CN109646389B

CN109646389B - 黄杆菌发酵提取物及其在化妆品中的应用

Info

Publication number: CN109646389B
Application number: CN201910144056.7A
Authority: CN
Inventors: 王培培; 杨秀芬; 郑春阳
Original assignee: Robustnique Corp ltd
Current assignee: Robustnique Corp ltd
Priority date: 2019-02-27
Filing date: 2019-02-27
Publication date: 2022-03-11
Anticipated expiration: 2039-02-27
Also published as: CN109646389A

Abstract

本发明公开了黄杆菌发酵提取物及其在化妆品中的应用。本发明人首次发现黄杆菌发酵提取物具有很好的抗氧化效果，将黄杆菌发酵提取物应用于化妆品中，得到了很好的祛皱美白效果，这一发现不仅拓宽了黄杆菌的应用领域，同时扩大了微生物发酵产物的使用选择，并补充了化妆品抗氧化原料。

Description

黄杆菌发酵提取物及其在化妆品中的应用

技术领域

本发明涉及化妆品领域，特别涉及黄杆菌发酵提取物在化妆品中的应用。

背景技术

美国化学专家Dr. Harman 于1993 年时在Drugs Aging 期刊中证实，过多的自由基是造成生物老化的重要原因。在正常情况下，自由基的产生和消除处于动态平衡状态，然而，不论是生物体自身氧化代谢的反应过程，或是外在环境中的离子辐射，以及诸如空气污染与化学物质等的环境污染物，生活压力大、失眠等都会使生物体内自由基的动态平衡遭到破坏，而不断的产生自由基及其衍生物。

对于皮肤而言，自由基会促进胶原蛋白的交联聚合，减少弹性蛋白基因，加速弹性纤维降解，还会直好氧接降解透明质酸，导致真皮保湿性、张力、弹性和柔软性等产生改变，继而引起皮肤衰老、形成皱纹。而且自由基还会侵害人体细胞造成细胞磷脂或不饱和脂肪酸过氧化，继而还可以与蛋白质结合形成脂褐素，它们在细胞内大量沉积，妨碍细胞代谢，引起细胞老化，导致肤色暗沉。

抗氧化即消除体内的自由基，是延缓衰老的关键途径。抗氧化剂的发展史是人类解决衰老的奋斗历程，总的来说可分为四代，第一代抗氧化剂主要是维生素类，包括VC、VE、生育酚，但这类抗氧化剂稳定性较差，其应用受到限制。第二代抗氧化剂包括β胡萝卜素、辅酶Q10，过氧化歧化酶SOD等，在实际应用中也遇到了不少难题：酶分子量通常都比较大，不易被皮肤吸收；酶易受温度和其他化学物质的影响而失活，难于保存和进行化学生产；失活的SOD反而促使发生自由基连锁反应，加速衰老过程。第三代抗氧化剂有黄酮类（如：白藜芦醇、芦丁）、类黄酮类（花青素（OPC）、葡萄籽提取物）、多酚类（原花青素、桂皮酸类、阿魏酸、丁羟甲苯、没食子酸丙酯、儿茶素、茶叶提取物）、硫辛酸、番茄红素类等，这类抗氧化剂具有相对分子量适中，稳定性稍好的特点而应用相对广泛。第四代抗氧化剂有虾青素、富勒烯等，此外，人体内存在着天然的抗氧化物质，包括谷胱甘肽（GSH）、褪黑素、尿酸、肌肽等也可以通过体外合成来制备。

而黄杆菌发酵提取物具有抗氧化能力，同时作为化妆品制剂还未被发现。目前，兰州交通大学从菘蓝中筛选到的一株黄杆菌，经验证对植物病原菌有抑制作用；南京农业大学保藏黄杆菌菌种，发现其具有降解甲氰菊酯的能力。

发明内容

本发明提供一种新型抗氧化剂——黄杆菌发酵提取物。黄杆菌菌株（Microbacterium maritypicum），0.4~0.8μm×1.0~4.0μm，属于微杆菌属，其在培养过程中分泌类胡萝卜素颜色物质，经发酵提取后，有明显的抗氧化作用，应用于化妆品中，具有很好的祛皱美白效果。这一发现不仅拓宽了黄杆菌的应用领域，同时扩大了微生物发酵产物的使用选择，并补充了化妆品抗氧化原料。

本发明的目的是由以下技术方案实现的：

黄杆菌发酵提取物及其在化妆品中的应用，所述黄杆菌发酵提取物含有抗氧化成分，通过筛选的黄杆菌经菌体培养、发酵、提取和纯化制成的冻干粉或溶液作为化妆品制剂，起到抗氧化作用。

所述发酵为液态发酵、半固态发酵中的一种或两种；所述发酵的过程是将活化的黄杆菌Microbacterium单菌落接种到LB培养基中，好氧过夜培养获得种子液，然后按照接种量5-10%将培养好的种子接种到发酵培养基中发酵，发酵温度30-32℃，适当光照，发酵24-36小时，得到含有抗氧化物质的黄杆菌发酵液。

进一步地，所述发酵培养基组成如下：胰蛋白胨10-20g/L、酵母提取物5-10g/L、氯化钠5-10g/L、葡萄糖5-20 g/L、七水硫酸镁0.01-0.05 g/L、硫酸锰0.01-1 g/L、水1L，pH6.5-6.8。

所述的提取和纯化方法选自以下至少三种的组合：浸提、萃取、沉淀、离心过滤、干燥、冻干。

所述提取过程是：将发酵后的黄杆菌发酵液，反复离心收集菌体，然后加入萃取剂重悬菌体，再进行菌体破碎，离心，去除菌体沉淀，得黄杆菌发酵提取物的粗提液，再经旋转蒸发或真空干燥去除萃取剂，得到黄杆菌发酵提取物成分，最后还可经柱层析法进一步纯化。

所述化妆品的形式包括但不限于水剂、凝胶、啫喱、乳液、膏霜、贴片精华类、气雾剂类、蜡基类、粉基类、护肤清洁类、护发类、染烫发类、牙膏类，功效包括但不限于保湿、美白、抗衰老、抗敏、舒缓、修复、防晒、祛痘、控油、生发、育发、美容修饰、美体、美乳；使用部位包括但不限于头部、面部、颈部；所述的黄杆菌发酵提取物占化妆品总质量的0-100%，不含两端数值0和100。

进一步地，所述黄杆菌发酵提取物占化妆品总质量的0.005-50%。

更进一步地，所述黄杆菌发酵提取物占化妆品总质量的0.01-20%。

本发明的有益效果：本发明人首次发现黄杆菌发酵提取物具有很好的抗氧化效果，而后将黄杆菌发酵提取物应用于化妆品中，得到了很好的祛皱美白效果，这一发现不仅拓宽了黄杆菌的应用领域，同时扩大了微生物发酵产物的使用选择，并补充了化妆品抗氧化原料。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为图1为黄杆菌发酵提取物与维生素C羟基自由基清除能力的对比图；

图2为实例产品和对照产品对皮肤皱纹的影响；

图3为实例产品和对照产品对皮肤颜色的影响。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

黄杆菌发酵提取物的制备方法如下：

1.黄杆菌菌体培养

首先配制种子培养基：胰蛋白胨10g/L 、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、蒸馏水1L，ph6.5-7.0。

将活化的黄杆菌Microbacterium单菌落接种到培养基中，在30℃摇瓶好氧培养24小时获得黄杆菌种子。

2.黄杆菌发酵

首先配制发酵培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物6g/L、氯化钠6g/L、葡萄糖15g/L、七水硫酸镁0.03 g/L、硫酸锰0.02 g/L、水1L，ph6.5-6.8。黄杆菌种子在30-32℃下发酵培养32小时，适当光照，得到含有抗氧化物质的黄杆菌发酵液。

3.黄杆菌发酵液的提取和纯化

首先将发酵后的黄杆菌发酵液，5000 r／min离心25min收集菌体，再加入蒸馏水，重悬菌体，再次离心，收集菌体；然后加入约10g/L甲醇，震荡2-4小时，离心 (8000 r／min，4℃)40min，去除菌体沉淀，收集上清液，得到黄杆菌发酵提取物的粗提物；再经过真空干燥获得黄杆菌发酵提取物成分。

羟基自由基(·OH)清除能力的测定

羟基自由基是活性氧中最活泼的自由基，也是毒性最大的自由基，几乎能与活细胞中任何分子发生反应，且反应速度极快。生物体在代谢过程中即可产生·OH ，它与蛋白质交联变性，给人体带来危害。

本发明利用Fenton试剂法分别测定黄杆菌发酵提取物与VC对羟基自由基的清除能力，具体测定步骤如下:

（1）在10 mL具塞比色管中，先后加入2 mL pH为7的混合磷酸盐缓冲溶液、1.2 mL0.50mmol/L的苋菜红、1.0mL 4.0mmol/L的硫酸亚铁溶液和1.0 mL0.02%的H₂O₂，用水稀至刻度，混匀，在室温下反应10 min，然后于510 nm波长处，用1 cm比色皿，测其吸光度A₁；

(2) 按以上操作加入各种溶液，只是不加Fenton试剂（硫酸亚铁溶液和H₂O₂相同条件下测定其吸光度值A₀；

(3) 将合成的样品黄杆菌发酵提取物配制成一定浓度的乙醇溶液。按上述步骤在加入1.0 mL 0.02%的H₂O₂之前，加入1.0 mL样品溶液，相同条件下测定其吸光度值A₂。则羟基自由基(·OH)去除率按下式进行计算:

羟基自由基清除率（%）= (A₂-A₁)/(A₀-A₁)×100%

式中: A₁为不加样品、加双氧水时的的吸光值；A₀为不加Fenton试剂时的吸光值；A₂为加入样品后所测得的吸光度值。

按同样的方法测定VC 清除羟基自由基(·OH)能力。

羟基自由基清除能力结果如附图1所示，从实验结果看，相同浓度的黄杆菌发酵提取物对羟基自由基的清除能力优于VC，且随着黄杆菌发酵提取物浓度的增大其去除羟基自由基的能力不断提高并逐渐趋于稳定。从而证明黄杆菌发酵提取物可以应用于抗衰老、美白等化妆品中，拓宽了其应用领域。

应用实施例1

一种含本发明所述的黄杆菌发酵提取物抗衰老精华，其配方如表1所示。

表1 一种含本发明所述的黄杆菌发酵提取物抗衰老精华的配方（质量分数）

应用实施例2

一种含本发明所述的黄杆菌发酵提取物的滋养面霜，其配方如表2所示。

表2 一种含本发明所述的黄杆菌发酵提取物的滋养面霜的配方（质量分数）

应用实施例3

一种含本发明所述的黄杆菌发酵提取物抗衰老眼精华，其配方如表3所示。

表3 一种含本发明所述的黄杆菌发酵提取物抗衰老眼精华的配方（质量分数）

以上实施例所述含黄杆菌发酵提取物的化妆品的制备方法为本领域常规的制备方法，包括如下步骤：

1．乳化锅中加入A相，搅拌，加热升温至85℃，保温20分钟；

2．油相锅中加入B相，搅拌升温至85℃，物料溶解完全；

3．将油相锅中溶解物料加入到乳化锅中，搅拌，均质，降温至45℃；

4．将C相加入到乳化锅中，搅拌均匀，温度降至40℃；

5．将D相加入到乳化锅中，搅拌均匀，均质，检测pH在5.5-6.5，即得。

黄杆菌发酵提取物改善皮肤皱纹的测试

选择健康志愿者年龄35-55之间，随机分为两组，每组30人，其中一组使用实施例1、实施例2、实施例3组合产品，另外一组作为对照组，其中对照组分别为实施例1、实施例2和实施例3中不加黄杆菌发酵提取物的产品，连续使用8周。测试期间，志愿者不可改变原有的面部清洁方式和习惯，除此外，不可使用除测试产品外的其他化妆品。在产品使用前，使用4周和8周后，用VISIA-CR（100-240 vac/50-60Hz/2A，CANFIELD，USA）平行偏振光照射眼周皮肤表面，通过数据分析，得到该部位皮肤的皱纹面积占所选区域的皱纹面积比，通过实施例和对照组化妆品对初始皱纹面积比平均值的减少幅度，反映所用产品的抗衰老效果，每组测试后的平均效果如图2所示。

从实验结果看出来，使用实施例中含黄杆菌发酵提取物的产品后，志愿者们测定部位的皱纹面积平均值相较初始测试的皱纹面积变少，且明显优于对照组产品的皱纹面积减少情况。随着使用时间的延长，实施例产品对皱纹面积改善的效果越明显。这可能由于实施例中黄杆菌发酵提取物通过强抗氧化能力，抵御UV等引起的活性氧自由基对皮肤造成的损伤，提高胶原蛋白，弹性蛋白、透明质酸等胞外基质的量，从而达到祛皱的效果。而对照组产品因含有基质中的油脂、保湿剂等成分，增加了皮肤的水分含量，使用后志愿者们的皱纹面积也略微减少了，但其效果远低于实施例，进一步说明了，黄杆菌发酵提取物具有改善皮肤皱纹的能力。

黄杆菌发酵提取物改善皮肤暗沉的测试

选择健康志愿者年龄18-55之间，脸上皮肤暗黄，有明显的色斑，随机分为量组，每组30人，其中一组使用实施例1、实施例2、实施例3组合产品，另外一组作为对照组，其中对照组分别为实施例1、实施例2和实施例3中不加黄杆菌发酵提取物的产品，连续使用8周。测试期间，志愿者不可改变原有的面部清洁方式和习惯，除此外，不可使用除测试产品外的其他化妆品。在产品使用前、使用4周和8周后，用VISIA-CR（100-240 vac/50-60Hz/2A，CANFIELD，USA）对面部两颊皮肤进行数据采集、分析，从而观察产品对皮肤暗沉改善的情况，每组测试结果的平均值如图3所示。

本仪器采用国际照明委员会（CIE）规定的色度系统（Lab色度系统）表示肤色的变化。

其中：L^*为亮度，a^*为红绿色度，b^*为蓝黄色度，三者的综合评价能够反映皮肤色度的变化。

ITA°值为皮肤个体类型角，是与L^*和b^*相关的表征皮肤明亮度的数值。ITA°值越大，肤色越明亮，反之，肤色越暗沉。

通过测定志愿者们使用实施例和对照组产品后的平均ITA°比初始ITA°均值增加的情况，反映皮肤色度改善的效果。

从实验结果看出来，使用实施例中含黄杆菌发酵提取物的产品后，志愿者的皮肤ITA°平均值比初始值增加12%左右，皮肤亮度明显提高，且使用的时间越久，对皮肤美白效果越明显。这可能由于实施例中黄杆菌发酵提取物通过强抗氧化能力，抵御UV等引起的活性氧自由基对皮肤造成的损伤，从而达到改善色素沉着，提亮肤色、祛暗沉的效果。

黄杆菌发酵提取物应用到化妆品中其功效包括但不限于保湿、美白、抗衰老、抗敏、舒缓、修复、防晒、祛痘、控油、生发、育发、美容修饰、美体、美乳等；化妆品形式包括但不限于水剂、凝胶、啫喱、乳液、膏霜、贴片精华类、气雾剂类、蜡基类、粉基类、护肤清洁类、护发清洁类、护发类、染烫发类、牙膏类等；使用部位包括但不限于头部、面部、颈部及全身。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims

1.黄杆菌发酵提取物在化妆品中的应用，其特征在于，所述黄杆菌发酵提取物通过筛选的黄杆菌Microbacterium maritypicum经菌体培养、发酵得到含有抗氧化物质的黄杆菌发酵液，经过提取和纯化制成的冻干粉或溶液作为化妆品制剂，起到抗氧化作用；所述发酵为液态发酵、半固态发酵中的一种或两种；所述发酵的过程是将活化的黄杆菌单菌落接种到LB培养基中，好氧过夜培养获得种子，然后按照接种量5-10%将培养好的种子接种到发酵培养基中发酵，发酵温度30-32℃，适当光照，发酵24-36小时。

2.如权利要求1所述的黄杆菌发酵提取物在化妆品中的应用，其特征在于，所述发酵培养基组成如下：胰蛋白胨10-20g/L、酵母提取物5-10g/L、氯化钠5-10g/L、葡萄糖5-20 g/L、七水硫酸镁0.01-0.05 g/L、硫酸锰0.01-1 g/L、水1L，pH 6.5-6.8。

3.如权利要求1所述的黄杆菌发酵提取物在化妆品中的应用，其特征在于，所述的提取和纯化方法选自以下至少三种的组合：浸提、萃取、沉淀、离心过滤、干燥、冻干。

4.如权利要求1所述的黄杆菌发酵提取物在化妆品中的应用，其特征在于，所述提取过程是：将发酵后的黄杆菌发酵液，反复离心收集菌体，然后加入萃取剂重悬菌体，再进行菌体破碎，离心，去除菌体沉淀，得到黄杆菌发酵提取物的粗提液，再经旋转蒸发或真空干燥去除萃取剂，得到黄杆菌发酵提取物成分，最后还可经柱层析法进一步纯化。

5.如权利要求1-4中任一权利要求所述的黄杆菌发酵提取物在化妆品中的应用，其特征在于，所述化妆品的形式包括但不限于水剂、乳液、膏霜、贴片类、气雾剂类、蜡基类、粉基类，功效包括但不限于保湿、美白、抗衰老、舒缓、修复、防晒、祛痘、控油、生发；使用部位包括但不限于头部、面部、颈部；所述的黄杆菌发酵提取物占化妆品总质量的0-100%，不含两端数值0和100。

6.如权利要求5所述的黄杆菌发酵提取物在化妆品中的应用，其特征在于，所述黄杆菌发酵提取物占化妆品总质量的0.005-50%。

7.如权利要求6所述的黄杆菌发酵提取物在化妆品中的应用，其特征在于，所述黄杆菌发酵提取物占化妆品总质量的0.01-20%。