JP6294579B2

JP6294579B2 - グルタチオン産生促進剤

Info

Publication number: JP6294579B2
Application number: JP2012013298A
Authority: JP
Inventors: 裕子内田; 郁子栗田; 政彦斎
Original assignee: Morinaga and Co Ltd
Current assignee: Morinaga and Co Ltd
Priority date: 2012-01-25
Filing date: 2012-01-25
Publication date: 2018-03-14
Anticipated expiration: 2032-01-25
Also published as: JP2013151458A

Description

本発明は、ピセアタンノール及び／又はスキルプシンＢを有効成分として含有するグルタチオン産生促進剤に関する。

グルタチオン（Glutathione）は、生体内に広く分布するトリペプチドであり、その別名はγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニル−グリシンである。グルタチオンは細胞内に比較的高濃度（およそ1〜10mM）に存在する一方、細胞外での濃度はその１／１００〜１／１０００程度である。グルタチオンの存在形態には、チオール基が遊離した還元型（GSH）と、そのチオール基ジスルフィド結合によってグルタチオン２分子がつながった酸化型（GSSG）とがあるが、生体内グルタチオンはその大部分が還元型である。

グルタチオンは様々な生理機能を発揮する。例えば、そのチオール基の還元・求核性によって酸化的障害からタンパク質、核酸、脂質等を保護したり、酸化型グルタチオンの細胞外への排出によって細胞内でのチオール濃度を維持したり、グルタチオン抱合によって有害分子を解毒したり、酸化ストレス応答に機能するグルタチオンペルオキシダーゼやグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの補酵素として活性酸素や過酸化物を除去したりすることなどが挙げられる。

このようにグルタチオンは、種々の酸化的ストレスから細胞や生体を保護する役割を果たす生体機能分子の主要な１つであると言える。従って、例えば、紫外線を浴びた肌においては、皮膚細胞中のグルタチオン量が減少して、肌の損傷が起こりやすくなり、また回復しにくくなる。また、加齢によっても皮膚細胞中のグルタチオン量は減少し、肌の老化の原因となる。

そこで、生体のグルタチオン量を高めることは、細胞の損傷や生体の老化を防ぎ、健常な身体を維持するのに有用であるとの考えから、近年、様々なグルタチオン産生促進剤が提案されている。例えば、下記特許文献１には、ビルベリー、ウォルナットから選ばれる１種又は２種の植物抽出物を有効成分とするグルタチオン産生促進剤の発明が開示されている。また、下記特許文献２には、クチナシの抽出物を含有することを特徴とするグルタチオン産生促進剤の発明が開示されている。また、下記特許文献３には、γ−トコフェロールまたはδ−トコフェロールを含有するグルタチオン産生促進剤の発明が開示されている。また、下記特許文献４には、サフランのカロチノイド系の色素成分であるクロセチンを有効成分とするグルタチオン産生促進剤の発明が開示されている。また、下記特許文献５には、皮膚を光保護するためのジチオラン化合物の使用であって、特にＵＶ放射によって引き起こされる酸化ストレスに対する天然の抗酸化保護を皮膚に与える内因性細胞内グルタチオンのレベルを強化および/または保持することを目的とした該ジチオラン化合物の使用の発明が開示されている。また、下記特許文献６には、マタタビの抽出物を含有することを特徴とするグルタチオン産生促進剤の発明が開示されている。また、下記特許文献７には、セイヨウバラ抽出物を有効成分とするグルタチオン産生促進剤の発明が開示されている。

特開２００６−２４１０６２号公報特開２００６−３４７９３４号公報特開２００７−２８４４３０号公報特開２００８−７４７２１号公報特開２０１０−７７１２１号公報特開２０１０−１２０８７６号公報特開２０１０−１９５７４６号公報

グルタチオンは、生体の各臓器または皮膚等での様々な生理的局面でその機能が果されるため、そのような多様な局面でグルタチオン量を高める上では、従来のものとは異なる新たな有効成分を含有するグルタチオン産生促進剤への要請があった。

そこで、本発明の目的は、生体のグルタチオン量を高めるのに有用な、新たな有効成分を含有するグルタチオン産生促進剤を提供することにある。

本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究した結果、ピセアタンノール及び／又はその２量体であるスキルプシンＢが、生体のグルタチオン量を高めることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は以下の構成を有するグルタチオン産生促進剤を提供する。
［１］ピセアタンノール及びスキルプシンＢからなる群から選ばれた少なくとも一種を有効成分として含有することを特徴とするグルタチオン産生促進剤。
［２］パッションフルーツ種子抽出物を有効成分として含有することを特徴とするグルタチオン産生促進剤。
［３］皮膚外用剤の形態とされている前記［１］又は［２］記載のグルタチオン産生促進剤。
［４］紫外線を受ける環境下において、肌の損傷を予防又は回復するために用いられる前記［３］記載のグルタチオン産生促進剤。

本発明のグルタチオン産生促進剤によれば、その有効成分であるピセアタンノール及び／又はその２量体であるスキルプシンＢが、皮膚を構成する細胞に作用して、その細胞が生産するグルタチオン量を高めることができる。本発明のグルタチオン産生促進剤は、皮膚外用剤の形態とすることができ、特に、紫外線を受ける環境下において、肌の損傷を予防又は回復するのに有用である。

試験例１（ピセアタンノール）において正常ヒト表皮細胞中の総グルタチオン量を定量した結果を示す図表である。試験例２（パッションフルーツ種子抽出物）において正常ヒト表皮細胞中の総グルタチオン量を定量した結果を示す図表である。試験例３（ピセアタンノール及びスキルプシンＢ）において正常ヒト表皮細胞中の総グルタチオン量を定量した結果を示す図表である。

本発明において用いられるピセアタンノール（Piceatannol）は、下記化学式（１）で表される。

上記化学式で表されるピセアタンノールは、２個のフェニル基がトランス型のアルケン基で連結した構造のピセアタンノールであるが、上記化学式（１）において、２個のフェニル基がシス型のアルケン基で連結した構造のピセアタンノールを用いることもできる。

本発明において用いられるスキルプシンＢ（Scirpusin B）は、下記化学式（２）で表される。

上記化学式で表されるスキルプシンＢは、ピセアタンノールの２量体の構造を有し、２個のフェニル基がトランス型のアルケン基で連結した構造のピセアタンノール構造を包含するが、上記ピセアタンノールと同様に、上記化学式（２）において、２個のフェニル基がシス型のアルケン基で連結した構造のピセアタンノール構造を包含するスキルプシンＢを用いることもできる。

ピセアタンノール及び／又はスキルプシンＢは化学合成品であってもよく、天然物由来のものであってもよい。例えば、パッションフルーツの種子にはピセアタンノール及び／又はスキルプシンＢが豊富に含まれているので、その抽出物を利用することもできる。

パッションフルーツは、パッシフローラ属トケイソウ科の植物であり、別名：クダモノトケイソウ(果物時計草)とよばれ、その実は甘酸っぱく果物として実をそのまま食したり、その果汁をジュースにして飲んだり、ゼリー、ケーキ等の飲食品に配合して、風味付けに用いられたりされている。パッションフルーツの種子は硬く、ジュースなどにする場合には果実から取り除かれ、果実を種ごと飲食した場合であってもその外皮は硬く消化を受けにくいのでそのまま排泄されてしまう。このような背景のなか、パッションフルーツの種子を有効利用するという面でも、ピセアタンノール及び／又はスキルプシンＢの起源としては、パッションフルーツの種子であることが好ましい。パッションフルーツの種子抽出物は、パッションフルーツの食経験からも裏付けられるように、安全性には問題がないものである。

パッションフルーツの種子抽出物の調製方法は特に限定されが、例えば、種子を細断、破砕、又は磨砕等し、種々の溶媒を用いて抽出する方法があげられる。抽出温度は適宜設定することができる。また、上記種子は、抽出効率をよくするため、適宜、酸又はアルカリ分解、酵素分解等の化学的処理を施してから抽出することもできる。

抽出溶媒としては、水、エタノール等の低級アルコール、酢酸エチル等の低級アルキルエステル、グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等が例示され、これらの一種又は二種以上の混合溶媒を用いることができる。これらの中で、含水１，３−ブチレングリコール又は含水エタノールは、後述するポリフェノール関連化合物を含む有効成分を効率よく抽出することができるので好ましい。

パッションフルーツの種子抽出物は、上記の方法で得られた抽出液を、そのまま又は濃縮して液体のまま用いてもよく、更に上記抽出液を凍結乾燥又は噴霧乾燥により粉末化して用いることもできる。抽出物中に含まれる不溶物は、適宜、濾過などで除くことができる。不溶物はさらに粉砕し、微細粒子状にしてもよい。

上記のようにして得られる一次抽出物は、抽出の条件によっても異なるが、通常０．５μｇ〜２０ｍｇ／１００ｍｇ、より典型的には３μｇ〜１０ｍｇ／１００ｍｇの純度でピセアタンノールを含有する。また、通常０．１μｇ〜２０ｍｇ／１００ｍｇ、より典型的には１μｇ〜７ｍｇ／１００ｍｇの純度でスキルプシンＢを含有する。よってその一次抽出物をそのまま用いることもできるが、これをイオン交換、サイズ排除カラムクロマト法、ＨＰＬＣ法、ゲルろ過、膜分離等により、分画、精製して用いることもできる。

具体的には、例えば、パッションフルーツの種子抽出物の一次抽出物を下記条件でＨＰＬＣにかけたときの保持時間が１９〜２２分に溶出される化合物であり、質量分析装置によるマススペクトル測定によってネガティブイオンモードのシグナルとしてｍ／ｚ２４３を呈する化合物（ピセアタンノール）を基準にして、ＨＰＬＣ等により分画、分取して、これを用いることができる。

［ＨＰＬＣ条件］
・カラム：Mightysil RP-18 GP250-10 径10mm、長さ250mm（関東化学株式会社製）
・カラム温度：40℃
・溶出条件：流速3ml/min、0％メタノール→30％メタノール（10min）
・ＵＶ検出：280nm

また、例えば、パッションフルーツの種子抽出物の一次抽出物を下記条件でＨＰＬＣにかけたときの保持時間が１０〜１５分に溶出される化合物であり、質量分析装置によるマススペクトル測定によってネガティブイオンモードのシグナルとしてｍ／ｚ４８５を呈する化合物（スキルプシンＢ）を基準にして、ＨＰＬＣ等により分画、分取して、これを用いることができる。

［ＨＰＬＣ条件］
・カラム：ODS-3 径4.6mm、長さ150mm（ジーエルサイエンス株式会社製）
・カラム温度：45℃
・溶出条件：流速0.75ml/min、15％アセトニトリル（0min）→40％アセトニトリル（20min）→45％アセトニトリル（25min）
・ＵＶ検出：280nm

なお、本発明において「パッションフルーツ種子抽出物」とは、上記パッションフルーツ種子の一次抽出物のみならず、それから更にピセアタンノール及び／又はスキルプシンＢを指標にして抽出物を分画、精製等して得られた組成物を含む意味である。

本発明のグルタチオン産生促進剤は、上記に説明したピセアタンノール及び／又はスキルプシンＢを、グルタチオン産生促進のための有効成分として含有するものである。その有効成分以外の他の成分を配合することに特に制限はなく、必要に応じて、薬学的に許容される基材や担体を添加して、公知の製剤方法によって、例えば錠剤、顆粒剤、散剤、液剤、粉末、顆粒、カプセル剤、ゼリー状剤等の形態にして、これを経口剤として利用することができる。また、軟膏剤、クリーム剤、ジェル、パック、化粧水、化粧料等の形態にして、これを皮膚外用剤として利用することができる。

本発明のグルタチオン産生促進剤において、上記有効成分の含有量は、各製剤形態とした場合に、その製品が使用される量と有効投与量との関係を勘案して適宜定めればよく、特に制限されるものではないが、通常、固形状の製品の場合には、ピセアタンノール換算で、0.000001〜99質量％含有させることが好ましく、0.00001〜10質量％含有させることがより好ましい。また、スキルプシンＢ換算で、0.0000005〜99質量％含有させることが好ましく、0.000001〜10質量％含有させることがより好ましい。そして、液状又はゼリー状の製品の場合には、ピセアタンノール換算で、0.000001〜30質量％含有させることが好ましく、0.00001〜10質量％含有させることがより好ましい。また、スキルプシンＢ換算で、0.0000005〜30質量％含有させることが好ましく、0.000001〜10質量％含有させることがより好ましい。

本発明のグルタチオン産生促進剤の投与形態としては、体の中から作用させるため経口的に摂取してもよく、あるいは皮膚に塗布して用いてもよい。また吸引して呼吸器系に適用してもよく、その投与形態が特に制限されるものではない。特に、後述する実施例で示すように、ピセアタンノール及び／又はスキルプシンＢは、皮膚を構成する細胞に作用して、その細胞が生産するグルタチオン量を高めることができるので、皮膚外用剤の形態で用いることが好ましい。例えば、肌のはりの衰えを予防したい部位やしわを予防したい部位、又はこれらを改善したい部位などに塗布したりして用いることができる。また、紫外線を浴びると皮膚を構成する細胞中のグルタチオン量が減少するので、紫外線を受ける環境下において、肌の損傷を予防又は回復するために用いることが好ましい。例えば、日光による肌の損傷を防ぐために予め皮膚に塗布したり、日光を浴びた後の肌の損傷の回復を促進するために皮膚に塗布したりして用いることができる。

本発明のグルタチオン産生促進剤の投与量としては、特に制限はないが、典型的に皮膚に塗布する場合には、ピセアタンノール換算で単位面積あたり一回およそ0.00002〜10μｇ／ｃｍ^２である。また、スキルプシンＢ換算で単位面積あたり一回およそ0.00001〜10μｇ／ｃｍ^２である。

以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

＜試験例１＞（ピセアタンノール）
［細胞破砕液の調製］
正常ヒト表皮細胞（倉敷紡績株式会社）を、96穴マイクロプレートに2.0x10⁴cells/wellの密度で播種し、正常ヒト表皮角化細胞増殖用培地(「HuMedia KG2」倉敷紡績株式会社)を用いて３７℃、５％ＣＯ_２の培養条件で培養した。播種２４時間後に、培地を、0，0.06，0.13，0.25，0.5，1μｇ／ｍＬの各濃度となるようにピセアタンノール（関東化学株式会社）を添加した正常ヒト表皮角化細胞増殖用培地基礎培地（「HuMediaKB2」倉敷紡績株式会社)と交換して、さらに２４時間同条件で培養後、超音波処理にて細胞を破砕し、細胞破砕液を得た。

［総グルタチオン量の測定］
上記細胞破砕液中の総グルタチオン(GSH＋GSSG)量を、グルタチオンレダクターゼリサイクリング法により定量した。即ち、まず、上記細胞破砕液1に対して2.5倍量のリン酸緩衝液(0.1 M、pH 7.5) を添加後、0.5倍量の2 mM還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)および0.5倍量の3.2 unit /mLグルタチオンレダクターゼを混合し、３７℃にて１０分間反応さてグルタチオンを還元型に変換した。次に5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)(DTNB)を溶解させたリン酸バッファー(0.1M、pH7.5)を最終濃度1mMとなるように加え、添加直後および１０分間インキュベート後の吸光度(Abs.450nm)を測定した。その差(Abs.450nm(10min)-Abs.450(0min))を、還元型グルタチオン(GSH)による5-チオ-2-ニトロ安息香酸(TNB)の生産量の指標とし、これを酸化型グルタチオンの標準品を用いて作成した検量線にあてはめ、細胞破砕液中の総グルタチオン(GSH＋GSSG)量を算出した。また、別途細胞破砕液中のタンパク質含量をタンパク量測定試薬（「BCA protein Assay Reagent」PIERCE）を用いて定量し、上記総グルタチオン量をタンパク量で除することにより、単位タンパク量あたりの総グルタチオン量を算出した。各々の結果は、Student t検定による有意差検定を行い、被検試料を添加しないコントロールとの差異を評価した。

［結果］
その結果、図１に示すように、ピセアタンノールの添加により濃度依存的にヒト表皮細胞中のグルタチオン量が増加した。

＜試験例２＞（パッションフルーツ種子抽出物）
［パッションフルーツ種子抽出物の調製］
パッションフルーツ種子を３０v/v％１，３−ブチレングリコール含有水溶液で抽出し、凍結乾燥した。凍結乾燥した固形分中のピセアタンノール濃度は3.7質量％であり、スキルプシンB濃度は質量1.7%であった。

［細胞破砕液の調製］
上記パッションフルーツ種子抽出物を被検試料として、0.00, 1.56, 3.13, 6.25, 12.50, 25.00μｇ／ｍＬの各濃度となるように培地に添加した以外は試験例１と同様にして、細胞破砕液を調製した。

［総グルタチオン量の測定］
上記細胞破砕液中の総グルタチオン(GSH＋GSSG)量を、試験例１と同様にして、定量した。各々の結果は、Student t検定による有意差検定を行い、被検試料を添加しないコントロールとの差異を評価した。

［結果］
その結果、図２に示すように、パッションフルーツ種子抽出物の添加により濃度依存的にヒト表皮細胞中のグルタチオン量が増加した。

＜試験例３＞（ピセアタンノール及びスキルプシンＢ）
［細胞破砕液の調製］
上記ピセアタンノールまたはスキルプシンＢ（パッションフルーツ由来）を被検試料として、それぞれ４μＭの濃度となるように培地に添加した以外は試験例１と同様にして、細胞破砕液を調製した。

［結果］
その結果、図３に示すように、スキルプシンＢの添加によりピセアタンノールとほぼ同程度にヒト表皮細胞中のグルタチオン量が増加した。

Claims

ピセアタンノール及びスキルプシンを含有し、前記ピセアタンノールを固形分中に０．５μｇ〜２０ｍｇ／１００ｍｇの純度で含み、前記スキルプシンＢを固形分中に０．１μｇ〜２０ｍｇ／１００ｍｇの純度で含む、パッションフルーツ種子抽出物を有効成分として含有することを特徴とする皮膚表皮細胞のグルタチオン産生促進用組成物。
皮膚外用剤の形態とされている請求項１記載の皮膚表皮細胞のグルタチオン産生促進用組成物。
紫外線を受ける環境下において、肌の損傷を予防又は回復するために用いられる請求項２記載の皮膚表皮細胞のグルタチオン産生促進用組成物。
ピセアタンノール換算で単位面積あたり一回0.00002〜10μｇ／ｃｍ^２、スキルプシンＢ換算で単位面積あたり一回0.00001〜10μｇ／ｃｍ^２の量で塗布して使用される、請求項２又は３記載の皮膚表皮細胞のグルタチオン産生促進用組成物。