CN103998441B - 低聚原花色素的纯化方法、聚合度的调整方法以及透明质酸酶抑制剂及胶原酶抑制剂 - Google Patents

低聚原花色素的纯化方法、聚合度的调整方法以及透明质酸酶抑制剂及胶原酶抑制剂 Download PDF

Info

Publication number
CN103998441B
CN103998441B CN201280062680.9A CN201280062680A CN103998441B CN 103998441 B CN103998441 B CN 103998441B CN 201280062680 A CN201280062680 A CN 201280062680A CN 103998441 B CN103998441 B CN 103998441B
Authority
CN
China
Prior art keywords
grape
oligomeric proanthocyanidins
raw material
extraction solvent
purification process
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201280062680.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103998441A (zh
Inventor
笠岛直树
吉本祐子
福井祐子
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suntory Holdings Ltd
Original Assignee
Suntory Holdings Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suntory Holdings Ltd filed Critical Suntory Holdings Ltd
Publication of CN103998441A publication Critical patent/CN103998441A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103998441B publication Critical patent/CN103998441B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A61K8/9783—Angiosperms [Magnoliophyta]
    • A61K8/9789—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/04—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring
    • C07D311/58—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring other than with oxygen or sulphur atoms in position 2 or 4
    • C07D311/60—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring other than with oxygen or sulphur atoms in position 2 or 4 with aryl radicals attached in position 2
    • C07D311/62—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring other than with oxygen or sulphur atoms in position 2 or 4 with aryl radicals attached in position 2 with oxygen atoms directly attached in position 3, e.g. anthocyanidins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A61K31/353—3,4-Dihydrobenzopyrans, e.g. chroman, catechin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/87—Vitaceae or Ampelidaceae (Vine or Grape family), e.g. wine grapes, muscadine or peppervine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/16—Emollients or protectives, e.g. against radiation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/02—Preparations for care of the skin for chemically bleaching or whitening the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D11/00—Solvent extraction
    • B01D11/02—Solvent extraction of solids
    • B01D11/0288—Applications, solvents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A61K2236/333—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using mixed solvents, e.g. 70% EtOH

Abstract

本发明涉及如下低聚原花色素的纯化方法，其包含以水或醇类水溶液为提取溶剂提取含有聚合度不同的多种低聚原花色素的原料的提取工序，该提取工序中，根据目标低聚原花色素的聚合度设定该提取溶剂的醇类浓度，以提取目标聚合度的低聚原花色素。

Description

低聚原花色素的纯化方法、聚合度的调整方法以及透明质酸酶抑制剂及胶原酶抑制剂
技术领域
本发明涉及用于从含有聚合度不同的低聚原花色素的原料中得到美白效果等好的低聚原花色素的纯化方法、低聚原花色素的聚合度的调整方法以及以低聚原花色素为有效成分的透明质酸酶抑制剂及胶原酶抑制剂等。
背景技术
以获得美白、改善皮肤干糙等的美容效果为目的，广泛使用皮肤外用剂、化妆品。虽已知具有美白作用等的各种物质，但因合成品在长期用于人类皮肤时多具有安全性的问题，所以，希望有来自天然的成分且效果好的产品。
低聚原花色素(以下也可简单称为“原花色素”或“OPC”)是在葡萄、苹果、可可等植物中大量含有的多酚的一种，是也称为“缩合型单宁”或“黄烷-3-醇聚合物”的化合物。OPC的结构通常以黄烷-3-醇为结构单位，为黄烷-3-醇在4-6位或4-8位缩合或聚合的结合模式。如此，OPC是指根据上述结合模式缩合或聚合的2聚体以上的聚合物的总称。
已报道OPC中存在具有抗氧化作用、美白作用等各种生理活性的物质。例如专利文献1中，记载了在康科德红葡萄的果实粉碎物中加入纯净水，在50～60℃下提取24小时，从该提取物中得到的葡萄提取物具有酪氨酸酶活性抑制作用及活性氧清除作用。专利文献2中，记载了聚合度为12的缩合型单宁可显示美白作用及酪氨酸酶活性抑制效果。专利文献3中，记载了葡萄酒粕乙醇提取物显示美拉德反应抑制活性，该提取物中含有儿茶素、原花青素B及原花青素C。专利文献4中公开了含有原花色素的美拉德反应抑制剂。专利文献5及6中，记载了将葡萄酒制造中的残留物及其提取物用于抗炎剂、抗氧化剂、肌肤返老还童剂等的化妆品配合物及/或医药品配合物制造用的活性物质组合物。
有关这些生理活性与OPC聚合度的活性相关性还有很多不十分明了，例如有关美白作用，已报道了聚合度为约12的OPC效果好(专利文献2)。因此，希望有可高纯度制造具有所需生理活性的OPC的技术。
植物原料中的OPC的分离纯化通常通过用热水或有机溶剂提取葡萄等的植物原料来进行。但因提取中还提取了与聚合度数无关的原花色素混合物，所以，难以从所得到的提取液中以高纯度分离及纯化具有目标生理活性的OPC。因此，希望有从原料中更简便、高效且高纯度制备具有所需生理活性的OPC的方法。
此外，预防或改善伴随增龄而产生的皱纹及松弛等是美容上的重要课题。作为代表性的皮肤老年特征的皱纹、松弛的原因还未完全明了，但作为原因之一，可列举由于增龄而使组织中的透明质酸量减少，并由此而使皮肤的水润感消失。因此，抑制分解透明质酸的透明质酸酶的活性对维持皮肤真皮中的透明质酸量，保持水润且具有紧致的肌肤非常有效。此外，还认为皮肤中胶原蛋白的减少是引起皮肤的皱纹、松弛的主要原因。胶原酶是参与胶原蛋白分解的酶，与皮肤弹性降低、皱纹产生等有关。
因此，抑制透明质酸酶及胶原酶的活性对赋予皮肤弹性、紧致、防止皮肤老化非常重要。例如在专利文献7中，公开了以每单位原花色素的结构单体中的没食子酸加成率为10％(摩尔比)以下的原花色素为有效成分而含有的胶原酶抑制剂、肤质改善剂。此外，在专利文献8中，还公开了以葡萄种子及/或葡萄榨汁粕的提取物为有效成分而含有的透明质酸酶抑制剂。但是，希望有相对于透明质酸酶及胶原酶有更优异的抑制效果，可更有效地改善皱纹、松弛等肌肤老化的安全性高的化妆品等。
现有技术文献
专利文献
专利文献1日本特开2005-29490号公报
专利文献2日本特开平10-236943号公报
专利文献3日本特开2006-256977号公报
专利文献4日本特开平6-336430号公报
专利文献5日本特表2003-518026号公报
专利文献6日本特表2003-527843号公报
专利文献7日本再表01-32131号公报
专利文献8日本特开2000-26306号公报
发明内容
本发明的目的在于，鉴于上述课题，提供可将具有美白作用等各种生理活性的低聚原花色素(OPC)以简便的操作、以高纯度从原料中分离(提取)及纯化的纯化方法。本发明的目的还在于，在从原料中提取OPC时，调整提取液中OPC的聚合度的方法。本发明的目的还进一步在于，提供以通过所述纯化方法得到的OPC为有效成分、安全性高且可发挥优异效果的黑色素生成抑制剂、透明质酸酶抑制剂及发挥优异效果的胶原酶抑制剂等。
本发明者鉴于上述课题深入研究的结果，在从含有多种OPC的原料中提取OPC时，发现由于提取溶剂中的醇类浓度不同，可提取不同聚合度的OPC。例如，如果提取溶剂中的醇类浓度为约30～70v/v％，则可提取聚合度高的OPC。另一方面，提取溶剂中的醇类浓度小于30v/v％，例如为约20v/v％以下时，可提取聚合度低的OPC。更具体而言，使用30～70v/v％左右的醇类水溶液进行提取时，可提取平均聚合度为8以上的OPC。此外，使用约20v/v％以下的醇类水溶液进行提取时，可提取平均聚合度小于8的OPC。如此，由于提取溶剂中的醇类浓度不同所提取的OPC的聚合度也不同，其成为了令人惊讶的见解。根据此方法，可高收率、高纯度且简便地制备具有各种生理活性的OPC。此外，通过调整提取中使用的溶剂的醇类浓度，可调整所得到的提取液中的OPC的聚合度。
本发明者还发现，通过上述纯化方法从来自葡萄的原料中得到的OPC具有黑色素生成抑制作用、透明质酸酶抑制作用及胶原酶抑制作用，而且OPC的聚合度越高这些作用越强。例如，使用约30～60v/v％、特别是约30～50v/v％的醇类水溶液提取的OPC的纯度特别高，发挥了好的黑色素生成抑制效果、透明质酸酶抑制效果及胶原酶抑制效果。例如透明质酸酶及胶原酶参与皱纹、松弛及皮肤的老化，对这些酶有强抑制活性的OPC作为防止皱纹、松弛效果及防止老化效果好的化妆品等而有用。
本发明者基于上述见解进一步不断研究，从而完成了本发明。
即本发明涉及以下的(1)～(25)。
(1)一种低聚原花色素的纯化方法，其特征在于，包含以水或醇类水溶液为提取溶剂提取含有聚合度不同的多种低聚原花色素的原料的提取工序，该提取工序中，根据目标低聚原花色素的聚合度设定该提取溶剂的醇类浓度，以提取目标聚合度的低聚原花色素。
(2)根据所述(1)中所述的方法，其特征在于，提取温度为70～小于100℃。
(3)根据所述(1)或(2)中所述的方法，其特征在于，醇类为乙醇。
(4)根据所述(1)～(3)中任一项所述的方法，其特征在于，纯化方法为(A)平均聚合度为5～小于8的低聚原花色素的纯化方法，或(B)平均聚合度为8以上的低聚原花色素的纯化方法。
(5)根据所述(1)～(4)中任一项所述的方法，其特征在于，(A)纯化方法为平均聚合度为5～小于8的低聚原花色素的纯化方法，使提取溶剂的醇类浓度为0～20v/v％，或(B)纯化方法为平均聚合度为8以上的低聚原花色素的纯化方法，使提取溶剂的醇类浓度为30～60v/v％。
(6)根据所述(1)～(5)中任一项所述的方法，其特征在于，纯化方法为平均聚合度为8～10的低聚原花色素的纯化方法，提取溶剂为40～50v/v％的乙醇水溶液。
(7)根据所述(1)～(6)中任一项所述的方法，其特征在于，含有聚合度不同的多种低聚原花色素的原料来自植物。
(8)根据所述(7)中所述的方法，其特征在于，来自植物的原料为选自葡萄果实、葡萄种皮及葡萄的种子中的至少1种的来自葡萄的原料。
(9)一种具有黑色素生成抑制作用的低聚原花色素的纯化方法，其特征在于，包含将选自葡萄果实、葡萄种皮及葡萄的种子中的至少1种的来自葡萄的原料于70～小于100℃下用30～60v/v％的醇类水溶液提取的提取工序。
(10)一种透明质酸酶抑制剂，其特征在于，以低聚原花色素为有效成分，该低聚原花色素在将选自葡萄果实、葡萄种皮及葡萄的种子中的至少1种的来自葡萄的原料在30～60v/v％的醇类水溶液中提取而得到的提取液或提取物中含有。
(11)根据所述(10)中所述的透明质酸酶抑制剂，其特征在于，提取温度为70～小于100℃。
(12)一种胶原酶抑制剂，其特征在于，以低聚原花色素为有效成分，该低聚原花色素在将选自葡萄果实、葡萄种皮及葡萄的种子中的至少1种的来自葡萄的原料在30～60v/v％的醇类水溶液中提取而得到的提取液或提取物中含有。
(13)根据所述(12)中所述的胶原酶抑制剂，其特征在于，提取温度为70～小于100℃。
(14)根据所述(10)～(13)中任一项所述的抑制剂，其特征在于，醇类为乙醇。
(15)根据所述(10)～(14)中任一项所述的抑制剂，其特征在于，醇类水溶液为40～50v/v％的乙醇水溶液。
(16)根据所述(10)～(15)中任一项所述的抑制剂，其特征在于，低聚原花色素的平均聚合度为8～10。
(17)一种透明质酸酶抑制剂，其特征在于，以平均聚合度为8～10的低聚原花色素为有效成分。
(18)一种胶原酶抑制剂，其特征在于，以平均聚合度为8～10的低聚原花色素为有效成分。
(19)根据所述(17)或(18)中所述的抑制剂，其特征在于，低聚原花色素在选自葡萄果实、葡萄种皮及葡萄的种子中的至少1种的来自葡萄的原料中含有。
(20)根据所述(17)～(19)中任一项所述的抑制剂，其特征在于，低聚原花色素的平均聚合度为8.5～9.5。
(21)根据所述(17)～(20)中任一项所述的抑制剂，其特征在于，低聚原花色素在将选自葡萄果实、葡萄种皮及葡萄的种子中的至少1种的来自葡萄的原料于70～小于100℃下在30～60v/v％的醇类水溶液中提取而得到的提取液或提取物中含有。
(22)根据所述(19)～(21)中任一项所述的抑制剂，其特征在于，葡萄为赤霞珠。
(23)根据所述(10)～(22)中任一项所述的抑制剂，其特征在于，为皮肤外用剂或化妆品。
(24)一种低聚原花色素的聚合度的调整方法，其特征在于，包含以水或醇类水溶液为提取溶剂提取含有聚合度不同的多种低聚原花色素的原料的提取工序，该提取工序中，根据目标低聚原花色素的聚合度设定该提取溶剂的醇类浓度，以提取目标聚合度的低聚原花色素。
(25)根据所述(24)中所述的方法，其特征在于，(A)通过使提取溶剂的醇类浓度为0～20v/v％，将提取液中的低聚原花色素的平均聚合度调整为5～小于8，或(B)通过使提取溶剂的醇类浓度为30～60v/v％，将提取液中的低聚原花色素的平均聚合度调整为8以上。
根据本发明的纯化方法，可从原料中简便且以高收率、高纯度分离及纯化显示优异美白作用等生理活性的OPC。因为通过此种方法纯化的OPC为高纯度，所以，在作为医药品、化妆品、饮食品、医药部外品等的材料使用时，对提高其医药品、化妆品、饮食品、医药部外品等的功能性上有用。例如本发明的纯化方法中，因提取溶剂使用约30～60v/v％的醇类水溶液而从来自葡萄的原料中得到的OPC具有优异的透明质酸酶抑制作用、胶原酶抑制作用、黑色素生成抑制作用等，所以发挥优异的防止皱纹、松弛效果、防止老化效果、美白效果等，可适合用于皮肤外用剂、化妆品、医药部外品等。
此外，根据本发明，可提供安全性高且发挥优异的黑色素生成抑制作用的黑色素生成抑制剂、发挥透明质酸酶抑制效果的透明质酸酶抑制剂及发挥优异的胶原酶抑制效果的胶原酶抑制剂。
具体实施方式
以下详细说明本发明。
本发明的低聚原花色素的纯化方法包含以水或醇类水溶液为提取溶剂提取含有聚合度不同的多种低聚原花色素的原料的提取工序。
本发明的方法只要可发挥本发明的效果，也可包含提取工序以外的工序。
作为含有聚合度不同的多种低聚原花色素的原料，优选为来自植物的原料，例如可列举葡萄、可可、苹果、松、不老莓、荔枝等植物的果实、果皮、种子、壳、叶、树皮及其处理物等。这些可单独使用，也可组合2种以上。本发明中使用的原料也可使用这些植物的处理物。作为处理物，例如可列举粉碎物、破碎物、磨碎物、干燥物、冷冻干燥物、压榨物、其浓缩物或压榨后的固体成分等。
本发明中的原料优选为来自葡萄的原料，例如，更优选为选自葡萄果实、葡萄种皮及葡萄的种子中的至少1种的来自葡萄的原料等。葡萄例如优选为成为葡萄酒的原料的品种，例如，莎当妮、甲州等成为白葡萄酒的原料的葡萄；赤霞珠、康科德、梅洛、贝利麝香A等成为红葡萄酒的原料的葡萄等。其中，优选为成为红葡萄酒的原料的葡萄，更优选为赤霞珠、梅洛等，进一步优选为赤霞珠。作为本发明中的原料，例如，也适合使用红葡萄酒或白葡萄酒制造中生成的葡萄果实的压榨物(榨汁粕)等。红葡萄酒的制造中生成的葡萄果实的压榨物是指在通常红葡萄酒制造工序中，将葡萄果实破碎，使包含果肉、果皮及种子的果汁(葡萄破碎物)发酵后，压榨所得到的发酵液后的榨汁粕(果皮及种子)等。白葡萄酒的制造中生成的压榨物是指在通常白葡萄酒制造工序中，从葡萄果实中压榨果汁后的榨汁粕(葡萄的果皮及种子)等。其中，作为本发明中的原料，适合使用红葡萄酒的制造中生成的葡萄果实的压榨物(榨汁粕)。更优选为赤霞珠、梅洛等葡萄果实的压榨物，进一步优选为赤霞珠的葡萄果实的压榨物。以葡萄酒制造中生成的葡萄压榨物为原料时，从有效利用原本作为废弃物处理的葡萄压榨物的方面来看为优选。
本发明中的提取溶剂为水或醇类水溶液。醇类通常为碳原子数1～4左右的低级醇类，例如可列举甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、2-丁醇、丁二醇等。这些中可使用1种或2种以上。其中，适合使用乙醇。
提取工序中的提取通常为在原料中添加作为提取溶剂的水或规定浓度的醇类水溶液来进行。提取工序中，优选为原料浸渍在提取溶剂中，也可适当进行搅拌、振荡等的操作。提取通常可以间歇式或连续式进行，优选为间歇式。
提取工序中的原料与提取溶剂之间的比例无特别限定，例如，以重量比计优选为相对于原料1提取溶剂为5～30左右，更优选为5～15左右，进一步优选为5～10左右。
本发明的纯化方法中，提取工序中的提取温度优选为约30～小于100℃(约30℃以上约小于100℃)，进一步优选为约70～小于100℃(约70℃以上约小于100℃)，特别优选为约70～90℃，特别优选为约70～小于90℃。为此种温度时，因低聚原花色素以外的物质的洗脱较少，可稳定提取低聚原花色素，因而优选。提取时间优选为约0.5～4小时，更优选为约1～2小时。提取可在常压或加压下进行，优选为在常压下进行。
所述提取工序中，根据目标低聚原花色素的聚合度设定提取溶剂的醇类浓度，以提取目标聚合度的低聚原花色素。根据提取工序中使用的提取溶剂中的醇类浓度，可从原料中提取不同聚合度的低聚原花色素。因此，通过适当设定作为提取溶剂使用的水或醇类水溶液的醇类浓度，可高效得到含有目标特定聚合度的低聚原花色素的提取液。
提取溶剂的醇类浓度可通过目标低聚原花色素、即从原料中提取的低聚原花色素的聚合度等来设定，例如优选设定在约0～70v/v％的范围内。使提取溶剂的醇类浓度为0％，是指作为提取溶剂使用水的意思。即本发明中，优选将水或醇类浓度为约70v/v％以下的醇类水溶液用作提取溶剂。只要提取溶剂的醇类浓度在该浓度范围内，即可通过调整提取中使用的提取溶剂的醇类浓度，提取出符合目标聚合度的低聚原花色素。例如，为了得到高聚合度(通常平均聚合度为约8以上，优选为平均聚合度为约8～10)的低聚原花色素，提取溶剂的醇类浓度优选为约30～70v/v％的范围，更优选为约30～60v/v％，进一步优选为约30～50v/v％，特别优选为约40～50v/v％的范围。只要是此种浓度范围内，即可得到高纯度的低聚原花色素，因而优选。提取溶剂中使用2种以上的醇类时，优选为使醇类的总浓度在所述范围内。
例如，要得到平均聚合度为约5～小于8(约5以上约小于8)的低聚原花色素时，提取工序中，优选使提取溶剂的醇类浓度为约0～20v/v％，更优选为约0～10v/v％。即作为提取溶剂，优选为使用水或醇类浓度为约20v/v％以下的醇类水溶液，更优选为使用水或醇类浓度为约10v/v％以下的醇类水溶液。提取溶剂的醇类浓度为所述范围时，通常可从原料中提取平均聚合度为约5～小于8的低聚原花色素。本发明的纯化方法适合作为这样的平均聚合度为约5～小于8的低聚原花色素的纯化方法使用。
此外，例如，要得到平均聚合度为约大于6约小于8的低聚原花色素时，提取工序中，优选为使提取溶剂的醇类浓度为约1～20v/v％，更优选为约10～20v/v％。即作为提取溶剂，优选为使用所述浓度的醇类水溶液。提取溶剂的醇类浓度为所述范围时，通常可从原料中提取平均聚合度为约大于6约小于8的低聚原花色素。
在通过上述提取工序得到的提取液中，通常含有聚合度不同/各种聚合度的低聚原花色素，通过作为提取溶剂使用上述规定浓度的醇类水溶液，可提取出平均聚合度为上述范围的聚合度的低聚原花色素。例如，如上所述，使提取溶剂的醇类浓度为约30～70v/v％时，通常可得到含有平均聚合度为约8以上的高聚合度的低聚原花色素的提取液。
低聚原花色素的平均聚合度通常可通过用低聚原花色素的数均分子量除以儿茶素的分子量(Mw290)来求出。低聚原花色素的平均聚合度可通过公知的方法求出。例如，可通过实施例中进行的低聚原花色素的聚合度的测定方法等，由凝胶过滤色谱法等的尺寸排除色谱法得到的测定结果使用GPC软件(株式会社岛津制作所)等计算出数均分子量，用所得到的数均分子量除以儿茶素的分子量(Mw290)来计算。
本发明的纯化方法也适合作为平均聚合度为约8以上的低聚原花色素的纯化方法使用。为了得到平均聚合度为8以上的低聚原花色素，优选为使提取工序中使用的提取溶剂的醇类浓度为约30～70v/v％。即作为提取溶剂，优选使用醇类浓度为约30～70v/v％的醇类水溶液。此外，将上述浓度的醇类水溶液作为提取溶剂使用时，通常通过提取工序提取的低聚原花色素的平均聚合度的上限通常为10左右。
提取平均聚合度为约8以上的低聚原花色素时，提取工序中，更优选使作为提取溶剂的醇类水溶液的醇类浓度为约30～60v/v％。进而在考虑到所提取的低聚原花色素的纯度时，作为提取溶剂的醇类水溶液的醇类浓度优选为约30～50v/v％，更优选为约40～50v/v％。只要是该浓度范围，即可得到更高纯度的低聚原花色素。
提取溶剂的醇类浓度可通过原料等适当设定，例如，使用来自葡萄的原料时，使提取溶剂的醇类浓度为约30～70v/v％时，通常可提取出平均聚合度为约8～10的低聚原花色素。此外，使用来自葡萄的原料的情况下，作为提取溶剂使用醇类浓度为约30～60v/v％的醇类水溶液时，因通常可高效提取出平均聚合度为约8.5～10，更优选为约8.5～9.5，进一步优选为约8.7～9.5的低聚原花色素，因而优选。
以白葡萄酒用葡萄为原料时，使提取溶剂的醇类浓度为约40～60v/v％，优选为约50v/v％时，通常可从原料中提取平均聚合度为约9以上的低聚原花色素。以红葡萄酒用葡萄为原料时，使提取溶剂的醇类浓度为约40～60v/v％时，通常可从原料中提取平均聚合度为9以上的低聚原花色素。
在本发明的其他优选方式中，还优选使提取溶剂的醇类浓度为约40～60v/v％。使提取溶剂的醇类浓度为约40～60v/v％时，通常可从原料中提取平均聚合度为约9～10的低聚原花色素。此外，考虑到所提取的低聚原花色素的纯度时，提取溶剂的醇类浓度优选为约40～50v/v％。
在本发明的纯化方法的优选方式中，提取工序中，将约30～70v/v％，更优选为约30～60v/v％，进一步优选为约30～50v/v％，特别优选为约40～50v/v％的乙醇水溶液用作提取溶剂进行提取。使用此种浓度的乙醇水溶液时，通常提取液中可提取出平均聚合度为约8以上，优选为平均聚合度为约8.5以上，更优选为约8.7以上的高聚合度且高纯度的低聚原花色素。此种纯化方法作为高纯度纯化平均聚合度为8以上的低聚原花色素的方法特别适合。
在本发明的纯化方法的特别优选方式中，提取工序中，作为提取溶剂使用约40～50v/v％的乙醇水溶液进行提取。此种纯化方法作为平均聚合度为约8～10的低聚原花色素的纯化方法而特别优选。
本发明的纯化方法中，根据提取工序中使用的提取溶剂的醇类浓度，可从原料中提取不同聚合度的低聚原花色素。因此，本发明的纯化方法作为从原料中高纯度提取目标聚合度的低聚原花色素的方法而有用。
在上述提取工序中，通过适当设定提取中使用的提取溶剂的醇类浓度，可调整所得到的提取液中的低聚原花色素的聚合度。因此本发明的纯化方法适合用作提取液中的低聚原花色素的聚合度的调整方法。
包含以水或醇类水溶液为提取溶剂提取含有聚合度不同的多种低聚原花色素的原料的提取工序，该提取工序中，根据目标低聚原花色素的聚合度设定该提取溶剂的醇类浓度，以提取目标聚合度的低聚原花色素的低聚原花色素的聚合度调整方法也包含在本发明内。
所述调整方法中的提取工序及其优选方式与上述纯化方法中的提取工序相同。
例如，提取工序中，使提取溶剂的醇类浓度为约0～20v/v％时，可从原料中提取平均聚合度为约5～小于8的低聚原花色素，由此可使提取液中的低聚原花色素的平均聚合度为约5～小于8。此外，使提取溶剂的醇类浓度为通常的约30～70v/v％，优选为约30～60v/v％，更优选为约30～50v/v％时，可从原料中提取平均聚合度为约8以上的低聚原花色素。由此，可使提取液中的低聚原花色素的平均聚合度为约8以上。因此，根据提取溶剂的醇类浓度，可将提取液中的低聚原花色素的聚合度调整到所需的范围。如此，(A)通过使提取溶剂的醇类浓度为约0～20v/v％，而将提取液中的低聚原花色素的平均聚合度调整到约5～小于8，或(B)通过使提取溶剂的醇类浓度为约30～60v/v％(优选为约30～50v/v％)，而将提取液中的低聚原花色素的平均聚合度调整到约8以上的调整方法为本发明的优选为实施方式之一。所提取的低聚原花色素的平均聚合度的上限通常为10左右。
本发明的纯化方法及调整方法也可适当包含提取工序以外的工序。例如，提取工序后，可通过过滤、离心分离等适当方法回收提取液。回收的提取液可直接作为医药、化妆品、饮食品、医药部外品等的材料使用，但也可根据需要除去溶剂、进行OPC成分的浓缩、干燥、粉末化等处理。而且在浓缩提取液的干燥、粉末化时，可适当使用医药品或化妆品领域等中使用的赋形剂等。
此外，将通过上述提取工序得到的提取液或提取液的浓缩物等通过超滤等的膜处理或吸附色谱法等的各种色谱法处理，可得到以更高纯度含有低聚原花色素的组分。作为吸附剂，可使用离子交换树脂、苯乙烯·二乙烯基苯类、甲基丙烯酸类等的吸附剂、亲水性乙烯基聚合物、修饰葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、反相硅胶等。吸附组分用醇类水溶液、醇类等的洗提液洗脱、回收。洗提液优选为甲醇、乙醇、丙醇、丙酮等。所得到的组分的主要成分为提取工序中从原料中提取的低聚原花色素。对于所得到的含有低聚原花色素的组分，可进一步进行浓缩、干燥、粉末化等的处理或也可作为1，3-丁二醇溶液等。
通过上述纯化方法得到的含有低聚原花色素的组分(以下也称为OPC组分)为高纯度含有特定聚合度的OPC的物质，具有各种生理活性，适合用于医药品、化妆品、医药部外品、饮食品等。
例如，上述纯化方法中，原料使用来自葡萄的原料等，提取工序中作为提取溶剂使用约30～60v/v％的醇类水溶液时，可得到具有优异的黑色素生成抑制作用、透明质酸酶抑制作用及胶原酶抑制作用的含有高纯度OPC的提取液或OPC组分。此种提取液及OPC组分在具有美白作用、透明质酸酶抑制作用或胶原酶抑制作用的医药品、化妆品、饮食品、医药部外品等中有用。本发明的纯化方法适合作为具有此种优异的美白作用、透明质酸酶抑制作用及胶原酶抑制作用的低聚原花色素或高纯度含有该低聚原花色素的组分的纯化方法、制备方法或制造方法使用。
包含在将选自葡萄果实、葡萄种皮及葡萄的种子中的至少1种的来自葡萄的原料于约70～小于100℃下在约30～60v/v％的醇类水溶液中提取的提取工序的具有黑色素生成抑制作用的低聚原花色素的纯化方法，也包含在本发明内。本发明的纯化方法及其优选方式等与上述的平均聚合度为约8以上(优选为约8～10)的低聚原花色素的纯化方法同样。所得到的低聚原花色素的黑色素生成抑制作用可用公知的方法、例如实施例中所述的方法等来评价。
通过本发明的纯化方法得到的具有黑色素生成抑制作用的低聚原花色素及高纯度含有该低聚原花色素的组分等对人体安全，且可发挥优异的黑色素生成抑制效果。通过上述纯化方法得到的低聚原花色素或含有该低聚原花色素的提取液、其处理物(提取物)、组分等作为黑色素生成抑制剂或美白剂，适合用于美白用皮肤外用剂、化妆品、饮食品、医药部外品等，对预防或抑制引发色斑、雀斑的黑色素的生成等发挥优异的效果。
通过上述纯化方法得到的以低聚原花色素为有效成分的黑色素生成抑制剂或美白剂，也包含在本发明内。通过上述纯化方法得到的含有低聚原花色素的提取液、该提取液的处理物(提取物)、含有低聚原花色素的组分等可直接使用，也可作为黑色素生成抑制剂或美白剂使用，还可进一步添加其他成分来使用。本说明书中，黑色素生成与黑色素产生含义相同。
以低聚原花色素为有效成分，该低聚原花色素在将选自葡萄果实、葡萄种皮及葡萄的种子中的至少1种的来自葡萄的原料在约30～60v/v％的醇类水溶液中提取而得到的提取液或提取物中含有的透明质酸酶抑制剂，也为本发明之一。
以低聚原花色素为有效成分，该低聚原花色素在将选自葡萄果实、葡萄种皮及葡萄的种子中的至少1种的来自葡萄的原料在约30～60v/v％的醇类水溶液中提取而得到的提取液或提取物中含有的胶原酶抑制剂，也为本发明之一。
透明质酸酶抑制作用及胶原酶抑制作用可用公知的方法评价。例如透明质酸酶抑制作用使用实施例中所述的方法，通过测定透明质酸酶的抑制率等来评价。胶原酶抑制作用例如可通过实施例中所述的方法或前田有美惠等(食品卫生学杂志31(3)，233-237(1990))中记载的方法等来评价。
在上述透明质酸酶抑制剂及胶原酶抑制剂中，低聚原花色素的平均聚合度优选为约8以上，更优选为约8～10，进一步优选为约8.5～10，特别优选为约9～10。此外，在其他优选方式中，低聚原花色素的平均聚合度为约8.5～9.5，更优选为约8.7～9.5。只要含有平均聚合度为此范围的聚合物，即使在低聚原花色素中存在单体、二聚体、其他片段，也可得到优异的透明质酸酶抑制活性、优异的胶原酶抑制活性，因而优选。
作为本发明的透明质酸酶抑制剂及胶原酶抑制剂的有效成分的低聚原花色素在上述纯化方法中，在作为原料使用选自葡萄果实、葡萄种皮及葡萄的种子中的至少1种的来自葡萄的原料，提取工序中使作为提取溶剂的醇类水溶液的醇类浓度为约30～70v/v％而得到的提取液或提取物中含有。更优选为醇类水溶液的醇类浓度为约30～60v/v％，进一步优选为约30～50v/v％，特别优选为约40～50v/v％而得到的提取液或提取物中含有的低聚原花色素。提取中的优选条件等与上述的平均聚合度为约8以上(优选为约8～10)的低聚原花色素的纯化方法中的条件等相同。例如，提取温度优选为约30～小于100℃，优选为约70～小于100℃，进一步优选为约70～90℃，特别优选为约70～小于90℃。醇类优选为乙醇。来自葡萄的原料及其优选方式也与上述的作为纯化方法的原料而使用的来自葡萄的原料及其优选方式同样。
本发明也包含以平均聚合度为约8～10的低聚原花色素为有效成分的透明质酸酶抑制剂。
以平均聚合度为约8～10的低聚原花色素为有效成分的胶原酶抑制剂也包含在本发明内。
本发明中，只要含有平均聚合度为约8～10的聚合物，即使在低聚原花色素中存在单体、二聚体、其他片段，也可得到优异的透明质酸酶抑制活性、优异的胶原酶抑制活性。平均聚合度为约8～10的低聚原花色素优选在选自葡萄果实、葡萄种皮及葡萄的种子中的至少1种的来自葡萄的原料中含有。此种在来自葡萄的原料中含有的低聚原花色素例如可通过上述纯化方法从原料中获得。低聚原花色素的平均聚合度的下限优选为约8.5。
上述透明质酸酶抑制剂及胶原酶抑制剂中，低聚原花色素是优选为平均聚合度为约8.5～9.5，更优选为平均聚合度为约8.7～9.5的低聚原花色素。而且，此种低聚原花色素优选为在将选自葡萄果实、葡萄种皮及葡萄的种子中的至少1种的来自葡萄的原料于约70～小于100℃下在约30～60v/v％的醇类水溶液中提取而得到的提取液或提取物中含有。提取的优选方式等与如上所述的上述纯化方法中的优选方式等相同。
来自葡萄的原料及其优选方式与上述纯化方法中的相同。葡萄特别优选为赤霞珠。
所述透明质酸酶抑制剂及胶原酶抑制剂不仅含有作为必需成分的低聚原花色素，还可含有其以外的成分。
本发明的抑制剂的制造中，可使用上述提取工序中得到的含有低聚原花色素的提取液或提取物。作为所述提取物，例如，可适合使用从回收的提取液中除去溶剂、进行OPC成分的浓缩、干燥、粉末化等处理后得到的提取液的浓缩物、干燥物、粉末等的处理物等。此外，将通过上述提取工序得到的提取液或其浓缩物等用上述超滤等的膜处理或吸附色谱法等的各种色谱法处理，所得到的高纯度含有OPC的组分也适合作为本发明中的提取物使用。
通过上述纯化方法得到的含有低聚原花色素的提取液或提取物可直接使用，也可作为透明质酸酶抑制剂或胶原酶抑制剂使用，还可进一步添加其他成分使用。
上述透明质酸酶抑制剂及胶原酶抑制剂、以及上述的黑色素生成抑制剂及美白剂例如适合作为皮肤外用剂等的医药品、医药部外品、化妆品等使用。
例如，将透明质酸酶抑制剂、胶原酶抑制剂、黑色素生成抑制剂及美白剂作为皮肤外用剂等时，剂型等无特别限定，例如可制成软膏、乳霜、乳液、洗液、美容液、面膜、浴剂、洗面奶等。将透明质酸酶抑制剂、胶原酶抑制剂、黑色素生成抑制剂及美白剂作为化妆品时，其形态无特别限定，例如，可制成化妆水、乳液、美容液、乳霜、面膜等的皮肤化妆品；妆前化妆水(makeupbaserosin)、妆前底霜、粉状、液状或乳霜状的粉底等的妆前化妆品；护手霜、护腿霜、爽肤水等的身体用化妆品；洗面奶、浴皂等。
上述透明质酸酶抑制剂及胶原酶抑制剂、以及上述的黑色素生成抑制剂及美白剂例如也可为如下组合物，其根据需要含有通常配合在皮肤外用剂、化妆品中的成分及/或添加剂。
作为配合成分，可列举美白剂、保湿剂、抗氧化剂、油性成分、紫外线吸收剂、表面活性剂、增粘剂、醇类、粉末成分、着色剂、水、各种皮肤营养剂、防腐·杀菌剂、收敛剂、香料等的各种成分、添加剂等，可根据需要适当配合这些1种或2种以上。上述本发明中的有效成分，例如，可在上述低聚原花色素或用上述纯化方法得到的含有低聚原花色素的提取液或提取物中适当配合这些通常使用的成分、添加剂等，根据通常方法，而得到皮肤外用剂、化妆品、医药部外品等。
将上述配合成分的一例如以下记载，但本发明中的配合成分不限于以下内容，即使是以下以外的成分，也可用作医药品、化妆品、医药部外品等的成分及添加剂来使用。
作为美白剂，例如可列举熊果苷、曲酸及其衍生物、氢醌衍生物、鞣花酸及其衍生物、传明酸及其衍生物、间苯二酚衍生物、半胱氨酸及其衍生物、松树皮提取物等、2，5-二羟基苯甲酸衍生物、烟酸衍生物、α-羟基酸等。
作为保湿剂，例如可列举多元醇(甘油、丙二醇、二丙二醇、1，3-丁二醇、聚乙二醇等)、糖类(山梨糖醇、赤藓糖醇、海藻糖、肌醇、葡萄糖、木糖醇蔗糖及其衍生物、糊精及其衍生物、蜂蜜等)、粘多糖类(例如，透明质酸及其衍生物、软骨素及其衍生物、肝素及其衍生物等)、弹性蛋白及其衍生物、胶原蛋白及其衍生物、乳酸、尿素、高级脂肪酸辛基十二醇酯(higherfattyacidoctyldodecyl)、海藻提取物、来自鱼贝类的胶原蛋白及其衍生物、各种氨基酸及这些的衍生物(甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、茶氨酸、吡咯烷酮羧酸钠等)等。
作为抗氧化剂，例如可列举维生素E及其衍生物(dl-α(β、γ)-生育酚、醋酸dl-α-生育酚、烟酸-dl-α-生育酚、亚油酸-dl-α-生育酚、琥珀酸dl-α-生育酚等的生育酚及其衍生物、泛醌类等)、维生素A及其衍生物(维生素A棕榈酸酯、维生素A醋酸酯等的维生素A及其衍生物、脱氢视黄醛等的视黄醛及其衍生物等)、类胡萝卜素(胡萝卜素、番茄红素、虾青素等)、维生素B及其衍生物(硫胺素盐酸盐、硫胺素硫酸盐、核黄素、醋酸核黄素、盐酸吡哆醇、吡哆醇二辛酸酯、黄素腺嘌呤二核苷酸、氰钴胺、叶酸类、烟酰胺、烟酸苄酯等的烟酸类、胆碱类等)、维生素D及其衍生物(麦角钙化醇、胆钙化醇、dihydroxystanal等)、芦丁及其衍生物、硫代牛磺酸、牛磺酸、氢醌及其衍生物、谷胱甘肽及其衍生物、没食子酸及其衍生物、胆固醇及其衍生物、超氧化物歧化酶、甘露醇等。
作为油性成分，例如可列举橄榄油、荷荷巴油、蓖麻油、大豆油、米油、米胚芽油、椰子油、棕榈油、可可油、池花籽油、乳木果油、茶树油、鳄梨油、澳洲坚果油、来自植物的角鲨烷等的来自植物的油脂类；貂油、海龟油等的来自动物的油脂类；蜂蜡、巴西棕榈蜡、米糠蜡、羊毛脂等的蜡类；液体石蜡、凡士林、石蜡、角鲨烷等的烃类；肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、异硬脂酸、顺-11-二十碳烯酸等的脂肪酸类；月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇等的高级醇类；肉豆蔻酸异丙酯、油酸丁酯、2-乙基己酸三甘油酯、高级脂肪酸辛基十二醇(硬脂酸辛基十二醇等)等的合成酯类及合成甘油三酯类等。
作为紫外线吸收剂，例如可列举对氨基苯甲酸乙酯、对二甲氨基苯甲酸辛酯、水杨酸戊酯及其衍生物、对甲氧基肉桂酸辛酯、肉桂酸辛酯、羟苯甲酮、2，4-二羟基二苯甲酮、2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮-5-磺酸盐、4-叔丁基-4-甲氧基苯甲酰甲烷(4-tertiarybutyl-4-methoxybenzoylmethane)、2-(2-羟基-5-甲基苯基)苯并三唑、尿刊酸、尿刊酸乙酯、芦荟提取物等。
作为表面活性剂，例如可列举聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、脂肪酸烷醇酰胺等的非离子表面活性剂；脂肪酸盐、烷基硫酸盐、烷基苯磺酸盐、聚氧乙烯烷基醚硫酸盐、聚氧乙烯脂肪胺硫酸盐、聚氧乙烯烷基苯基醚硫酸盐、聚氧乙烯烷基醚磷酸盐、N-十二烷基肌氨酸钠等的阴离子表面活性剂；季铵盐、伯～叔脂肪胺盐、三烷基苄基铵盐、烷基吡啶鎓盐、2-烷基-1-羟乙基咪唑啉盐、N，N-二烷基吗啉鎓盐(N，N-DialkylMorpholinium)、聚乙烯聚胺脂肪酸酰胺盐等的阳离子表面活性剂；N，N-二甲基-N-烷基-N-羧甲基铵甜菜碱、N，N，N-三烷基-N-亚烷基铵羧基甜菜碱、N-酰氨丙基-N’，N’-二甲基-N’-β-羟丙基铵磺基甜菜碱、椰子油脂肪酸酰胺丙基甜菜碱等的两性表面活性剂等。
作为增粘剂，例如可列举海藻酸、琼脂、卡拉胶、褐藻多糖等来自褐藻、绿藻或红藻的成分；果胶、刺槐豆胶、芦荟多糖体等的多糖类；黄原胶、黄蓍胶、瓜尔胶等的橡胶类；羧甲基纤维素、羟基乙基纤维素等的纤维素衍生物；聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯、丙烯酸·甲基丙烯酸共聚物等的合成高分子类；透明质酸及其衍生物；聚谷氨酸及其衍生物等。
作为醇类，例如可列举乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、2-丁醇、丁二醇、月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇、羊毛脂醇、氢化羊毛脂醇、油醇、十六烷醇、2-辛基十二醇、甘油、山梨糖醇、丙二醇、1，3-丁二醇、乙二醇及其聚合物等。
作为粉末成分，例如可列举绢云母、氧化钛、滑石、高岭土、膨润土、氧化锌、碳酸镁、氧化镁、氧化锆、硫酸钡、无水硅酸、云母、尼龙粉、聚乙烯粉、丝粉、纤维素系粉、谷类(米、麦、玉米、黍等)的粉、豆类(大豆、小豆等)的粉等。
作为着色剂，例如可列举无水硅酸、硅酸镁、滑石、高岭土、膨润土、云母、云母钛、氯氧化铋、氧化锆、氧化镁、氧化锌、氧化钛、碳酸钙、碳酸镁、氧化铁黄、氧化铁红、氧化铁黑、群青、氧化铬、氢氧化铬、碳黑、异极矿等的无机颜料；甘蓝红色素、米红色素、茜草色素、胭脂树橙色素、乌贼黑色素、姜黄色素、刺槐色素等的天然色素等。
作为各种皮肤营养剂，例如可列举各种维生素(维生素A、B、D、E等)及其衍生物、核糖核酸及其盐、脱氧核糖核酸及其盐、α-及γ-亚麻酸、黄嘌呤及其衍生物(咖啡因等)、氨基酸及其衍生物(丝氨酸、谷氨酸、茶氨酸、羟基脯氨酸、吡咯烷酮羧酸等)、二十二碳六烯酸及其衍生物、二十碳五烯酸及其衍生物、来自动物的提取物(乌贼墨等软体动物的提取物、贝壳提取物、贝肉提取物、鱼肉提取物、鸡冠提取物、蜂王浆、蚕丝蛋白及其分解物、胎盘提取物、血清除蛋白提取物、乳铁蛋白或其分解物等)、酵母提取物、微生物发酵代谢产物(乳酸菌、双岐杆菌等的代谢产物)等。
作为防腐·杀菌剂，例如可列举尿素；对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯等的对羟基苯甲酸酯类；二丁基羟基甲苯、苯氧乙醇、双氯酚、盐酸氯己定、苯扎氯铵、水杨酸、乙醇、十一碳烯酸、苯酚类、异丙基甲基苯酚、1，2-戊二醇、各种精油类、树皮干蒸馏物等。
作为收敛剂，例如可列举氯化锌、硫酸锌、氧化锌、琥珀酸、尿囊素、异极矿、对苯酚磺酸锌、硫酸铝钾、雷琐辛、氯化铁、薄荷醇等。
作为低聚原花色素，在皮肤外用剂及化妆品中的配合量优选为0.000006～1质量％左右，更优选为0.0000125～0.5质量％左右，进一步优选为0.0001～0.01％左右，特别优选为0.0005～0.0025质量％左右。
本发明的透明质酸酶抑制剂及胶原酶抑制剂、以及上述的黑色素生成抑制剂及美白剂的使用方法根据使用对象皮肤状态等的不同而不同，例如可为以下的方法。
即1天数次(例如，约1～5次，优选为约1～3次)，在皮肤上涂布适量(例如，约0.05～2g)即可。此外，低聚原花色素(优选平均聚合度为约8～10的低聚原花色素)的1天使用量优选为涂布约0.00025～0.25mg，更优选为涂布约0.005～0.2mg的组合物即可。涂布期限无特别限定。
本发明的透明质酸酶抑制剂及胶原酶抑制剂对人体安全，且发挥优异的透明质酸酶抑制或胶原酶抑制效果。因此，本发明的抑制剂适合用于预防或抑制皱纹、松弛用皮肤外用剂或化妆品、预防或防止老化用皮肤外用剂或化妆品等，对预防或抑制皱纹、松弛、预防或防止皮肤老化等发挥优异的效果。
实施例
以下举出实施例进一步详细地说明本发明，但这些对本发明无任何限定。
实施例中，醇类浓度(％)在无特殊说明的情况下为体积％(v/v％)。
以下的制备例中，作为白葡萄酒用葡萄压榨物，使用在白葡萄酒制造工序中得到的葡萄压榨物，即由葡萄果实压榨果汁后的榨汁粕(葡萄的果皮及种子)。作为红葡萄酒用葡萄压榨物，使用将红葡萄酒制造工序中得到的葡萄压榨物、即破碎葡萄果实的破碎液(包含果肉、果皮及种子的果汁)发酵后，压榨该发酵液而得到的榨汁粕(果皮及种子)。
制备例1
由白葡萄酒用葡萄压榨物(莎当妮)制备原花色素类
(1)通过热水的提取
在白葡萄酒制造工序中得到的莎当妮(葡萄品种)的压榨物(莎当妮的果皮及种子、250g)中，加入作为提取溶剂的10倍量的水，在80℃下加热提取1小时。将所得到的热水提取液通过尼龙网(日本理化学器械株式会社制、商品名：NRS-200)进行粗过滤，得到提取液1。而且，对于过滤后的残渣也再次在相同条件下进行提取、过滤，将所得到的提取液2与上述的提取液1合并后，减压浓缩至400mL。将所得到的浓缩液用硅藻土过滤，将滤液导通入填充了丙烯酸类树脂AmberliteXAD(注册商标)-7HP(ORGANO株式会社、100mL)的色谱柱后，用水(200mL)进行通液，除去多余的糖类及有机酸(洗脱糖类及有机酸)。其后，作为洗提液使用70％乙醇水溶液(400mL)，从色谱柱中洗脱多酚。将所得到的洗脱液减压浓缩后，用于冷冻干燥，得到1.62g来自白葡萄酒用葡萄的原花色素组分1。
(2)通过乙醇水溶液的提取
在上述(1)的方法的加热提取中，作为提取溶剂，除了分别使用10％、20％、30％、50％及70％乙醇水溶液代替水以外，与上述(1)进行同样的操作，提取及纯化来自白葡萄酒用葡萄的原花色素。由此，分别得到2.03g(提取溶剂10％乙醇水溶液)、2.06g(提取溶剂20％乙醇水溶液)、2.57g(提取溶剂30％乙醇水溶液)、2.80g(提取溶剂50％乙醇水溶液)及2.32g(提取溶剂70％乙醇水溶液)的来自白葡萄酒用葡萄的原花色素组分2～6。
制备例2
由红葡萄酒用葡萄压榨物(赤霞珠)制备原花色素类
(1)通过热水的提取
在红葡萄酒制造工序中得到的赤霞珠(葡萄品种)的压榨物(赤霞珠的果皮及种子、30g)中，加入作为提取溶剂的10倍量的水，在80℃下加热提取1小时。将所得到的热水提取液通过尼龙网(日本理化学器械株式会社制、商品名：NRS-200)进行粗过滤，得到提取液。将所得到的提取液减压浓缩至10mL后，用水混合至45mL，在冰箱中静置3天。而后将该提取液用于离心分离(3000rpm、5分钟)，将其上清液导通入填充了丙烯酸类树脂AmberliteXAD(注册商标)-7HP(ORGANO公司、20mL)的色谱柱后，将水(40mL)进行通液，除去多余的糖类及有机酸(洗脱糖类及有机酸)。其后，作为洗提液使用70％乙醇水溶液(80mL)，从色谱柱中洗脱多酚。将所得到的洗脱液减压浓缩后，进行冷冻干燥，得到46mg来自红葡萄酒用葡萄的原花色素组分1。
(2)通过乙醇水溶液的提取
在上述(1)的方法的加热提取中，作为提取溶剂，除了分别使用10％、20％、30％、40％、50％、60％及70％乙醇水溶液代替水以外，与上述(1)进行同样的操作，提取及纯化来自红葡萄酒用葡萄的原花色素。由此，分别得到58mg(提取溶剂10％乙醇水溶液)、78mg(提取溶剂20％乙醇水溶液)、89mg(提取溶剂30％乙醇水溶液)、97mg(提取溶剂40％乙醇水溶液)、104mg(提取溶剂50％乙醇水溶液)、99mg(提取溶剂60％乙醇水溶液)及76mg(提取溶剂70％乙醇水溶液)来自红葡萄酒用葡萄的原花色素组分2～8。
制备例3
为了根据品种的不同而评价来自葡萄的原花色素组分的差异，使用以下品种的葡萄的压榨物，提取及纯化来自葡萄的原花色素。
白葡萄酒用葡萄压榨物
·莎当妮的压榨物(制备例1中使用的白葡萄酒用葡萄压榨物)
·甲州的压榨物(甲州的果皮及种子)
红葡萄酒用葡萄压榨物
·赤霞珠的压榨物(制备例2中使用的红葡萄酒用葡萄压榨物)
·康科德的压榨物(康科德的果皮及种子)
·梅洛的压榨物(梅洛的果皮及种子)
·贝利麝香A的压榨物(贝利麝香A的果皮及种子)
在葡萄酒制造工序中得到的葡萄的压榨物莎当妮、赤霞珠、康科德、梅洛、贝利麝香A及甲州的各自的果皮及种子中，加入作为提取溶剂的15倍量的水，在80℃下加热提取1小时，将该热水提取液通过尼龙网，(日本理化学器械株式会社制、商品名：NRS-200)进行过滤，得到提取液1。而且，对于过滤后的残渣也再次用相同条件进行提取及过滤，将所得到的提取液2与上述的提取液1合并后，用珪藻土过滤，将滤液导通入填充了AmberliteXAD(注册商标)-7HP(ORGANO株式会社、100mL)的色谱柱后，将水(色谱柱容积(CV)的2倍量)进行通液，除去多余的糖类及有机酸(洗脱糖类及有机酸)。其后，作为洗提液使用70％乙醇水溶液(CV的3倍量)，从色谱柱中洗脱多酚。将所得到的洗脱液减压浓缩后，用于冷冻干燥，分别得到收率为0.832％(莎当妮)、0.833％(赤霞珠)、0.762％(康科德)、1.075％(梅洛)、0.617％(贝利麝香A)及1.094％(甲州)的来自葡萄酒用葡萄的原花色素组分。
制备例4
将制备例3中得到的来自莎当妮的原花色素组分及来自赤霞珠的原花色素组分分别使用SephadexLH-20(商品名、Pharmaciafinechemicals公司)进行纯化及分离，分为简单多酚组分、儿茶素·表儿茶素组分、低分子低聚原花色素组分及高分子低聚原花色素组分的4组。流动相中，按照此水(CV的3倍量)、20％乙醇水溶液(CV的3倍量)、35％乙醇水溶液(CV的3倍量)、55％乙醇水溶液(CV的3倍量)、75％乙醇水溶液(CV的3倍量)及70％丙酮水溶液(CV的3倍量)的顺序使用。
分别将通过20％乙醇水溶液的洗脱组分作为简单多酚组分而得到，将通过35％乙醇水溶液的洗脱组分作为儿茶素·表儿茶素组分得到，将通过55％乙醇水溶液的洗脱组分作为低分子低聚原花色素组分得到，将通过75％乙醇水溶液的洗脱组分作为高分子低聚原花色素组分得到。
评价方法
上述制备的来自葡萄酒用葡萄压榨物的原花色素组分的评价方法如下所示。
(1)来自葡萄酒用葡萄压榨物的原花色素组分中的原花色素纯度的测定方法
来自葡萄酒用葡萄压榨物的原花色素组分的低聚原花色素纯度用根据日本专利第4659407号中所示方法的方法求出。具体而言，用以下方法求出纯度。
首先，在上述制备例中制备的来自葡萄酒用葡萄压榨物的原花色素组分各1.0mg中，加入1.0mL0.6N盐酸/丁醇，使其在90℃下反应2小时，将低聚原花色素类分解成花青素。对于所得到的反应溶液，在后述的高效液相色谱法的分析条件下进行分析，对反应溶液中所含有的花青素量进行定量后，通过如下所示的计算式计算出低聚原花色素纯度。此外，标准物质使用原花色素B-1(PB-1、funakoshi株式会社：NIU-N210)。
(高效液相色谱法分析条件)
检测波长：520nm
色谱柱：YMC-PackODSA-312(φ6.0×150.0mm、商品名、YMC株式会社制)
溶剂：水∶甲醇∶醋酸＝67.5∶17.5∶15.0(体积比)
柱温：40℃
流速：1.0mL/min
(低聚原花色素纯度计算式)
[式1]
(2)来自葡萄酒用葡萄的原花色素组分中的低聚原花色素的聚合度的测定方法
将上述制备例中制备的来自葡萄酒用葡萄的原花色素组分的低聚原花色素聚合度在如下所示HPLC的条件下测定。此外，校正曲线的制作中，使用Shodex公司的SL-105(Lot.00301)及(+)-儿茶素水合物(Sigma株式会社：C1251)。
(高效液相色谱法分析条件)
检测器：RI
色谱柱：Shodex(注册商标)OHpakSB-806MHQ(φ7.6×250mm)(昭和电工株式会社制)
Shodex(注册商标)OHpakSB-802.5HQ(φ7.6×250mm)(昭和电工株式会社制)
(Guardcolumn：Shodex(注册商标)OHpakSB-G)(昭和电工株式会社制)
溶剂(流动相)：20MmLiBr/DMF
柱温：40℃
流速：0.6mL/min
评价样品用20mmLiBr/DMF溶解至50mg/mL后，进样10uL。
低聚原花色素的平均聚合度如下计算，由通过上述HPLC的测定结果使用GPC软件(株式会社岛津制作所)计算出数均分子量，用所得到的数均分子量除以儿茶素的分子量(Mw290)来计算。
(3)使用B16黑色素瘤细胞的黑色素生成抑制试验法
1)培养基
含10％胎牛血清的伊格尔最小必需培养基(以下单纯称为培养基)。
2)试验样品
制作试验浓度的200倍的DMSO溶液，试验时用培养基稀释200倍以用于试验。对照制作DMSO溶液，阳性对照制作10mM熊果苷(Arbutin)的DMSO溶液，均在试验时用培养基稀释200倍以用于试验。
3)培养
第1天：将1.5×105个的B16黑色素瘤细胞与5mL培养基一起在60mm×15mm培养皿中播种，用CO2培养箱(37℃、CO2分压5％)培养。且试验以n＝2进行。
第2天：与含有试验样品的培养基交换，用CO2培养箱培养3天。
第5天：与第2天相同，与含有试验样品的培养基交换，用CO2培养箱进一步培养2天。
第7天：将所培养的细胞破碎，测定黑色素量和蛋白量。
4)细胞破碎
除去培养基，用5mL的PBS(-)洗涤细胞。除去洗涤液，加入1mL0.02％EDTA·PBS(-)，37℃下培养5分钟后，进行吹吸使细胞悬浮。取0.9mL细胞悬浮液置于2.0mL容量的微量离心管中，离心(5000rpm、1分钟)后，除去上清。添加0.9mLPBS(-)用旋涡混合器分散细胞，离心(5000rpm、1分钟)后，除去上清。添加0.45mL50mM磷酸缓冲液(pH6.8)并用旋涡混合器分散细胞后，用超声波破碎装置(CosmoBio公司、型号UCD-250HSA)在冰冷条件下破碎细胞。
破碎条件：输出250W30secON/30secOFF/Total5min
5)黑色素测定
取细胞破碎液400μL置于2.0mL容量的微量离心管中，添加等量的4N-NaOH，60℃下加热2小时，进行黑色素的洗脱处理。取处理液加入96孔板，每200μL加入3孔(well)中，测定492nm处的吸光度，求出平均值。因与各样品一起以n＝2进行试验，所以，进一步求出这些的平均值，使用黑色素(NacalaiTesque公司)，由预先制作的黑色素的校正曲线求出黑色素量。
6)蛋白量测定
将细胞破碎液35μL用等量的50mM磷酸缓冲液(pH6.8)稀释，在96孔板上每次取5μL加入3孔中，使用DC蛋白浓度测定试剂盒II(Bio-Rad公司)进行反应，测定690nm处的吸光度，求出平均值。因与各样品一起以n＝2进行试验，所以，进一步求出这些的平均值，使用诊断试剂盒的牛血清白蛋白，由预先制作的蛋白的校正曲线求出蛋白量。
7)试验数据的归纳
以对照(DMSO)的黑色素量、蛋白量为100，计算出空白、熊果苷(阳性对照)及各样品的黑色素量及蛋白量的比。进而以对照(DMSO)的(黑色素量/蛋白量)比为100，计算出熊果苷(阳性对照)及样品的(黑色素量/蛋白量)比，由100减去该值求出熊果苷(阳性对照)及样品的黑色素生成抑制率。此外，在试验例1、3及4中，将试样浓度以公比2倍稀释求出抑制率，由各试验浓度的黑色素生成抑制率通过内插法求出为50％抑制的试样浓度“IC50(μg/mL)”。“IC50(μg/mL)”表示用于50％抑制黑色素生成的需要的浓度，可以说显示更低值的化合物其作为抑制剂的活性更高。
(4)透明质酸酶抑制试验
来自葡萄酒用葡萄的低聚原花色素的透明质酸酶抑制试验用改变了文献(前田有美惠等、食品卫生学杂志31(3)，233-237(1990))方法的以下方法实施。透明质酸通过透明质酸酶分解成N-乙酰己糖胺。通过将还原末端的N-乙酰葡糖胺通过由对二甲基氨基苯甲醛(和光纯药工业株式会社制，以下简称为p-DAB)标记的显色，用吸光度定量，测定透明质酸酶抑制活性。
在溶解在10％DMSO中的40μL试样溶液中，混合20μL溶解在0.1M醋酸缓冲液(pH4.0)中的1000U/mL透明质酸酶(Sigma公司制)，37℃下预备加温20分钟。在相同缓冲液中添加40μL溶解的0.5mg/mLcompound48/80(Sigma公司制)，37℃下静置20分钟使透明质酸酶活化。在该溶液中添加100μL0.8mg/mL透明质酸钾溶液，使其最终浓度为0.4mg/mL，37℃下反应40分钟后，添加40μL0.4N氢氧化钠溶液，冰冷以使反应停止。将用6NNaOH调节到pH9.1的0.8M硼酸溶液加入到40μL反应液中，100℃下煮沸3分钟。在冰中冷却到室温，在其中添加1.2mL遮光的10mg/mL对二甲基氨基苯甲醛(p-DAB)溶液，37℃下反应20分钟后，测定585nm处的吸光度(A585)。试样的透明质酸酶抑制活性用由下式求出的抑制率表示。
抑制率(％)＝{1-(a-b)/(c-d)}×100
a：添加了酶的试样溶液的A585
b：未添加酶的试样溶液的A585
c：添加了酶的对照溶液的A585
d：未添加酶的对照溶液的A585
此外，在比较对照中，代替试样溶液，添加40μL400μg/mL(摩尔浓度0.873mM)的(-)-表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯(和光纯药株式会社制，以下简称为EGCG)来使用。
(5)胶原酶抑制试验
来自葡萄酒用葡萄的低聚原花色素的胶原酶抑制试验用改变了文献(Wunsch等、HoppeSeylersZPhysiolChem.，333，149-51(1963))方法的以下方法实施。
将10mg胶原酶TypeIV(Sigma公司)溶解于1mL蒸馏水中，使酶溶液为100μg/mL(55.lunit/mL)的浓度，使用时稀释50倍使用。底物溶液中，为使PZ-肽(4-phenylazo-benzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg-OH)(Pz-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg-OH、Sigma公司制)的浓度为0.5μg/mL，溶解于含有20nmol/L氯化钙的Tris盐酸缓冲液(pH7.1)中使用。在20μL溶解于10％DMSO中的试样溶液中，混合20μL酶溶液及160μL底物溶液，37℃下反应30分钟。而后，加入400μL25mM柠檬酸溶液使反应停止，将反应液中的Pz-Pro-Leu用2mL乙酸乙酯提取。以乙酸乙酯为对照，测定所得到的乙酸乙酯层的波长320nm处的吸光度。此外，各试样的抑制活性用由下式求出的抑制率计算。
胶原酶抑制率(％)＝{1-(a-b)/(c-d)}×100
a：试样添加时反应30分钟后的吸光度
b：试样添加时反应0分钟后的吸光度
c：试样无添加反应30分钟后的吸光度
d：试样无添加反应0分钟后的吸光度
上述式中，胶原酶的活性被完全抑制时，胶原酶抑制率(％)为100％。可以说显示出高“抑制率(％)”的化合物作为抑制剂的活性更高。
在胶原酶抑制试验中，阳性对照为代替试样溶液，添加20μL800μg/mL(摩尔浓度0.176mm)的Isoamylphosphonyl-Glycyl-L-Proly-L-Alaine，dipotassiumsalt；C15H26K2N3O6P(ElastinProductsCompany，Inc.制，以下简称为IP304)(反应时的浓度为80μg/mL)来使用。
试验例1
对于制备例1中制备的来自白葡萄酒用葡萄的原花色素组分1～6，在通过上述评价方法评价功效等时，得到表1所示的结果。
[表1]
*1用低聚原花色素的数均分子量除以儿茶素的分子量(Mw290)的结果
已表明在用含30％～50％水的乙醇水溶液提取的来自白葡萄酒用葡萄的原花色素组分中，具有高的黑色素生成抑制作用。可看出其活性与所含有的低聚原花色素的纯度及其聚合度具有相关性。此外，可知用含30％～50％水的乙醇水溶液进行提取时，可以高收率且高纯度提取原料中所含有的高聚合度的低聚原花色素。
试验例2
对于制备例2中制备的来自红葡萄酒用葡萄的原花色素组分1～8，通过上述评价方法评价功效等，得到表2所示的结果。
[表2]
*1用低聚原花色素的数均分子量除以儿茶素的分子量(Mw290)的结果
已表明在用含30％～60％水的乙醇水溶液提取的来自红葡萄酒用葡萄的原花色素组分中，具有高的黑色素生成抑制效果及透明质酸酶抑制作用。可知用含30％～60％水的乙醇水溶液进行提取时，可高收率且高纯度提取原料中所含有的高聚合度的低聚原花色素。
试验例3
对于制备例3中制备的来自葡萄酒用葡萄的原花色素组分，通过上述评价方法评价功效等，得到表3所示的结果。
[表3]
*1用低聚原花色素的数均分子量除以儿茶素的分子量(Mw290)的结果
此次进行了研究的来自各种葡萄的原花色素组分的黑色素生成抑制及透明质酸酶抑制活性与低聚原花色素的纯度或聚合度成比例。其中，可知从莎当妮、赤霞珠及甲州中得到的来自葡萄的原花色素组分可得到好的美容效果。
试验例4
对于制备例4中制备的来自葡萄酒用葡萄的原花色素组分，通过上述评价方法评价功效等，得到表4及表5所示的结果。来自莎当妮的原花色素组分的结果如表4所示，来自赤霞珠的原花色素组分的结果如表5所示。表4及表5的转移率为以制备例4中制备的来自葡萄酒用葡萄的原花色素组分中所含有的简单酚组分量、儿茶素·表儿茶素组分量、低分子OPC组分量及高分子OPC组分量的合计为100时，由简单酚组分量、儿茶素·表儿茶素组分量、低分子OPC组分量及高分子OPC组分量计算出的各个组分的比例。例如简单酚组分的转移率可通过下式计算。下式中，“儿茶素·表儿茶素组分”简写为“儿茶素组分”。
[式2]
[表4]
*1用低聚原花色素的数均分子量除以儿茶素的分子量(Mw290)的结果
[表5]
*1用低聚原花色素的数均分子量除以儿茶素的分子量(Mw290)的结果
试验例1～4中，对于来自葡萄的原花色素组分的分离物进行黑色素生成抑制效果及透明质酸酶抑制的评价时，可看出所有的高分子低聚原花色素组分中均有好的效果。因此，可知为得到高的美容功效，低聚原花色素中还需要具有高聚合度的提取物。通过上述研究，可知用含30v/v％～60v/v％、优选为30v/v％～50v/v％水的乙醇水溶液提取的来自葡萄的原花色素组分中富含具有高聚合度的低聚原花色素，还可知为了以高纯度得到具有好的美容效果的低聚原花色素，进行提取的溶剂非常重要。此外，特别是使用30～60％的乙醇水溶液时，可高效提取低聚原花色素，且可得到大量含有高聚合度低聚原花色素的提取物。
试验例5
将制备例2中制备的来自红葡萄酒用葡萄的原花色素组分1～8在800μg/mL的10％DMSO溶液中调整，通过上述(5)胶原酶抑制试验的评价方法评价各组分的胶原酶抑制活性，得到表6所示的结果。表6所示的胶原酶抑制率为由上述胶原酶抑制率的计算式求出的值。阳性对照(IP304)的胶原酶抑制率(由上述胶原酶抑制率的计算式求出的值)为71.1％。
[表6]
*1用低聚原花色素的数均分子量除以儿茶素的分子量(Mw290)的结果
试验例6
将制备例3中制备的热水提取的来自葡萄酒用葡萄的原花色素组分在800μg/mL的10％DMSO溶液中调整，通过上述(5)胶原酶抑制试验的评价方法评价各组分的胶原酶抑制活性，得到表7所示的结果。表7所示的胶原酶抑制率为由上述胶原酶抑制率的计算式求出的值。阳性对照(IP304)的胶原酶抑制率(上述胶原酶抑制率的计算式求出的值)为84.0％。
[表7]
*1用低聚原花色素的数均分子量除以儿茶素的分子量(Mw290)的结果
试验例7
将制备例4中制备的来自赤霞珠的原花色素组分在800μg/mL的10％DMSO溶液中调整，通过上述(5)胶原酶抑制试验的评价方法评价各组分的胶原酶抑制活性，得到表8所示的结果。表8所示的胶原酶抑制率为由上述胶原酶抑制率的计算式求出的值。阳性对照(IP304)的胶原酶抑制率(上述胶原酶抑制率的计算式求出的值)为84.6％。表8的转移率与表5中的转移率相同。
[表8]
*1用低聚原花色素的数均分子量除以儿茶素的分子量(Mw290)的结果
从试验例5～7中，可看出对来自葡萄的原花色素组分的分离物进行胶原酶抑制的评价时，所有的高分子低聚原花色素组分均具有好的效果。因此，可知在低聚原花色素中，具有高聚合度的提取物也具有高的美容功效。例如在用含30v/v％～60v/v％、优选为30v/v％～50v/v％水的乙醇水溶液提取的来自葡萄的原花色素组分中，富含具有高聚合度的低聚原花色素，显示出高的胶原酶抑制活性。
工业实用性
根据本发明，可以高纯度纯化在饮食品、化妆品或医药品等领域中有用的低聚原花色素。例如，通过本发明的纯化方法得到的低聚原花色素具有优异的美白作用、透明质酸酶抑制作用及胶原酶抑制作用，在化妆品、医药品等领域中均有用。

Claims (22)

1.一种低聚原花色素的纯化方法，其特征在于，包含于70℃以上且小于100℃下，以水或醇类水溶液为提取溶剂提取含有聚合度不同的多种低聚原花色素的原料的提取工序，该提取工序中，根据目标低聚原花色素的聚合度设定该提取溶剂的醇类浓度，以提取目标聚合度的低聚原花色素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，醇类为乙醇。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，纯化方法为(A)平均聚合度为5以上且小于8的低聚原花色素的纯化方法，或(B)平均聚合度为8以上的低聚原花色素的纯化方法。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，(A)纯化方法为平均聚合度为5以上且小于8的低聚原花色素的纯化方法，使提取溶剂的醇类浓度为0～20v/v％，或(B)纯化方法为平均聚合度为8以上的低聚原花色素的纯化方法，使提取溶剂的醇类浓度为30～60v/v％。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，纯化方法为平均聚合度为8～10的低聚原花色素的纯化方法，提取溶剂为40～50v/v％的乙醇水溶液。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，含有聚合度不同的多种低聚原花色素的原料来自植物。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，含有聚合度不同的多种低聚原花色素的原料为选自葡萄果实、葡萄种皮及葡萄的种子中的至少1种的来自葡萄的原料。
8.一种具有黑色素生成抑制作用的低聚原花色素的纯化方法，其特征在于，包含将选自葡萄果实、葡萄种皮及葡萄的种子中的至少1种的来自葡萄的原料于70℃以上且小于100℃下用30～60v/v％的醇类水溶液提取的提取工序。
9.一种透明质酸酶抑制剂，其特征在于，以低聚原花色素为有效成分，该低聚原花色素在将选自葡萄果实、葡萄种皮及葡萄的种子中的至少1种的来自葡萄的原料于70℃以上且小于100℃下，在30～60v/v％的醇类水溶液中提取而得到的提取液或提取物中含有。
10.一种胶原酶抑制剂，其特征在于，以低聚原花色素为有效成分，该低聚原花色素在将选自葡萄果实、葡萄种皮及葡萄的种子中的至少1种的来自葡萄的原料于70℃以上且小于100℃下，在30～60v/v％的醇类水溶液中提取而得到的提取液或提取物中含有。
11.根据权利要求9或10所述的抑制剂，其特征在于，醇类为乙醇。
12.根据权利要求9或10所述的抑制剂，其特征在于，醇类水溶液为40～50v/v％的乙醇水溶液。
13.根据权利要求9或10所述的抑制剂，其特征在于，低聚原花色素的平均聚合度为8～10。
14.一种透明质酸酶抑制剂，其特征在于，以平均聚合度为8～10的低聚原花色素为有效成分。
15.一种胶原酶抑制剂，其特征在于，以平均聚合度为8～10的低聚原花色素为有效成分。
16.根据权利要求14或15所述的抑制剂，其特征在于，低聚原花色素在选自葡萄果实、葡萄种皮及葡萄的种子中的至少1种的来自葡萄的原料中含有。
17.根据权利要求14或15所述的抑制剂，其特征在于，低聚原花色素的平均聚合度为8.5～9.5。
18.根据权利要求14或15所述的抑制剂，其特征在于，低聚原花色素在将选自葡萄果实、葡萄种皮及葡萄的种子中的至少1种的来自葡萄的原料于70℃以上且小于100℃下，在30～60v/v％的醇类水溶液中提取而得到的提取液或提取物中含有。
19.根据权利要求14或15所述的抑制剂，其特征在于，低聚原花色素在选自葡萄果实、葡萄种皮及葡萄的种子中的至少1种的来自葡萄的原料中含有，葡萄为赤霞珠。
20.权利要求9～19中任一项所述的抑制剂在作为皮肤外用剂或化妆品中的用途。
21.一种低聚原花色素的聚合度的调整方法，其特征在于，包含于70℃以上且小于100℃下以水或醇类水溶液为提取溶剂提取含有聚合度不同的多种低聚原花色素的原料的提取工序，该提取工序中，根据目标低聚原花色素的聚合度设定该提取溶剂的醇类浓度，以提取目标聚合度的低聚原花色素。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，(A)通过使提取溶剂的醇类浓度为0～20v/v％，将提取液中的低聚原花色素的平均聚合度调整为5以上且小于8，或(B)通过使提取溶剂的醇类浓度为30～60v/v％，将提取液中的低聚原花色素的平均聚合度调整为8以上。
CN201280062680.9A 2011-12-28 2012-12-27 低聚原花色素的纯化方法、聚合度的调整方法以及透明质酸酶抑制剂及胶原酶抑制剂 Active CN103998441B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011288803 2011-12-28
JP2011-288803 2011-12-28
PCT/JP2012/083770 WO2013100003A1 (ja) 2011-12-28 2012-12-27 オリゴメリックプロアントシアニジンの精製方法、重合度の調整方法並びにヒアルロニダーゼ阻害剤及びコラゲナーゼ阻害剤

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103998441A CN103998441A (zh) 2014-08-20
CN103998441B true CN103998441B (zh) 2016-02-17

Family

ID=48697482

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280062680.9A Active CN103998441B (zh) 2011-12-28 2012-12-27 低聚原花色素的纯化方法、聚合度的调整方法以及透明质酸酶抑制剂及胶原酶抑制剂

Country Status (5)

Country Link
JP (1) JP5905492B2 (zh)
CN (1) CN103998441B (zh)
HK (1) HK1196360A1 (zh)
TW (1) TWI574954B (zh)
WO (1) WO2013100003A1 (zh)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6622294B2 (ja) * 2014-05-30 2019-12-18 シャクリー コーポレイション シャルドネブドウ種子抽出物
US10709751B2 (en) 2014-05-30 2020-07-14 Shaklee Corporation Chardonnay grape seed extract
WO2017173240A1 (en) 2016-03-31 2017-10-05 Gojo Industries, Inc. Antimicrobial peptide stimulating cleansing composition
EP3435765A1 (en) * 2016-03-31 2019-02-06 Gojo Industries, Inc. Antimicrobial peptide stimulating sanitizing composition
AU2017240069B2 (en) 2016-03-31 2024-03-07 Gojo Industries, Inc. Sanitizer composition with probiotic/prebiotic active ingredient
CN106045959B (zh) * 2016-05-23 2018-04-24 湖南鑫利生物科技有限公司 一种利用葡萄籽提取物制备低聚原花青素的方法
EP3544575A1 (en) 2016-11-23 2019-10-02 GOJO Industries, Inc. Sanitizer composition with probiotic/prebiotic active ingredient
CN107550800A (zh) * 2017-10-24 2018-01-09 广东芭薇生物科技股份有限公司 一种多方位美白组合物及其应用
CN108299370B (zh) * 2018-04-09 2021-12-07 上海永姿化妆品有限公司 一种用于护肤乳液的生物抗氧化剂的合成方法
CN109232328A (zh) * 2018-09-29 2019-01-18 广东丽臣奥威实业有限公司 一种抗氧化烷基苯磺酸盐组合物的制备方法
JP6667773B1 (ja) * 2018-12-20 2020-03-18 公益財団法人 佐賀県地域産業支援センター 炎症性サイトカイン産生抑制用の組成物
CN110194756A (zh) * 2019-07-22 2019-09-03 刘文倩 一种制备低聚合度原花青素的方法
FR3114814B1 (fr) 2020-10-07 2023-10-27 M&M Braun GmbH Extrait de pépins de raisin à efficacité biologique positive accrue, son procédé de fabrication et ses utilisations
CN113244224B (zh) * 2021-05-27 2022-06-03 中南林业科技大学 一种鞣花酸缓释凝胶及其制备方法和应用
WO2023058649A1 (ja) * 2021-10-05 2023-04-13 一丸ファルコス株式会社 ストレス改善剤

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1495178A (zh) * 1999-04-23 2004-05-12 Э�ͷ��͹�ҵ��ʽ���� 原花色素低聚物的提纯方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2694748B2 (ja) * 1989-12-28 1997-12-24 キッコーマン株式会社 プロアントシアニジンの製造法
JP3502415B2 (ja) * 1993-05-28 2004-03-02 株式会社コーセー メイラード反応阻害剤
JPH1171294A (ja) * 1997-08-29 1999-03-16 Pias Arise Kk コラゲナーゼ阻害剤
JP2000026306A (ja) * 1998-07-14 2000-01-25 Kikkoman Corp ヒアルロニダーゼ阻害剤
WO2001032131A1 (fr) * 1999-10-29 2001-05-10 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Agents d'amelioration de texture de la peau
US6627232B1 (en) * 2000-06-09 2003-09-30 Mars Incorporated Method for extracting cocoa procyanidins
JP2003238426A (ja) * 2002-02-18 2003-08-27 Toyo Shinyaku:Kk コラゲナーゼ阻害剤、皮膚外用剤および健康食品
JP2004238289A (ja) * 2003-02-03 2004-08-26 Kikkoman Corp 血栓形成抑制剤及び機能性食品
US20080044453A1 (en) * 2003-09-26 2008-02-21 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Therapeutic Agent for Treatment of Autoimmune Diseases
JPWO2005070443A1 (ja) * 2004-01-21 2007-12-27 株式会社東洋新薬 樹皮抽出物
US7863466B2 (en) * 2005-04-15 2011-01-04 Toyo Shinyaku Co., Ltd. Method of producing proanthocyanidin-containing material
CN101239963A (zh) * 2008-03-18 2008-08-13 上海大学 肉桂原花青素高聚物催化氢解为低聚物的方法
JP2011178728A (ja) * 2010-03-02 2011-09-15 Kobe Univ Ａｍｐｋ活性化剤、ｇｌｕｔ４活性化剤、およびそれらを用いた医薬品・飲食品

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1495178A (zh) * 1999-04-23 2004-05-12 Э�ͷ��͹�ҵ��ʽ���� 原花色素低聚物的提纯方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
植物原花色素研究利用进展与发展趋势;石碧等;《四川大学学报（工程科技版）》;20060920;第38卷(第5期);第18页右栏第18-23行 *

Also Published As

Publication number Publication date
HK1196360A1 (zh) 2014-12-12
TWI574954B (zh) 2017-03-21
TW201332985A (zh) 2013-08-16
CN103998441A (zh) 2014-08-20
JP5905492B2 (ja) 2016-04-20
WO2013100003A1 (ja) 2013-07-04
JPWO2013100003A1 (ja) 2015-05-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103998441B (zh) 低聚原花色素的纯化方法、聚合度的调整方法以及透明质酸酶抑制剂及胶原酶抑制剂
WO2001026670A1 (fr) Agents de soin de la peau, agents anti-ages pour la peau, agents de blanchiment de la peau et preparations pour la peau, a usage externe
KR101749965B1 (ko) 새싹보리 추출물을 포함하는 미백 및 주름개선용 화장료 조성물
JP2005008539A (ja) マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤
JP2001261570A (ja) 皮膚外用剤
KR101973639B1 (ko) 콩잎 추출물을 함유하는 항산화용 조성물
JP2007210915A (ja) 皮膚外用剤
JP2017214349A (ja) 化粧料及び経口組成物
JP2003300824A (ja) 老化防止用皮膚外用剤
US20170196797A1 (en) Composition containing glycine gracilis oil
KR20120023876A (ko) 홍삼 또는 인삼 유래 진세노사이드 알이와 알에이치투 복합체를 함유하는 화장료 조성물 및 그 제조 방법
CN109528536A (zh) 一种含有胆碱鞣花酸盐的护肤品及其制备方法
KR101071414B1 (ko) 과나바나 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백용 조성물
KR20170079814A (ko) 레몬머틀 추출물을 포함하는 음료 조성물
KR102283526B1 (ko) 해조류 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물
KR102283527B1 (ko) 곡류 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물
JP2003155221A (ja) 皮膚外用剤
JP6827691B2 (ja) 化粧料
JP4203325B2 (ja) 皮膚外用剤及び皮膚外用剤組成物
JP2019199437A (ja) 皮膚外用剤
JP2007238597A (ja) 皮膚外用剤
JP2007131602A (ja) 美白用外用剤
KR102128168B1 (ko) 표고버섯 추출물 및 고로쇠 잎 추출물을 포함하는 항노화 활성을 갖는 조성물
JP6735225B2 (ja) 皮膚外用組成物及び経口組成物
CN101543525B (zh) 一种含红豆越橘提取物的美容组合物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1196360

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant