CN114703066A

CN114703066A - 一种栅藻、其活性成分的提取方法与应用

Info

Publication number: CN114703066A
Application number: CN202210467073.6A
Authority: CN
Inventors: 裴海燕; 蒋丽群; 谢真
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2022-04-29
Filing date: 2022-04-29
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2042-04-29
Also published as: CN114703066B

Abstract

本发明公开了一种栅藻、其活性成分的提取方法与应用，所述栅藻于2021年11月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M 20211488。本发明中筛选得到一种栅藻，命名为Coelastrella sp.SDEC‑28，从该栅藻提取得到的活性成分可以明显抑制黑色素瘤细胞的增殖活性，能够减少黑色素的产生，对皮肤起到美白的作用。

Description

一种栅藻、其活性成分的提取方法与应用

技术领域

本发明属于微藻生物技术领域，涉及一种栅藻、其活性成分的提取方法与应用。

背景技术

这里的陈述仅提供与本发明相关的背景技术，而不必然地构成现有技术。

近年来，美白护肤品已经成为日常生活的必需品，但化学美白成分的添加往往会伴随着致敏性、细胞毒性等不安全因素。因此，开发安全、高效的天然产物中的美白成分作为美白护肤品添加物成为化妆品领域的研究热点。

微藻内含丰富的生物活性物质，包括脂质、多肽或氨基酸、抗氧化剂、多糖和色素，使其可以作为护肤品开发生产的良好来源，但是，目前微藻代谢物在护肤品中的应用技术主要是作为保湿剂和抗氧化剂，应用范围较为局限。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种栅藻、其活性成分的提取方法与应用。

为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：

第一方面，本发明提供了一种栅藻，所述栅藻于2021年11月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M20211488。

第二方面，本发明提供所述栅藻的活性物质的提取方法，包括如下步骤：

将栅藻培养收获后，加入甲醇溶剂，超声破碎，至藻泥发白停止；

离心收集上清液，过滤，然后利用大孔树脂去除滤液中的叶绿素。

第三方面，本发明提供一种提取物，由所述提取方法提取得到的活性物质组成。

第四方面，本发明提供所述提取物在制备美白产品中的应用。

上述本发明的一种或多种实施例取得的有益效果如下：

本发明中筛选得到一种栅藻，命名为Coelastrella sp.SDEC-28，从该栅藻提取得到的活性成分可以明显抑制黑色素瘤细胞的增殖活性，能够减少黑色素的产生，对皮肤起到美白的作用。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1是本发明实施例的栅藻SDEC-28的显微形态学照片；

图2为本发明实施例提供的栅藻SDEC-28的系统发育树；

图3为本发明实施例提供的栅藻SDEC-28甲醇提取物的提取过程流程图；

图4为本发明实施例提供的栅藻SDEC-28对黑色素瘤细胞的细胞活力的影响和抑制率的表征图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

在一些实施例中，用于提取活性物质的栅藻为生长至稳定期的栅藻。

优选的，所述栅藻的培养基为BG11培养基，栅藻是全光培养，光照强度为50-70μmol/m²/s。

在一些实施例中，超声破碎的功率为800-1000W，超声破碎时间为80-100min。

优选的，超声破碎的功率为900W，超声破碎时间为90min。

在一些实施例中，采用有机滤膜对上清液进行过滤。

第四方面，本发明提供所述提取物在制备抑制黑色素瘤细胞药物中的应用。

第五方面，本发明提供所述提取物在制备美白产品中的应用。

优选的，所述美白产品选自面膜、保湿霜、防晒乳或保湿乳。

实施例1

微藻的分离鉴定与培养

微藻Coelastrella sp.SDEC-28保藏编号为CCTCC M 20211488，保藏日期为2021年11月25日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，分离于山东东营盐碱地中。

样品采集

2021年1月从山东东营盐碱地采集样品。

SDEC-28的分离纯化

取回的水样离心浓缩后加入BG11培养基进行扩大培养，扩大培养7天后通过血球板计数法在显微镜下计数计算藻密度，然后将藻密度稀释至16-18cells/mL(确保每个板孔中加入的细胞数为1或0个)。

在超净实验台中，取50μL稀释后的藻液于96孔板上的小孔中，其中每个小孔预先加有200μL BG11培养基，加盖用封口膜将培养板密封，防止液体挥发。

将培养板放在光照培养箱内培养10余天，待小孔中长出藻株在倒置显微镜下仔细观察并标记单细胞孔。待标记的单细胞孔内细胞增至500个以上或出现颜色时，转移单细胞孔内的藻细胞于装有10mL BG11培养基并经过灭菌的三角瓶中，用棉塞封口，置于光照培养箱中培养。经过筛选最终得到一株纯藻株，命名为SDEC-28。

SDEC-28的鉴定

1、SDEC-28的形态鉴定

藻细胞在光学显微镜下为绿色，为多细胞和单细胞两种形态，呈圆形，直径为10-15μm，其形态符合栅藻属特征，显微结构如图1所示。

2、SDEC-28的分子生物学鉴定

离心收集对数生长期的藻细胞，使用真菌基因组DNA抽提试剂盒提取基因组DNA，对其进行18S rDNA扩增。PCR扩增体系为50μL，其中包括DNA样品0.5μL，10×Buffer(Mg²⁺)2.5μL，dNTP(各2.5mM)1μL，酶0.2μL，上游引物(10μM)0.5μL，下游引物(10μM)0.5μL，ddH₂O25μL。PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，55℃复性45s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃延伸10min。

上下游引物分别为：GTAGTCATATGCTTGTCTC(NS1，见SEQ ID NO.1)和GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC(NS6，见SEQ ID NO.2)。

PCR扩增产物交由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。PCR扩增产物为18SrDNA的部分序列，长度为1321bp，根据测序结果，利用Clustalx1.83、Mega 6等相关软件与GenBank数据库中找到的同源序列进行比对分析，并采用NJ(neighbor-joining)法构建系统发育树(见图2)。SDEC-28与Scenedesmus sp.(KU057946.1,JQ315585.1)的Querycoverage值达到100％，Maxident值为99％。系统发育树同时表明SDEC-28进化地位与栅藻属最为接近。结合显微形态鉴定，初步认定其为栅藻属，命名为Coelastrella sp.SDEC-28。

SDEC-28的培养

使用藻种为实验室前期自主筛选的藻种Coelastrella sp.SDEC-28。预先养殖在BG11培养基(常见淡水蓝藻和绿藻培养基)中。栅藻SDEC-28经过扩大培养以初始接种密度为0.5g/L接种于BG11培养基中，实验室微藻培养用的光生物反应器的材料为有机玻璃，总体积为3L，培养体系放置于人工气候室中，温度为25±1℃，光暗周期为24:0，光照强度为60μmol/m²/s。待到藻生长至稳定期4000rpm的转速下离心10min进行离心收获，得到藻泥。

实施例2

栅藻SDEC-28中活性物质的甲醇提取：

活性物质的提取方法如图3所示，收集生长至稳定期的Coelastrella sp.SDEC-28，生物量OD₆₈₀＝1.5的藻液1L，离心去上清后，加10ml甲醇，超声破碎仪功率为900W，超声破碎90min，显微镜下观察到细胞破碎且藻泥发白停止，离心收集上清液，用有机滤膜进行过滤，利用大孔树脂去除滤液中的叶绿素，即得含有活性物质的提取液。进一步干燥，得到活性物质干粉。

实施例3

栅藻SDEC-28活性物质对黑色素抑制的试验

A375细胞是人恶性黑色素瘤细胞，国外化妆品生产企业的科研部门在筛选美白剂的过程中，广泛采用该细胞株作为美白化学物功效测定的受试细胞。在实验中也采用这种细胞株作为受试细胞。

1)取活性物质干粉，甲醇溶解至100mg/mL，再用甲醇分别稀释至50mg/mL、25mg/mL、10mg/mL、5mg/mL。取以上五组浓度的活性物质100μL，分别加入10mL DMEM培养基(含10％胎牛血清)，即获得提取物浓度分别为1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、100μg/mL和50μg/mL的黑色素瘤细胞培养基。

2)黑色素瘤A375细胞用含有10％胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5％CO₂条件下培养，2-3天传代1次，实验用细胞为培养12-18小时获得的处于对数生长期的细胞。

取黑色素瘤细胞A375，用PBS缓冲液洗涤两次，加入胰酶消化液，调整细胞浓度至50000个/mL，接种于96孔板中，每孔接种200μL相应的细胞悬液。置于5％CO₂，37℃培养箱中孵育4小时(融合度达到40％)。待细胞状态趋于稳定，重新加入不同浓度提取物(终浓度为50、100、250、500、1000μg/mL)，同时设立空白对照组(不含甲醇和微藻提取物)和溶剂对照组(添加100μL甲醇至10mL完全培养基)。

继续孵育24小时后，每孔加入10μL cck8溶液，并在培养箱孵育2小时。用酶标仪测定450nm处的吸光度，计算细胞活力：

细胞活力*(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100。

Coelastrella sp.SDEC-28提取物对黑色素瘤细胞抑制的效果见图4。SDEC-28甲醇提取物在50、100、250、500和1000μg/mL的浓度下都对黑色素瘤细胞A375有抑制作用，并且随着浓度的提高，抑制作用进一步加强，随浓度增加抑制率逐渐增加，呈明显的剂量-效应关系。当浓度由50μg/mL升高到1000μg/mL时，对细胞增殖的抑制作用由16.62％升高到80.21％。因此，SDEC-28甲醇提取物能有效抑制黑色素瘤细胞的生长和分裂，对黑色素瘤有明显的抑制效果，可用于美白类产品的开发。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 一种栅藻、其活性成分的提取方法与应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtagtcatat gcttgtctc 19

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcatcacaga cctgttattg cctc 24

Claims

1.一种栅藻，其特征在于：所述栅藻于2021年11月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M 20211488。

2.权利要求1所述栅藻的活性物质的提取方法，包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述栅藻的活性物质的提取方法，其特征在于：用于提取活性物质的栅藻为生长至稳定期的栅藻。

4.根据权利要求2所述栅藻的活性物质的提取方法，其特征在于：所述栅藻的培养基为BG11培养基，栅藻是全光培养，光照强度为50-70μmol/m²/s。

5.根据权利要求2所述栅藻的活性物质的提取方法，其特征在于：超声破碎的功率为800-1000W，超声破碎时间为80-100min。

6.根据权利要求5所述栅藻的活性物质的提取方法，其特征在于：超声破碎的功率为900W，超声破碎时间为90min。

7.根据权利要求2所述栅藻的活性物质的提取方法，其特征在于：采用有机滤膜对上清液进行过滤。

8.一种提取物，其特征在于：由权利要求2-7任一所述提取方法提取得到的活性物质组成。

9.权利要求8所述提取物在制备抑制黑色素瘤细胞药物中的应用，或在制备美白产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述美白产品选自面膜、保湿霜、防晒乳或保湿乳。