo o coadiuvante adatto per la nutrizione umana e, opzionalmente, uno o più agenti attivi aggiuntivi per riparare o prevenire lesioni cellulari causate da perossido o per la ricostruzione o rigenerazione di tessuti epidermici dopo la lesione da perossido o per impedire lesioni da perossidi dei tessuti epidermici o per sostenere o coadiuvare o rinforzare un trattamento medico del cancro, di malattie infiammatorie o di invecchiamento precoce o naturale della pelle. In una forma di realizzazione preferita l’estratto idroalcolico incluso nel supplemento nutrizionale o prodotto nutraceutico è una miscela di etanolo-acqua avente rapporto di etanolo/acqua (percentuale in volume) nell’intervallo di 4: 1-1:1, preferibilmente 2:1, più preferibilmente 3:1.

Oggetti aggiuntivi dell’invenzione sono l’utilizzo dell’estratto idroalcolico grezzo dell’invenzione in composizioni cosmetiche o supplementi nutrizionali o prodotti nutraceutici, per riparare o prevenire lesioni cellulari causate da perossido o per la ricostruzione o rigenerazione di tessuti epidermici dopo la lesione da perossido o per prevenire lesioni da perossidi dei tessuti epidermici o per il trattamento di infiammazioni della pelle o invecchiamento della pelle o per sostenere, coadiuvare o rafforzare un trattamento medico del cancro, di malattie infiammatorie o invecchiamento precoce o naturale della pelle.

Un oggetto finale dell’invenzione è un metodo per preparare un estratto idroalcolico di Tetraselmis suecica comprendente i seguenti passi di:

· estrarre una biomassa di Tetraselmis sp. con una miscela di alcool-acqua,

• separare la fase liquida dalle cellule della biomassa,

• opzionalmente ri-estrarre almeno una volta le cellule separate con lo stesso, o diverso, solvente idroalcolico,

• unire gli estratti e

• opzionalmente essiccare oppure essiccare parzialmente gli estratti uniti, a patto che il metodo non comprenda alcun passo mirato alla separazione o purificazione di uno o più componenti specifici o gruppo di componenti o arricchimento degli estratti con uno o più componenti o gruppo di componenti.

Poiché gli estratti grezzi dell’invenzione comprendono tutte o sostanzialmente tutte le sostanze estraibili idroalcoliche presenti nelle cellule T. species , specificamente il contenuto totale di carotenoidi, preferibilmente nei loro rapporti naturali, gli estratti grezzi offrono il primo vantaggio di essere particolarmente efficace nell’attivazione di meccanismi di riparazione di cellule danneggiate e nella rigenerazione di tessuti epidermici dopo lesione ossidativa. Un secondo vantaggio è la sicurezza dell’estratto come mostrato dai risultati riportati nella sezione sperimentale della domanda.

Infine, l’elevata resa degli ingredienti funzionali recuperati dalla biomassa totale e completamente rinnovabile e la facilità e la convenienza del processo di estrazione rappresentano altri vantaggi competitivi per lo sviluppo industriale di questa invenzione.

Descrizione delle Figure

Figura 1. Pannello A: cromatogramma HPLC di pigmenti da un estratto di etanolo/acqua della microalga verde Tetraselmis suecica. Pannello B: analisi LC-PDA-ESI<+>MS/MS del pool di carotenoidi nell’estratto etanolo/acqua of T. suecica.

Figura 2. Contenuto di pigmenti di estratto di etanolo/acqua di Tetraselmis suecica. I dati del contenuto di 9’-c/<'>s<,>-neoxantina e anteraxantina mancano a causa della loro coeluzione. I dati sono indicati come percentuale del rapporto pigmento/clorofilla.

Figura 3. Attività di riparazione in vitro di estratto di etanolo/acqua Tetraselmis suecica nei confronti del trattamento H202. (A) Cellule umane di adenocarcinoma polmonare (A549) trattate con varie concentrazioni di estratti di T. suecica per 24 e 48 ore. La vitalità cellulare è stata determinata utilizzando il saggio MTT ed espressa come percentuale di cellule in crescita di controllo. (B) Vitalità cellulare di cellule di adenocarcinoma polmonare (A549) trattate con varie concentrazioni di H202(0,3, 3, 30, 300 mM) per 24 e 48 ore. (C) Effetto di estratto sulla vitalità cellulare di cellule A549 dopo esposizione a H202prima del trattamento con estratto a 2, 5, 10, 25, 50, 100, 200 e 400

Figura 4. Pannelli A, B, C: Effetto di estratto di etanolo/acqua di Tetraselmis suecica a tre diverse concentrazioni (100, 200 and 400 pg mi<'1>) su espressione del gene con stress ossidativo in cellule umane di adenocarcinoma polmonare trattate con H202(A549). Le cellule A549 sono state pre-trattate con H202(30 mM = 12 pg mi<'1>) per 1 ora prima dei trattamenti con estratto (100, 200 e 400 pg mi<'1>) e raccolte 2 ore dopo. (D) Controllo negativo per la valutazione dell’effetto di estratto di etanolo/acqua di Tetraselmis suecica a tre concentrazioni diverse (100, 200 e 400 pg mi<'1>) su espressione del gene con stress ossidativo nelle cellule umane di adenocarcinoma polmonare (A549). Tre saggi indipendenti sono stati eseguiti tre volte e i dati sono espressi come media ±S.D. Valori di espressione superiori o inferiori di due volte la differenza rispetto ai controlli sono stati considerati significativi.

Figura 5. Pannelli A, B: L’effetto dell’estratto di etanolo/acqua da Tetraselmis suecica sul rilascio in siero di prostaglandina PGE2indotto da trattamento con H202nelle cellule umane di adenocarcinoma polmonare (A549). (A). Concentrazione media di PGE2(pg pi<'1>) determinata da ELISA nel terreno di coltura di cellule trattate con 100, 200 e 400 pg mi<'1>dell’estratto per 24 ore. (B). Media della concentrazione di PGE2(pg pi<'1>) determinata da ELISA nel terreno di coltura di cellule trattate con 100, 200 e 400 pg mi<'1>dell’estratto per 24 ore dopo il pre-trattamento con 30 mM (= 12 pg mi<'1>) di H202per 1 ora. Gli asterischi denotano le differenze significative rispetto ai controlli (*p<0,05 e **p<0,005) e determinate utilizzando il test t di Student.

Figura 6. Risposta di colture di tessuti EpiDerm™ dopo applicazione topica di 30 mM (= 12 pg mi<'1>) H202per 1 ora prima di trattamento con estratto di etanolo/acqua di Tetraselmis suecica (200 pg mi<'1>) che mostra l’effetto di riparazione dell’estratto dopo il trattamento con H202. Tre saggi indipendenti sono stati eseguiti tre volte; i dati sono mostrati come media ±S.D. Sono state determinate differenze significative tra i gruppi trattati utilizzando il test t di Student (*p<0,05) e ANOVA. NC = non trattato. Ts 200 pg = 200 pg estratto di T. suecica ; H202+ Ts 200 pg = tessuto epidermico pretrattato con H202per 1 ora e recuperato con estratto.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE

La presente invenzione si riferisce a estratti idroalcolici grezzi di T. sp. e a loro applicazioni terapeutiche, cosmetiche e nutrizionali.

Allo scopo della presente invenzione, Γ espressione “ estratto grezzo ” o “ estratto totale’<'>’ indica un estratto idroalcolico comprendente tutte oppure sostanzialmente tutte le sostanze bioattive estraibili idroalcoliche presenti nelle cellule T. species , specificamente il contenuto totale di carotenoidi, preferibilmente nel loro rapporto naturale. Quindi, il metodo di estrazione comprende solo uno o più passi(o) di estrazione condotti con la miscela selezionata alcool-acqua, ma non comprende alcun passo aggiuntivo che mira a separare, estrarre o purificare uno o più componenti specifici o gruppo di componenti o ad arricchire l’estratto con uno o più componenti o gruppo di componenti.

Metodo di crescita

La sorgente naturale utilizzata attualmente, cioè Tetraselmis species, preferibilmente T. suecica , sono microalghe verdi che crescono in condizioni standardizzate in laboratorio. Grazie alla facilità di crescita di queste specie, l’ottimizzazione e la produzione in scala a livello industriale è fattibile considerando che ad esempio T. suecica viene già coltivata in massa per gli altri prodotti della chimica fine che produce.

Allo scopo della presente invenzione T. suecica è stata fatta crescere in fotobioreattori (e.g. 100 L) nel terreno f/2 di Guillard costantemente gorgogliato con aria. La crescita è stata eseguita a temperatura ambiente (ad esempio circa 19°C) ad una densità di flusso di fotoni adatta con alternanza di periodi di luce e buio di 12 ore.

Metodo di estrazione

Il metodo di estrazione è descritto nella tecnica precedente [Koen Goiris et al] e comprende i seguenti passi:

Una biomassa di Tetraselmis sp. viene fatta crescere secondo le procedure note. La biomassa viene estratta con una miscela di alcool-acqua, la fase liquida viene separata dalle cellule e le cellule separate opzionalmente vengono ri-estratte almeno una volta con lo stesso, o diverso, solvente idroalcolico. Gli estratti vengono uniti e immagazzinati in forma liquida oppure in forma secca o semi-secca per successivi utilizzi o per analisi. Per evitare l’ossidazione degli estratti, tutti i passaggi dell’estrazione preferibilmente sono eseguiti in condizioni di buio, in atmosfera inerte, ad esempio in atmosfera di azoto, e a temperatura fredda o a temperatura ambiente.

La biomassa iniziale è costituita da cellule vive, umide, secche oppure liofilizzate. La forma preferita è la forma liofilizzata. Il terreno di estrazione e la biomassa vengono miscelate ad un rapporto secco (peso/volume) di circa 100mg/ml di terreno di estrazione.

II terreno di estrazione è una miscela idro-alcolica comprendente qualunque alcool adatto, come etanolo, metanolo, n-propanolo, isopropanolo, n-butanolo, iso-butanolo, ter-butanolo o alcool polari equivalenti. Il rapporto di acqua/alcool dipende dal tipo di alcool. Ad esempio il rapporto (percentuale in volume) può trovarsi nell’intervallo di 4: 1-1:1, preferibilmente 2:1, più preferibilmente 3:1. Nella soluzione più preferita la miscela idroalcolica di estrazione è una miscela di etanolo/acqua avente rapporto di etanolo-acqua di circa 3:1.

La biomassa viene estratta per un tempo adatto che va da 10 a 60 minuti, preferibilmente da 20 a 40 minuti, più preferibilmente per circa 30 minuti. Dopo l’estrazione, le cellule vengono separate dalla soluzione sumatante tramite qualunque tecnica adatta, ad esempio tramite sedimentazione, filtrazione o centrifugazione oppure ultracentrifùgazione, o gelfiltrazione. Preferibilmente la separazione viene eseguita tramite centrifugazione, più preferibilmente tramite centrifugazione a 4500xg, ad esempio per 10 minuti o più, a temperatura ambiente (cioè circa 20°C).

Opzionalmente il pellet cellulare viene ri-sospeso nello stesso, o diverso, terreno di estrazione idroalcolico ed estratto per almeno una seconda volta. Tutti i primi, secondi e successivi (se esistenti) estratti vengono quindi riuniti ed asciugati con qualunque tecnica di asciugatura adatta nota a condizione che Testratto non sia denaturato oppure ossidato.

L’essiccamento può essere eseguita tramite evaporazione, ad esempio in un evaporatore rotante, oppure tramite spray-drying o tramite liofilizzazione.

Alternativamente gli estratti liquidi riuniti possono essere immagazzinati in forma liquida o congelata in atmosfera inerte, ad esempio azoto, e a bassa temperatura, ad esempio a - 20°C o meno.

L’elevata resa degli ingredienti funzionali recuperati dalla biomassa totale e la facilità del processo di estrazione rappresentano un altro vantaggio competitivo per lo sviluppo industriale di questa invenzione.

Contenuto di Tetraselmis species

Il contenuto di pigmenti nell’estratto di etanolo/acqua della specie di alga verde, valutato con cromatografia liquida ad alta prestazione (“High Performance Liquid Chromatography” (HPLC), contiene pigmenti di porforina, clorofilla a, a’ e b, e carotenoidi quali pigmenti di carotene a e γ e xantofilla come luteina, dodecanoato di loroxantina e altra loroxantina, violaxantina, neoxantina, 9’-c/.v-neoxantina, anteraxantina e zeaxantina.

I componenti dei pigmenti, tempi di ritenzione e valori di assorbanza in HPLC di un estratto di T. suecica rappresentativo dell’invenzione sono indicati nella Tabella 1 e in Figura 1A.

I risultati sono anche confermati da dati HPLC-PDA-MS/MS (vedere Figura 1B).

Le xantofille costituiscono la frazione più abbondante dei pigmenti totali identificati negli estratti dell’invenzione. Il contenuto è sempre superiore al 50%, normalmente superiore al 60%, a circa il 79% - 80%, e, nel gruppo, la luteina è la più abbondante, raggiungendo concentrazioni confrontabili a quella della clorofilla b (Chi b circa il 31% di Chi a, Luteina circa 33% di Chi a, Figura 2). I pigmenti di neoxantina e violaxantina hanno mostrato una percentuale su Chi a di circa 16%, mentre il dodecanoato di loroxantina una percentuale di circa 8%.

Oltre ai pigmenti, T. species , inclusa T. suecica , hanno un contenuto di lipidi elevato e per questo motivo sono spesso utilizzate per la produzione di biocombustibile. La frazione di lipidi di T. suecica contiene C16:0, C 18 : 1 , CI 8:3 omega 3, C 18 :4 omega 6 e C20:5 omega 3 come i maggiori acidi grassi. Inoltre, ha livelli elevati di vitamina E (atocoferolo in quantità che vanno da 190 a 1080 pg/g peso secco). T. suecica produce anche composti fenolici come acido protocatechico, p-idrossibenzoico, vanillico, siringico, caffeico, clorogenico, 4-idrossibenzaldeide, e 4-diidrossibenzaldeide, tutti aventi proprietà di chemioprofilassi (ad esempio effetto antiossidante, anticarcinogenico, o antimutagenico e anti-infiammatorio).

Infine T. suecica produce inoltre grandi quantità di carboidrati, in caso per la produzione di farina priva di glutine.

Sostanzialmente tutte queste sostanze sono incluse negli estratti totali grezzi dell’invenzione.

Gli estratti idroalcolici dell’invenzione mostrano molte attività farmacologiche che sono alla base di corrispondenti applicazioni terapeutiche, cosmetiche o nutrizionali.

L’estratto di etanolo/acqua da T. suecica, contenente livelli elevati di carotenoidi, ha mostrato marcata capacità di sequestro di radicali se testato con il saggio DPPH. L’addizione dell’estratto dell’invenzione ha portato alla riduzione del 98% del radicale DPPH (porpora) nella sua forma ridotta (giallo) alle concentrazioni più elevate. Come riportato nella Tabella 2, l’attività di eliminazione dei radicali dell’estratto è stata dipendente dalla dose e la sua efficacia è stata 70% superiore all’ α-tocoferolo alle concentrazioni più elevate. In aggiunta, l’inibizione di radicali liberi DPPH indotta dall’estratto è stata confrontabile ad altre molecole antiossidanti ben note come l’acido ascorbico in cui la riduzione in percentuale dei radicali liberi è circa 95%.

Per chiarire questo effetto a livello molecolare, i presenti inventori hanno studiato la differenza nei modelli di espressione del gene da stress ossidativo tra cellule trattate solo con 30 mM H202e cellule recuperate con 100, 200 e 400 pg mi<'1>di estratto. I geni coinvolti nel metabolismo ROS come i geni reattivi a stress ossidativo ATOX1, CCL5 (RANTES), DHCR24, FOXM1, GPX1, GPX4, PDLIM1, PRDX5, SIRT2, SOD2 sono stati tutti significativamente up-regolati in maniera dose-dipendente dopo il trattamento di recupero con estratto per le concentrazioni più elevate sperimentate.

Sempre per chiarire l’effetto di purificazione dai radicali di T. suecica i presenti inventori hanno anche analizzato l’espressione di proteine essenziali coinvolte in meccanismi antiossidanti (GPX4 and DHCR24) e PTGR1 e hanno osservato l’espressione aumentata di proteine DHCR24 e PTGR1 indotte dal trattamento di estratto grezzo. L’elevata up-regolazione di PTGR1 potrebbe essere legata ad una riduzione di rilascio di prostaglandina dalle cellule. Infatti, gli esperimenti ELISA hanno mostrato una significativa diminuzione dipendente dalla dose dei livelli di prostaglandina PGE2nel terreno di coltura dopo il trattamento di recupero con Testratto che conferma questa ipotesi. Quindi i presenti inventori hanno illustrato per la prima volta che un estratto di etanolo/acqua da una microalga verde marina agisce come un inibitore di rilascio di prostaglandina in una risposta infiammatoria.

Effetto di riparazione rigenerativa su cellule e tessuti

Grazie ai meccanismi cellulari sopra discussi, Testratto idroalcolico dell’invenzione mostra forte attività anti-infiammatoria e determina l’attivazione di meccanismi di riparazione di cellule danneggiate e la ricostruzione e la rigenerazione di tessuti epidermici.

Per valutare gli effetti rigenerativi di cellule e di riparazione dei tessuti causati dall’estratto dell’invenzione, le linee cellulare polmonare A549 sono state trattate con H202. Infatti, la linea cellulare polmonare A549 è nota avere una risposta diversificata se esposta a perossido di idrogeno e per questo motivo può essere utilizzata come modello cellulare adatto per valutare le lesioni da perossido e gli effetti di guarigione/riparazione. L’esposizione di H202ha causato una riduzione nella vitalità cellulare A549 fino al 36% dopo 48 ore, ma l’addizione dell’estratto dell’invenzione ha indotto un forte recupero della vitalità cellulare, con un recupero fino al 100% in alcuni casi (vedere figura 3 a, b, c).

Inoltre, per confermare l’adeguatezza degli estratti dell’invenzione come potenziale agente cosmetico per l’applicazione topica, l’effetto degli estratti è stata valutata su tessuto epidermico umano commerciale (EPI-200) come un modello sperimentale di tessuto. Il test ha mostrato che l’estratto ha esercitato un forte effetto di riparazione o di rigenerazione dopo la lesione causata da perossido di idrogeno (vedere Figura 7).

Applicazioni industriali

Gli estratti dell’invenzione trovano applicazione nella preparazione di composizioni farmaceutiche o formulazioni per trattare i disordini e/o le malattie correlate a danni ossidativi di cellule, come il cancro, le malattie infiammatorie o l’invecchiamento precoce della pelle. Gli estratti dell’invenzione trovano anche applicazione nella preparazione di composizioni cosmetiche efficaci nel trattamento di invecchiamento naturale della pelle e rigenerazione del tessuto e come supplementi nutrizionali o integratori o adiuvanti per sostenere o co-adiuvare o rafforzare il trattamento medico di cancro, malattie infiammatorie o invecchiamento precoce della pelle o naturale.

Composizioni adatte per l’utilizzo terapeutico o cosmetico possono essere sotto forma di soluzione, emulsione, emulsione liposoma, sospensione, gel, olio, pomata. Alternativamente, con l’estratto dell’invenzione può essere imbevuto un dispositivo medico come un tessuto farmaceutico, un gesso, un cerotto. Alternativamente, gli estratti dell’invenzione, in forma secca solida, vengono utilizzati per la preparazione di composizioni solide quali compresse, capsule, polveri, granulati.

Le composizioni possono essere formulate per qualunque via di somministrazione come topica, orale, spray o somministrazione parentale e possono includere qualunque eccipiente farmacologicamente oppure cosmeticamente accettabile, con ulteriori componenti convenzionali e additivi.

Additivi convenzionali sono: stabilizzatore pH, conservanti, agenti antimicrobici, vettori, regolatori di umidità, agenti di assorbimento UV, emulsionanti, agenti gelificanti, addensanti, coloranti, agenti aromatizzanti, agenti per la cura della pelle. Le composizioni comprendono l’estratto idroalcolico dell’invenzione in quantità (percentuale in volume o percentuale di peso) che va da 1% a 100%, preferibilmente da 4% a 50%, più preferibilmente da 5% a 10%.

L’estratto dell’invenzione può anche essere utilizzato come supplemento nutrizionale, integratore o adiuvante o come prodotto nutraceutico. In questo caso l’estratto sarà formulato in compresse e/o miscela in polvere a varie concentrazioni a seconda degli utilizzi. In caso di supplemento antiossidante, la formulazione potrebbe contenere l’estratto a 0,2-0, 4 mg per ciascun gr di miscela in polvere e/o compressa. La concentrazione più attiva potrebbe essere selezionata in base a biosaggi eseguiti su linee cellulari gastrointestinali.

Un altro aspetto chiave di questa invenzione è rappresentata dalla specifica scelta di concentrazione guidata da un saggio biologico per la prototipazione dell’ingrediente funzionale potenziale pronto da essere lanciato sul mercato. La formulazione guidata da saggio biologico degli agenti cosmetici o farmaceutici viene eseguita con analisi morfologica/molecolare su linee cellulari e/o modello di tessuto epidermico. La concentrazione più attiva dell’estratto viene determinata in base alla capacità di esercitare attività di riparazione su cellule dell’epidermide danneggiate. In particolare, la concentrazione attiva in grado di riparare cellule danneggiate è 1-2 pg per ogni g di prodotto cosmetico (ad esempio pomata).

Opzionalmente l’estratto dell’invenzione viene combinato con l’addizione di agenti terapeutici o cosmetici ad esempio disinfettante o battericidi, ad esempio Clorexidina (0,2%).

ESEMPIO SPERIMENTALE

Ceppo e condizioni di coltura

La prasinofite Tetraselmis suecica è stata acquistata dalla raccolta di fitoplancton marino americano (CCMP 906) ed è stato fatto crescere in terreno di Guillard f/2<30>senza acido silicico in bottiglie di policarbonato da due litri, fatto costantemente gorgogliare con aria filtrata tramite filtri a membrana da 0,2 pm. Le colture sono state fatte crescere a 19°C, una densità di flusso di fotone di circa 150 pmol fotoni m<-2>s<-1>, e un fotoperiodo di ciclo di 12:12 ore luce:buio (12L:12D). Le concentrazioni cellulari iniziali sono state circa 5 x IO<3>cellule mi<'1>. La biomassa microalgale è stata raccolta tramite centrifuga dopo 9 giorni (~8 x IO<3>cellule mi<'1>).

Preparazione di estratto di etanolo/acqua da Tetraselmis suecica

L’estrazione è stata eseguita secondo et a/.<8>(Goiris, K., et al. Antioxidant potential of microalgae in relation to their phenolic and carotenoid content. J Appi. Phycol. 24(6), 1477-1486, 2011). La procedura di estrazione è stata condotta in condizioni di buio, a temperatura ambiente e in atmosfera di azoto, per evitare l’ossidazione del campione. La biomassa liofilizzata (-100 mg) è stata estratta con 1 mi di miscela di etanolo/acqua (3/1 percentuale in volume) per 30 min. La miscela è stata separata tramite centrifugazione a 4500 x g, per 10 minuti, a 20°C, e lo strato superiore è stato trasferito in un tubo pulito. Il pellet è stato ri-sospeso in 1 mi della miscela di etanolo/acqua ed estratto per una seconda volta. L’estratto etanolico è stato asciugato in un evaporatore rotante (Buchi rotavapor R-114). L’estratto secco è stato immagazzinato in atmosfera di azoto a -20°C prima dell’analisi.

Analisi HPLC di pigmenti bioattivi

Le misurazioni di pigmenti sono state condotte tramite cromatografia liquida ad alta risoluzione (HPLC) su una aliquota dell’estratto etanolico (10 mg), secondo i metodi descritti in<32>. Prima dell’iniezione nella HPLC, 250 pL di un Agente di Coppia Ionica (acetato di ammonio 1 mole L<-1>, concentrazione finale di 0,33 moli L<-1>) sono stati aggiunti a 0,5 mL dell’estratto di pigmento e incubati per 5 minuti al buio a 4°C. Questo estratto è stato quindi iniettato nel loop da 50 pL di HPLC serie 1100 della Hewlett Packard (Hewlett Packard, Wilmington, NC, USA), fornita di una colonna a fase inversa (colonna C8 Kinetex; 50 mm><4.6 mm; dimensione particelle 2,6 pm, Phenomenex®, USA). La temperatura della colonna è stata mantenuta continuamente a 20°C, e la velocità di flusso della fase mobile è stata impostata a 1,7 mL min<-1>. La fase mobile era composta da due miscele di solventi: A, metanolo/acetato di ammonio acquoso (70/30, percentuale in volume) e B, metanolo. Durante l’eluizione di 12 minuti, è stato programmato il gradiente tra i solventi: 75% A (0 min), 50% A (1 min), 0% A (8 min) isocratico per 3 min. Le clorofille e i carotenoidi sono stati rilevati tramite spettroscopia a serie di diodi (dati di spettro raccolti neirintervallo 350 - 750 nm) utilizzando un rilevatore a serie di fotodiodi della Hewlett Packard, modello DAD serie 1100 ed è stato riportato un cromatogramma di assorbanza a 440 nm. Le clorofille sono state anche rilevate tramite fluorescenza utilizzando uno standard FLD cellule serie 1100 della Hewlett Packard con eccitazione e lunghezze d’onda di emissione impostate, rispettivamente, a 407 nm e 665 nm. L’identificazione e la quantificazione dei pigmenti sono state eseguite utilizzando standard di pigmento della D.H.I. Acqua & Environment (Horsholm, Denmark). Gli standard di pigmento derivavano innanzitutto da fitoplancton. Gli standard vengono inondati con N2 al 100% e forniti in fiale sigillate con 2,5 mL, insieme ad un certificato di analisi. Tutte le informazioni relative alla accuratezza della preparazione degli standard e i numeri di riferimento di tutti gli standard sono disponibili al seguente indirizzo: http://cl4.dhigroup.com/productdescriptions /phytoplanktonpigmentstandards. Inoltre, le informazioni spettrali sono state confrontate con una biblioteca di spettri di clorofilla e carotenoidi di pigmenti preparati da colture di fitoplancton standard<9>(see Brunet, C. et al. Spectral radiation dependent photoprotective mechanism in thè diatom Pseudonitzschia multistriata. PLoS ONE. 9, e87015 (2014).

Il profilo di pigmento di cromatografìa liquida ad alta prestazione (HPLC) dell’ estratto di etanolo/acqua di T. suecica ha rivelato pigmenti di porforina, clorofilla a e b, a carotene e γ carotene e pigmenti di xantofilla come luteina, dodecanoato di loroxantina, decenoato di loroxantina, violaxantina, neoxantina, O’-c/.s-neoxantina e anteraxantina (Figura 1A, Tabella 1). I pigmenti sono stati identificati tramite spettrografìa a serie di diodi (DAD) e confrontando i loro spettri di assorbimento visibili con standard autentici.

Analisi LC-MS/MS dei pigmenti bioattivi

L’analisi LC-MS/MS è stata eseguita su un Acquas Alliance HPLC con un rivelatore Acquas 996 PDA in linea con spettrometro di massa Q-Tof (Acquas) caratterizzato da una sorgente ESI in modalità di ionizzazione positiva. Colonna: Phenomenex Luna C8 250 x 4,6 mm, 5pm, 100A. Eluente A: Acqua, B: MeOH. Gradiente: da 90% B a 100% B in 15 minuti, tenendo per 20 minuti. Flusso: 0,7 mi min<'1>. PDA: 400-700 nm. Portata di massa totale: 450-1000 m/z.

Tabella 1

Picco Tempo di Pigmento Abbreviazione Assorbanza massima ritenuta (min) (lini)

1 2,08 tipo violaxantinae tipo Viola 415-440-469

2 2,29 Neoxantina Neo 413-436-465

3 2,39 Violaxantina Viola 415-440-469

9 ’-c/s-Neoxantina c-Neo Anth 413-436-465 422-4 2,97

Anteraxantina 447-472

5 3,58 Luteina Lut 418-444-474

6 4,74 Dodecanoato di Loroxantina Loro-fi 420-448-473

7 5,04 Clorofilla b Chi b 457-650

8 6,05 Clorofilla a Chi a 430-618-665

9a 6,23

Clorofilla a’ Chi a’ 430-618-665 9b 6,42

10 7,26 γ-Carotene γ-Car 436-462-490

11 7,46 a-Carotene a-Car 425-449-476

I risultati di HPLC sono stati anche supportati da dati HPLC-PDA-MS/MS data (Figura 1B) SI, Tabella SI). Non sono stati osservati altri pigmenti di xantofilla, come loroxantina e zeaxantina, che sono stati trovati di solito nelle alghe verdi. Il decenoato di loroxantina è stato provvisoriamente identificato solo tramite analisi LC-MS/MS. Le xantofille costituivano circa il 79% dei pigmenti totali identificati e, alfinterno del gruppo, la luteina è stata la più abbondante, raggiungendo concentrazioni confrontabili con quelle della clorofilla b (Chi b 31% di Chi a, Luteina 33% di Chi a, Figura 2). I pigmenti di neoxantina e violaxantina hanno mostrato una percentuale di Chi a di circa 16%, mentre il dodecanoato di loroxantina una percentuale di 8%.

Attività di sequestro dei radicali DPPH

L’estratto di etanolo/acqua ha mostrato una marcata attività di riduzione verso le specie di radicali quando è stata sperimentata la capacità di purificazione da 2,2-difenil-l picrilidrazil (DPPH) radicale. (DPPH) 2,2-Di(4-tert-ottilfenil)-l-picrilidrazil è stato utilizzato per la prova di purificazione da radicali (Sigma Aldrich, cat. 257621). Varie concentrazioni di estratto di T. suecica sono state mescolate con una concentrazione finale di DPPH di 0,1 mM di metanolo, permettendo di reagire per 30 min al buio, ed è stata misurata l’assorbanza a 517 nm utilizzando un lettore di micropiastre. L’addizione di concentrazioni di estratto di 25, 50 e 100 pg è risultata in una riduzione dipendente dalla dose (rispettivamente 21,5%, 52,0% e 97.7%) del radicale DPPH porpora nella forma ridotta gialla. Questa attività è stata significativamente più forte del controllo positivo, α-tocoferolo, sperimentato alle stesse concentrazioni (Tabella 2). I valori nella Tabella 2 sono riportati come percentuale verso un bianco e sono la media ±SD di tre campioni indipendenti analizzati tre volte. Gli asterischi indicano aumenti significativi nell’attività misurata di purificazione da radicali *p<0,05 versus controllo.

Tabella 2.

Concentrazione di estratto Densità ottica (OD517 Percentuale di inibizione (pg/ml) nm) (IP) di radicale DPPH

ODTO-ODTS

0 0.000±0.00l ().()±().789 Tetraselmis suecica 50 0,0655±0,029 21,1±2,87*

Ϊ00 0,081125±0, 034 52,00±3,44* 200 0.1 l I ±0.051 97,72±5,09*

0 0,000±0,001 0,0±0,789 a-tocoferolo 50 0,0125±0,052 5,98±5,21

100 0,026±0,035 12,36±1,10* 200 0,040±0,013 26,00±1,3*

Trattamento di Cellule Umane

La linea cellulare A549 epiteliale basale alveolare umana di adenocarcinoma è stata acquistata dalla American Type Culture Collection (ATCC® CCL185™) e fatta crescere in DMEM-F12 (Dulbecco’ s modifìed Eagle’s medium) integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS), 100 unità mi<'1>di penicillina e 100 pg mi<'1>di streptomicina in una atmosfera al 5% di C02a 37°C. Le cellule A549 (pozzetto<'1>di cellule 2 x IO<3>) sono state inseminate in una piastra a 96 pozzetti e tenute per tutta la notte per Γ attacco. L’estratto dell’invenzione è stato disciolto in dimetilsulfossido (DMSO) ed utilizzato per il trattamento di cellule. Il settanta per cento di cellule confluenti sono state trattate con estratto a 2, 5, 10, 25, 50, 100, 200 e 400 pg mi<'1>per 24 e 48 h in un terreno cellulare completo. La concentrazione finale di DMSO utilizzata è stata 1% (percentuale in volume) per ciascun trattamento.

Vitalità Cellulare

L’ effetto di estratto di etanolo/acqua sulla vitalità cellulare è stato determinato utilizzando il saggio di bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazolo-2-yl)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) (Applichem A2231) secondo<34>. Le cellule di adenocarcinoma polmonare (A549), inseminate in piastre a 96 pozzetti (pozzetto da 2 x IO<3>cellule), dopo tempi di trattamento, sono stati trattati con 10 μΐ (5 mg mi<'1>) di MTT e incubati per 3 ore. L’assorbanza è stata registrata su un lettore di micropiastre ad una lunghezza d’onda di 570 nm (Multiskan FC, THERMO SCIENTIFIC). L’effetto dell’estratto sulla vitalità cellulare è stata valutata come percentuale di vitalità cellulare calcolata come il rapporto tra assorbanza media di ciascun campione e assorbanza media di controllo. Le cellule A549 trattate con diverse concentrazioni dell’estratto per 24 e 48 ore non sono state influenzate da nessuna delle concentrazioni sperimentate (2, 5, 10, 25, 50, 100, 200 pg mi<'1>) eccetto che le cellule A549 alla concentrazione più elevata di 200 e 400 pg mi<'1>, che hanno indotto una leggera riduzione della vitalità cellulare (80 e 81% della vitalità cellulare, a 400 pg mi<'1>, ai due tempi di incubazione, Figura 3 A).

Per valutare gli effetti antiossidanti dell’estratto abbiamo indotto uno stress ossidativo su cellule A549 con perossido di idrogeno (H202). In primo luogo, abbiamo trattato le cellule A549 con un ampio intervallo di concentrazioni di H202(0,3, 3, 30 e 300 mM) per determinare la dose di Concentrazione Inibitoria semi massima (IC50) per il pretrattamento di cellule, prima di esperimenti di recupero con estratto; la dose IC50 è stata stabilita come 30 mM dopo 24 ore e 48 ore di trattamento (Figura 3B). Quindi abbiamo trattato le cellule A549 con 30 mM di H202per 1 ora, inducendo stress ossidativo H202e abbiamo aggiunto l’estratto alle cellule. L’estratto ha indotto un significativo effetto di recupero su cellule A549 stressate con H202dopo 48 ore di trattamento. Gli istogrammi in Figura 3C mostrano l’effetto di trattamento con H202(trattamento di lesione) ed estratto. Il trattamento con H202è risultato nella vitalità cellulare del 36% dopo 48 ore, mentre l’aggiunta di estratto ha indotto una proliferazione di cellule A549, con un aumento di vitalità cellulare di 143, 114, 125, 112, 133, 126, 114 e 148% per tutte le concentrazioni sperimentate (2, 5, 10, 25, 50, 100, 200 e 400 pg mi<'1>) rispetto al controllo negativo. Entro l’errore sperimentale, vi è stato un effetto plateau già a 2 pg mi<'1>dell’estratto e un ulteriore aumento di questa concentrazione non ha influenzato la vitalità cellulare.

Estrazione di RNA e Real-Time PCR

Le cellule A549 (2 x IO<6>), utilizzate per l’estrazione e l’analisi di RNA sono state inseminate in piatti di Perii (diametro 100 mm) per ottenere quattro tipi di campioni: controllo negativo senza alcun trattamento, controllo positivo con 30 mM di cellule H202, trattate con estratti di etanolo/acqua (100, 200 e 400 pg mi<'1>), e cellule recuperate con estratti (100, 200 e 400 pg mi<'1>) dopo pre-trattamento per 1 ora con 30 mM di H202. Dopo 2 ore di tempo di esposizione, le cellule A549 sono state lavate direttamente nel piatto di Perii aggiungendo soluzione salina fredda tamponata con fosfato (PBS) e scuotendo leggermente.

Le cellule sono state Usate nel piatto di Perii aggiungendo 1 mi di reagente Trisure (Bioline, cat. BIO-38033) per diametro di piatto di 100 mm. RNA è stato isolato secondo il protocollo del fabbricante. La concentrazione e la purezza di RNA sono state valutate utilizzando il nanofotometro NanodroP (Euroclone).

Circa 200 ng RNA sono stati sottoposti a reazione di trascrizione inversa utilizzando il primo kit di linea RT<2>(Qiagen, cat.330401) secondo le istruzioni del fabbricante. L’analisi qRT-PCR è stata eseguita tre volte utilizzando il kit “RT<2>Profiler PCR Array” (Qiagen, cat.330231), per analizzare l’espressione di geni da stress ossidativo cellulare su cellule A549. I piatti sono stati fatti procedere su un VUA7 (blocchi di pozzetti Applied Biosystems 384), protocollo di Standard Fast PCR Cycling con 10 μΐ volumi di reazione. Le condizioni di ciclo utilizzate sono state: 1 iniziazione di ciclo a 95,0°C per 10 minuti seguita da amplificazione per 40 cicli a 95,0°C per 15 s e 60,0°C per 1 minuto. Dati di amplificazione sono stati raccolti tramite ViiA 7 RUO Software (Applied Biosystems). I valori di soglia di ciclo (Ct) sono stati analizzati con software online di analisi di dati di serie PCR (http://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php, Qiagen).

L’espressione dei geni coinvolti nello stress ossidativo e percorsi di riparazione (Informazioni supplementari, Tabella S2) è stata analizzata nelle cellule A549 trattate con 100, 200 e 400 pg mi<'1>di solo estratto (Figura 4D) e 100, 200 e 400 pg mi<'1>di estratto dopo 1 ora di esposizione a 30 mM di H202(rispettivamente, Figura 4A, 4B, 4C) poiché le concentrazioni di estratto inferiori non hanno indotto cambiamenti nell’espressione dei geni e proteine. I risultati dell’espressione dei geni sono riportate dopo due 2 ore di trattamento in quanto diversi fattori implicati nei percorsi di riparazione del danno ossidativo sono stati già espressi e attivati dopo questo intervallo di tempo. I geni di controllo per qPCR in tempo reale sono stati beta-actina (ACTB), beta-2-microglobulina (B2M), ipoxantina fosforibosiltranferasi (HPRT1) e proteina ribosomiale grande P0(RPLP0), l’espressione dei quali è rimasta costante. Per gli studi di espressione di geni, sono state selezionate le tre concentrazioni più alte (100, 200 e 400 pg mi<'1>) che hanno mostrato forte attività di riparazione anche se abbiamo osservato una leggera citotossicità (circa il 20%) alle due concentrazioni più alte (200 ed 400 pg mi<'1>). Nonostante la tossicità, vi è stata una significativa attivazione dipendente dalla dose degli specifici meccanismi di risposta allo stress ossidativo senza attivare i geni coinvolti nei programmi di morte cellulare con tutte e tre le concentrazioni. Questo suggerisce che la leggera citotossicità non inibisce l’attività di riparazione dell’estratto.

Estrazione di Proteina e analisi Western Blot

Le cellule A549 (2 x IO<6>), utilizzate per l’estrazione e l’analisi di proteina sono state inseminate in piatti di Perii (diametro 100 mm) per ottenere quattro tipi di campioni: controllo negativo senza alcun trattamento, controllo positivo con cellule trattate con 30 mM di H202, cellule trattate con 100, 200 e 400 pg mi<'1>, e cellule recuperate con 100, 200 e 400 pg m<'1>di estratto dopo pre-trattamento per 1 ora con 30 mM di H202. Il Usato di cellule A549 è stato preparato dopo 24 ore di trattamento raschiando le cellule di ogni piatto di Perii in 1 mi di tampone “Radio Immune Precipitation Assay” (RIPA, Celi Signaling, cat. 9806), integrato con 1 pM di inibitore proteasi PMSF (Celi Signaling, cat. 8553). Il Usato è stato incubato su ghiaccio per 15 min e quindi chiarificato tramite centrifuga a 14000 x g, per 20 min. La concentrazione totale di proteina è stata determinata secondo il metodo Bradford utilizzando un “Protein Assay Reagent” (Applichem, cat. A6932) con albumina di siero bovino (BSA, Sigma Aldrich, cat. A2058) come standard. L’estratto di proteina è stato immagazzinato a -20°C fino all’utilizzo. Prima dell’elettroforesi, i campioni di proteina sono stati incubati a 100°C per 5 minuti. Dopo 10% SDS-PAGE, i gel tinti con Coomassie oppure macchiati su membrana di nitrocellulosa (Biorad, cat. 170-4159). Le membrane sono state incubate per 1 ora in reagente bloccante (IX Tris Buffered Saline-TBS), con 0,1% Tween-20 con 5% percentuale in peso/volume di latte in polvere non grasso, e incubate tutta la notte a 4°C con anticorpi primari diluiti in IX TBS, 0,1% Tween-20 con 5% BSA.

Sono state esaminate tre proteine chiavi: 24-deidrocolesterolo riduttasi (DHCR24, 1:1000, Sigma Aldrich SAB1405713), glutatione peroxidasi 4 (GPX4, 1:1000, Sigma Aldrich SAB2500486), prostaglandina riduttasi 1 (PTGR1, 1:1000, Sigma Aldrich SAB4500918). Il controllo positivo è stato ottenuto utilizzando anticorpi anti-3-actina (1:500, Novus Biological cat. NB600-501).

Dopo l’incubazione, le membrane sono state lavate tre volte per 5 minuti ciascuna con 15 mi di TBS/Tween e quindi incubate con anticorpo secondario HRP coniugato con leggera agitazione per 1 ora a temperatura ambiente. Per anticorpi β-actina e DHCR24, abbiamo utilizzati anticorpi secondari HRP coniugati “anti -mouse” (1:10000, Santa Cruz Biotechnology); per anticorpi GPX4 e PTGR1, abbiamo utilizzato anticorpi secondari HRP coniugati “anti-rabbit” (1:10000, Jackson ImmunoResearch).

Dopo l’incubazione, le membrane sono state lavate tre volte per 5 minuti ciascuna con 15 mi di TBS/Tween. Le membrane macchiate sono state immunorilevate utilizzando “clarity Western ECL” (Biorad, cat. 170-5060). Le proteine sono state visualizzate con pellicola di raggi X medica di Fuji (cat. 47410). L’analisi densitometrica di fasce immunopositiviu è stata eseguita utilizzando il software Image J.

ELISA per PGE2

Le prostaglandine sono state quantificate nel terreno cellulare tramite il kit ELISA (Life Technologies, cat. EHPGE2) secondo le raccomandazioni standard del fabbricante. Abbiamo quantificato le prostaglandine in quattro campioni: cellule A549 senza trattamento (di controllo), cellule A549 trattate con 100, 200 e 400 pg mi<'1>di estratto, cellule A549 trattate solo con 30 mM di H202e cellule A549 trattate con 100, 200 e 400 pg mi<'1>dell’estratto dopo pre-trattamento per 1 ora con 30 mM H202.

Poiché i geni DHCR24, GPX4 e PTGR1 hanno ruoli cruciali nei percorsi di segnalazione cellulare antiossidante/anti-infiammatoria, le cellule A549 sono state trattate con 200 e 400 pg mi<'1>di estratto per 24 ore in presenza o assenza di 30 mM H202e i livelli di proteina sono stati analizzati tramite Western blot. Abbiamo scelto le concentrazioni più attive utilizzate per analisi saggio PCR per confrontare la upregolazione tra gene ed espressione di proteina. Il tempo di esposizione è stato 24 ore in quanto i livelli di espressione di proteina erano troppo bassi prima di questo periodo. L’analisi di Western blot ha rivelato un aumento significativo solo nell’espressione di DHCR24 alle due concentrazioni sperimentate, mentre l’espressione di GPX4 e PTGR1 sono aumentate significativamente solo dopo pretrattamento H202a 400 pg mi<'1>. Alla luce di questi risultati, abbiamo ipotizzato che l’estratto era in grado di riparare il danno cellulare perossidativo riducendo la quantità di prostaglandine. Il test ELISA quantitativo è stato utilizzato per determinare i livelli di prostaglandina E2(PGE2) secreti dalle cellule A549 nel terreno di coltura cellulare prima e dopo il trattamento con estratto. Come mostrato in Figura 5A, le cellule A549 trattate con estratti (concentrazioni di 100, 200 e 400 pg mi<'1>) avevano gli stessi livelli di prostaglandina E2(rispettivamente 29, 30 e 28 pg pi<'1>) del controllo negativo (30 pg pi<'1>). Al contrario, vi era una significativa diminuzione dipendente dalla dose (90, 29 e 28 pg pi<'1>) dei livelli di prostaglandina E2rispetto al controllo positivo (140 pg pi<'1>) nelle cellule A549 trattate con estratto (100, 200 e 400 pg mi<'1>) dopo pretrattamento con 30 mM di H202(Figura 5B). Questi dati mostrano che il trattamento di estratto risulta in una significativa diminuzione dei livelli di PGE2nelle cellule danneggiate da H202.

Trattamento di epidermide umana

EpiDerm™ è stato acquistato dalla MatTek Corporation (EPI-200-SIT) e mantenuto nel terreno di coltura fornito dal fabbricante e secondo il protocollo standardizzato. Il modello di pelle EpiDerm (area di 0,6 cm<2>) era costituito da cheratinociti prelevati da epidermide umana normale (NHEK) coltivati per formare un modello multi-strato, altamente differenziato, dell’epidermide umana.

I tessuti di EpiDerm sono stati condizionati tramite incubazione con terreno di coltura per rilasciare composti correlati allo stress di trasporto e detriti tutta la notte (in una atmosfera di C02al 5% a 37°C). Circa 200 pg mi<'1>di estratto di carotenoidi sono stati disciolti in dimetilsulfossido (DMSO, concentrazione finale 1% percentuale in volume) ed utilizzati per il trattamento di epidermide umana; dopo 1 ora di incubazione con Γ estratto, un terreno di recupero completo è stato utilizzato per 24 ore di tempo di recupero.

Vitalità dei Tessuti

Abbiamo utilizzato il modello di tessuto epidermico umano ricostruito EpiDerm EPI-200 (dimensione 0,63 cm<2>) come modello in vitro per confermare la potenziale applicazione di questo estratto come cosmeceutico. In particolare, abbiamo scelto questo tessuto in quanto lo stress ossidativo in vivo avviene frequentemente nell’epidermide causando invecchiamento e altre malattie correlate con lo stress ossidativo.

L’effetto dell’estratto sulla vitalità del tessuto è stato determinato utilizzando il saggio MTT. Dopo 1 ora di trattamento e 24 ore di tempo di recupero, i tessuti sono stati trasferiti a piastre a 24 pozzetti contenenti terreno MTT (1 mg mi<'1>). Dopo 3 ore di incubazione in MTT, il sale di formazano blu è stato estratto con 2 ml/tessuto di isopropanolo e la densità ottica del formazan estratto è stata determinata utilizzando uno spettrofotometro ad una lunghezza d’onda di 570 nm. La relativa vitalità di tessuto è stata calcolata per ciascun tessuto come percentuale della media dei tessuti di controllo negativi. Il potenziale di irritazione della pelle dell’estratto di test è stato predetto se la vitalità di tessuto relativa rimanente era al di sotto del 50% (MatTek Corporation-Protocol).

EPI-200 è stato trattato con 30 mM H202e con 200 pg mi<'1>dell’estratto di etanolo/acqua per 1 ora, dopo lesione con H202. Il modello di tessuto epidermico è stato trattato con 200 pg mi<'1>di estratto in quanto questa era la concentrazione più bassa alla quale i dati di espressione di gene e di proteina rivelavano una completa attivazione di tutti i fattori chiave nel percorso antiossidante. H terreno trattato è stato rimosso e sostituito con estratto, ma senza H202, per valutare se l’effetto irritante persisteva dopo 24 ore di recupero (indicato come tempo di recupero). H trattamento con 200 pg mi<'1>di estratto per 1 ora ha influenzato significativamente la vitalità del tessuto dopo 24 ore di tempo di recupero (vitalità 85%) in confronto all’effetto irritante di 1 ora di trattamento con H202(18% vitalità) (Figura 6). L’effetto di riparazione dell’estratto era anche più evidente 1 ora più tardi dopo il trattamento con 30 mM H202e 200 pg mi<'1>del tessuto di estratto, con la vitalità che aumentava da circa 20% a circa 108,5% rispetto al controllo negativo.

Analisi Statistica

Il significato statistico del saggio DPPH è stato determinato dal test t di Student (valori *p < 0,05). Le differenze statistiche tra le cellule trattate e di controllo per i conteggi della vitalità cellulare sono stati determinati da One-way ANOVA e le differenze significative tra i gruppi trattati dal test t di Student (*) e ANOVA seguiti dal test di Dunnett (#) (valori p < 0,001) utilizzando software Microsoft Excel (versione 365, 2013). I dati di espressione dei geni sono stati analizzati dal software online di analisi di dati di saggio PCR array (http://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php, Qiagen®). Solo valori di espressione superiori a 2,0 volte la differenza rispetto ai controlli sono stati considerati significativi. L’espressione di proteina Western blot è stata calcolata come la percentuale di zona integrale di ogni singola fascia di gel rispetto alla zona totale di corsie di gel, rappresentata come pixel. Le differenze statistiche tra trattati e controlli sono state determinate dal test t di Student con valori significativi di p < 0,05. I dati significativamente diversi dai controlli, con valori di p < 0,001 sono marcati con due asterischi nelle figure. Le differenze significative tra gruppi trattati, dopo esperimenti di tessuto umano epidermico, sono state determinate utilizzando il test t di Student (*p < 0.05. e ANOVA.

RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI

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2. Jo, W.S. et al. Effect of Microalgal Extracts of Tetraselmis suecica against UVB-Induced Photoaging in Human Skin Fibroblasts. Toxicol. Res. 28(4), 241-248 (2012).

3. Dall'Osto, L., Cazzaniga, S., North, H., Marion-Poll, A., Bassi, R. The Arabidopsis aba4-l mutant reveals a specific function for neoxantina in protection against photooxi dative stress. Plani Celi. 19(3), 1048-1064 (2007).

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9. Brunet, C. et al. Spectral radiation dependent photoprotective mechanism in thè diatom Pseudonitzschia multistriata. PLoS ONE. 9, e87015 (2014).

Claims (22)

1. RIVENDICAZIONI 1. Estratto idroalcolico grezzo di Tetraselmis suecica per l’utilizzo nel trattamento curativo o trattamento preventivo di disordini o malattie correlate ai danni ossidativi di cellule o tessuti.
2. 2. Estratto idroalcolico grezzo di Tetraselmis suecica per l’utilizzo in un trattamento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il trattamento serve per riparare o prevenire la lesione cellulare causata da perossido o per la ricostruzione o rigenerazione di tessuti epidermici dopo la lesione da perossido o per prevenire lesioni da perossidi dei tessuti epidermici.
3. 3. Estratto idroalcolico grezzo di Tetraselmis suecica per l’utilizzo in un trattamento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 o 2, in cui il disordine o la malattia è selezionato/a tra cancro, malattie infiammatorie o invecchiamento precoce della pelle.
4. 4. Estratto idroalcolico grezzo di Tetraselmis suecica per l’utilizzo in un trattamento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, in cui l’estratto idroalcolico è la miscela di acqua e di un alcool selezionato da etanolo, metanolo, n-propanolo, isopropanolo, n-butanolo, iso-butanolo, ter-butanolo o alcool polari equivalenti.
5. 5. Estratto idroalcolico grezzo di Tetraselmis suecica per l’utilizzo in un trattamento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, in cui il rapporto alcool/acqua (percentuale in volume) è nell’intervallo di 4: 1-1:1, preferibilmente 2:1, più preferibilmente 3:1.
6. 6. Estratto idroalcolico grezzo di Tetraselmis suecica per l’utilizzo in un trattamento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, in cui l’estratto è una miscela di etanolo/acqua avente rapporto di etanolo/acqua di 3 : 1.
7. 7. Estratto idroalcolico grezzo di Tetraselmis suecica per l’utilizzo in un trattamento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 in cui l’estratto è in forma secca.
8. 8. Composizione farmaceutica per l’utilizzo in un trattamento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, comprendente un estratto idroalcolico grezzo di Tetraselmis suecica, opzionalmente in forma secca, un eccipiente farmaceuticamente accettabile e, opzionalmente, uno o più additivi e/o uno o più agenti attivi aggiuntivi.
9. 9. Composizione farmaceutica per l’utilizzo in un trattamento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, comprendente un estratto idroalcolico grezzo di Tetraselmis suecica, opzionalmente in forma secca, un eccipiente farmaceuticamente accettabile e, opzionalmente, uno o più additivi e/o uno o più agenti attivi aggiuntivi, in cui l’estratto è una miscela di acqua e di un alcool selezionato da etanolo, metanolo, n-propanolo, isopropanolo, n-butanolo, isobutanolo, ter-butanolo or alcool polari equivalenti.
10. 10. Composizione farmaceutica per l’utilizzo in un trattamento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, comprendente un estratto idroalcolico grezzo di Tetraselmis suecica, opzionalmente in forma secca, un eccipiente farmaceuticamente accettabile e, opzionalmente, uno o più additivi e/o uno o più agenti attivi aggiuntivi, in cui l’estratto è una miscela di acqua e di un alcool selezionato da etanolo, metanolo, n-propanolo, isopropanolo, n-butanolo, isobutanolo, ter-butanolo or alcool polari equivalenti aventi rapporto di alcool/acqua (percentuale in volume) nell’intervallo di 4: 1-1:1, preferibilmente 2:1, più preferibilmente 3:1.
11. 11. Composizione farmaceutica per l’utilizzo in un trattamento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, comprendente un estratto grezzo di etanolo/acqua 3:1 di Tetraselmis suecica, opzionalmente in forma secca, un eccipiente farmaceuticamente accettabile e, opzionalmente, uno o più additivi e/o uno o più agenti attivi aggiuntivi.
12. 12. Composizione cosmetica comprendente l’estratto idroalcolico grezzo di Tetraselmis suecica, opzionalmente in forma secca, un eccipiente cosmeticamente accettabile e, opzionalmente, uno o più additivi e/o uno o più agenti attivi aggiuntivi, per riparare cosmeticamente o prevenire la lesione cellulare causata da perossido oppure per la ricostruzione o rigenerazione di tessuti epidermici dopo la lesione da perossido oppure per impedire lesioni da perossidi dei tessuti epidermici.
13. 13. Composizione cosmetica secondo la rivendicazione 12 per il trattamento di infiammazioni della pelle o invecchiamento della pelle.
14. 14. Composizione cosmetica secondo la rivendicazione 12 o 13 in cui l’estratto idroalcolico è una miscela di etanolo-acqua avente rapporto di etanolo/acqua (percentuale in volume) nell’intervallo di 4: 1-1:1, preferibilmente 2:1, più preferibilmente 3:1.
15. 15. Supplemento nutrizionale o prodotto nutraceutico comprendente un estratto idroalcolico grezzo di Tetraselmis suecica, opzionalmente in forma secca, almeno un additivo o coadiuvante adatto per la nutrizione umana e, opzionalmente, uno o più agenti attivi aggiuntivi per riparare o prevenire lesioni cellulari causate da perossido o per la ricostruzione o rigenerazione di tessuti epidermici dopo la lesione da perossido o per prevenire lesioni da perossidi dei tessuti epidermici.
16. 16. Supplemento nutrizionale o prodotto nutraceutico comprendente un estratto idroalcolico grezzo di Tetraselmis suecica, opzionalmente in forma secca, almeno un additivo o coadiuvante adatto per la nutrizione umana e, opzionalmente, uno o più agenti attivi aggiuntivi per sostenere o coadiuvare o rinforzare un trattamento medico del cancro, malattie infiammatorie o invecchiamento precoce della pelle o naturale.
17. 17. Supplemento nutrizionale o nutraceutico secondo le rivendicazioni 15 o 16, in cui l’estratto idroalcolico è una miscela di etanolo-acqua avente rapporto di etanolo/acqua (percentuale in volume) nell’intervallo di 4: 1-1:1, preferibilmente 2:1, più preferibilmente 3:1.
18. 18. Uso di un estratto idroalcolico grezzo di Tetraselmis suecica, opzionalmente in forma secca, in una composizione cosmetica, per cosmeticamente riparare o prevenire lesioni cellulari causate da perossido o per la ricostruzione o rigenerazione di tessuti epidermici dopo la lesione da perossido o per prevenire lesioni da perossidi dei tessuti epidermici oppure per il trattamento di infiammazioni della pelle o invecchiamento della pelle.
19. 19. Uso di un estratto idroalcolico grezzo di Tetraselmis suecica, secondo la rivendicazione 18, in cui l’estratto idroalcolico è una miscela di etanolo-acqua avente rapporto di etanolo/acqua (percentuale in volume) nell’intervallo di 4: 1-1:1, preferibilmente 2:1, più preferibilmente 3:1.
20. 20. Uso di un estratto idroalcolico grezzo di Tetraselmis suecica, opzionalmente in forma secca, in un supplemento nutrizionale o prodotto nutraceutico per riparare o prevenire lesioni cellulari causate da perossido oppure per la ricostruzione o rigenerazione di tessuti epidermici dopo la lesione da perossido o per impedire lesioni da perossidi dei tessuti epidermici.
21. 21. Uso di un estratto idroalcolico grezzo di Tetraselmis suecica, opzionalmente in forma secca, in un supplemento nutrizionale o prodotto nutraceutico per sostenere, coadiuvare o rafforzare un trattamento medico del cancro, malattie infiammatorie o invecchiamento precoce della pelle o naturale.
22. 22. Metodo per la preparazione di un estratto idroalcolico di Tetraselmis suecica comprendente i seguenti passi di: estrarre una biomassa di Tetraselmis sp. con una miscela di alcool-acqua, separare la fase liquida dalle cellule della biomassa, opzionalmente ri-estrarre almeno una volta le cellule separate con lo stesso, o diverso, solvente idroalcolico, unire gli estratti e opzionalmente essiccare oppure essiccare parzialmente gli estratti uniti, a condizione che il metodo non comprenda alcun passaggio mirato alla separazione o purificazione di uno o più componenti specifici o gruppo di componenti o arricchimento degli estratti con uno o più componenti o gruppo di componenti.