WO2023058649A1 - ストレス改善剤 - Google Patents

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WO2023058649A1
WO2023058649A1 PCT/JP2022/037119 JP2022037119W WO2023058649A1 WO 2023058649 A1 WO2023058649 A1 WO 2023058649A1 JP 2022037119 W JP2022037119 W JP 2022037119W WO 2023058649 A1 WO2023058649 A1 WO 2023058649A1
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stress
skin
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molecular weight
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賢一 伊藤
朋志 ▲浜▼田
弘之 小島
史佳 若山
秀之 伊東
裕二 岩岡
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一丸ファルコス株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a stress reliever, and more particularly to a stress reliever for improving rough skin caused by psychological stress or the like.
  • Non-Patent Document 1 An example of evidence shows that (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • Cortisol suppresses the expression of keratin 10 (K10), filaggrin (FLG), and involucrin (INV) mRNA in normal human skin keratinocytes via glucocorticoid receptors, and increases intracellular oxidative stress.
  • Ginkgo biloba extract containing flavonoids such as terpene lactones, kaempferol, and quercetin has been reported to restore cortisol-induced decreases in K10, FLG, and INV mRNA expression in normal human skin keratinocytes and three-dimensional artificial epidermis ( For example, see Non-Patent Document 2).
  • Patent Document 1 discloses an ABCA12 gene expression promoter that contains an extract from the residue of pressing grapes as an active ingredient.
  • ABCA12 which is one of the membrane transport proteins called transporters
  • transporters is decreased by various internal and external factors, and when its function is disrupted, various abnormalities occur in the epidermis and the like. Therefore, agents that target the stratum corneum such as the skin and can directly promote the expression of the ABCA12 gene are not only pharmaceuticals and foods (including beauty and health-oriented food and drink), but also external preparations such as beverages and cosmetics. It is thought that it can be used for However, the active ingredient of the grape fruit-derived ABCA12 gene expression promoter has not yet been clarified.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide an active ingredient having a stress-relieving effect.
  • the present inventors found that proanthocyanidins obtained from a specific purified fraction have skin rhythm-improving effects in human cultured cell lines. That is, the present invention includes the following embodiments.
  • a stress reliever containing proanthocyanidin as an active ingredient containing proanthocyanidin as an active ingredient.
  • the active ingredient is represented by the following formula (I):
  • R 1 represents a methoxy group, a hydrogen atom or a hydroxy group
  • R 2 is a hydrogen atom, a hydroxy group or the following formula (II):
  • n represents an integer of 0 to 907.
  • a proanthocyanidin represented by (1) or (2) which is a proanthocyanidin represented by (1) or (2).
  • the stress-relieving agent according to (7), wherein the skin-related gene is ABCA12 and/or filaggrin.
  • the stress ameliorating agent of the present invention it is possible to provide a stress ameliorating agent such as an action to ameliorate rough skin due to psychological stress.
  • FIG. 1 shows the structural formulas of epicatechin and catechin, which are representative components of flavan compounds that constitute proanthocyanidins, and gallic acid, which is frequently ester-added to the hydroxyl group at the 3-position of the flavan ring.
  • FIG. 2 is a fractionation diagram showing an outline of a method for fractionating a grape fruit extract by column chromatography.
  • FIG. 3A is the result of reverse-phase HPLC analysis of the 70% acetone fraction purified in Example 1.
  • FIG. FIG. 3B is the result of analyzing the 70% acetone fraction purified in Example 1 by GPC using a TSK-gel Super AW3000 column.
  • FIG. 4 shows the relative expression levels of ABCA12 in human epidermal keratinocytes NHEK cultured in the presence or absence of the 70% acetone fraction purified in Example 1.
  • FIG. 5 shows the relative expression levels of filaggrin in human epidermal keratinocytes NHEK cultured in the presence or absence of the 70% acetone fraction purified in Example 1.
  • FIG. 6 shows the relative expression levels of Bmal1 in human epidermal keratinocytes NHEK cultured in the presence or absence of the 70% acetone fraction purified in Example 1.
  • FIG. FIG. 7 shows the results of analyzing the 70% acetone fraction purified in Example 1 by GPC using a TSKgel SuperAW5000 column.
  • the stress-relieving agent of the present invention contains proanthocyanidin as an active ingredient.
  • the active ingredient "proanthocyanidins” refers to catechins, that is, polyphenols having a flavan skeleton as a basic unit. Examples of structural units thereof include flavan-3-ols such as catechin, epicatechin, gallocatechin, epigallocatechin, catechin gallate, epicatechin gallate, gallocatechin gallate, and epigallocatechin gallate.
  • Fig. 1 shows the structural formulas of epicatechin and catechin, which are representative components of flavan compounds that constitute proanthocyanidins, and gallic acid, which is often esterified to the 3-position hydroxy group of the flavan ring.
  • the 3-hydroxy group in this structural formula may form an ester (gallate) with gallic acid, and the hydroxy group at any site other than the 3-position forms a glycoside or methyl ether (methoxy).
  • the main binding sites between the constituent units of proanthocyanidin include one position at positions 4 and 6 or positions 4 and 8, or two positions at positions 4 and 8 and oxygen at positions 2 and 7. It is not limited to these, and the steric configuration of these bonds is not particularly limited. In other words, proanthocyanidins, although there are many types, may have similar physiological activities due to the commonality that the carbon atoms in the flavan skeleton form oligomers by C—C bonds.
  • proanthocyanidins obtained by polymerizing a specific monomer
  • typical proanthocyanidins include propelargo, which is defined and classified according to the number of hydroxy groups on the B ring (see FIG. 1).
  • Proanthocyanidin in the present invention is preferably procyanidin or prodelphinidin.
  • the constituent units of “procyanidins” may be the same or different and may be selected from catechin, epicatechin, catechin gallate and epicatechin gallate.
  • the constituent units of "prodelphinidin” may be the same or different and may be selected from gallocatechin, epigallocatechin, gallocatechin gallate and epigallocatechin gallate.
  • Proanthocyanidin which is an active ingredient in the present invention, preferably has a molecular weight of 1000 to 190000 (the lower or upper limit of the molecular weight may be, for example, 5000, 41923.),
  • the formula ( The compounds of I) include proanthocyanidins having a degree of polymerization n of 0 to 907. Since the active ingredient has a wide range of molecular weights, it can also be expressed as an average molecular weight. For example, in a molecular weight distribution curve obtained by gel permeation chromatography (GPC), when the molecular weight corresponding to the peak position is measured in terms of polystyrene, it has an average molecular weight of about 42,000.
  • GPC gel permeation chromatography
  • the average molecular weight may be expressed as a number average molecular weight value or a weight average molecular weight value, which will be described in detail in the examples below.
  • the active ingredient has formula (I): (wherein R 1 represents a methoxy group (CH 3 O--), hydrogen atom (H--) or hydroxy group (HO--), R 2 represents a hydrogen atom, a hydroxy group or the following formula (II):
  • n represents an integer from 0 to 907.
  • n represents an integer from 0 to 907.
  • the lower limit or upper limit of n can be set to 3, 9, 23, 73, 198, 339, for example.
  • the above active ingredient of the present invention can be produced, for example, from plant materials such as grapes by organic solvent extraction and column chromatography purification. Alternatively, it may be produced by a chemical synthesis method using a known method. For example, catechin and epicatechin obtained from commercially available sources can be synthesized by multimerization (see, for example, Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2002-542240).
  • the active ingredient more preferably has the following formula (IV): (Wherein, R 1 represents a methoxy group, a hydrogen atom or a hydroxy group, R 2 represents a hydrogen atom, a hydroxy group, or a functional group represented by formula (II) above; n represents an integer of 0 to 907; ) is a proanthocyanidin represented by Note that the lower limit or upper limit of n can be set to 3, 9, 23, 73, 198, 339, for example.
  • the active ingredient according to the present invention can be extracted and purified from grapes, for example.
  • the grape fruit extract used as a raw material for the stress ameliorator is preferably a fruit extract derived from the genus Vitaceae (Vitis), most preferably the genus Vitaceae (Vitis) ) is a fruit extract of Chardonnay. Or, in addition to Chardonnay, Vitis vinifera Niagara, Sauvignon Blanc, Riesling, Kerner, Cabernet Sauvignon, Cabernet Franc, Merlot Pinot Noir, or Wild Grape, or Vinifera hybrid Koshu, Muscat Berry A , Campbell Early, Muscat Alexandria, Kyoho, or Concord may be used.
  • hydrophilic organic solvents that can be used as extraction solvents include lower aliphatic alcohols having 1 to 3 carbon atoms such as methanol, ethanol, propanol and isopropanol; 4 polyhydric alcohols, and the like.
  • the mixing ratio can be adjusted as appropriate, but from the results of Examples described later, extraction is performed with 30 to 50% 1,3-BG or 30 to 90% ethanol. is most preferred.
  • the extraction is not particularly limited as long as the soluble components contained in the grape fruit (raw, fruit with skin, seeds in the fruit) can be eluted into the extraction solvent, and can be carried out according to the usual method.
  • an extract can be obtained by immersing grapes in 2 to 10 times the amount (mass ratio) of an extraction solvent, extracting soluble components at room temperature, and filtering to remove extraction residues. If necessary, treatments such as dilution, concentration and drying may be carried out according to conventional methods.
  • an adsorbent capable of adsorbing and eluting proanthocyanidins such as a styrene-divinylbenzene-based synthetic adsorption resin, anion exchange resin, octadecyl group chemically bonded silica gel (ODS), gel filtration resin (Toyopearl (registered trademark) HW- 40C, etc.) are used.
  • Proanthocyanidins can be adsorbed by passing the above grape extract or the like through a column filled with these adsorbents, and after washing, fractionation and purification of proanthocyanidins can be performed by passing an appropriate eluate. can.
  • a membrane separation method using a molecular weight fractionation membrane or the like can be used.
  • ⁇ Stress improving agent and its effect ⁇ Stress improving agent and its effect>
  • Psychological stress activates the hypothalamic-pituitary-adrenal axis and stimulates the production of stress hormones both locally and systemically. This results in decreased production of epidermal lipids and structural proteins, decreased hydration of the stratum corneum, and skin barrier dysfunction characterized by increased transepidermal water loss (TEWL).
  • Cortisol which is secreted by psychological stress, is called hydrocortisone and is a hormone that maintains the homeostasis of the human body. Abnormal or excessive secretion of cortisol causes abnormal terminal differentiation of keratinocytes and affects skin conditions. is expected to give
  • the stress alleviating agent of the present embodiment is preferably a stress alleviating agent for alleviating the subject's rough skin caused by psychological stress.
  • the skin contains various genes whose expression is regulated by clock genes, for example, the ABCA12 protein gene and the moisturizing factor filaggrin gene FLG, which are important for the formation and maintenance of the skin barrier. It keeps a rhythm, and it repairs the skin periodically to keep it healthy. It is thought that when the genetic skin rhythm is weakened by psychological stress, the circadian rhythm of these skin-related genes is disturbed, thereby causing skin troubles such as dryness and rough skin.
  • the stress reliever of the present embodiment cares for skin disorders by improving such skin rhythm. Therefore, a skin rhythm-improving agent refers to an agent that improves disturbance of the circadian rhythm of skin-related genes.
  • a stress-reducing agent in one embodiment can be used for a subject having disturbances in the circadian rhythm of skin-related genes.
  • Genes that control circadian rhythms include PER (PER1, PER2, etc.), CRY (CRY1, CRY2, etc.), BMAL (BMAL1, etc.), and CLOCK (CLOCK). These genes are known to be present in various animals such as humans and mice, and to be expressed in cells almost throughout the body. Skin-related genes regulated by these clock genes include, but are not limited to, ABCA12 and/or filaggrin.
  • the Bmal1 gene is one of the clock genes and has the function of increasing the enzyme that makes fat cells. Bmal1 is thought to increase or decrease depending on the time of day in the body of mammals, with the lowest level around 3:00 pm and the highest level between 10:00 pm and 2:00 am.
  • the ABCA12 gene is mainly expressed in the stomach and skin at embryonic day 18.5, and even after maturity, it is strongly expressed not only in the skin and stomach, but also in the heart, intestine, kidney, etc., and is also expressed in the brain, liver, and lung. Is recognized. In particular, hyperkeratosis of the epidermis and gastric mucosa is observed as a disorder in ABCA12 knockout mice.
  • Filaggrin is a filament aggregating protein, and is a protein with a molecular weight of about 40 kDa that plays an important role in the formation of stratum corneum. In particular, it is known to play an important role in promoting epidermal differentiation and maintaining skin barrier function.
  • Filaggrin is involved in various skin diseases, and it has been reported that mutation of the filaggrin gene is a major factor in the development of atopic dermatitis and ichthyosis vulgaris (Nature Genetics, 38, 441-446, 2006).
  • oral composition The stress relieving agent of the present invention may be in the form of an oral composition as one embodiment.
  • Oral compositions include, for example, beverages, foods, pharmaceuticals, and quasi-drugs.
  • Specific examples of food and drink include vegetable juices, fruit juice drinks, soft drinks, beverages such as tea, instant noodles, soups, jellies, puddings, yogurt, cake premix products, confectionery, furikake, miso, soy sauce, sauces, and dressings.
  • various general processed foods such as margarine, bread, cakes, cookies, chocolate, candies, gummies, gums and jellies, powders, granules, Pill-shaped, tablet-shaped, soft-capsule-shaped, hard-capsule-shaped, paste-shaped or liquid-shaped nutritional supplements, foods for specified health uses, functional foods, health foods, concentrated liquid diets, therapeutic foods for dysphagia, etc. can be done.
  • the active ingredient of the present invention and known raw materials may be used, or a part of the known raw materials may be replaced with the active ingredient of the present invention and produced by a conventional method.
  • the active ingredient of the present invention may optionally be added to glucose (glucose), dextrin, lactose, starch or processed products thereof, excipients such as cellulose powder, vitamins, minerals, oils and fats of animals, plants and fish, proteins ( (including proteins derived from animals, plants and yeast, hydrolysates thereof, etc.), carbohydrates, pigments, flavors, antioxidants, surfactants, other edible additives, and edible powders and extracts containing various nutritional functional ingredients.
  • the stress-reducing agent of the present invention may be in the form of an external preparation for skin as one embodiment.
  • the external preparation for skin according to the present embodiment is 1) pharmaceuticals, 2) quasi-drugs in a form suitable for use such as ampoules, capsules, powders, granules, liquids, gels, bubbles, emulsions, sheets, mists, and sprays.
  • Topical or systemic external skin preparations for example, lotions, milky lotions, creams, ointments, lotions, oils, basic cosmetics such as packs, solid soaps, liquid soaps, facial cleansers such as hand washes, skin Cleansing agents, massage agents, cleansing agents, depilatories, depilatories, shaving agents, aftershave lotions, preshave lotions, shaving creams, foundations, lipsticks, blushers, eyeshadows, eyeliners, mascara, and other make-up cosmetics cosmetics, perfumes, nail preparations, nail enamels, nail enamel removers, poultices, plasters, tapes, sheets, patches, aerosols, etc.), 4) Medicinal or/and applied to the scalp and hair and cosmetic formulations (e.g., shampoos, rinses, hair treatment agents, pre-hair treatment agents, permanent liquids, hair dyes, hair styling agents, hair tonics, hair restorers, hair tonics, poultices, plaster agents, tape agents , sheet
  • the amount of the active ingredient according to the present invention can be appropriately adjusted according to the formulation to be blended. , hereinafter the same), the range of 0.002 to 1.0% by mass for make-up cosmetics, and the range of 0.002 to 10.0% by mass for cleansing cosmetics.
  • the solid content of the composition is in the range of 0.0001 to 5.0% by mass.
  • the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
  • the unit % of numerical values indicating the addition amount of various components means % by mass.
  • Example 1 Purification of active ingredients from grape fruit extract European grape (Vitis vinifera L.) fruit (raw, fruit with skin/seeds in fruit) is extracted by adding 50% ethanol aqueous solution, A filtrate was obtained by filtration. The filtrate was dried by an evaporator and pulverized. 4.0 g of the powder was dissolved in 50% methanol and fractionated by carum chromatography according to the following procedure.
  • Toyopearl (registered trademark) HW-40C column (inner diameter 2.2 cm, length 40 cm) was loaded with the methanol solution of the above extract, and various solvents shown in FIG. components were eluted. 50% methanol first, followed by 60% methanol, 70% methanol, a mixed solvent of methanol-water-acetone (70:20:10), a mixed solvent of methanol-water-acetone (70:10:20) and 70% After successive elution with acetone, 3.5 g, 81.0 mg, 68.4 mg, 60.8 mg, 58.6 mg and 118.3 mg of solid content were recovered, respectively. As shown in Test Example 1 described later, the 70% acetone-eluted fraction has the activity of promoting the expression of the Bmal1 gene in human epidermal cells, so we tried to identify the active ingredient by focusing on this fraction.
  • FIGS. 3(a) and 3(b) The results of analysis of the 70% acetone-eluted fraction described above by reverse-phase HPLC or GPC under the conditions shown below are shown in FIGS. 3(a) and 3(b), respectively.
  • ⁇ Calibration curve> TSKgel Standard Polystyrene Oligomer kit (Tosoh) was used as a standard, and analysis was carried out using standards having the following molecular weight ranges. Based on the results, a calibration curve was prepared by plotting the molecular weight on the horizontal axis and the retention time (min) on the vertical axis. The measured molecular weights of the standard products and the retention times (min) by GPC analysis are as follows. Molecular weight Retention time (min) 10200 7.40 17400 7.20 37900 6.90 96400 6.60 190000 6.29
  • FIG. 7 shows the results of GPC analysis using the above 70% acetone eluted fraction.
  • This fraction contained a polymer having a peak at a retention time of 6.880 minutes, and the molecular weight corresponding to the peak position was estimated to be 41,923 from the calibration curve.
  • cDNA was synthesized using Takara Bio Inc.
  • As a control (comparative control) a considerable amount of a solution equivalent to the solvent of the sample was used.
  • the expression level of the gene was measured by a quantitative PCR method (polymerase chain reaction method). SYBR Premi Ex Taq (Takara Bio Inc.) was used for the quantitative PCR method.
  • RPS18 As an internal standard, the expression level of RPS18, which is a housekeeping gene, was quantified, and the relative expression level ratio to RPS18 was calculated to obtain the Bmal1 gene relative expression level ratio.
  • primers for PCR commercially available primers for RPS18 of Bmal1 (both QuantiTect Primers: Qiagen) were used.
  • RNA was replaced with a KBM medium containing cortisol, and ABCA12 was cultured for 6 hours, while filaggrin was cultured for 22 hours.
  • cDNA was synthesized using PrimeScript RT reagent Kit (Takara Bio).
  • a control comparative control, no cortisol added
  • a considerable amount of a solution equivalent to the solvent of the sample was used.
  • the expression level of the gene was measured by a quantitative PCR method (polymerase chain reaction method). SYBR Premix Ex Taq (Takara Bio) was used for the quantitative PCR method.
  • RPS18 As an internal standard, the expression level of RPS18, which is a housekeeping gene, was quantified, and the relative expression level ratio with respect to RPS18 was calculated as the relative expression level ratio of ABCA12 and filaggrin genes.
  • Commercially available primers for ABCA12, filaggrin, and RPS18 (QuantiTect Primer: Qiagen or Perfect Real Time Primer: Takara Bio) were used as primers for PCR.
  • FIGS. 4 to 6 The results are shown in FIGS. 4 to 6.
  • FIG. 4 the control group is labeled as "control”.
  • addition of cortisol reduced the expression level of ABCA12 relative to the control group to 0.62 (the group described as “cortisol” in FIG. 4), but addition of the purified sample reduced ABCA12 increased to 1.35 (group indicated as "cortisol + sample” in Fig. 4).
  • addition of cortisol reduced the expression level of filaggrin relative to the control group to 0.61 (the group described as “cortisol” in FIG. 5), but addition of the purified sample reduced the expression level of filaggrin to 0.61. increased to 0.87 (group described as "cortisol + sample” in Fig. 5).
  • FIG. 4 the control group is labeled as "control”.
  • addition of cortisol reduced the expression level of ABCA12 relative to the control group to 0.62 (the group described as “cortisol” in FIG. 4), but addition of the purified sample reduced ABCA12
  • cortisol decreased the expression level of BmalI relative to the control to 0.63 (the group labeled as “cortisol” in FIG. 6).
  • the expression level relative value increased to 0.88 (group described as "cortisol + sample” in Fig. 6).
  • "*" indicates that there is a statistically significant difference at p ⁇ 0.05 as a result of Dunnett's test.
  • the stress ameliorating agent of the present invention can be used as a skin rhythm ameliorating agent that adjusts the circadian rhythm of skin-related genes. Therefore, the stress ameliorating agent of the present invention may be used as a cosmetic for improving rough skin of subjects caused by psychological stress.

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Abstract

本開示は、例えばブドウ果実抽出物から得られる、心理的ストレスによる肌荒れ改善作用を有する有効成分を提供することを目的とする。プロアントシアニジンを有効成分として含む、ストレス改善剤を提供する。

Description

ストレス改善剤 クロスリファレンス
　本出願は、日本国において、２０２１年１０月５日に出願された特願２０２１－１６４０４１号及び２０２２年３月２５日に出願された特願２０２２－０４９５５４号に基づく優先権を主張するものであり、当該出願に記載された内容はすべて、参照によりそのまま本明細書に援用される。
　本発明は、ストレス改善剤に関し、より詳細には、心理的ストレス等による肌あれを改善するためのストレス改善剤に関する。
　現代人は、肉体的にも心理的にもストレスの多い環境で生活しており、心理的ストレスは、表皮のバリア機能を低下させることで肌のトラブルを引き起こすと考えられている。例えば、人混みや孤独感、ニコチン中毒、不眠、暗算作業、肉体的苦痛、受験や夫婦間のストレス、性格の不一致などからくる心理的ストレスが、急性および慢性の表皮機能障害を引き起こす可能性があることは、多くの証拠が示している（例えば、非特許文献１参照）。
　コルチゾールは、グルココルチコイド受容体を介して、正常ヒト皮膚ケラチノサイトにおけるケラチン１０（Ｋ１０）、フィラグリン（ＦＬＧ）、インボルクリン（ＩＮＶ）のｍＲＮＡの発現を抑制し、細胞内の酸化ストレスを上昇させる。テルペンラクトンやケンフェロール、ケルセチンなどのフラボノイドを含むイチョウ葉エキスは、正常ヒト皮膚ケラチノサイト及び３次元人工表皮において、コルチゾールによるＫ１０、ＦＬＧ、ＩＮＶのｍＲＮＡ発現の低下を回復させることが報告されている（例えば、非特許文献２参照）。
　また、特許文献１には、ブドウ果実圧搾残渣からの抽出物を有効成分とする、ＡＢＣＡ１２遺伝子発現促進剤が開示されている。トランスポーターと呼ばれる膜輸送タンパク質の１つであるＡＢＣＡ１２は、様々な内的・外的要因により低下し、その機能が破綻すると、表皮などに種々の異常が起こることが知られている。そのため、皮膚などの角質層をターゲットとし、直接ＡＢＣＡ１２遺伝子の発現を促進させることができる剤は、医薬品、食品（美容や健康志向の飲食品を含む）のみならず、飲料、化粧料等外用剤に利用することができると考えられる。しかしながら、ブドウ果実由来のＡＢＣＡ１２遺伝子発現促進剤の有効成分については未だ明らかではない。
Ｍ．　Ｍａａｒｏｕｆ，　Ｃ．Ｌ．　Ｍａａｒｏｕｆ，　Ｇ．　Ｙｏｓｉｐｏｖｉｔｃｈ，　Ｖ．Ｙ．　Ｓｈｉ，　Ｔｈｅ　ｉｍｐａｃｔ　ｏｆ　ｓｔｒｅｓｓ　ｏｎ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｂａｒｒｉｅｒ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ：　ａｎ　ｅｖｉｄｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ　ｒｅｖｉｅｗ，　Ｂｒ　Ｊ　Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１９，１８１（６）：１１２９－１１３７． Ｓ．　Ｙａｗａｋａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓｔｒｅｓｓ　ｉｓ　ａｎ　ｉｎｉｔｉａｔｏｒ　ｏｆ　ｓｋｉｎ　ｐｒｏｂｌｅｍｓ　ｄｕｅ　ｔｏ　ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｂａｒｒｉｅｒ　ｃａｕｓｅｄ　ｂｙ　ａｂｎｏｒｍａｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　－　Ａ　Ｇｉｎｇｋｏ　ｌｅａｆ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｉｓ　ａｎ　ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ　ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ｆｏｒ　ｄｅａｌｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓｔｒｅｓｓ　－　Ｔｈｅ　ＩＦＳＣＣ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　２０２０　Ｙｏｋｏｈａｍａ
特許第６８３１５４９号
　そこで、本発明が解決しようとする課題は、ストレス改善作用を有する有効成分を提供することである。
　本発明者らは、ブドウ果実抽出物に含まれる上記有効成分について鋭意検討した結果、特定の精製画分から得られるプロアントシアニジンが、ヒト培養細胞系で肌リズム改善作用を有することを見出した。すなわち、本発明は以下の実施形態を含む。
（１）プロアントシアニジンを有効成分として含む、ストレス改善剤。
（２）有効成分が、分子量１０００～１９００００のプロアントシアニジンである、（１）に記載のストレス改善剤。
（３）有効成分が、下記式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 （式中、Ｒ１は、メトキシ基、水素原子又はヒドロキシ基を示し、
Ｒ２は、水素原子、ヒドロキシ基又は下記式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 で表される官能基を示し、ｎは、０から９０７の整数を示す。）で表されるプロアントシアニジンである、（１）又は（２）に記載のストレス改善剤。
（４）プロアントシアニジンが、プロシアニジンである、（１）～（３）のいずれか一項に記載のストレス改善剤。
（５）心理的ストレスによる肌あれを改善するための、（１）～（４）のいずれか一項に記載のストレス改善剤。
（６）肌リズム改善剤である、（１）～（５）のいずれか一項に記載のストレス改善剤。
（７）肌関連遺伝子の概日リズムに乱れを有する対象者のための（１）～（６）のいずれか一項に記載のストレス改善剤。
（８）肌関連遺伝子が、ＡＢＣＡ１２及び／又はフィラグリンである（７）に記載のストレス改善剤。
　本発明のストレス改善剤によれば、心理的ストレスによる肌荒れ改善作用等のストレス改善剤を提供することができる。
図１は、プロアントシアニジンを構成するフラバン化合物の代表成分であるエピカテキン及びカテキン並びにフラバン環３位水酸基にしばしばエステル付加する没食子酸の構造式をそれぞれ示した図である。 図２は、ブドウ果実抽出物のカラムクロマトグラフィーによる分画方法の概要を示した分画図である。 図３Ａは、実施例１で精製した７０％アセトン画分を逆相ＨＰＬＣで分析した結果である。 図３Ｂは、実施例１で精製した７０％アセトン画分を、ＴＳＫ－ｇｅｌ　Ｓｕｐｅｒ　ＡＷ３０００カラムを用いたＧＰＣで分析した結果である。 図４は、実施例１で精製した７０％アセトン画分の存在又は非存在下で培養したヒト表皮角化細胞ＮＨＥＫにおけるＡＢＣＡ１２の発現量相対値を示す。 図５は、実施例１で精製した７０％アセトン画分の存在又は非存在下で培養したヒト表皮角化細胞ＮＨＥＫにおけるフィラグリンの発現量相対値を示す。 図６は、実施例１で精製した７０％アセトン画分の存在又は非存在下で培養したヒト表皮角化細胞ＮＨＥＫにおけるＢｍａｌ１の発現量相対値を示す。 図７は、実施例１で精製した７０％アセトン画分を、ＴＳＫｇｅｌ　ＳｕｐｅｒＡＷ５０００カラム用いたＧＰＣで分析した結果である。
　次に、本発明の各実施形態について、図面を参照して説明する。なお、以下に説明する各実施形態は、特許請求の範囲に係る発明を限定するものではなく、また、各実施形態の中で説明されている諸要素及びその組み合わせの全てが本発明の解決手段に必須であるとは限らない。
＜有効成分＞
　本発明のストレス改善剤は、有効成分として、プロアントシアニジンを含む。この有効成分である「プロアントシアニジン」とは、カテキン類、すなわち、フラバン骨格を基本単位とするポリフェノール類をいう。その構成単位としては、例えば、フラバン－３－オールとしてカテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート等が挙げられる。
　図１は、プロアントシアニジンを構成するフラバン化合物の代表成分であるエピカテキン及びカテキン並びにフラバン環の３位ヒドロキシ基にしばしばエステル付加する没食子酸の構造式を示す。この構造式の３位のヒドロキシ基は没食子酸とエステル（ガレート）を形成していてもよく、３位以外のいずれかの部位のヒドロキシ基が配糖体あるいはメチルエーテル（メトキシ）を形成していてもよい。
　プロアントシアニジンの構成単位同士の主たる結合部位としては、４位と６位又は４位と８位のいずれか１箇所、あるいは４位と８位及び２位と７位酸素の２箇所が挙げられるがこれらに限定されるものではなく、またこれら結合の立体配置も特に限定されるものではない。すなわち、プロアントシアニジンには、非常に多くの種類が存在するものの、フラバン骨格の炭素同士がＣ－Ｃ結合にてオリゴマーを形成するという共通性から、類似の生理活性を有する可能性がある。
　ある特定の単量体が重合したプロアントシアニジンには慣用名が与えられ、代表的なプロアントシアニジンとしては、Ｂ環（図１参照）のヒドロキシ基の数に応じて定義、分類された、プロペラルゴニジン（４’－ＯＨ）、プロシアニジン（３’－ＯＨ、４’－ＯＨ）、プロデルフィニジン（３’－ＯＨ、４’－ＯＨ、５’－ＯＨ）が挙げられるが、プロアントシアニジンはこれらに限定されるものではない。
　本発明において「プロアントシアニジン」は、好ましくは、プロシアニジン又はプロデルフィニジンである。「プロシアニジン」の構成単位は、同一又は異なっていてもよく、カテキン、エピカテキン、カテキンガレート、およびエピカテキンガレートから選択できる。「プロデルフィニジン」の構成単位は、同一又は異なっていてもよく、ガロカテキン、エピガロカテキン、ガロカテキンガレート、及びエピガロカテキンガレートから選択できる。
　本発明において有効成分である「プロアントシアニジン」は、好ましくは、分子量１０００～１９００００であり（当該分子量の下限又は上限を、例えば、５０００、４１９２３とすることもある。）であり、例えば、式（Ｉ）の化合物における重合度ｎが、０から９０７のプロアントシアニジンを含む。この有効成分は幅広い範囲の分子量を有することから平均分子量で表すこともできる。例えば、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって得られる分子量分布曲線において、ピーク位置に相当する分子量をポリスチレン換算で測定すると、約４２０００の平均分子量を有する。平均分子量の表記において「約」とは、測定誤差等を考慮してプラスマイナス１０％の数値範囲を含む。あるいは、平均分子量としては、数平均分子量値又は重量平均分子量値として表してもよく、後述する実施例で詳細に説明する。
　好ましい実施形態において、有効成分は、下記式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （式中、Ｒ１は、メトキシ基（ＣＨ３Ｏ－）、水素原子（Ｈ－）又はヒドロキシ基（ＨＯ－）を示し、Ｒ２は、水素原子、ヒドロキシ基又は下記式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 で表される官能基を示し、ｎは、０から９０７、の整数を示す。）で表されるプロアントシアニジンである。なお、当該ｎの下限又は上限を、例えば、３、９、２３、７３、１９８、３３９、とすることもできる。
　なお、式（Ｉ）において、ｎが０の場合は、下記式（ＩＩＩ）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　本発明の上記有効成分は、例えば、ブドウ果実などの植物素材から有機溶媒抽出及びカラムクロマトグラフィー精製により製造することができる。あるいは、公知の方法を用いた化学合成法により製造してもよい。例えば、市販の供給源から得られるカテキン及びエピカテキンを、多量体化することにより合成することもできる（例えば、特表２００２－５４２２４０号公報参照）。
　当該有効成分は、より好ましくは、下記式（ＩＶ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （式中、Ｒ１は、メトキシ基、水素原子又はヒドロキシ基を示し、
Ｒ２は、水素原子、ヒドロキシ基又は上記式（ＩＩ）で表される官能基を示し、ｎは、０から９０７、の整数を示す。）で表されるプロアントシアニジンである。なお、当該ｎの下限又は上限を、例えば、３、９、２３、７３、１９８、３３９、とすることもできる。
　本発明に係る有効成分は、例えば、ブドウ果実から抽出及び精製することができる。１つの実施形態において、ストレス改善剤の原料として用いられるブドウ果実抽出物は、ブドウ科（Ｖｉｔａｃｅａｅ）ブドウ属（Ｖｉｔｉｓ）由来の果実抽出物が好ましく、最も好ましくはブドウ科（Ｖｉｔａｃｅａｅ）ブドウ属（Ｖｉｔｉｓ）シャルドネ（Ｃｈａｒｄｏｎｎａｙ）の果実抽出物である。もしくは、シャルドネの他にも、ヴィニフェラ種（Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ）のナイアガラ、ソービニオンブラン、リースリング、ケルナー、カベルネ・ソーヴィニヨン、カベルネ・フラン、メルローピノノアール、あるいはヤマブドウ、又はヴィニフェラ系交雑種の甲州、マスカット・ベリーＡ、キャンベルアーリー、マスカット・アレキサンドリア、巨峰、あるいはコンコード等の品種を用いてもよい。
　抽出溶媒としては、水、親水性有機溶媒又は含水親水性有機溶媒を使用することができる。その際、抽出物の変性を避けるため、室温に近い温度で抽出することが好ましい。抽出溶媒として使用しうる親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等の炭素数１～３の低級脂肪族アルコール、１，３－ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２～４の多価アルコール等が挙げられる。含水親水性有機溶媒を使用する場合、その混合比は適宜調整することができるが、後述する実施例の結果から、３０～５０％の１，３－ＢＧ又は３０～９０％のエタノールで抽出することが最も好適である。
　抽出は、ブドウ果実（生、皮つき果実、果実の中に種あり）に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させることができれば特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、ブドウ果実を２～１０倍量（質量比）の抽出溶媒に浸漬し、常温で可溶性成分を抽出した後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出物を得ることができる。必要であれば、常法に従って希釈、濃縮、乾燥等の処理を行ってもよい。
　続いて、プロアントシアニジンを吸着かつ溶離できる吸着剤、例えばスチレンージビニルベンゼン系の合成吸着樹脂、陰イオン交換樹脂、オクタデシル基化学結合型シリカゲル（ＯＤＳ）、ゲルろ過樹脂（トヨパール（登録商標）ＨＷ－４０Ｃ等）などが使用される。これらの吸着剤を充填したカラムに上記のブドウ果実抽出液などを通すことによりプロアントシアニジンを吸着させ、洗浄後、それぞれに適した溶出液を通すことにより、プロアントシアニジンの分画精製を行なうことができる。また、分子量分画膜を用いた膜分離法等を用いることもできる。
＜ストレス改善剤及びその作用効果＞
　心理的なストレスは、視床下部－下垂体－副腎軸を亢進させ、局所的および全身的なストレスホルモンの産生を刺激する。その結果、表皮の脂質や構造タンパク質の産生が減少し、角質層の水和が低下し、経表皮水分損失（ＴＥＷＬ）の増加により特徴づけられる皮膚バリア機能障害が生じる。心理的ストレスにより分泌されるコルチゾールは、ヒドロコルチゾンと呼ばれ、人体の恒常性を維持するホルモンであるが、コルチゾールの異常分泌や過剰分泌は、ケラチノサイトの異常な終末分化を引き起こし、皮膚の状態に影響を与えることが予想される。
　本実施形態のストレス改善剤は、好ましくは、心理的ストレスにより生じた対象者の肌あれを改善するためのストレス改善剤である。如何なる理論にも拘束されるものではないが、肌は、時計遺伝子によって発現調節される種々の遺伝子、例えば、皮膚のバリア形成・維持に重要なＡＢＣＡ１２タンパクの遺伝子や保湿因子フィラグリンの遺伝子ＦＬＧが肌リズムを刻んでおり、周期的に肌を修復して健常性を保っている。心理的なストレスにより遺伝子の肌リズムが減弱すると、これらの肌関連遺伝子の概日リズムに乱れを生じ、それによって乾燥や肌荒れなどの肌トラブルを引き起こすと考えられる。本実施形態のストレス改善剤は、このような肌リズムを改善することにより、肌の不調をケアする。したがって、肌リズム改善剤とは、肌関連遺伝子の概日リズムの乱れを改善する剤をいう。
　１つの実施形態におけるストレス改善剤は、肌関連遺伝子の概日リズムに乱れを有する対象者のために用いることができる。概日リズム(サーカディアンリズム)をつかさどる遺伝子としては、ＰＥＲ（ＰＥＲ１、ＰＥＲ２など）、ＣＲＹ（ＣＲＹ１、ＣＲＹ２など）、ＢＭＡＬ（ＢＭＡＬ１など）、ＣＬＯＣＫ（ＣＬＯＣＫ）が挙げられる。これらの遺伝子は、ヒト、マウスなど様々な動物が有し、またほぼ全身の細胞に発現していることが知られている。これらの時計遺伝子によって制御される肌関連遺伝子としては、ＡＢＣＡ１２及び／又はフィラグリンを含むがこれらに限定されない。
　Ｂｍａｌ１遺伝子は、時計遺伝子の一つであり、脂肪細胞を作る酵素を増やす機能を持つ。Ｂｍａｌ１は、哺乳類の体内において、時間帯によって増減し、午後３時ごろが最も少なく、午後１０時頃から午前２時頃に最も多くなると考えられている。ＡＢＣＡ１２遺伝子は、胎生１８．５日では主に胃や皮膚に発現が認められ、成熟後でも皮膚や胃はもちろん、心臓、腸、腎臓などで強く発現し、脳、肝臓、肺にも発現が認められる。特に、ＡＢＣＡ１２ノックアウトマウスにおける障害として、表皮や胃粘膜の過角化が認められる。またヒトにおけるＡＢＣＡ１２の異常によって引き起こされる代表的な疾患として、先天的に皮膚のバリアの要である脂質が十分に運ばれず、脂質層がうまく作られないことによって、全身の皮膚が非常に厚い板状の角層に覆われ、まぶたや唇がめくれあがる等の症状を示す道化師様魚鱗癬という皮膚疾患が報告されている。フィラグリンとは、フィラメント凝集タンパク質（Ｆｉｌａｍｅｎｔ　ａｇｇｒｅｇａｔｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）のことをいい、角質層の形成に重要な役割を果たす、分子量約４０ｋＤａのタンパク質である。特に、表皮分化の促進や皮膚のバリア機能の維持に重要な役割を果たすことが知られている。フィラグリンは種々の皮膚疾患に関与し、フィラグリン遺伝子の変異がアトピー性皮膚炎や尋常性魚鱗癬発症の主要因子であることが報告されている（Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３８、４４１－４４６、２００６）。
＜ストレス改善剤の形態及び有効成分の含有量＞
（経口組成物）
　本発明のストレス改善剤は、1つの実施形態として経口組成物の形態でありうる。経口組成物としては、例えば、飲料、食品、医薬品、医薬部外品が挙げられる。飲食品の具体例として、野菜ジュース、果汁飲料、清涼飲料、茶等の飲料類、即席麺、スープ、ゼリー、プリン、ヨーグルト、ケーキプレミックス製品、菓子類、ふりかけ、味噌、醤油、ソース、ドレッシング、マヨネーズ、植物性クリーム、焼肉用たれや麺つゆ等の調味料、麺類、うどん、蕎麦、スパゲッティ、ハムやソーセージ等の畜肉魚肉加工食品、ハンバーグ、コロッケ、ふりかけ、佃煮、ジャム、牛乳、クリーム、バター、スプレッドやチーズ等の粉末状、固形状又は液状の乳製品、マーガリン、パン、ケーキ、クッキー、チョコレート、キャンディー、グミ、ガム、ゼリー等の各種一般加工食品のほか、粉末状、顆粒状、丸剤状、錠剤状、ソフトカプセル状、ハードカプセル状、ペースト状又は液体状の栄養補助食品、特定保健用食品、機能性食品、健康食品、濃厚流動食や嚥下障害用食品の治療食等を挙げることができる。
　これらの飲食品を製造するには、本発明の有効成分と公知の原材料を用い、あるいは公知の原材料の一部を本発明の有効成分で置き換え、常法によって製造すればよい。例えば、本発明の有効成分を、必要に応じてグルコース（ブドウ糖）、デキストリン、乳糖、澱粉又はその加工物、セルロース粉末等の賦形剤、ビタミン、ミネラル、動植物や魚介類の油脂、たん白（動植物や酵母由来の蛋白質、その加水分解物等を含む）、糖質、色素、香料、酸化防止剤、界面活性剤、その他の食用添加物、各種栄養機能成分を含む粉末やエキス類等の食用素材とともに混合して粉末、顆粒、ペレット、錠剤等の形状に加工したり、常法により一般加工食品に加工処理したり、これらを混合した液状物をゼラチン、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース等の被覆剤で被覆してカプセルに成形したり、飲料（ドリンク類）の形態に加工して、栄養補助食品や健康食品として利用することは好適である。とりわけ錠剤、カプセル剤やドリンク剤が望ましい。
（皮膚外用剤）
　本発明のストレス改善剤は、1つの実施形態として皮膚外用剤の形態であってもよい。本実施形態の皮膚外用剤は、アンプル、カプセル、粉末、顆粒、液体、ゲル、気泡、エマルジョン、シート、ミスト、スプレー剤等利用上の適当な形態の１）医薬品類、２）医薬部外品類、３）局所用又は全身用の皮膚外用剤類（例えば、化粧水、乳液、クリーム、軟膏、ローション、オイル、パック等の基礎化粧料、固形石鹸、液体ソープ、ハンドウォッシュ等の洗顔料や皮膚洗浄料、マッサージ用剤、クレンジング用剤、除毛剤、脱毛剤、髭剃り処理料、アフターシェーブローション、プレシェーブローション、シェービングクリーム、ファンデーション、口紅、頬紅、アイシャドウ、アイライナー、マスカラ等のメークアップ化粧料、香水類、美爪剤、美爪エナメル、美爪エナメル除去剤、パップ剤、プラスター剤、テープ剤、シート剤、貼付剤、エアゾール剤等）、４）頭皮・頭髪に適用する薬用又は／及び化粧用の製剤類（例えば、シャンプー剤、リンス剤、ヘアートリートメント剤、プレヘアートリートメント剤、パーマネント液、染毛料、整髪料、ヘアートニック剤、育毛・養毛料、パップ剤、プラスター剤、テープ剤、シート剤、エアゾール剤等）、５）浴湯に投じて使用する浴用剤、６）その他、腋臭防止剤や消臭剤、制汗剤、衛生用品、衛生綿類、ウエットティシュ等が挙げられる。
　本発明に係る有効成分の配合量は、配合する製剤に応じて適宜調整可能であり、固形分量として、例えば、基礎化粧料の場合は、０．００２～１．０質量％（固形分質量％、以下同じ）の範囲、メークアップ化粧料の場合は、０．００２～１．０質量％の範囲、又清浄用化粧料の場合は、０．００２～１０．０質量％の範囲である。また、毛髪用化粧料の場合は、組成物の固形分として、０．０００１～５．０質量％の範囲である。
　次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。なお、以下の実施例において、各種成分の添加量を示す数値の単位％は、質量％を意味する。
［実施例１］ブドウ果実抽出物からの有効成分の精製
　ヨーロッパブドウ（Vitis　vinifera　L.)の果実（生、皮つき果実・果実の中に種あり）に５０％エタノール水溶液を加えて抽出し、ろ過してろ液を得た。当該ろ液をエバポレータにより乾燥して、粉末化した。当該粉末４．０ｇを５０％メタノールに溶解し、以下の手順に従ってカルムクロマトグラフィーを行い分画した。
　トヨパール（登録商標）ＨＷ－４０Ｃカラム（内径２．２ｃｍ、長さ４０ｃｍ）に、上記抽出物のメタノール溶液を負荷し、図２に示した各種溶媒を左から右の順に用いて、カラムに吸着した成分を溶出した。最初に５０％メタノール、続いて６０％メタノール、７０％メタノール、メタノール－水－アセトン（７０：２０：１０）の混合溶媒、メタノール－水－アセトン（７０：１０：２０）の混合溶媒及び７０％アセトンにて逐次的に溶出し、それぞれ、３．５ｇ、８１．０ｍｇ、６８．４ｍｇ、６０．８ｍｇ、５８．６ｍｇ及び１１８．３ｍｇの固形分を回収した。後述する試験例１に示すように、７０％アセトン溶出画分は、ヒト表皮細胞のＢｍａｌ１遺伝子の発現促進活性を有することから、この画分に着目して有効成分の同定を試みた。
　上記７０％アセトン溶出画分を、逆相ＨＰＬＣ又はＧＰＣにて以下に示す条件で分析した結果を、それぞれ、図３（ａ）及び図３（ｂ）に示す。
（逆相ＨＰＬＣ分析）
ポンプ：ＨＩＴＡＣＨＩ　Ｃｈｒｏｎｏｍａｓｔｅｒ５１１０
検出器：ＨＩＴＡＣＨＩ　Ｃｈｒｏｎｏｍａｓｔｅｒ５４２０（２８０ｎｍ）
カラム：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ　Ｃ１８（ＧＬ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）
（４．６ｍｍ　Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ，粒子径５μｍ）
移動相：（Ａ）Ｈ２Ｏ：ＣＨ３ＣＮ：ＨＣＯＯＨ＝９０：５：５
（Ｂ）Ｈ２Ｏ：ＣＨ３ＣＮ：ＨＣＯＯＨ＝５０：４５：５
グラジエント：（Ｂ）０分（０％）→３０分（１００％）→３０．１分（０％）→４５分（０％）
流速：１．０ｍＬ／分
温度：４０℃
注入量：１０μＬ
（ＧＰＣ分析）
ポンプ：ＳＨＩＭＡＤＺＵ　ＬＣ－１０ＡＶ
検出器：ＳＨＩＭＡＤＺＵ　ＳＰＤ－１０ＡＶ（２８０ｎｍ）
カラム：ＴＳＫ－ｇｅｌ　Ｓｕｐｅｒ　ＡＷ３０００
（内径６．０ｍｍ×１５０ｍｍ，粒子径４μｍ）×２
移動相：ＤＭＦ：３Ｍ　ＨＣＯＯＮＨ３＝９９．５：０．５
流速：０．５ｍＬ／分
温度：４０℃
注入量：５μＬ
　当該画分を用いて、プロアントシアニジンの呈色反応である塩酸－ブタノール分解反応を行うと、濃赤色を呈し、吸収極大波長が５４５ｎｍであったことから、文献値との比較により、プロアントシアニジンの中でもプロシアニジンであることが推測された。
　そこで、上記７０％アセトン溶出画分を用いて、さらに詳細な分子量分布を以下の条件で測定した。
＜ＧＰＣ分析条件＞
ポンプ：ＳＨＩＭＡＤＺＵ　ＬＣ－１０ＡＶ
検出器：ＳＨＩＭＡＤＺＵ　ＳＰＤ－１０ＡＶ（２８０ｎｍ）
カラムオーブン：ＳＨＩＭＡＤＺＵ　ＣＴＯ－１０ＡＣ
カラム：ＴＳＫｇｅｌ　ＳｕｐｅｒＡＷ５０００（６．０ｍｍＩＤ×１５０ｍｍ、７μｍ、Ｔｏｓｏｈ）
検出波長：２８０ｎｍ
移動相：ＤＭＦ／３Ｍ　ＨＣＯＯＮＨ４（９９．５：０．５）
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：５μＬ
カラム温度：４０℃
＜検量線＞
　標準品としてＴＳＫｇｅｌ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ　Ｏｌｉｇｏｍｅｒ　ｋｉｔ（Ｔｏｓｏｈ）を使用し、下記の分子量範囲の標準品を用いて分析を行った。その結果を基に横軸に分子量、縦軸に保持時間（ｍｉｎ）をプロットし、検量線を作製した。測定した標準品の分子量とＧＰＣ分析による保持時間（ｍｉｎ）は以下の通りである。
分子量　　　　保持時間（ｍｉｎ）
１０２００　　　　７．４０
１７４００　　　　７．２０
３７９００　　　　６．９０
９６４００　　　　６．６０
１９００００　　　６．２９
　上記７０％アセトン溶出画分を用いたＧＰＣ分析結果を図７に示す。この画分には、保持時間６．８８０分にピークを有する高分子が含まれ、検量線から、ピーク位置に相当する分子量は４１９２３と推定された。なお、本分析装置に搭載したソフトウェア（μ7　Plus　DataStation、システムインスツルメンツ株式会社)を用いて計算した平均分子量は以下の通りである。
ピークトップ換算平均分子量値：４１９２３
Ｍｎ（数平均分子量値）：１８６５１
Ｍｗ（重量平均分子量値）：１９９３０１７７
分散度：Ｍｗ／Ｍｎ＝１０６８．６１
［試験例１］
　ヒト表皮細胞ＨａＣａＴ（Cell　Lines　Service（コスモバイオ）、ＨａＣａＴ(Human　Skin　Keratinocyte)、３００４９３－ＳＦ）を培養プレートに播種し、５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ上培地中でサブコンフルエントまで３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。次いで１％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地に交換し、１６時間培養後、上記実施例１で調製したブドウ果実抽出物及び精製試料（７０％アセトン画分）を培地に添加し、２時間培養を行なった。その後、培地を１％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地に交換してさらに６時間培養し、細胞からＲＮＡ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＲＮＡの抽出を行い、得られたＲＮＡを鋳型にＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。なお、コントロール（比較対照）は、試料の溶媒と同等液を相当量用いた。このｃＤＮＡを用いて、定量ＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖反応法）にて、遺伝子の発現量を測定した。定量ＰＣＲ法にはＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉ　Ｅｘ　Ｔａｑ（タカラバイオ社）を用いた。内部標準としては、ハウスキーピング遺伝子であるＲＰＳ１８の発現量を定量し、ＲＰＳ１８に対する相対発現量比を算出して、Ｂｍａｌ１遺伝子相対発現量比とした。ＰＣＲ用プライマーには、市販の、Ｂｍａｌ１のＲＰＳ１８用プライマー（いずれも、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ　Ｐｒｉｍｅｒ：キアゲン社）を用いた。
　その結果を表１に示す。培養液中に添加した精製試料（７０％アセトン画分）の固形分濃度依存的にＢｍａｌ１遺伝子の発現量が増加することが分かった。固形分濃度と相対発現量とを比較すると、精製試料中の有効成分は、ブドウ果実抽出物に比べて５～１０倍程度濃縮されていると推測される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
［試験例２］
　ヒト表皮角化細胞ＮＨＥＫ（成人表皮角化細胞、クラボウ、ＫＫ－４１０９）を培養プレートに播種し、増殖添加剤を添加した表皮角化細胞増殖基本培地（ＫＢＭ培地、クラボウ）にてコンフルエントまで３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。次いでストレスホルモンであるコルチゾールを含むＫＢＭ培地に交換し、２４時間培養後、実施例１で精製した試料（７０％アセトン画分）を培地に添加し、２時間培養を行なった。その後、培地を、コルチゾールを含むＫＢＭ培地に交換し、さらにＡＢＣＡ１２の場合は６時間培養し、一方、フィラグリンでは２２時間培養し、細胞からＲＮＡ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて抽出を行い、得られたＲＮＡを鋳型にＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いてｃＤＮＡを合成した。なお、コントロール（比較対照、コルチゾール無添加）は、試料の溶媒と同等液を相当量用いた。このｃＤＮＡを用いて、定量ＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖反応法）にて、遺伝子の発現量を測定した。定量ＰＣＲ法にはＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ（タカラバイオ）を用いた。内部標準としては、ハウスキーピング遺伝子であるＲＰＳ１８の発現量を定量し、ＲＰＳ１８に対する相対発現量比を算出して、ＡＢＣＡ１２、フィラグリン遺伝子相対発現量比とした。ＰＣＲ用プライマーには、市販のＡＢＣＡ１２、フィラグリン、ＲＰＳ１８用プライマー（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ　Ｐｒｉｍｅｒ：キアゲンまたはＰｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　Ｐｒｉｍｅｒ：タカラバイオ）を用いた。
　その結果を図４～図６に示す。図４～図６において、「コントロール」と標記しているのが、コントロール群である。
　図４では、コルチゾールの添加によってコントロール群に対するＡＢＣＡ１２の発現量相対値が０．６２（図４中の「コルチゾール」と記載している群）まで低下したが、精製試料を添加することによって、ＡＢＣＡ１２の発現量相対値が１．３５（図４中の「コルチゾール＋試料」と記載している群）まで増加した。
　図５では、コルチゾールの添加によってコントロール群に対するフィラグリンの発現量相対値が０．６１（図５中の「コルチゾール」と記載している群）まで低下したが、精製試料を添加することによって、フィラグリンの発現量相対値が０．８７（図５中の「コルチゾール＋試料」と記載している群）まで増加した。
　図６では、コルチゾールの添加によってコントロールに対するＢｍａｌＩの発現量相対値が０．６３（図６中の「コルチゾール」と記載している群）まで低下したが、精製試料を添加することによって、ＢｍａｌＩの発現量相対値が０．８８（図６中の「コルチゾール＋試料」と記載している群）まで増加した。
　なお、図４～図６において、「＊」は、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ　ｔｅｓｔの結果、ｐ＜０．０５で統計的有意差があることを示す。
　本発明のストレス改善剤は、肌関連遺伝子の概日リズムを整える肌リズム改善剤として使用することができる。したがって、本発明のストレス改善剤は、心理的ストレスにより生じた対象者の肌あれを改善する化粧品として利用できる可能性がある。

 

Claims (8)

  1. 　プロアントシアニジンを有効成分として含む、ストレス改善剤。
  2. 　前記有効成分が、分子量１０００～１９００００のプロアントシアニジンである、請求項１に記載のストレス改善剤。
  3. 　前記有効成分が、下記式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ｒ１は、メトキシ基、水素原子又はヒドロキシ基を示し、
    Ｒ２は、水素原子、ヒドロキシ基又は下記式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     で表される官能基を示し、ｎは、０から９０７の整数を示す。）で表されるプロアントシアニジンである、請求項１又は２に記載のストレス改善剤。
  4. 　前記プロアントシアニジンが、プロシアニジンである請求項１～３のいずれか一項に記載のストレス改善剤。
  5. 　心理的ストレスによる肌あれを改善するための、請求項１～４のいずれか一項に記載のストレス改善剤。
  6. 　肌リズム改善剤である、請求項１～５のいずれか一項に記載のストレス改善剤。
  7. 　肌関連遺伝子の概日リズムに乱れを有する対象者のための請求項１～６のいずれか一項に記載のストレス改善剤。
  8. 　前記肌関連遺伝子が、ＢＭＡＬ１、ＡＢＣＡ１２及び／又はフィラグリンである請求項７に記載のストレス改善剤。

     
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