WO2013100003A1 - オリゴメリックプロアントシアニジンの精製方法、重合度の調整方法並びにヒアルロニダーゼ阻害剤及びコラゲナーゼ阻害剤 - Google Patents

オリゴメリックプロアントシアニジンの精製方法、重合度の調整方法並びにヒアルロニダーゼ阻害剤及びコラゲナーゼ阻害剤 Download PDF

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grape
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oligomeric
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笠島　直樹
祐子 吉本
祐子 福井
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サントリーホールディングス株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a purification method for obtaining oligomeric proanthocyanidins having a high whitening effect from raw materials containing oligomeric proanthocyanidins having different degrees of polymerization, a method for adjusting the polymerization degree of oligomeric proanthocyanidins, and oligomeric proanthocyanidins
  • the present invention relates to a hyaluronidase inhibitor, a collagenase inhibitor, and the like, which contain as an active ingredient.
  • Skin external preparations and cosmetics are widely used for the purpose of obtaining beauty effects such as whitening and improvement of rough skin.
  • Various substances with whitening action are known, but synthetic products often have safety problems when used on human skin for a long time. Is required.
  • Oligomeric proanthocyanidins are a kind of polyphenols that are abundant in plants such as grapes, apples and cacao, and are referred to as “condensed tannins” or “flavan-3”. A compound also referred to as “all polymerized product”.
  • the structure of OPC generally has a bonding mode in which flavan-3-ol is a structural unit and flavan-3-ol is condensed or polymerized at the 4-6 or 4-8 position.
  • OPC is a general term for polymers of a dimer or higher that are condensed or polymerized according to the above-mentioned bonding mode.
  • Patent Document 1 discloses that a grape extract obtained from an extract obtained by adding purified water to pulverized fruit of Concord red grapes and extracting at 50 to 60 ° C. for 24 hours has a tyrosinase activity inhibitory action and an active oxygen scavenging action. It is described that it had.
  • Patent Document 2 describes that condensed tannin having a polymerization degree of 12 exhibits a whitening action and a tyrosinase activity inhibitory effect.
  • Patent Document 3 describes that the wine ground ethanol extract showed Maillard reaction inhibitory activity and that the extract contained catechin, procyanidin B and procyanidin C.
  • Patent Document 4 discloses a Maillard reaction inhibitor containing proanthocyanidins.
  • residues from wine production and extracts thereof are used as active substance compositions for the production of cosmetic and / or pharmaceutical formulations such as anti-inflammatory agents, antioxidants, skin rejuvenants and the like. The use is described.
  • Patent Document 2 Regarding the activity correlation between these physiological activities and the degree of polymerization of OPC, it is often not fully elucidated. However, for whitening, for example, OPC having a degree of polymerization of about 12 has been reported to be highly effective. (Patent Document 2). Accordingly, there is a need for a technique that can prepare OPC having a desired physiological activity with high purity.
  • Patent Document 7 discloses a collagenase inhibitor and a skin quality improving agent containing proanthocyanidins having an gallic acid addition rate per constituent monomer of proanthocyanidins of 10% (molar ratio) or less as an active ingredient.
  • Patent Document 8 discloses a hyaluronidase inhibitor containing grape seed and / or grape juice extract as an active ingredient.
  • JP 2005-29490 A JP-A-10-236943 JP 2006-256977 A JP-A-6-336430 Special table 2003-518026 gazette Special table 2003-527843 gazette Table 01-32131 JP 2000-26306 A
  • an object of the present invention is to separate (extract) and purify oligomeric proanthocyanidins (OPC) having various physiological activities such as whitening action from raw materials with high purity by a simple operation. It is to provide a purification method. Another object of the present invention is to provide a method for adjusting the degree of polymerization of OPC in an extract when extracting OPC from a raw material.
  • the present invention further comprises a melanin production inhibitor, hyaluronidase inhibitor, and a collagenase inhibitor that exhibits an excellent effect, including OPC obtained by the purification method as an active ingredient, which is highly safe and exhibits an excellent effect. It is also intended to provide.
  • OPCs having different degrees of polymerization are extracted depending on the alcohol concentration in the extraction solvent. It was. For example, when the alcohol concentration in the extraction solvent is about 30 to 70 v / v%, OPC having a high degree of polymerization was extracted. On the other hand, when the alcohol concentration in the extraction solvent was less than 30 v / v%, for example, about 20 v / v% or less, OPC having a low polymerization degree was extracted.
  • the present inventors also indicate that the OPC obtained from the grape-derived raw material by the above purification method has a melanin production inhibitory effect, a hyaluronidase inhibitory action and a collagenase inhibitory action, and further, the higher the degree of polymerization of OPC, the more these actions are. I found it strong.
  • OPC extracted using an aqueous alcohol solution of about 30 to 60 v / v%, particularly about 30 to 50 v / v% has a particularly high purity and exhibits high melanin production inhibitory effect, hyaluronidase inhibitory effect and collagenase inhibitory effect. did.
  • hyaluronidase and collagenase are involved in wrinkle, sagging and skin aging, and OPC having a strong inhibitory activity against these enzymes is useful as a cosmetic product having a high wrinkling, sagging prevention effect and anti-aging effect. It is.
  • the present inventors have further studied based on the above findings and completed the present invention.
  • the present invention relates to the following (1) to (25).
  • (1) including an extraction step of extracting raw materials containing a plurality of types of oligomeric proanthocyanidins having different degrees of polymerization using water or an aqueous alcohol solution as an extraction solvent, and in the extraction step, the degree of polymerization of the target oligomeric proanthocyanidins
  • a method for purifying oligomeric proanthocyanidins, wherein the alcoholic concentration of the extraction solvent is set according to the method, and oligomeric proanthocyanidins having a desired degree of polymerization are extracted.
  • (2) The method according to (1), wherein the extraction temperature is 70 to less than 100 ° C.
  • (3) The method according to (1) or (2) above, wherein the alcohol is ethanol.
  • the purification method is (A) a purification method of oligomeric proanthocyanidins having an average degree of polymerization of 5 to less than 8 or (B) a purification method of oligomeric proanthocyanidins having an average degree of polymerization of 8 or more.
  • the method according to any one of (1) to (3).
  • the purification method (A) is a purification method of oligomeric proanthocyanidins having an average degree of polymerization of less than 5 to 8, and the alcohol concentration of the extraction solvent is 0 to 20 v / v%, or (B) the purification method Is a method for purifying oligomeric proanthocyanidins having an average degree of polymerization of 8 or more, wherein the alcohol concentration of the extraction solvent is 30 to 60 v / v%.
  • the method according to any one of the above (1) to (4) .
  • the purification method is a purification method of oligomeric proanthocyanidins having an average degree of polymerization of 8 to 10
  • the extraction solvent is an aqueous ethanol solution of 40 to 50 v / v%
  • the method according to one item (7) The method according to any one of (1) to (6), wherein the raw material containing a plurality of types of oligomeric proanthocyanidins having different degrees of polymerization is derived from a plant.
  • the plant-derived raw material is at least one grape-derived raw material selected from the group consisting of grape berries, grape seed coat and grape seeds.
  • a method for purifying oligomeric proanthocyanidins having an inhibitory action on melanin production comprising: (10) Oligomeric proanthocyanidins as an active ingredient, and the oligomeric proanthocyanidins are 30-60 v / v% of at least one grape-derived material selected from the group consisting of grapefruit, grape seed coat and grape seeds
  • a hyaluronidase inhibitor characterized in that it is contained in an extract obtained by extraction in an aqueous alcohol solution or an extract.
  • the average degree of polymerization of the oligomeric proanthocyanidins is 8 to 10.
  • a hyaluronidase inhibitor comprising an oligomeric proanthocyanidin having an average degree of polymerization of 8 to 10 as an active ingredient.
  • a collagenase inhibitor comprising an oligomeric proanthocyanidin having an average degree of polymerization of 8 to 10 as an active ingredient.
  • the alcoholic proanthocyanidins are at least one grape-derived raw material selected from the group consisting of grape fruits, grape seed coats and grape seeds, in an aqueous alcohol solution of 30-60 v / v% at less than 70-100 ° C.
  • (24) including an extraction step of extracting a raw material containing plural kinds of oligomeric proanthocyanidins having different polymerization degrees using water or an aqueous alcohol solution as an extraction solvent, and in the extraction step, the polymerization degree of the target oligomeric proanthocyanidins
  • OPC exhibiting physiological activity such as excellent whitening action can be separated and purified from the raw material simply and with high yield and high purity. Since OPC purified by such a method is highly pure, when used as a material for pharmaceuticals, cosmetics, foods and drinks, quasi drugs, etc., such pharmaceuticals, cosmetics, foods and drinks, quasi drugs, etc. Useful for improving functionality.
  • OPC obtained from a grape-derived raw material using an aqueous alcohol solution of about 30-60 v / v% as an extraction solvent has excellent hyaluronidase inhibitory action, collagenase inhibitory action, melanin production inhibitory action, etc. Therefore, it exhibits excellent wrinkles, sagging prevention effect, anti-aging effect, whitening effect and the like, and is suitably used for skin external preparations, cosmetics, quasi drugs and the like.
  • a melanin production inhibitor that exhibits high safety and excellent melanin production inhibitory activity
  • a hyaluronidase inhibitor that exhibits hyaluronidase inhibitory effect
  • a collagenase inhibitor that exhibits excellent collagenase inhibitory effect
  • the method for purifying oligomeric proanthocyanidins of the present invention includes an extraction step of extracting a raw material containing plural types of oligomeric proanthocyanidins having different degrees of polymerization using water or an aqueous alcohol solution as an extraction solvent.
  • the method of the present invention may include steps other than the extraction step as long as the effects of the present invention are exhibited.
  • a plant-derived raw material As a raw material containing a plurality of types of oligomeric proanthocyanidins having different degrees of polymerization, a plant-derived raw material is preferable.
  • the raw material used in the present invention may be a processed product of these plants. Examples of the processed product include a pulverized product, a crushed product, a crushed product, a dried product, a lyophilized product, a squeezed product, a concentrate thereof, and a solid content after squeezing.
  • the raw material in the present invention is preferably a grape-derived raw material, and more preferably, for example, at least one grape-derived raw material selected from the group consisting of grape fruit, grape seed coat and grape seed.
  • Grapes are preferably varieties that are the raw materials of wine, for example, grapes that are the raw materials of white wines such as Chardonnay and Koshu; grapes that are the raw materials of red wines such as Cabernet Sauvignon, Concord, Merlot, Muscat Berry A, etc. Can be mentioned. Among them, grapes which are the raw materials for red wine are preferable, Cabernet Sauvignon and Merlot are more preferable, and Cabernet Sauvignon is more preferable.
  • a pressed product (squeezed lees) of grape fruits produced in the production of red wine or white wine is also preferably used.
  • the grape fruit pressed product produced in the production of red wine is usually a red wine production process, in which the grape fruit is crushed and fermented with fruit juice (grape crushed material) containing pulp, fruit skin and seeds, It is a squeezed rice cake (fruit peel and seed) after squeezing.
  • the pressed product produced in the production of white wine is usually squeezed grapes (grape peels and seeds) after squeezing the fruit juice from the grape fruit in the white wine production process.
  • a pressed product (squeezed lees) of grape fruit produced in the production of red wine is preferably used as a raw material in the present invention. More preferred are pressed products of grape fruits such as Cabernet Sauvignon and Merlot, and more preferred are pressed products of grape fruits of Cabernet Sauvignon. It is preferable to use a grape press produced in wine production as a raw material from the viewpoint that the grape press that is originally disposed as waste can be used effectively.
  • the extraction solvent in the present invention is water or an alcohol aqueous solution.
  • the alcohol is usually a lower alcohol having about 1 to 4 carbon atoms, and examples thereof include methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, 2-butanol, butylene glycol and the like. These can be used alone or in combination of two or more. Of these, ethanol is preferably used.
  • Extraction in the extraction step is usually performed by adding water or an aqueous alcohol solution having a predetermined concentration as an extraction solvent to the raw material.
  • the raw material is preferably immersed in the extraction solvent, and operations such as stirring and shaking may be performed as appropriate.
  • Extraction is usually performed in a batch system or a continuous system, but a batch system is preferred.
  • the ratio of the raw material and the extraction solvent in the extraction step is not particularly limited.
  • the extraction solvent is preferably about 5 to 30 with respect to the raw material 1 by weight, and more preferably about 5 to 15. More preferably, it is about 5 to 10.
  • the extraction temperature in the extraction step is preferably from about 30 to less than 100 ° C. (from about 30 ° C. to less than about 100 ° C.), and from about 70 to less than 100 ° C. (from about 70 ° C. to about 100 ° C. Less than about 70-90 ° C, particularly preferably about 70-90 ° C. Such a temperature is preferable because there is little elution of substances other than oligomeric proanthocyanidins and oligomeric proanthocyanidins can be stably extracted.
  • the extraction time is preferably about 0.5 to 4 hours, more preferably about 1 to 2 hours. Extraction can be performed under normal pressure or under pressure, but preferably under normal pressure.
  • the alcohol concentration of the extraction solvent is set according to the degree of polymerization of the target oligomeric proanthocyanidin, and the oligomeric proanthocyanidin having the target degree of polymerization is extracted.
  • the alcohol concentration in the extraction solvent used in the extraction step oligomeric proanthocyanidins with different degrees of polymerization are extracted from the raw material.
  • the extraction liquid containing the oligomeric proanthocyanidin of the target specific polymerization degree can be efficiently obtained by setting suitably the alcohol concentration of the water or alcohol aqueous solution used as an extraction solvent.
  • the alcohol concentration of the extraction solvent may be set according to the degree of polymerization of the target oligomeric proanthocyanidins, that is, the oligomeric proanthocyanidins extracted from the raw material, but it should be set in the range of about 0 to 70 v / v%, for example. Is preferred.
  • To make the alcohol concentration of the extraction solvent 0% means that water is used as the extraction solvent. That is, in the present invention, it is preferable to use water or an alcohol aqueous solution having an alcohol concentration of about 70 v / v% or less as the extraction solvent.
  • oligomeric proanthocyanidins having a polymerization degree suitable for the purpose can be extracted by adjusting the alcohol concentration of the extraction solvent used for extraction.
  • the alcohol concentration of the extraction solvent is about 30 to 70 v / v%.
  • the range is preferably about 30 to 60 v / v%, more preferably about 30 to 50 v / v%, and particularly preferably about 40 to 50 v / v%.
  • Such a concentration range is preferable because highly pure oligomeric proanthocyanidins can be obtained.
  • the total concentration of the alcohol be in the above range.
  • the alcohol concentration of the extraction solvent is about 0 to 20 v / v% in the extraction step. It is preferably about 0-10 v / v%. That is, as the extraction solvent, water or an alcohol aqueous solution having an alcohol concentration of about 20 v / v% or less, preferably water or an alcohol aqueous solution having an alcohol concentration of about 10 v / v% or less is used.
  • the purification method of the present invention is suitably used as a method for purifying oligomeric proanthocyanidins having an average degree of polymerization of less than about 5-8.
  • the alcohol concentration of the extraction solvent is about 1 to 20 v / v% in the extraction step. More preferably, it is about 10 to 20 v / v%. That is, it is preferable to use an alcohol aqueous solution having the above concentration as the extraction solvent.
  • the alcohol concentration of the extraction solvent is within the above range, oligomeric proanthocyanidins having an average degree of polymerization of more than about 6 and less than about 8 are usually extracted from the raw material.
  • the extraction liquid obtained by the extraction step usually contains oligomeric proanthocyanidins having different polymerization degrees / various polymerization degrees.
  • the average polymerization degree can be extracted with an oligomeric proanthocyanidin having a polymerization degree in the above range.
  • the alcohol concentration of the extraction solvent is about 30 to 70 v / v%
  • an extract containing an oligomeric proanthocyanidin having a high polymerization degree and an average polymerization degree of about 8 or more is usually obtained.
  • the average degree of polymerization of oligomeric proanthocyanidins is usually determined by dividing the number average molecular weight of oligomeric proanthocyanidins by the molecular weight of catechin (Mw 290).
  • the average degree of polymerization of the oligomeric proanthocyanidin can be determined by a known method. For example, the number average using GPC software (Shimadzu Corporation) etc.
  • the purification method of the present invention is also suitably used as a purification method for oligomeric proanthocyanidins having an average degree of polymerization of about 8 or more.
  • the alcohol concentration of the extraction solvent used in the extraction step is preferably about 30 to 70 v / v%. That is, it is preferable to use an alcohol aqueous solution having an alcohol concentration of about 30 to 70 v / v% as the extraction solvent.
  • the upper limit of the average degree of polymerization of the oligomeric proanthocyanidins extracted by the extraction step is usually about 10.
  • the alcohol concentration of the aqueous alcohol solution as the extraction solvent is about 30 to 60 v / v% in the extraction step. Further, considering the purity of the extracted oligomeric proanthocyanidins, the alcohol concentration of the aqueous alcohol solution as the extraction solvent is preferably about 30 to 50 v / v%, and preferably about 40 to 50 v / v%. More preferred. Within this concentration range, higher purity oligomeric proanthocyanidins can be obtained.
  • the alcohol concentration of the extraction solvent may be appropriately set depending on the raw material and the like.
  • the average polymerization degree is usually about 30 to 70 v / v% when the alcohol concentration of the extraction solvent is about 30 to 70 v / v Oligomeric proanthocyanidins that are about 8-10 are extracted.
  • the average degree of polymerization is usually about 8.5 to 10, more preferably about 8.5. ⁇ 9.5, more preferably about 8.7 to 9.5, is preferable because it can efficiently extract oligomeric proanthocyanidins.
  • an oligomeric proanthocyanidin having an average polymerization degree of about 9 or more is usually obtained when the alcohol concentration of the extraction solvent is about 40-60 v / v%, preferably about 50 v / v%. Extracted from raw materials.
  • oligomeric proanthocyanidins having an average polymerization degree of 9 or more are usually extracted from the raw materials when the alcohol concentration of the extraction solvent is about 40-60 v / v%.
  • the alcohol concentration of the extraction solvent is preferably about 40 to 60 v / v%.
  • the alcohol concentration of the extraction solvent is about 40 to 60 v / v%, an oligomeric proanthocyanidin having an average degree of polymerization of about 9 to 10 is usually extracted from the raw material.
  • the alcohol concentration of the extraction solvent is preferably about 40 to 50 v / v%.
  • the purification method of the present invention in the extraction step, about 30 to 70 v / v%, more preferably about 30 to 60 v / v%, further preferably about 30 to 50 v / v%, particularly preferably about 40 is used.
  • Extraction is performed using an aqueous ethanol solution of ⁇ 50 v / v% as an extraction solvent.
  • a high degree of polymerization usually having an average degree of polymerization of about 8 or more, preferably an average degree of polymerization of about 8.5 or more, more preferably about 8.7 or more in the extract.
  • high purity oligomeric proanthocyanidins are extracted.
  • Such a purification method is particularly suitable as a method for purifying oligomeric proanthocyanidins having an average degree of polymerization of 8 or more with high purity.
  • extraction is performed using an aqueous ethanol solution of about 40-50 v / v% as an extraction solvent.
  • a purification method is particularly preferable as a purification method for oligomeric proanthocyanidins having an average degree of polymerization of about 8 to 10.
  • the purification method of the present invention oligomeric proanthocyanidins having different degrees of polymerization can be extracted from the raw material depending on the alcohol concentration of the extraction solvent used in the extraction step. Therefore, the purification method of the present invention is useful as a method for extracting oligomeric proanthocyanidins having a desired degree of polymerization from raw materials with high purity.
  • the degree of polymerization of oligomeric proanthocyanidins in the resulting extract can be adjusted by appropriately setting the alcohol concentration of the extraction solvent used for extraction. Therefore, the purification method of the present invention is suitably applied to a method for adjusting the degree of polymerization of oligomeric proanthocyanidins in the extract.
  • a method for adjusting the degree of polymerization of oligomeric proanthocyanidins by setting the alcohol concentration of the extraction solvent and extracting oligomeric proanthocyanidins having the desired degree of polymerization is also included in the present invention.
  • the extraction step in the adjustment method and the preferred embodiment thereof are the same as the extraction step in the purification method described above.
  • the alcohol concentration of the extraction solvent is about 0 to 20 v / v%
  • oligomeric proanthocyanidins having an average degree of polymerization of less than about 5 to 8 are extracted from the raw material.
  • the average degree of polymerization of proanthocyanidins can be less than about 5-8.
  • the alcohol concentration of the extraction solvent is usually about 30 to 70 v / v%, preferably about 30 to 60 v / v%, more preferably about 30 to 50 v / v%
  • the average degree of polymerization from the raw material is about 8 or more.
  • Oligomeric proanthocyanidins are extracted. Thereby, the average degree of polymerization of oligomeric proanthocyanidins in the extract can be about 8 or more. Therefore, the degree of polymerization of the oligomeric proanthocyanidins in the extract can be adjusted to a desired range according to the alcohol concentration of the extraction solvent.
  • the average degree of polymerization of oligomeric proanthocyanidins in the extract is adjusted to less than about 5 to 8, or (B ) Adjustment to adjust the average degree of polymerization of oligomeric proanthocyanidins in the extract to about 8 or more by setting the alcohol concentration of the extraction solvent to about 30 to 60 v / v% (preferably about 30 to 50 v / v%).
  • the method is one of the preferred embodiments of the present invention.
  • the upper limit of the average degree of polymerization of the extracted oligomeric proanthocyanidins is usually about 10.
  • the purification method and the adjustment method of the present invention may appropriately include steps other than the extraction step.
  • the extract after the extraction step, the extract can be recovered by appropriate means such as filtration and centrifugation.
  • the recovered extract can be used as it is as a material for pharmaceuticals, cosmetics, foods and drinks, quasi drugs, etc., but if necessary, it can be subjected to treatments such as solvent removal, concentration of OPC, drying, and powdering. Good.
  • excipients used in the pharmaceutical or cosmetic field may be used as appropriate.
  • the oligomeric proanthocyanidins have a higher purity. Is obtained.
  • adsorbent ion exchange resin, adsorbent such as styrene / divinylbenzene, methacrylic acid, etc., hydrophilic vinyl polymer, modified dextran gel, polyacrylamide gel, reverse phase silica gel and the like are used.
  • the adsorbed fraction is recovered by elution with an eluent such as an aqueous alcohol solution or alcohol.
  • the eluent is preferably methanol, ethanol, propanol, acetone or the like.
  • the main component of the obtained fraction is oligomeric proanthocyanidins extracted from the raw material in the extraction process.
  • the obtained fraction containing oligomeric proanthocyanidins may be further subjected to treatment such as concentration, drying, and powdering, or may be a 1,3-butylene glycol solution or the like.
  • the fraction containing oligomeric proanthocyanidins obtained by the above purification method contains OPC with a specific degree of polymerization in high purity, has various physiological activities, and is a pharmaceutical product. It is suitably used for cosmetics, quasi-drugs, foods and drinks, and the like.
  • an excellent melanin production inhibitory effect, hyaluronidase inhibitory effect, and An extract or OPC fraction containing high-purity OPC having a collagenase inhibitory action can be obtained.
  • Such an extract and OPC fraction are useful for pharmaceuticals, cosmetics, foods and drinks, quasi drugs, etc. having a whitening action, a hyaluronidase inhibitory action, or a collagenase inhibitory action.
  • the purification method of the present invention is a method for purifying, preparing, or preparing an oligomeric proanthocyanidin having such excellent whitening action, hyaluronidase inhibitory action, and collagenase inhibitory action or a fraction containing the oligomeric proanthocyanidin in high purity. It is also suitably used as a production method.
  • a method for purifying oligomeric proanthocyanidins having an inhibitory action on melanin production is also included in the present invention.
  • the purification method of the present invention and preferred embodiments thereof are the same as the purification method of oligomeric proanthocyanidins having an average degree of polymerization of about 8 or more (preferably about 8 to 10).
  • the melanin production inhibitory action of the obtained oligomeric proanthocyanidins can be evaluated by a known method, for example, the method described in Examples.
  • Oligomeric proanthocyanidins having a melanin production inhibitory action obtained by the purification method of the present invention, and fractions containing the oligomeric proanthocyanidins in high purity are safe to the human body and have an excellent melanin production inhibitory effect. It is something that demonstrates.
  • An oligomeric proanthocyanidin obtained by the above purification method or an extract containing the oligomeric proanthocyanidin, a processed product (extract) thereof, a fraction, and the like are used as a melanin inhibitor or a whitening agent, and a skin external preparation for whitening. It is suitably used for cosmetics, foods and drinks, quasi drugs, and the like, and exhibits excellent effects such as prevention or suppression of the production of melanin pigments that cause stains and freckles.
  • a melanin production inhibitor or a whitening agent containing an oligomeric proanthocyanidin obtained by the above purification method as an active ingredient is also included in the present invention.
  • Extracts containing oligomeric proanthocyanidins obtained by the above purification method, processed products (extracts) of the extract, fractions containing oligomeric proanthocyanidins, etc. can be used as melanin production inhibitors or whitening agents as they are. Although it can be used, other components may be added and used.
  • melanin production is synonymous with melanin production.
  • Oligomeric proanthocyanidins as an active ingredient, the oligomeric proanthocyanidins comprising at least one grape-derived raw material selected from the group consisting of grape fruit, grape seed coat and grape seeds in an amount of about 30-60 v / v alcohol
  • An extract obtained by extraction in an aqueous solution or a hyaluronidase inhibitor contained in the extract is also one aspect of the present invention.
  • Oligomeric proanthocyanidins as an active ingredient, the oligomeric proanthocyanidins comprising at least one grape-derived raw material selected from the group consisting of grape fruit, grape seed coat and grape seeds in an amount of about 30-60 v / v alcohol
  • An extract obtained by extraction in an aqueous solution or a collagenase inhibitor contained in the extract is also one aspect of the present invention.
  • Hyaluronidase inhibitory action and collagenase inhibitory action can be evaluated by known methods.
  • the hyaluronidase inhibitory action can be evaluated by measuring the inhibition rate of hyaluronidase by the method described in Examples.
  • Collagenase inhibitory activity can be evaluated by, for example, the method described in the Examples or the method described in Yumi Maeda et al. (Food Hygiene Journal 31 (3), 233-237 (1990)).
  • the average degree of polymerization of the oligomeric proanthocyanidins is preferably about 8 or more, more preferably about 8 to 10, still more preferably about 8.5 to 10. Particularly preferably about 9-10. In another preferred embodiment, the average degree of polymerization of the oligomeric proanthocyanidins is about 8.5 to 9.5, more preferably about 8.7 to 9.5. If a polymer having an average degree of polymerization in such a range is included, even if oligomeric proanthocyanidins contain monomers, dimers, or other fragments, they have excellent hyaluronidase inhibitory activity and excellent collagenase inhibitory activity. Since it is obtained, it is preferable.
  • Oligomeric proanthocyanidins which are active ingredients of the hyaluronidase inhibitor and collagenase inhibitor of the present invention, are derived from at least one grape selected from the group consisting of grape fruits, grape seed coats and grape seeds as raw materials in the above purification method.
  • the extraction liquid or the extract obtained by setting the alcohol concentration of the aqueous alcohol solution as the extraction solvent in the extraction step to about 30 to 70 v / v%. More preferably, it is contained in an extract or extract obtained by setting the alcohol concentration of the aqueous alcohol solution to about 30 to 60 v / v%, more preferably about 30 to 50 v / v%, particularly preferably about 40 to 50 v / v%.
  • the preferable conditions for extraction are the same as the conditions for the purification method of oligomeric proanthocyanidins having an average degree of polymerization of about 8 or more (preferably about 8 to 10).
  • the extraction temperature is preferably about 30 to less than 100 ° C., preferably about 70 to less than 100 ° C., more preferably about 70 to 90 ° C., and particularly preferably about 70 to less than 90 ° C.
  • the alcohol is preferably ethanol.
  • the grape-derived raw material and preferred embodiments thereof are also the same as the grape-derived raw material used as the raw material for the purification method described above and preferred embodiments thereof.
  • the present invention also includes a hyaluronidase inhibitor containing an oligomeric proanthocyanidin having an average degree of polymerization of about 8 to 10 as an active ingredient.
  • Collagenase inhibitors containing oligomeric proanthocyanidins having an average degree of polymerization of about 8 to 10 as an active ingredient are also included in the present invention.
  • a polymer having an average degree of polymerization of about 8 to 10 is included, even if monomers, dimers, and other fragments are present in oligomeric proanthocyanidins, excellent hyaluronidase inhibitory activity, Collagenase inhibitory activity is obtained.
  • the oligomeric proanthocyanidins having an average degree of polymerization of about 8 to 10 are preferably contained in at least one grape-derived material selected from the group consisting of grape fruit, grape seed coat and grape seed.
  • the oligomeric proanthocyanidins contained in such grape-derived raw materials can be obtained from the raw materials by the purification method described above, for example.
  • the lower limit of the average degree of polymerization of the oligomeric proanthocyanidins is preferably about 8.5.
  • the oligomeric proanthocyanidins preferably have an average degree of polymerization of about 8.5 to 9.5, more preferably an average degree of polymerization of about 8.7 to 9.5.
  • Anthocyanidin preferably contains at least one grape-derived raw material selected from the group consisting of grape fruit, grape seed coat and grape seed, at a temperature of about 30 to less than about 70 to 100 ° C. It is contained in an extract or extract obtained by extraction in a 60 v / v% alcohol aqueous solution.
  • the preferable aspect etc. of extraction are the same as the preferable aspect in the said purification method mentioned above.
  • the grape-derived raw materials and preferred embodiments thereof are the same as those in the purification method described above.
  • the grape is particularly preferably a Cabernet Sauvignon.
  • the hyaluronidase inhibitor and collagenase inhibitor may contain other components in addition to the essential component oligomeric proanthocyanidins.
  • an extract containing an oligomeric proanthocyanidin obtained in the above extraction step or an extract can be used.
  • the extract for example, a concentrated extract, a dried product, a processed product such as a powder obtained by performing a process such as solvent removal, concentration of OPC, drying, and pulverization from the recovered extract is preferably used.
  • the extract or extract containing oligomeric proanthocyanidins obtained by the above purification method can be used as it is as a hyaluronidase inhibitor or collagenase inhibitor, but other components may be added and used.
  • the above hyaluronidase inhibitor, collagenase inhibitor, and the above-described melanin production inhibitor and whitening agent are suitably used as, for example, pharmaceuticals such as skin external preparations, quasi-drugs, and cosmetics.
  • pharmaceuticals such as skin external preparations, quasi-drugs, and cosmetics.
  • the dosage form is not particularly limited.
  • an ointment, cream, emulsion, lotion, cosmetic liquid, pack, It can be used as a bath agent, facial cleanser and the like.
  • the form thereof is not particularly limited.
  • skin cosmetics such as skin lotion, milky lotion, cosmetic liquid, cream, pack, etc .
  • makeup Makeup cosmetics such as base lotions, makeup base creams, powdery, liquid or creamy foundations
  • body cosmetics such as hand creams, leg creams, body lotions; facial cleansers, body soaps and the like.
  • the hyaluronidase inhibitor, the collagenase inhibitor, and the melanin production inhibitor and the whitening agent described above are, for example, compositions containing components and / or additives that are usually blended in skin external preparations and cosmetics as necessary. It may be.
  • the ingredients include whitening agents, moisturizers, antioxidants, oily ingredients, UV absorbers, surfactants, thickeners, alcohols, powder ingredients, colorants, water, various skin nutrients, antiseptics and bactericides. , Various components such as astringents and fragrances, additives and the like, and one or more of these can be appropriately blended as necessary.
  • the above-mentioned oligomeric proanthocyanidins or the extract or extract containing the oligomeric proanthocyanidins obtained by the above purification method, these normally used components, additives, etc. are appropriately added. It can mix
  • blending component in the present invention is not limited to the following, and components other than those listed below may be used for pharmaceuticals, cosmetics, quasi-drugs, etc.
  • Additives can be used.
  • whitening agents include 2,5-dihydroxybenzoic acid such as arbutin, kojic acid and its derivatives, hydroquinone derivatives, ellagic acid and its derivatives, tranexamic acid and its derivatives, resorcinol derivatives, cysteine and its derivatives, pine bark extract, etc. Derivatives, nicotine derivatives, ⁇ -hydroxy acids and the like.
  • humectants include polyhydric alcohols (glycerin, propylene glycol, dipropylene glycol, 1,3-butylene glycol, polyethylene glycol, etc.), saccharides (sorbitol, erythritol, trehalose, inositol, glucose, xylitol sucrose and derivatives thereof, dextrin.
  • polyhydric alcohols glycolin, propylene glycol, dipropylene glycol, 1,3-butylene glycol, polyethylene glycol, etc.
  • saccharides sorbitol, erythritol, trehalose, inositol, glucose, xylitol sucrose and derivatives thereof, dextrin.
  • mucopolysaccharides eg hyaluronic acid and derivatives thereof, chondroitin and derivatives thereof, heparin and derivatives thereof
  • elastin and derivatives thereof collagen and derivatives thereof, lactic acid, urea, higher fatty acid octyldodecyl , Seaweed extract, seafood-derived collagen and its derivatives, various amino acids and their derivatives (glycine, serine, aspartic acid, glutamic acid, arginine, theanine, pyrrolidone carbo Sodium acid etc.) and the like.
  • Antioxidants include, for example, vitamin E and its derivatives (dl- ⁇ ( ⁇ , ⁇ ) -tocopherol, dl- ⁇ -tocopherol acetate, nicotinic acid-dl- ⁇ -tocopherol, linoleic acid-dl- ⁇ -tocopherol, succinate Tocopherols such as acid dl- ⁇ -tocopherol and derivatives thereof, ubiquinones and the like, vitamin A and derivatives thereof (retinol palmitate, retinol acetate such as retinol, retinal such as dehydroretinal and derivatives thereof), carotenoid ( Carotene, lycopene, astaxanthin, etc.), vitamin B and its derivatives (thiamine hydrochloride, thiamine sulfate, riboflavin, riboflavin acetate, pyridoxine hydrochloride, pyridoxine dioctanoate, flavin adenine dinucle
  • oily components include olive oil, jojoba oil, castor oil, soybean oil, rice oil, rice germ oil, palm oil, palm oil, cacao oil, meadowweed oil, sheer butter, tea tree oil, avocado oil, macadamia nut oil, Plant-derived oils and fats such as plant-derived squalane; animal-derived oils and fats such as mink oil and turtle oil; waxes such as beeswax, canauba wax, rice wax, and lanolin; hydrocarbons such as liquid paraffin, petrolatum, paraffin wax, and squalane Fatty acids such as myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, isostearic acid, cis-11-eicosenoic acid; higher alcohols such as lauryl alcohol, cetanol, stearyl alcohol; isopropyl myristate, butyl oleate, 2 -Ethylhexidylglycera De, synthetic esters and synthetic t
  • ultraviolet absorbers examples include ethyl paraaminobenzoate, ethylhexyl paradimethylaminobenzoate, amyl salicylate and derivatives thereof, 2-ethylhexyl paramethoxycinnamate, octyl cinnamate, oxybenzone, 2,4-dihydroxybenzophenone, 2-hydroxy-4 -Methoxybenzophenone-5-sulfonate, 4-tertiarybutyl-4-methoxybenzoylmethane, 2- (2-hydroxy-5-methylphenyl) benzotriazole, urocanic acid, ethyl urocanate, aloe extract, etc. It is done.
  • surfactant examples include polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, polyethylene glycol fatty acid ester, polyglycerin fatty acid ester, polyoxyethylene glycerin fatty acid ester, polyoxyethylene Nonionic surfactants such as hydrogenated castor oil, polyoxyethylene sorbitol fatty acid ester, fatty acid alkanolamide; fatty acid salt, alkyl sulfate, alkylbenzene sulfonate, polyoxyethylene alkyl ether sulfate, polyoxyethylene fatty amine sulfate, Polyoxyethylene alkyl phenyl ether sulfate, polyoxyethylene alkyl ether phosphate, sodium N-lauroyl sarcosine, etc.
  • Nonionic surfactants such as hydrogenated castor oil, polyoxyethylene sorbitol fatty acid ester, fatty
  • Anionic surfactant quaternary ammonium salt, primary to tertiary fatty amine salt, trialkylbenzylammonium salt, alkylpyridinium salt, 2-alkyl-1-hydroxyethylimidazolinium salt, N, N-dialkyl morpho Cationic surfactants such as runium salts and polyethylene polyamine fatty acid amide salts; N, N-dimethyl-N-alkyl-N-carboxymethylammoniobetaine, N, N, N-trialkyl-N-alkyleneammoniocarboxybetaine And amphoteric surfactants such as N-acidaminopropyl-N ′, N′-dimethyl-N′- ⁇ -hydroxypropylammoniosulfobetaine and coconut oil fatty acid amidopropylbetaine.
  • thickeners include, for example, algaic acid, agar, carrageenan, fucoidan and other dry algae, green algae or red algae-derived components; pectin, locust bean gum, aloe polysaccharides and other polysaccharides; xanthan gum, tragacanth gum, guar gum and other gums; Cellulose derivatives such as methyl cellulose and hydroxyethyl cellulose; synthetic polymers such as polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, carboxyvinyl polymer, acrylic acid / methacrylic acid copolymer; hyaluronic acid and derivatives thereof; polyglutamic acid and derivatives thereof.
  • alcohols examples include ethanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, 2-butanol, butylene glycol, lauryl alcohol, cetyl alcohol, stearyl alcohol, lanolin alcohol, hydrogenated lanolin alcohol, oleyl alcohol, hexadecyl alcohol, 2 -Octyldodecanol, glycerin, sorbitol, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, ethylene glycol and polymers thereof.
  • powder components include sericite, titanium oxide, talc, kaolin, bentonite, zinc oxide, magnesium carbonate, magnesium oxide, zirconium oxide, barium sulfate, silicic anhydride, mica, nylon powder, polyethylene powder, silk powder, cellulose System powder, powder of cereals (rice, wheat, corn, millet, etc.), powder of beans (soybean, red beans, etc.), and the like.
  • colorants include anhydrous silicic acid, magnesium silicate, talc, kaolin, bentonite, mica, titanium mica, bismuth oxychloride, zirconium oxide, magnesium oxide, zinc oxide, titanium oxide, calcium carbonate, magnesium carbonate, yellow iron oxide , Bengala, Black iron oxide, Gunjo, Chrome oxide, Chromium hydroxide, Carbon black, Calamine, and other inorganic pigments; Red cabbage dye, red rice dye, Akane dye, Anato dye, Ikumi dye, Turmeric dye, Enju dye, etc. And pigments.
  • Examples of various skin nutrients include various vitamins (vitamins A, B, D, E, etc.) and derivatives thereof, ribonucleic acid and salts thereof, deoxyribonucleic acid and salts thereof, ⁇ - and ⁇ -linolenic acid, xanthine and derivatives thereof ( Caffeine, etc.), amino acids and derivatives thereof (serine, glutamic acid, theanine, hydroxyproline, pyrrolidone carboxylic acid, etc.), docosahexaenoic acid and derivatives thereof, eicosapentaenoic acid and derivatives thereof, animal extracts (mollusk extracts such as squid) Shell extract, shellfish extract, fish extract, chicken crown extract, royal jelly, silk protein and its degradation products, placenta extract, serum deproteinization extract, lactoferrin or its degradation products), yeast extract, microbial fermentation And metabolites (metabolites such as lactic acid bacteria and bifidobacteria).
  • vitamins vitamins
  • antiseptic / bactericides examples include urea; paraoxybenzoates such as methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, propyl paraoxybenzoate, butyl paraoxybenzoate; dibutylhydroxytoluene, phenoxyethanol, dichlorophene, chlorhexidine hydrochloride, Examples include benzalkonium, salicylic acid, ethanol, undecylenic acid, phenols, isopropylmethylphenol, 1,2-pentanediol, various essential oils, and bark dry distillate.
  • astringents include zinc chloride, zinc sulfate, zinc oxide, succinic acid, allantoin, calamine, zinc p-phenolsulfonate, potassium aluminum sulfate, resorcin, ferric chloride, menthol and the like.
  • the blending amount in the external preparation for skin and cosmetics is preferably about 0.000006 to 1% by mass, more preferably about 0.0000125 to 0.5% by mass, and about 0.0001 to 0.01% as oligomeric proanthocyanidins. Is more preferably about 0.0005 to 0.0025 mass%.
  • the method of using the hyaluronidase inhibitor and collagenase inhibitor of the present invention, and the above-described melanin production inhibitor and whitening agent differ depending on the condition of the skin to be used, but may be, for example, the following method. That is, an appropriate amount (for example, about 0.05 to 2 g) may be applied to the skin several times a day (for example, about 1 to 5 times, preferably about 1 to 3 times).
  • the daily use amount of oligomeric proanthocyanidins (preferably, oligomeric proanthocyanidins having an average degree of polymerization of about 8 to 10) is preferably about 0.00025 to 0.25 mg, more preferably about 0.005 to 0. What is necessary is just to apply
  • the application period is not particularly limited.
  • the hyaluronidase inhibitor and collagenase inhibitor of the present invention are safe for the human body and exhibit excellent hyaluronidase inhibition or collagenase inhibitory effects.
  • the inhibitor of the present invention is suitably used for skin external preparations or cosmetics for preventing or suppressing wrinkles and sagging, skin external preparations or cosmetics for preventing or preventing aging, and preventing or suppressing wrinkles and sagging, Demonstrates excellent effects in preventing or preventing skin aging.
  • grape pressed products obtained in the white wine production process that is, squeezed grapes after pressing fruit juice from grape fruits (grape skin and seeds) were used as grape pressed products for white wine.
  • a red wine grape press product the grape press product obtained in the red wine production process, that is, a fermented crushed liquid (fruit juice including fruit, skin and seeds) is fermented, and then the fermented liquid is compressed.
  • Juice koji fruit skin and seeds
  • the resulting concentrated solution was filtered through diatomaceous earth, and the filtrate was passed through a column filled with acrylic resin Amberlite XAD (registered trademark) -7HP (organo corporation, 100 mL), and then water (200 mL) was passed through. The excess sugars and organic acids were removed (the sugars and organic acids were eluted). Thereafter, polyphenol was eluted from the column using a 70% aqueous ethanol solution (400 mL) as an eluent. The obtained eluate was concentrated under reduced pressure, and then subjected to lyophilization to obtain 1.62 g of white wine grape-derived proanthocyanidin fraction 1.
  • the extract was subjected to centrifugation (3000 rpm, 5 minutes), and the supernatant was passed through a column packed with acrylic resin Amberlite XAD (registered trademark) -7HP (organo, 20 mL). Water (40 mL) was passed through to remove excess saccharide and organic acid (the saccharide and organic acid were eluted). Thereafter, polyphenol was eluted from the column using a 70% aqueous ethanol solution (80 mL) as an eluent. The obtained eluate was concentrated under reduced pressure and then freeze-dried to obtain 46 mg of red wine grape-derived proanthocyanidin fraction 1.
  • Amberlite XAD registered trademark
  • -7HP organic acid
  • Grape-derived proanthocyanidins were extracted and purified using the pressed products of grapes of the following varieties.
  • White wine grape pressing product, Chardonnay pressing product (white wine grape pressing product used in Preparation Example 1) ⁇ Koshu pressed (Koshu peel and seeds) Red wine grape press, Cabernet Sauvignon press (red wine grape press used in Preparation Example 2) ⁇ Concord press (concord skin and seeds) ⁇ Merlot pressed products (Merlot peel and seeds) ⁇ Muscat berry A pressed product (Muscat berry A peel and seeds)
  • Grape press obtained from the wine making process Chardonnay, Cabernet Sauvignon, Concord, Merlot, Muscat Berry A, and Koshu peels and seeds are added 15 times the amount of water as an extraction solvent, and at 80 ° C for 1 hour Heat extraction was performed, and this hot water extract was filtered through a nylon mesh (manufactured by Nihon Riken Kikai Co., Ltd., trade name: NRS-200) to obtain extract 1. Further, the residue after filtration is again extracted and filtered under the same conditions, and the obtained extract 2 is combined with the previous extract 1 and then filtered through diatomaceous earth, and the filtrate is Amberlite XAD (registered trademark).
  • the mobile phase includes water (3 times the amount of CV), 20% aqueous ethanol solution (3 times the amount of CV), 35% aqueous solution of ethanol (3 times the amount of CV), 55% aqueous ethanol solution (3 times the amount of CV), A 75% aqueous ethanol solution (three times the amount of CV) and a 70% aqueous acetone solution (three times the amount of CV) were used in this order.
  • Evaluation method The evaluation method of the wine grape press-derived proanthocyanidin fraction prepared above is shown below.
  • the obtained reaction solution was analyzed under the analysis conditions of high performance liquid chromatography described below, and after quantifying the amount of cyanidin contained in the reaction solution, the purity of oligomeric proanthocyanidin was calculated according to the formula shown below.
  • Proanthocyanidin B-1 (PB-1, Funakoshi Co., Ltd .: NIU-N210) was used as a standard substance.
  • the average degree of polymerization of the oligomeric proanthocyanidins was calculated from the measurement results obtained by the above HPLC using GPC software (Shimadzu Corporation), and the obtained number average molecular weight was calculated as the molecular weight of catechin (Mw 290). Divided by and calculated.
  • Hyaluronidase Inhibition Test The hyaluronidase inhibition test for wine-derived oligomeric proanthocyanidins was modified from the literature (Yumie Maeda et al., Food Hygiene Journal 31 (3), 233-237 (1990)). It carried out by the method of. Hyaluronic acid is broken down into N-acetylhexosamine by hyaluronidase. Hyaluronidase inhibitory activity was measured by quantifying the N-acetylglucosamine at the reducing end by absorbance with a p-dimethylaminobenzaldehyde (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., hereinafter abbreviated as p-DAB) label.
  • p-DAB p-dimethylaminobenzaldehyde
  • Inhibition rate (%) ⁇ 1- (ab) / (cd) ⁇ ⁇ 100
  • Collagenase inhibition test of wine grape-derived oligomeric proanthocyanidins was modified from the method of the literature (Wunsch et al., Hoppe Seylers Z Physiol Chem., 333, 149-51 (1963)), and the following method was used. Carried out.
  • Collagenase inhibition rate (%) ⁇ 1 ⁇ (a ⁇ b) / (c ⁇ d) ⁇ ⁇ 100 a: Absorbance after 30 minutes of reaction when adding sample b: Absorbance after 0 minute of reaction when adding sample c: Absorbance after 30 minutes of reaction without addition of sample d: Absorbance after 30 minutes of reaction without addition of sample In the above formula, When the activity is completely inhibited, the collagenase inhibition rate (%) is 100%. It can be said that a compound showing a high “inhibition rate (%)” has a higher activity as an inhibitor.
  • Test example 1 Regarding the proanthocyanidin fractions 1 to 6 derived from white wine grapes prepared in Preparation Example 1, the efficacy and the like were evaluated by the above evaluation method, and the results shown in Table 1 were obtained.
  • proanthocyanidin fraction derived from white wine grapes extracted with 30-50% aqueous ethanol solution has a high melanin production inhibitory effect.
  • the activity was correlated with the purity of the oligomeric proanthocyanidins contained and the degree of polymerization. It was also found that when extraction was performed with a 30% to 50% aqueous ethanol aqueous solution, oligomeric proanthocyanidins having a high degree of polymerization contained in the raw material could be extracted with high yield and high purity.
  • Test example 2 For the red wine grape-derived proanthocyanidins fractions 1 to 8 prepared in Preparation Example 2, the efficacy and the like were evaluated by the above evaluation methods, and the results shown in Table 2 were obtained.
  • proanthocyanidin fraction derived from red wine grapes extracted with 30% -60% aqueous ethanol solution has a high melanin production inhibitory effect and hyaluronidase inhibitory effect. It was found that extraction with a 30% to 60% aqueous ethanol solution can extract the oligomeric proanthocyanidins having a high degree of polymerization contained in the raw material with high yield and high purity.
  • Test example 3 For the wine grape-derived proanthocyanidin fraction prepared in Preparation Example 3, the efficacy and the like were evaluated by the above evaluation methods, and the results shown in Table 3 were obtained.
  • the melanin production suppression and hyaluronidase inhibitory activities of the various grape-derived proanthocyanidins examined in this study were proportional to the purity or degree of polymerization of oligomeric proanthocyanidins. Among them, it was found that the grape-derived proanthocyanidin fraction obtained from Chardonnay, Cabernet Sauvignon, and Koshu has a high beauty effect.
  • Test example 4 For the wine grape-derived proanthocyanidin fraction prepared in Preparation Example 4, efficacy and the like were evaluated by the above evaluation methods, and the results shown in Tables 4 and 5 were obtained. The results of the Chardonnay-derived proanthocyanidin fraction are shown in Table 4, and the results of the Cabernet Sauvignon-derived proanthocyanidin fraction are shown in Table 5. The transfer rates in Tables 4 and 5 are the simple phenol fraction, catechin / epicatechin fraction, low molecular OPC fraction and high molecular OPC fraction contained in the wine grape-derived proanthocyanidin fraction prepared in Preparation Example 4.
  • the grape-derived proanthocyanidins fraction extracted with aqueous ethanol aqueous solution of 30 v / v% to 60 v / v%, preferably 30 v / v% to 50 v / v% is rich in oligomeric proanthocyanidins having a high degree of polymerization
  • the solvent to be extracted is important for obtaining an oligomeric proanthocyanidin having a high cosmetic effect with high purity.
  • an oligomeric proanthocyanidin was efficiently extracted, and an extract containing a large amount of oligomeric proanthocyanidins having a high degree of polymerization was obtained.
  • Test Example 5 The red wine grape-derived proanthocyanidins fractions 1 to 8 prepared in Preparation Example 2 were adjusted to 800 ⁇ g / mL of a 10% DMSO solution, and the collagenase inhibitory activity of each fraction was determined according to the evaluation method of (5) collagenase inhibition test. The results shown in Table 6 were obtained.
  • the collagenase inhibition rate shown in Table 6 is a value obtained from the above-described formula for calculating the collagenase inhibition rate.
  • the collagenase inhibition rate of the positive control (IP304) (value obtained from the above formula for calculating the collagenase inhibition rate) was 71.1%.
  • Test Example 6 The wine-derived wine-derived proanthocyanidin fraction prepared in Preparation Example 3 was adjusted to 800 ⁇ g / mL of a 10% DMSO solution, and the collagenase inhibitory activity of each fraction was evaluated according to the evaluation method of (5) collagenase inhibition test. And the results shown in Table 7 were obtained.
  • the collagenase inhibition rate shown in Table 7 is a value obtained from the above-described calculation formula for the collagenase inhibition rate.
  • the collagenase inhibition rate of the positive control (IP304) (value obtained from the above formula for calculating the collagenase inhibition rate) was 84.0%.
  • Test Example 7 The cabernet sauvumble-derived proanthocyanidin fraction prepared in Preparation Example 4 was adjusted to an 800 ⁇ g / mL 10% DMSO solution, and the collagenase inhibitory activity of each fraction was evaluated by the above (5) evaluation method for collagenase inhibition test. The results shown in Table 8 were obtained.
  • the collagenase inhibition rate shown in Table 8 is a value obtained from the above-described formula for calculating the collagenase inhibition rate.
  • the collagenase inhibition rate of the positive control (IP304) (the value obtained from the above formula for calculating the collagenase inhibition rate) was 84.6%.
  • the migration rate in Table 8 is the same as the migration rate in Table 5.
  • a grape-derived proanthocyanidin fraction extracted with a water-containing ethanol aqueous solution of 30 v / v% to 60 v / v%, preferably 30 v / v% to 50 v / v% is rich in oligomeric proanthocyanidins having a high degree of polymerization. And showed high collagenase inhibitory activity.
  • oligomeric proanthocyanidins useful in the fields of foods, drinks, cosmetics, and pharmaceuticals can be purified with high purity.
  • the oligomeric proanthocyanidins obtained by the purification method of the present invention have excellent whitening action, hyaluronidase inhibitory action, and collagenase inhibitory action, and are useful in the fields of cosmetics, pharmaceuticals and the like.

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Abstract

　重合度の異なる複数種のオリゴメリックプロアントシアニジンを含有する原料を、水又はアルコール水溶液を抽出溶媒として抽出する抽出工程を含み、該抽出工程において、目的とするオリゴメリックプロアントシアニジンの重合度に応じて該抽出溶媒のアルコール濃度を設定し、目的の重合度のオリゴメリックプロアントシアニジンを抽出するオリゴメリックプロアントシアニジンの精製方法。

Description

オリゴメリックプロアントシアニジンの精製方法、重合度の調整方法並びにヒアルロニダーゼ阻害剤及びコラゲナーゼ阻害剤
　本発明は、重合度の異なるオリゴメリックプロアントシアニジンを含有する原料から、美白効果等が高いオリゴメリックプロアントシアニジンを得るための精製方法、オリゴメリックプロアントシアニジンの重合度の調整方法、並びにオリゴメリックプロアントシアニジンを有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤及びコラゲナーゼ阻害剤等に関する。
　美白、肌荒れの改善などの美容効果を得る目的で、皮膚外用剤、化粧品が広く用いられている。美白作用等を有する種々の物質が知られているが、合成品は、長期に人間の皮膚に使用した場合に安全性の問題があることが多いことから、天然由来の成分で効果が高いものが求められている。
　オリゴメリックプロアントシアニジン（以下、単に「プロアントシアニジン」、又は「ＯＰＣ」ともいう）は、ブドウ、リンゴ、カカオ等の植物に多く含まれるポリフェノールの一種であり、「縮合型タンニン」又は「フラバン－３－オール重合物」とも称されている化合物である。ＯＰＣの構造は、一般に、フラバン－３－オールを構成単位とし、フラバン－３－オールが４－６位又は４－８位で縮合又は重合する結合様式をとっている。このように、ＯＰＣとは、上記結合様式に従い縮合又は重合した、２量体以上の重合体の総称である。
　ＯＰＣには、抗酸化作用、美白作用等の様々な生理活性を持つものがあることが報告されている。例えば特許文献１には、コンコード赤ブドウの果実粉砕物に精製水を加え、５０～６０℃で２４時間抽出した抽出物から得られたブドウ抽出物が、チロシナーゼ活性阻害作用及び活性酸素消去作用を有していたことが記載されている。特許文献２には、重合度が１２の縮合型タンニンが、美白作用及びチロシナーゼ活性阻害効果を示すことが記載されている。特許文献３には、ワインかすエタノール抽出物がメイラード反応阻害活性を示したこと、該抽出物にカテキン、プロシアニジンＢ及びプロシアニジンＣが含まれていたことが記載されている。特許文献４には、プロアントシアニジンを含むメイラード反応阻害剤が開示されている。特許文献５及び６には、ワイン製造からの残留物及びその抽出物を、抗炎症剤、酸化防止剤、肌若返り剤等の化粧品配合物及び／又は医薬品配合物製造用の活性物質組成物に使用することが記載されている。
　これらの生理活性とＯＰＣの重合度との活性相関に関しては、十分に解明されていないことが多いが、例えば美白作用については、重合度が約１２のＯＰＣが効果が高いことが報告されている（特許文献２）。従って、所望の生理活性を有するＯＰＣを高純度で調製することができる技術が求められている。
　植物原料からのＯＰＣの分離精製は、通常熱水又は有機溶媒でブドウ等の植物原料を抽出することにより行われている。しかしながら、抽出において重合度数に無関係にプロアントシアニジン混合物が抽出されるため、得られた抽出液から目的とする生理活性を有するＯＰＣを高純度で分離及び精製することが困難であった。このため、原料からより簡便に、効率よく、かつ高純度で所望の生理活性を有するＯＰＣを調製する方法が求められている。
　また、加齢に伴い発生するしわ及びたるみ等を予防又は改善することは、美容上の重要な課題である。代表的な皮膚の老徴であるしわ、たるみの原因は未だ完全に解明されていないが、原因の１つとして、加齢により組織中のヒアルロン酸量が減少し、それに伴い、皮膚のみずみずしさが失われていくことが挙げられる。このため、ヒアルロン酸を分解するヒアルロニダーゼの活性を阻害することは、皮膚真皮中のヒアルロン酸量を維持し、みずみずしくハリのある肌を保つために有効である。また、皮膚中のコラーゲンの減少は、皮膚のしわやたるみを引き起す主な原因であると考えられている。コラゲナーゼは、コラーゲンの分解に関与する酵素であり、皮膚の弾性の低下やしわの発生などに関与する。
　従って、ヒアルロニダーゼ及びコラゲナーゼの活性を抑制することは、皮膚に弾力性やハリを与え、皮膚の老化防止のために重要である。例えば特許文献７には、プロアントシアニジンの構成単量体あたりの没食子酸付加率が１０％（モル比）以下であるプロアントシアニジンを有効成分として含有するコラゲナーゼ阻害剤や肌質改善剤が開示されている。また、特許文献８には、ブドウ種子及び／又はブドウ搾汁粕の抽出物を有効成分として含有するヒアルロニダーゼ阻害剤が開示されている。しかしながら、ヒアルロニダーゼ及びコラゲナーゼに対してより優れた阻害効果を有し、しわやたるみ等の肌の老化をより効果的に改善できる安全性の高い化粧品等が求められている。
特開２００５－２９４９０号公報 特開平１０－２３６９４３号公報 特開２００６－２５６９７７号公報 特開平６－３３６４３０号公報 特表２００３－５１８０２６号公報 特表２００３－５２７８４３号公報 再表０１－３２１３１号公報 特開２０００－２６３０６号公報
　本発明の目的は、上記課題に鑑み、美白作用等の種々の生理活性を有するオリゴメリックプロアントシアニジン（ＯＰＣ）を、簡便な操作で、高純度で原料から分離（抽出）及び精製することができる精製方法を提供することである。本発明はまた、原料からＯＰＣを抽出する際に、抽出液中のＯＰＣの重合度を調整する方法を提供することを目的とする。本発明はさらに、前記精製方法により得られるＯＰＣを有効成分とする、安全性が高く、しかも優れた効果を発揮するメラニン生成抑制剤、ヒアルロニダーゼ阻害剤、及び優れた効果を発揮するコラゲナーゼ阻害剤等を提供することも目的とする。
　本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意研究した結果、複数種のＯＰＣを含む原料からＯＰＣを抽出する際に、抽出溶媒中のアルコール濃度によって、異なる重合度のＯＰＣが抽出されることを見出した。例えば、抽出溶媒中のアルコール濃度が約３０～７０ｖ／ｖ％であれば、重合度の高いＯＰＣが抽出された。一方、抽出溶媒中のアルコール濃度が３０ｖ／ｖ％未満、例えば約２０ｖ／ｖ％以下では、重合度の低いＯＰＣが抽出された。より具体的には、３０～７０ｖ／ｖ％程度のアルコール水溶液を用いて抽出を行うと、平均重合度が８以上となるＯＰＣが抽出された。また、約２０ｖ／ｖ％以下のアルコール水溶液を用いて抽出を行うと、平均重合度が８未満となるＯＰＣが抽出された。このように、抽出溶媒中のアルコール濃度によって、抽出されるＯＰＣの重合度が異なることは、驚くべき知見であった。このような方法によれば、各種の生理活性を有するＯＰＣを収率よく、かつ高純度で、しかも簡便に調製することができる。また、抽出に用いる溶媒のアルコール濃度を調整することによって、得られる抽出液中のＯＰＣの重合度を調整できる。
　本発明者らはまた、上記精製方法によりブドウ由来の原料から得られるＯＰＣが、メラニン生成抑制作用、ヒアルロニダーゼ阻害作用及びコラゲナーゼ阻害作用を有すること、さらに、ＯＰＣの重合度が高いほどこれらの作用が強いことを見出した。例えば、約３０～６０ｖ／ｖ％、特に約３０～５０ｖ／ｖ％のアルコール水溶液を用いて抽出されたＯＰＣは、純度が特に高く、高いメラニン生成抑制効果、ヒアルロニダーゼ阻害効果及びコラゲナーゼ阻害効果を発揮した。例えばヒアルロニダーゼ、及びコラゲナーゼは、しわ、たるみ及び皮膚の老化に関与しており、これらの酵素に対して強い阻害活性を有するＯＰＣは、しわ、たるみ防止効果、及び老化防止効果が高い化粧品等として有用である。
　本発明者らは、上記知見に基づきさらに研究を重ね、本発明を完成させた。
　すなわち本発明は、以下の（１）～（２５）に関する。
（１）重合度の異なる複数種のオリゴメリックプロアントシアニジンを含有する原料を、水又はアルコール水溶液を抽出溶媒として抽出する抽出工程を含み、該抽出工程において、目的とするオリゴメリックプロアントシアニジンの重合度に応じて該抽出溶媒のアルコール濃度を設定し、目的の重合度のオリゴメリックプロアントシアニジンを抽出することを特徴とするオリゴメリックプロアントシアニジンの精製方法。
（２）抽出温度が、７０～１００℃未満である前記（１）に記載の方法。
（３）アルコールがエタノールである前記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）精製方法が、（Ａ）平均重合度が５～８未満のオリゴメリックプロアントシアニジンの精製方法である、又は（Ｂ）平均重合度が８以上のオリゴメリックプロアントシアニジンの精製方法である前記（１）～（３）のいずれか一項に記載の方法。
（５）（Ａ）精製方法が、平均重合度が５～８未満のオリゴメリックプロアントシアニジンの精製方法であり、抽出溶媒のアルコール濃度を０～２０ｖ／ｖ％とする、又は（Ｂ）精製方法が、平均重合度が８以上のオリゴメリックプロアントシアニジンの精製方法であり、抽出溶媒のアルコール濃度を３０～６０ｖ／ｖ％とする前記（１）～（４）のいずれか一項に記載の方法。
（６）精製方法が、平均重合度が８～１０のオリゴメリックプロアントシアニジンの精製方法であり、抽出溶媒が４０～５０ｖ／ｖ％のエタノール水溶液である前記（１）～（５）のいずれか一項に記載の方法。
（７）重合度の異なる複数種のオリゴメリックプロアントシアニジンを含有する原料が、植物由来である前記（１）～（６）のいずれか一項に記載の方法。
（８）植物由来の原料が、ブドウ果実、ブドウ種皮及びブドウの種子からなる群より選択される少なくとも１種のブドウ由来の原料である前記（７）に記載の方法。
（９）ブドウ果実、ブドウ種皮及びブドウの種子からなる群より選択される少なくとも１種のブドウ由来の原料を、７０～１００℃未満で３０～６０ｖ／ｖ％のアルコール水溶液中で抽出する抽出工程を含むことを特徴とするメラニン生成抑制作用を有するオリゴメリックプロアントシアニジンの精製方法。
（１０）オリゴメリックプロアントシアニジンを有効成分とし、該オリゴメリックプロアントシアニジンが、ブドウ果実、ブドウ種皮及びブドウの種子からなる群より選択される少なくとも１種のブドウ由来の原料を３０～６０ｖ／ｖ％のアルコール水溶液中で抽出して得られる抽出液、又は抽出物に含有されるものであることを特徴とするヒアルロニダーゼ阻害剤。
（１１）抽出温度が、７０～１００℃未満である前記（１０）に記載のヒアルロニダーゼ阻害剤。
（１２）オリゴメリックプロアントシアニジンを有効成分とし、該オリゴメリックプロアントシアニジンが、ブドウ果実、ブドウ種皮及びブドウの種子からなる群より選択される少なくとも１種のブドウ由来の原料を３０～６０ｖ/ｖ％のアルコール水溶液中で抽出して得られる抽出液、又は抽出物に含有されるものであることを特徴とするコラゲナーゼ阻害剤。
（１３）抽出温度が、７０～１００℃未満である前記（１２）に記載のコラゲナーゼ阻害剤。
（１４）アルコールがエタノールである前記（１０）～（１３）のいずれか一項に記載の阻害剤。
（１５）アルコール水溶液が、４０～５０ｖ／ｖ％のエタノール水溶液である前記（１０）～（１４）のいずれか一項に記載の阻害剤。
（１６）オリゴメリックプロアントシアニジンの平均重合度が、８～１０である前記（１０）～（１５）のいずれか一項に記載の阻害剤。
（１７）平均重合度が８～１０のオリゴメリックプロアントシアニジンを有効成分とすることを特徴とするヒアルロニダーゼ阻害剤。
（１８）平均重合度が８～１０のオリゴメリックプロアントシアニジンを有効成分とすることを特徴とするコラゲナーゼ阻害剤。
（１９）オリゴメリックプロアントシアニジンが、ブドウ果実、ブドウ種皮及びブドウの種子からなる群より選択される少なくとも１種のブドウ由来の原料に含まれるものである前記（１７）又は（１８）に記載の阻害剤。
（２０）オリゴメリックプロアントシアニジンの平均重合度が８．５～９．５である前記（１７）～（１９）のいずれか一項に記載の阻害剤。
（２１）オリゴメリックプロアントシアニジンが、ブドウ果実、ブドウ種皮及びブドウの種子からなる群より選択される少なくとも１種のブドウ由来の原料を、７０～１００℃未満で３０～６０ｖ／ｖ％のアルコール水溶液中で抽出して得られる抽出液、又は抽出物に含まれるものである前記（１７）～（２０）のいずれか一項に記載の阻害剤。
（２２）ブドウが、カベルネ・ソーヴィニヨンである前記（１９）～（２１）のいずれか一項に記載の阻害剤。
（２３）皮膚外用剤又は化粧品である前記（１０）～（２２）のいずれか一項に記載の阻害剤。
（２４）重合度の異なる複数種のオリゴメリックプロアントシアニジンを含有する原料を、水又はアルコール水溶液を抽出溶媒として抽出する抽出工程を含み、該抽出工程において、目的とするオリゴメリックプロアントシアニジンの重合度に応じて該抽出溶媒のアルコール濃度を設定し、目的の重合度のオリゴメリックプロアントシアニジンを抽出することを特徴とするオリゴメリックプロアントシアニジンの重合度の調整方法。
（２５）
　（Ａ）抽出溶媒のアルコール濃度を０～２０ｖ／ｖ％とすることにより、抽出液中のオリゴメリックプロアントシアニジンの平均重合度を５～８未満に調整する、又は（Ｂ）抽出溶媒のアルコール濃度を３０～６０ｖ／ｖ％とすることにより、抽出液中のオリゴメリックプロアントシアニジンの平均重合度を８以上に調整する前記（２４）に記載の方法。
　本発明の精製方法によれば、優れた美白作用等の生理活性を示すＯＰＣを、原料から簡便に、しかも高収率かつ高純度で分離及び精製することができる。このような方法により精製されたＯＰＣは、高純度であることから、医薬品、化粧品、飲食品、医薬部外品等の材料として用いると、その医薬品、化粧品、飲食品、医薬部外品等の機能性を向上させるのに有用である。例えば本発明の精製方法において、ブドウ由来の原料から、抽出溶媒に約３０～６０ｖ／ｖ％のアルコール水溶液を用いて得られるＯＰＣは、優れたヒアルロニダーゼ阻害作用、コラゲナーゼ阻害作用、メラニン生成抑制作用等を有することから、優れたしわ、たるみ防止効果、老化防止効果、美白効果等を発揮するものであり、皮膚外用剤、化粧品、医薬部外品等に好適に用いられる。
　また、本発明によれば、安全性が高く、しかも優れたメラニン生成抑制作用を発揮するメラニン生成抑制剤、ヒアルロニダーゼ阻害効果を発揮するヒアルロニダーゼ阻害剤、及び優れたコラゲナーゼ阻害効果を発揮するコラゲナーゼ阻害剤を提供することができる。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明のオリゴメリックプロアントシアニジンの精製方法は、重合度の異なる複数種のオリゴメリックプロアントシアニジンを含有する原料を、水又はアルコール水溶液を抽出溶媒として抽出する抽出工程を含む。
　本発明の方法は、本発明の効果を奏することになる限り、抽出工程以外の工程を含んでもよい。
　重合度の異なる複数種のオリゴメリックプロアントシアニジンを含有する原料として、植物由来の原料が好ましく、例えば、ブドウ、カカオ、リンゴ、松、アロニア、ライチ、等の植物の果実、果皮、種子、殻、葉、樹皮、及びその処理物等が挙げられる。これらは、単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせてもよい。本発明に用いられる原料は、これらの植物の処理物であってもよい。処理物として、例えば、粉砕物、破砕物、摩砕物、乾燥物、凍結乾燥物、圧搾物、その濃縮物、又は圧搾後の固形分等が挙げられる。
　本発明における原料は、ブドウ由来の原料が好ましく、例えば、ブドウ果実、ブドウ種皮及びブドウの種子からなる群より選択される少なくとも１種のブドウ由来の原料等がより好ましい。ブドウは、例えば、ワインの原料となる品種が好ましく、例えば、シャルドネ、甲州等の白ワインの原料となるブドウ；カベルネ・ソーヴィニヨン、コンコード、メルロー、マスカットベリーＡ等の赤ワインの原料となるブドウ等が挙げられる。中でも、赤ワインの原料となるブドウが好ましく、カベルネ・ソーヴィニヨン、メルロー等がより好ましく、カベルネ・ソーヴィニヨンがさらに好ましい。本発明における原料として、例えば、赤ワイン又は白ワイン製造において生成するブドウ果実の圧搾物（搾汁粕）等も好適に使用される。赤ワインの製造において生成するブドウ果実の圧搾物とは、通常赤ワイン製造工程において、ブドウ果実を破砕し、果肉、果皮及び種子を含む果汁（ブドウ破砕物）を発酵させた後、得られる発酵液を圧搾した後の搾汁粕（果皮及び種子）等である。白ワインの製造において生成する圧搾物とは、通常白ワイン製造工程において、ブドウ果実から果汁を圧搾した後の搾汁粕（ブドウの果皮及び種子）等である。中でも、本発明における原料として、赤ワインの製造において生成するブドウ果実の圧搾物（搾汁粕）が好適に用いられる。より好ましくは、カベルネ・ソーヴィニヨン、メルロー等のブドウ果実の圧搾物であり、さらに好ましくはカベルネ・ソーヴィニヨンのブドウ果実の圧搾物である。ワイン製造において生成するブドウ圧搾物を原料とすると、本来廃棄物として処分されるブドウ圧搾物を有効利用することができる点からも好ましい。
　本発明における抽出溶媒は、水又はアルコール水溶液である。アルコールは、通常炭素数１～４程度の低級アルコールであり、例えば、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール、２－ブタノール、ブチレングリコール等が挙げられる。これらは１種又は２種以上用いることができる。中でも、エタノールが好適に用いられる。
　抽出工程における抽出は、通常、原料に、抽出溶媒として、水又は所定の濃度のアルコール水溶液を添加して行われる。抽出工程においては、原料が抽出溶媒中に浸漬していることが好ましく、適宜撹拌、振とう等の操作を行ってもよい。抽出は、通常バッチ式又は連続式で行われるが、バッチ式が好ましい。
　抽出工程における原料と抽出溶媒との割合は特に限定されないが、例えば、重量比で原料１に対して抽出溶媒を５～３０程度とすることが好ましく、５～１５程度とすることがより好ましく、５～１０程度とすることがさらに好ましい。
　本発明の精製方法において、抽出工程における抽出温度は、約３０～１００℃未満（約３０℃以上約１００℃未満）であることが好ましく、約７０～１００℃未満（約７０℃以上約１００℃未満）がさらに好ましく、約７０～９０℃が特に好ましく、約７０～９０℃未満が特に好ましい。このような温度であると、オリゴメリックプロアントシアニジン以外の物質の溶出も少なく、オリゴメリックプロアントシアニジンを安定的に抽出できるため好ましい。抽出時間は、約０．５～４時間が好ましく、約１～２時間がより好ましい。抽出は、常圧又は加圧下で行うことができるが、好ましくは常圧下で行う。
　前記抽出工程においては、目的とするオリゴメリックプロアントシアニジンの重合度に応じて抽出溶媒のアルコール濃度を設定し、目的の重合度のオリゴメリックプロアントシアニジンを抽出する。抽出工程に用いる抽出溶媒中のアルコール濃度に応じて、異なる重合度のオリゴメリックプロアントシアニジンが原料から抽出される。このため、抽出溶媒として用いる水又はアルコール水溶液のアルコール濃度を設定を適宜設定することにより、目的とする特定の重合度のオリゴメリックプロアントシアニジンを含有する抽出液を効率よく得ることができる。
　抽出溶媒のアルコール濃度は、目的とするオリゴメリックプロアントシアニジン、すなわち原料から抽出するオリゴメリックプロアントシアニジンの重合度等により設定すればよいが、例えば、約０～７０ｖ／ｖ％の範囲で設定することが好ましい。抽出溶媒のアルコール濃度を０％にするとは、抽出溶媒として水を用いることを意味する。すなわち本発明においては、水又はアルコール濃度が約７０ｖ／ｖ％以下のアルコール水溶液を抽出溶媒に用いることが好ましい。抽出溶媒のアルコール濃度がこの濃度範囲であれば、抽出に用いる抽出溶媒のアルコール濃度を調整することにより、目的にあった重合度のオリゴメリックプロアントシアニジンを抽出することができる。例えば、高重合度（通常、平均重合度約８以上、好ましくは平均重合度約８～１０）のオリゴメリックプロアントシアニジンを得るためには、抽出溶媒のアルコール濃度は、約３０～７０ｖ／ｖ％の範囲が好ましく、約３０～６０ｖ／ｖ％がより好ましく、約３０～５０ｖ／ｖ％がさらに好ましく、特に好ましくは約４０～５０ｖ／ｖ％の範囲である。このような濃度範囲であれば、高純度のオリゴメリックプロアントシアニジンを得ることができるため好ましい。抽出溶媒に２種以上のアルコールを用いる場合には、アルコールの総濃度が前記の範囲となるようにすることが好ましい。
　例えば、平均重合度が約５～８未満（約５以上約８未満）となるオリゴメリックプロアントシアニジンを得る場合には、抽出工程において、抽出溶媒のアルコール濃度を約０～２０ｖ／ｖ％とすることが好ましく、約０～１０ｖ／ｖ％とすることがより好ましい。すなわち、抽出溶媒として、好ましくは水又はアルコール濃度が約２０ｖ／ｖ％以下のアルコール水溶液、より好ましくは水又はアルコール濃度が約１０ｖ／ｖ％以下のアルコール水溶液を用いる。抽出溶媒のアルコール濃度が前記範囲であると、通常、平均重合度が約５～８未満となるオリゴメリックプロアントシアニジンが原料から抽出される。本発明の精製方法は、このように平均重合度が約５～８未満のオリゴメリックプロアントシアニジンの精製方法として好適に用いられる。
　また、例えば、平均重合度が約６を超えて約８未満となるオリゴメリックプロアントシアニジンを得る場合には、抽出工程において、抽出溶媒のアルコール濃度を約１～２０ｖ／ｖ％とすることが好ましく、約１０～２０ｖ／ｖ％とすることがより好ましい。すなわち抽出溶媒として、前記濃度のアルコール水溶液を用いることが好ましい。抽出溶媒のアルコール濃度が前記範囲であると、通常、平均重合度が約６を超えて約８未満となるオリゴメリックプロアントシアニジンが原料から抽出される。
　上記抽出工程により得られる抽出液中には通常、重合度が異なる／様々な重合度のオリゴメリックプロアントシアニジンが含まれるが、抽出溶媒として上記所定の濃度のアルコール水溶液を用いることにより、平均重合度が上記の範囲となる重合度のオリゴメリックプロアントシアニジンを抽出することができる。例えば、上述したように抽出溶媒のアルコール濃度を約３０～７０ｖ／ｖ％とすると、通常、平均重合度が約８以上となる高重合度のオリゴメリックプロアントシアニジンを含む抽出液が得られる。
　オリゴメリックプロアントシアンジンの平均重合度は、通常、オリゴメリックプロアントシアニジンの数平均分子量を、カテキンの分子量（Ｍｗ２９０）で除することによって求められる。オリゴメリックプロアントシアンジンの平均重合度は、公知の方法により求めることができる。例えば、実施例で行ったオリゴメリックプロアントシアンジンの重合度の測定方法等により、ゲルろ過クロマトグラフィー等のサイズ排除クロマトグラフィーによる測定結果からGPCソフトウェア（株式会社島津製作所）等を使用して数平均分子量を算出し、得られた数平均分子量をカテキンの分子量（Mw 290）で除して計算することができる。
　本発明の精製方法は、平均重合度が約８以上のオリゴメリックプロアントシアニジンの精製方法としても好適に使用される。平均重合度が８以上のオリゴメリックプロアントシアニジンを得るためには、抽出工程に用いる抽出溶媒のアルコール濃度を約３０～７０ｖ／ｖ％とすることが好ましい。すなわち抽出溶媒として、アルコール濃度が約３０～７０ｖ／ｖ％のアルコール水溶液を用いることが好ましい。また、上記濃度のアルコール水溶液を抽出溶媒として用いると、通常、抽出工程により抽出されるオリゴメリックプロアントシアニジンの平均重合度の上限は、通常１０程度である。
　平均重合度が約８以上のオリゴメリックプロアントシアニジンを抽出する場合、抽出工程において、抽出溶媒であるアルコール水溶液のアルコール濃度を約３０～６０ｖ／ｖ％とすることがより好ましい。さらに、抽出されたオリゴメリックプロアントシアニジンの純度を考慮すると、抽出溶媒であるアルコール水溶液のアルコール濃度は、約３０～５０ｖ／ｖ％であることが好ましく、約４０～５０ｖ／ｖ％であることがより好ましい。この濃度範囲であれば、より高純度のオリゴメリックプロアントシアニジンを得ることができる。
　抽出溶媒のアルコール濃度は、原料等により適宜設定すればよいが、例えば、ブドウ由来の原料を用いる場合、抽出溶媒のアルコール濃度が約３０～７０ｖ／ｖ％であると、通常、平均重合度が約８～１０となるオリゴメリックプロアントシアニジンが抽出される。また、ブドウ由来の原料を用いる場合、抽出溶媒としてアルコール濃度が約３０～６０ｖ／ｖ％のアルコール水溶液を用いると、通常、平均重合度が約８．５～１０、より好ましくは約８．５～９．５、さらに好ましくは約８．７～９．５のオリゴメリックプロアントシアニジンを効率よく抽出できるため好ましい。
　白ワイン用ブドウを原料とする場合、抽出溶媒のアルコール濃度が約４０～６０ｖ／ｖ％、好ましくは約５０ｖ／ｖ％であると、通常平均重合度が約９以上となるオリゴメリックプロアントシアニジンが原料から抽出される。赤ワイン用ブドウを原料とした場合、抽出溶媒のアルコール濃度が約４０～６０ｖ／ｖ％であると、通常平均重合度が９以上となるオリゴメリックプロアントシアニジンが原料から抽出される。
　本発明の別の好ましい態様においては、抽出溶媒のアルコール濃度を約４０～６０ｖ／ｖ％とすることも好ましい。抽出溶媒のアルコール濃度が約４０～６０ｖ／ｖ％であると、通常、原料から平均重合度が約９～１０のオリゴメリックプロアントシアニジンが抽出される。また、抽出されたオリゴメリックプロアントシアニジンの純度を考慮すると、抽出溶媒のアルコール濃度は、約４０～５０ｖ／ｖ％であることが好ましい。
　本発明の精製方法の好ましい態様においては、抽出工程において、約３０～７０ｖ／ｖ％、より好ましくは約３０～６０ｖ／ｖ％、さらに好ましくは約３０～５０ｖ／ｖ％、特に好ましくは約４０～５０ｖ／ｖ％のエタノール水溶液を抽出溶媒として用いて抽出を行う。このような濃度のエタノール水溶液を用いると、通常、抽出液中には平均重合度が約８以上、好ましくは平均重合度が約８．５以上、より好ましくは約８．７以上の高重合度かつ高純度のオリゴメリックプロアントシアニジンが抽出される。このような精製方法は、平均重合度が８以上のオリゴメリックプロアントシアニジンを高純度で精製する方法として特に好適である。
　本発明の精製方法の特に好ましい態様においては、抽出工程において、抽出溶媒として約４０～５０ｖ／ｖ％のエタノール水溶液を用いて抽出を行う。このような精製方法は、平均重合度が約８～１０のオリゴメリックプロアントシアニジンの精製方法として特に好ましい。
　本発明の精製方法においては、抽出工程に用いる抽出溶媒のアルコール濃度に応じて、異なる重合度のオリゴメリックプロアントシアニジンを原料から抽出することができる。このため本発明の精製方法は、原料から目的とする重合度のオリゴメリックプロアントシアニジンを高い純度で抽出する方法としても有用である。
　上記抽出工程においては、抽出に用いる抽出溶媒のアルコール濃度を適宜設定することにより、得られる抽出液中のオリゴメリックプロアントシアニジンの重合度を調整することができる。従って本発明の精製方法は、抽出液中のオリゴメリックプロアントシアニジンの重合度の調整方法に好適に適用される。
　重合度の異なる複数種のオリゴメリックプロアントシアニジンを含有する原料を、水又はアルコール水溶液を抽出溶媒として抽出する抽出工程を含み、該抽出工程において、目的とするオリゴメリックプロアントシアニジンの重合度に応じて該抽出溶媒のアルコール濃度を設定し、目的の重合度のオリゴメリックプロアントシアニジンを抽出するオリゴメリックプロアントシアニジンの重合度の調整方法も、本発明に包含される。
　前記調整方法における抽出工程、及びその好ましい態様は、上述した精製方法における抽出工程と同じである。
　例えば、抽出工程において、抽出溶媒のアルコール濃度を約０～２０ｖ／ｖ％とすると、原料から平均重合度が約５～８未満のオリゴメリックプロアントシアニジンが抽出され、これにより抽出液中のオリゴメリックプロアントシアニジンの平均重合度を約５～８未満とすることができる。また、抽出溶媒のアルコール濃度を通常約３０～７０ｖ／ｖ％、好ましくは約３０～６０ｖ／ｖ％、より好ましくは約３０～５０ｖ／ｖ％とすると、原料から平均重合度が約８以上のオリゴメリックプロアントシアニジンが抽出される。これにより、抽出液中のオリゴメリックプロアントシアニジンの平均重合度を約８以上とすることができる。従って、抽出溶媒のアルコール濃度に応じて、抽出液中のオリゴメリックプロアントシアニジンの重合度を所望の範囲に調整することができる。このように、（Ａ）抽出溶媒のアルコール濃度を約０～２０ｖ／ｖ％とすることにより、抽出液中のオリゴメリックプロアントシアニジンの平均重合度を約５～８未満に調整する、又は（Ｂ）抽出溶媒のアルコール濃度を約３０～６０ｖ／ｖ％（好ましくは約３０～５０ｖ／ｖ％）とすることにより、抽出液中のオリゴメリックプロアントシアニジンの平均重合度を約８以上に調整する調整方法は、本発明の好ましい実施態様の１つである。抽出されるオリゴメリックプロアントシアニジンの平均重合度の上限は、通常１０程度である。
　本発明の精製方法及び調整方法は、抽出工程以外の工程を適宜含んでもよい。例えば、抽出工程の後、ろ過、遠心分離等の適宜の手段により抽出液を回収することができる。回収した抽出液は、そのまま医薬、化粧品、飲食品、医薬部外品等の材料として使用することができるが、必要により溶媒除去、ＯＰＣ分の濃縮、乾燥、粉末化等の処理を行ってもよい。さらに、濃縮した抽出液の乾燥、粉末化に際し、医薬品又は化粧品分野等で用いられる賦形剤等を適宜使用してよい。
　また、上記抽出工程により得られる抽出液、又は抽出液の濃縮物等を、限外ろ過等の膜処理、又は吸着クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー処理することにより、オリゴメリックプロアントシアニジンをより高純度で含有する画分が得られる。吸着剤としては、イオン交換樹脂、スチレン・ジビニルベンゼン系、メタクリル酸系等の吸着剤、親水性ビニルポリマー、修飾デキストランゲル、ポリアクリルアミドゲル、逆相系シリカゲル等が用いられる。吸着画分は、アルコール水溶液、アルコール等の溶離液で溶出して回収される。溶離液は、好ましくはメタノール、エタノール、プロパノール、アセトン等である。得られる画分の主成分は、抽出工程で原料から抽出されたオリゴメリックプロアントシアニジンである。得られたオリゴメリックプロアントシアニジンを含む画分について、さらに濃縮、乾燥、粉末化等の処理を行うか、あるいは１，３－ブチレングリコール溶液等としてもよい。
　上記精製方法により得られるオリゴメリックプロアントシアニジンを含有する画分（以下、ＯＰＣ画分ともいう）は、特定の重合度のＯＰＣを高純度で含むものであり、各種の生理活性を有し、医薬品、化粧品、医薬部外品、飲食品等に好適に用いられる。
　例えば、上記精製方法において、原料にブドウ由来の原料等を使用し、抽出工程において抽出溶媒として約３０～６０ｖ／ｖ％のアルコール水溶液を用いると、優れたメラニン生成抑制作用、ヒアルロニダーゼ阻害作用、及びコラゲナーゼ阻害作用を有する高純度のＯＰＣを含む抽出液又はＯＰＣ画分を得ることができる。このような抽出液及びＯＰＣ画分は、美白作用、ヒアルロニダーゼ阻害作用、又はコラゲナーゼ阻害作用を有する医薬品、化粧品、飲食品、医薬部外品等に有用なものである。本発明の精製方法は、このように優れた美白作用、ヒアルロニダーゼ阻害作用、及びコラゲナーゼ阻害作用を有するオリゴメリックプロアントシアニジン又は該オリゴメリックプロアントシアニジンを高純度で含有する画分の精製方法、調製方法又は製造方法としても好適に用いられる。
　ブドウ果実、ブドウ種皮及びブドウの種子からなる群より選択される少なくとも１種のブドウ由来の原料を、約７０～１００℃未満で約３０～６０ｖ／ｖ％のアルコール水溶液中で抽出する抽出工程を含むメラニン生成抑制作用を有するオリゴメリックプロアントシアニジンの精製方法も、本発明に包含される。本発明の精製方法及びその好ましい態様等は、上述した平均重合度約８以上（好ましくは約８～１０）のオリゴメリックプロアントシアニジンの精製方法と同様である。得られたオリゴメリックプロアントシアニジンのメラニン生成抑制作用は、公知の方法、例えば、実施例に記載の方法等で評価することができる。
　本発明の精製方法により得られるメラニン生成抑制作用を有するオリゴメリックプロアントシアニジン、及び該オリゴメリックプロアントシアニジンを高純度で含有する画分等は、人体に安全であり、かつ優れたメラニン生成抑制効果を発揮するものである。上記精製方法により得られるオリゴメリックプロアントシアニジン又は該オリゴメリックプロアントシアニジンを含有する抽出液、その処理物（抽出物）、画分等は、メラニン生成抑制剤、又は美白剤として、美白用皮膚外用剤、化粧品、飲食品、医薬部外品等に好適に用いられ、シミやソバカスの原因となるメラニン色素の生成予防又は抑制等に優れた効果を発揮する。
　上記精製方法により得られるオリゴメリックプロアントシアニジンを有効成分とするメラニン生成抑制剤、又は美白剤も、本発明に包含される。上記精製方法により得られるオリゴメリックプロアントシアニジンを含有する抽出液、該抽出液の処理物（抽出物）、オリゴメリックプロアントシアニジンを含有する画分等は、そのままでもメラニン生成抑制剤、又は美白剤として使用できるが、さらにその他の成分を添加して用いてもよい。本明細書中、メラニン生成は、メラニン産生と同義である。
　オリゴメリックプロアントシアニジンを有効成分とし、該オリゴメリックプロアントシアニジンが、ブドウ果実、ブドウ種皮及びブドウの種子からなる群より選択される少なくとも１種のブドウ由来の原料を約３０～６０ｖ／ｖ％のアルコール水溶液中で抽出して得られる抽出液、又は抽出物に含有されるものであるヒアルロニダーゼ阻害剤も、本発明の１つである。
　オリゴメリックプロアントシアニジンを有効成分とし、該オリゴメリックプロアントシアニジンが、ブドウ果実、ブドウ種皮及びブドウの種子からなる群より選択される少なくとも１種のブドウ由来の原料を約３０～６０ｖ／ｖ％のアルコール水溶液中で抽出して得られる抽出液、又は抽出物に含有されるものであるコラゲナーゼ阻害剤も、本発明の１つである。
　ヒアルロニダーゼ阻害作用及びコラゲナーゼ阻害作用は、公知の方法で評価することができる。例えばヒアルロニダーゼ阻害作用は、実施例に記載の方法でヒアルロニダーゼの阻害率を測定すること等により評価することができる。コラゲナーゼ阻害作用は、例えば、実施例に記載の方法又は前田有美恵ら(食品衛生学雑誌31(3),233-237(1990))に記載の方法等で評価することができる。
　上記ヒアルロニダーゼ阻害剤及びコラゲナーゼ阻害剤において、オリゴメリックプロアントシアニジンの平均重合度は、約８以上であることが好ましく、より好ましくは約８～１０であり、さらに好ましくは、約８．５～１０であり、特に好ましくは約９～１０である。また、別の好ましい態様においては、オリゴメリックプロアントシアニジンの平均重合度は、約８．５～９．５であり、より好ましくは約８．７～９．５である。平均重合度がこのような範囲となる重合体が含まれていれば、オリゴメリックプロアントシアニジン中にモノマーやダイマー、その他の断片が存在しても、優れたヒアルロニダーゼ阻害活性、優れたコラゲナーゼ阻害活性が得られるため好ましい。
　本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤及びコラゲナーゼ阻害剤の有効成分であるオリゴメリックプロアントシアニジンは、上記精製方法において、原料としてブドウ果実、ブドウ種皮及びブドウの種子からなる群より選択される少なくとも１種のブドウ由来の原料を使用し、抽出工程において抽出溶媒であるアルコール水溶液のアルコール濃度を約３０～７０ｖ／ｖ％として得られる抽出液、又は抽出物に含まれるものである。より好ましくは、アルコール水溶液のアルコール濃度を約３０～６０ｖ／ｖ％、さらに好ましくは約３０～５０ｖ／ｖ％、特に好ましくは約４０～５０ｖ／ｖ％として得られる抽出液、又は抽出物に含まれるオリゴメリックプロアントシアニジンである。抽出における好ましい条件等は、上述した平均重合度約８以上（好ましくは約８～１０）のオリゴメリックプロアントシアニジンの精製方法における条件等と同じである。例えば、抽出温度は、約３０～１００℃未満であることが好ましく、約７０～１００℃未満が好ましく、約７０～９０℃がさらに好ましく、約７０～９０℃未満が特に好ましい。アルコールは、エタノールが好ましい。ブドウ由来の原料及びその好ましい態様も、上述した精製方法の原料として用いられるブドウ由来の原料及びその好ましい態様と同様である。
　本発明は、平均重合度が約８～１０のオリゴメリックプロアントシアニジンを有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤も包含する。
　平均重合度が約８～１０のオリゴメリックプロアントシアニジンを有効成分とするコラゲナーゼ阻害剤も、本発明に包含される。
　本発明においては、平均重合度が約８～１０となる重合体が含まれていれば、オリゴメリックプロアントシアニジン中にモノマーやダイマー、その他の断片が存在しても、優れたヒアルロニダーゼ阻害活性、優れたコラゲナーゼ阻害活性が得られる。平均重合度が約８～１０のオリゴメリックプロアントシアニジンは、好ましくは、ブドウ果実、ブドウ種皮及びブドウの種子からなる群より選択される少なくとも１種のブドウ由来の原料に含まれるものである。このようなブドウ由来の原料に含まれるオリゴメリックプロアントシアニジンは、例えば、上述した精製方法により原料から得ることができる。オリゴメリックプロアントシアニジンの平均重合度の下限は、好ましくは約８．５である。
　上記ヒアルロニダーゼ阻害剤及びコラゲナーゼ阻害剤において、オリゴメリックプロアントシアニジンは、好ましくは平均重合度が約８．５～９．５、より好ましくは平均重合度が約８．７～９．５のオリゴメリックプロアントシアニジンである。また、このようなオリゴメリックプロアントシアニジンは、好ましくは、ブドウ果実、ブドウ種皮及びブドウの種子からなる群より選択される少なくとも１種のブドウ由来の原料を、約７０～１００℃未満で約３０～６０ｖ／ｖ％のアルコール水溶液中で抽出して得られる抽出液、又は抽出物に含有されるものである。抽出の好ましい態様等は、上述した上記精製方法における好ましい態様等と同じである。
　ブドウ由来の原料及びその好ましい態様は、上述した精製方法におけるものと同じである。ブドウは、特に好ましくは、カベルネ・ソーヴィニヨンである。
　前記ヒアルロニダーゼ阻害剤、及びコラゲナーゼ阻害剤は、必須成分であるオリゴメリックプロアントシアニジンに加えて、これ以外の成分を含んでもよい。
　本発明の阻害剤の製造には、上記抽出工程で得られるオリゴメリックプロアントシアニジンを含有する抽出液、又は抽出物を使用することができる。前記抽出物として、例えば、回収した抽出液から溶媒除去、ＯＰＣ分の濃縮、乾燥、粉末化等の処理を行って得られる抽出液の濃縮物、乾燥物、粉末等の処理物等を好適に使用できる。また、上記抽出工程により得られる抽出液又はその濃縮物等を、上述した限外ろ過等の膜処理、又は吸着クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー処理して得られるＯＰＣを高純度で含有する画分も、本発明における抽出物として好適に使用できる。
　上記精製方法により得られるオリゴメリックプロアントシアニジンを含有する抽出液、又は抽出物は、そのままでもヒアルロニダーゼ阻害剤、又はコラゲナーゼ阻害剤として使用できるが、さらにその他の成分を添加して用いてもよい。
　上記ヒアルロニダーゼ阻害剤、及びコラゲナーゼ阻害剤、並びに上述したメラニン生成抑制剤、及び美白剤は、例えば、皮膚外用剤等の医薬品、医薬部外品、化粧品等として好適に使用される。
　例えば、ヒアルロニダーゼ阻害剤、コラゲナーゼ阻害剤、メラニン生成抑制剤、及び美白剤を皮膚外用剤等とする場合、剤型等は特に限定されず、例えば軟膏、クリーム、乳液、ローション、美容液、パック、浴用剤、洗顔料等とすることができる。ヒアルロニダーゼ阻害剤、コラゲナーゼ阻害剤、メラニン生成抑制剤、及び美白剤を化粧品とする場合、その形態は特に限定されず、例えば、化粧水、乳液、美容液、クリーム、パック等の皮膚化粧品；メイクアップベースローション、メイクアップベースクリーム、パウダー状、液状又はクリーム状のファンデーション等のメイクアップ化粧品；ハンドクリーム、レッグクリーム、ボディローション等の身体用化粧品；洗顔料、ボディーソープ等とすることができる。
　上記ヒアルロニダーゼ阻害剤、及びコラゲナーゼ阻害剤、並びに上述したメラニン生成抑制剤、及び美白剤は、例えば、必要に応じて通常皮膚外用剤や化粧品に配合される成分及び／又は添加剤を含有する組成物であってもよい。
　配合成分としては、美白剤、保湿剤、酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水、各種皮膚栄養剤、防腐・殺菌剤、収斂剤、香料等の各種成分、添加剤等が挙げられ、これらの１種又は２種以上を必要に応じて適宜配合することができる。上述した本発明における有効成分、例えば、上記オリゴメリックプロアントシアニジン、又は上記精製方法で得られるオリゴメリックプロアントシアニジンを含有する抽出液又は抽出物に、これらの通常使用される成分、添加剤等を適宜配合し、常法に従って、皮膚外用剤、化粧品、医薬部外品等を得ることができる。
　上記配合成分の一例を以下に記載するが、本発明における配合成分は以下のものに限定されず、下記以外のものであっても、医薬品、化粧品、医薬部外品等に使用される成分及び添加剤を使用することができる。
　美白剤として、例えば、アルブチン、コウジ酸及びその誘導体、ハイドロキノン誘導体、エラグ酸及びその誘導体、トラネキサム酸及びその誘導体、レゾルシノール誘導体、システイン及びその誘導体、松樹皮抽出物等、2,5-ジヒドロキシ安息香酸誘導体、ニコチン誘導体、α－ヒドロキシ酸等が挙げられる。
　保湿剤として、例えば、多価アルコール（グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ポリエチレングリコール等）、糖類（ソルビトール、エリスリトール、トレハロース、イノシトール、グルコース、キシリトール蔗糖及びその誘導体、デキストリン及びその誘導体、ハチミツ等）、ムコ多糖類(例えば、ヒアルロン酸及びその誘導体、コンドロイチン及びその誘導体、ヘパリン及びその誘導体等)、エラスチン及びその誘導体、コラーゲン及びその誘導体、乳酸、尿素、高級脂肪酸オクチルドデシル、海藻抽出物、魚介類由来コラーゲン及びその誘導体、各種アミノ酸及びそれらの誘導体（グリシン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、テアニン、ピロリドンカルボン酸ナトリウム等）等が挙げられる。
　酸化防止剤として、例えば、ビタミンＥ及びその誘導体（ｄｌ－α（β、γ）－トコフェロール、酢酸ｄｌ－α－トコフェロール、ニコチン酸－ｄｌ－α－トコフェロール、リノール酸－ｄｌ－α－トコフェロール、コハク酸ｄｌ－α－トコフェロール等のトコフェロール及びその誘導体、ユビキノン類等）、ビタミンＡ及びその誘導体（パルミチン酸レチノール、酢酸レチノール等のレチノール及びその誘導体、デヒドロレチナール等のレチナール及びその誘導体等）、カロチノイド（カロチン、リコピン、アスタキサンチン等）、ビタミンＢ及びその誘導体（チアミン塩酸塩、チアミン硫酸塩、リボフラビン、酢酸リボフラビン、塩酸ピリドキシン、ピリドキシンジオクタノエート、フラビンアデニンジヌクレオチド、シアノコバラミン、葉酸類、ニコチン酸アミド、ニコチン酸ベンジル等のニコチン酸類、コリン類等）、ビタミンＤ及びその誘導体（エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール、ジヒドロキシスタナール等）、ルチン及びその誘導体、チオタウリン、タウリン、ハイドロキノン及びその誘導体、グルタチオン及びその誘導体、没食子酸及びその誘導体、コレステロール及びその誘導体、スーパーオキサイドジスムターゼ、マンニトール等が挙げられる。
　油性成分として、例えば、オリーブ油、ホホバ油、ヒマシ油、大豆油、米油、米胚芽油、ヤシ油、パーム油、カカオ油、メドウフォーム油、シアーバター、ティーツリー油、アボガド油、マカデミアナッツ油、植物由来スクワラン等の植物由来の油脂類；ミンク油、タートル油等の動物由来の油脂類；ミツロウ、カナウバロウ、ライスワックス、ラノリンなどのロウ類；流動パラフィン、ワセリン、パラフィンワックス、スクワラン等の炭化水素類；ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、イソステアリン酸、ｃｉｓ－１１－エイコセン酸等の脂肪酸類；ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコールなどの高級アルコール類；ミリスチン酸イソプロピル、オレイン酸ブチル、２－エチルへキシジルグリセライド、高級脂肪酸オクチルドデシル（ステアリン酸オクチルドデシル等）等の合成エステル類及び合成トリグリセライド類等が挙げられる。
　紫外線吸収剤として、例えば、パラアミノ安息香酸エチル、パラジメチルアミノ安息香酸エチルヘキシル、サリチル酸アミル及びその誘導体、パラメトキシ桂皮酸２－エチルヒキシル、桂皮酸オクチル、オキシベンゾン、２，４－ジヒドロキシベンゾフェノン、２－ヒドロキシ－４－メトキシベンゾフェノン－５－スルホン酸塩、４－ターシャリーブチル－４－メトキシベンゾイルメタン、２－（２－ヒドロキシ－５－メチルフェニル）ベンゾトリアゾール、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチル、アロエ抽出物等が挙げられる。
　界面活性剤として、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド等の非イオン界面活性剤；脂肪酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレン脂肪アミン硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル燐酸塩、N-ラウロイルサルコシンナトリウム等のアニオン界面活性剤；第四級アンモニウム塩、第一級～第三級脂肪アミン塩、トリアルキルベンジルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩、２－アルキルー１－ヒドロキシエチルイミダゾリニウム塩、Ｎ，Ｎ－ジアルキルモルフォルニウム塩、ポリエチレンポリアミン脂肪酸アミド塩等のカチオン界面活性剤；Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－アルキル－Ｎ－カルボキシメチルアンモニオベタイン、Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリアルキル－Ｎ－アルキレンアンモニオカルボキシベタイン、Ｎ－アシドアミノプロピル－Ｎ’，Ｎ’－ジメチル－Ｎ’－β－ヒドロキシプロピルアンモニオスルホベタイン、ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン等の両性界面活性剤等が挙げられる。
　増粘剤として、例えば、アルギン酸、寒天、カラギーナン、フコイダン等の渇藻、緑藻又は紅藻由来成分；ペクチン、ローカストビーンガム、アロエ多糖体等の多糖類；キサンタンガム、トラガントガム、グアーガム等のガム類；カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース等のセルロース誘導体；ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アクリル酸・メタクリル酸共重合体等の合成高分子類；ヒアルロン酸及びその誘導体；ポリグルタミン酸及びその誘導体等が挙げられる。
　アルコール類として、例えば、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール、２－ブタノール、ブチレングリコール、ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ラノリンアルコール、水添ラノリンアルコール、オレイルアルコール、ヘキサデシルアルコール、２－オクチルドデカノール、グリセリン、ソルビトール、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、エチレングリコール及びその重合体等が挙げられる。
　粉末成分として、例えば、例えばセリサイト、酸化チタン、タルク、カオリン、ベントナイト、酸化亜鉛、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、酸化ジルコニウム、硫酸バリウム、無水ケイ酸、雲母、ナイロンパウダー、ポリエチレンパウダー、シルクパウダー、セルロース系パウダー、穀類（米、麦、トウモロコシ、キビ等）のパウダー、豆類(大豆、小豆等)のパウダー等が挙げられる。
　色剤として、例えば、無水ケイ酸、ケイ酸マグネシウム、タルク、カオリン、ベントナイト、マイカ、雲母チタン、オキシ塩化ビスマス、酸化ジルコニウム、酸化マグネシウム、酸化亜鉛、酸化チタン、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、黄酸化鉄、ベンガラ、黒酸化鉄、グンジョウ、酸化クロム、水酸化クロム、カーボンブラック、カラミン等の無機顔料；赤キャベツ色素、赤米色素、アカネ色素、アナトー色素、イカスミ色素、ウコン色素、エンジュ色素等の天然色素等が挙げられる。
　各種皮膚栄養剤として、例えば、各種ビタミン（ビタミンＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅ等）及びその誘導体、リボ核酸及びその塩、デオキシリボ核酸及びその塩、α－及びγ－リノレン酸、キサンチン及びその誘導体（カフェイン等）、アミノ酸及びその誘導体（セリン、グルタミン酸、テアニン、ヒドロキシプロリン、ピロリドンカルボン酸等）、ドコサヘキサエン酸及びその誘導体、エイコサペンタエン酸及びその誘導体、動物由来抽出物（イカスミ等軟体動物抽出物、貝殻抽出物、貝肉抽出物、魚肉抽出物、鶏冠抽出物、ローヤルゼリー、シルクプロテイン及びその分解物、胎盤抽出物、血清除蛋白抽出物、ラクトフェリン又はその分解物等）、酵母抽出物、微生物発酵代謝産物（乳酸菌、ビフィズス菌等の代謝産物）等が挙げられる。
　防腐・殺菌剤として、例えば、尿素；パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル等のパラオキシ安息香酸エステル類；ジブチルヒドロキシトルエン、フェノキシエタノール、ジクロロフェン、塩酸クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、サリチル酸、エタノール、ウンデシレン酸、フェノール類、イソプロピルメチルフェノール、１，２－ペンタンジオール、各種精油類、樹皮乾留物等が挙げられる。
　収斂剤として、例えば、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、酸化亜鉛、コハク酸、アラントイン、カラミン、ｐ－フェノールスルホン酸亜鉛、硫酸アルミニウムカリウム、レゾルシン、塩化第二鉄、メントール等が挙げられる。
　皮膚外用剤及び化粧品への配合量は、オリゴメリックプロアントシアニジンとして、0.000006～1質量％程度とするのが好ましく、0.0000125～0.5質量％程度とするのがより好ましく、0.0001～0.01％程度とするのがさらに好ましく、0.0005～0.0025質量％程度とするのが特に好ましい。
　本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤、及びコラゲナーゼ阻害剤、並びに上述したメラニン生成抑制剤、及び美白剤の使用方法は、使用対象の皮膚の状態等によって異なるが、例えば以下の方法とすればよい。
　即ち、１日数回（例えば、約１～５回、好ましくは約１～３回）、適量（例えば、約０．０５～２ｇ）を皮膚に塗布すればよい。またオリゴメリックプロアントシアニジン（好ましくは、平均重合度が約８～１０のオリゴメリックプロアントシアニジン）の１日使用量が、好ましくは約０．０００２５～０．２５ｍｇ、より好ましくは約０．００５～０．２ｍｇとなるように組成物を塗布すればよい。塗布期間は特に限定されない。
　本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤、及びコラゲナーゼ阻害剤は、人体に安全であり、かつ優れたヒアルロニダーゼ阻害又はコラゲナーゼ阻害効果を発揮するものである。このため、本発明の阻害剤は、しわ、たるみの予防又は抑制用皮膚外用剤又は化粧品、老化予防又は防止用の皮膚外用剤又は化粧品等に好適に用いられ、しわ、たるみの予防又は抑制、皮膚の老化予防又は防止等に優れた効果を発揮する。
　以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。
　実施例中、アルコール濃度（％）は、特に断らない限り体積％（ｖ／ｖ％）である。
　以下の調製例中、白ワイン用ブドウ圧搾物として、白ワイン製造工程で得られるブドウ圧搾物、すなわちブドウ果実から果汁を圧搾した後の搾汁粕（ブドウの果皮及び種子）を用いた。赤ワイン用ブドウ圧搾物として、赤ワイン製造工程において得られるブドウ圧搾物、すなわちブドウ果実を破砕した破砕液（果肉、果皮及び種子を含む果汁）を発酵させた後、該発酵液を圧搾して得られる搾汁粕（果皮及び種子）を用いた。
調製例１
白ワイン用ブドウ圧搾物（シャルドネ）からのプロアントシアニジン類の調製
（１）熱水による抽出
　白ワイン製造工程で得られるシャルドネ（ブドウ品種）の圧搾物（シャルドネの果皮及び種子、２５０ｇ）に、抽出溶媒として１０倍量の水を加え、８０℃で１時間加熱抽出を行った。得られた熱水抽出液をナイロンメッシュ（日本理化学器械株式会社製、商品名：NRS-200）により粗ろ過して抽出液１を得た。また、ろ過後の残渣についても再度同条件で抽出、ろ過を行い、得られた抽出液２を先の抽出液１とあわせた後、４００ｍＬまで減圧濃縮した。得られた濃縮液を珪藻土ろ過し、ろ液をアクリル系樹脂　アンバーライトＸＡＤ（登録商標）－７ＨＰ（オルガノ株式会社、１００ｍＬ）を充填したカラムに通導させた後、水（２００ｍＬ）を通液させ、余分な糖類及び有機酸を除いた（糖類及び有機酸を溶出させた）。その後、溶離液として７０％エタノール水溶液（４００ｍＬ）を用いて、カラムからポリフェノールを溶出させた。得られた溶出液を減圧濃縮した後、凍結乾燥に供し、白ワイン用ブドウ由来プロアントシアニジン画分１を１．６２ｇ得た。
（２）エタノール水溶液による抽出
　上記（１）の方法の加熱抽出において、抽出溶媒として、水の代わりに１０％、２０％、３０％、５０％、及び７０％エタノール水溶液をそれぞれ用いた以外は、上記（１）と同様の操作を行って、白ワイン用ブドウ由来プロアントシアニジンを抽出、及び精製した。これにより、白ワイン用ブドウ由来プロアントシアニジン画分２～６を、それぞれ２．０３ｇ（抽出溶媒１０％エタノール水溶液）、２．０６ｇ（抽出溶媒２０％エタノール水溶液）、２．５７ｇ（抽出溶媒３０％エタノール水溶液）、２．８０ｇ（抽出溶媒５０％エタノール水溶液）、及び２．３２ｇ（抽出溶媒７０％エタノール水溶液）得た。
調製例２
赤ワイン用ブドウ圧搾物（カベルネ・ソーヴィニヨン）からのプロアントシアニジン類の調製
（１）熱水による抽出
　赤ワイン製造工程で得られるカベルネ・ソーヴィニヨン（ブドウ品種）の圧搾物（カベルネ・ソーヴィニヨンの果皮及び種子、３０ｇ）に、抽出溶媒として１０倍量の水を加え、８０℃で１時間加熱抽出を行った。得られた熱水抽出液を、ナイロンメッシュ（日本理化学器械株式会社製、商品名:NRS-200）により粗ろ過して抽出液を得た。得られた抽出液を１０ｍＬまで減圧濃縮した後、水にて４５ｍＬまでメスアップし、３日間冷蔵庫で静置した。次にこの抽出液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）に供し、その上澄み液をアクリル系樹脂　アンバーライトＸＡＤ（登録商標）－７ＨＰ（オルガノ社、２０ｍＬ）を充填したカラムに通導させた後、水（４０ｍＬ）を通液させ余分な糖類及び有機酸を除いた（糖類及び有機酸を溶出させた）。その後、溶離液として７０％エタノール水溶液（８０ｍＬ）を用いて、カラムからポリフェノールを溶出させた。得られた溶出液を減圧濃縮した後、凍結乾燥し、赤ワイン用ブドウ由来プロアントシアニジン画分１を４６ｍｇ得た。
（２）エタノール水溶液による抽出
　上記（１）の方法の加熱抽出において、抽出溶媒として、水の代わりに１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、及び７０％エタノール水溶液をそれぞれ用いた以外は、上記（１）と同様の操作を行って、赤ワイン用ブドウ由来プロアントシアニジンを抽出、及び精製した。これにより、赤ワイン用ブドウ由来プロアントシアニジン画分２～８を、それぞれ５８ｍｇ（抽出溶媒１０％エタノール水溶液）、７８ｍｇ（抽出溶媒２０％エタノール水溶液）、８９ｍｇ（抽出溶媒３０％エタノール水溶液）、９７ｍｇ（抽出溶媒４０％エタノール水溶液）、１０４ｍｇ（抽出溶媒５０％エタノール水溶液）、９９ｍｇ（抽出溶媒６０％エタノール水溶液）、及び７６ｍｇ（抽出溶媒７０％エタノール水溶液）得た。
調製例３
　品種によるブドウ由来プロアントシアニジン画分の違いを評価するため、以下の品種のブドウの圧搾物を用いて、ブドウ由来のプロアントシアニジンを抽出、及び精製した。
白ワイン用ブドウ圧搾物
・シャルドネの圧搾物（調製例１で用いた白ワイン用ブドウ圧搾物）
・甲州の圧搾物（甲州の果皮及び種子）
赤ワイン用ブドウ圧搾物
・カベルネ・ソーヴィニヨンの圧搾物（調製例２で用いた赤ワイン用ブドウ圧搾物）
・コンコードの圧搾物（コンコードの果皮及び種子）
・メルローの圧搾物（メルローの果皮及び種子）
・マスカットベリーＡの圧搾物（マスカットベリーＡの果皮及び種子）
　ワイン製造工程で得られるブドウの圧搾物シャルドネ、カベルネ・ソーヴィニヨン、コンコード、メルロー、マスカットベリーＡ、及び甲州それぞれの果皮、及び種子に、抽出溶媒として１５倍量の水を加え、８０℃で１時間加熱抽出を行い、この熱水抽出液をナイロンメッシュ（日本理化学器械株式会社製、商品名：NRS-200）によりろ過して抽出液１を得た。また、ろ過後の残渣についても再度同条件で抽出、及びろ過を行い、得られた抽出液２を先の抽出液１とあわせた後、珪藻土ろ過し、ろ液をアンバーライトＸＡＤ（登録商標）－７ＨＰ（オルガノ株式会社、１００ｍＬ）を充填したカラムに通導させた後、水（カラム容積（ＣＶ）の２倍量）を通液させ余分な糖類及び有機酸を除いた（糖類及び有機酸を溶出させた）。その後溶離液として７０％エタノール水溶液（ＣＶの３倍量）を用いて、カラムからポリフェノールを溶出させた。得られた溶出液を減圧濃縮した後、凍結乾燥に供し、ワイン用ブドウ由来プロアントシアニジン画分をそれぞれ、収率０．８３２％（シャルドネ）、０．８３３％（カベルネ・ソーヴィニヨ）、０．７６２％（コンコード）、１．０７５％（メルロー）、０．６１７％（マスカットベリーＡ）、及び１．０９４％（甲州）で得た。
調製例４
　調製例３で得られたシャルドネ由来プロアントシアニジン画分及びカベルネ・ソーヴィニヨン由来プロアントシアニジン画分それぞれを、Sephadex LH-20（商品名、Pharmacia fine chemicals社）を用いて精製及び分画を行い、単純ポリフェノール画分、カテキン・エピカテキン画分、低分子オリゴメリックプロアントシアニジン画分、及び高分子オリゴメリックプロアントシアニジン画分の４つに分けた。移動相には、水（ＣＶの３倍量）、２０％エタノール水溶液（ＣＶの３倍量）、３５％エタノール水溶液（ＣＶの３倍量）、５５％エタノール水溶液（ＣＶの３倍量）、７５％エタノール水溶液（ＣＶの３倍量）、及び７０％アセトン水溶液（ＣＶの３倍量）をこの順に用いた。
　２０％エタノール水溶液による溶出画分を、単純ポリフェノール画分、３５％エタノール水溶液による溶出画分を、カテキン・エピカテキン画分、５５％エタノール水溶液による溶出画分を、低分子オリゴメリックプロアントシアニジン画分、７５％エタノール水溶液による溶出画分を、高分子オリゴメリックプロアントシアニジン画分としてそれぞれ得た。
評価方法
　上記で調製したワイン用ブドウ圧搾物由来プロアントシアニジン画分の評価方法を、以下に示す。
（１）ワイン用ブドウ圧搾物由来プロアントシアニジン画分中のプロアントシアニジン純度の測定方法
　ワイン用ブドウ圧搾物由来プロアントシアニジン画分のオリゴメリックプロアントシアンジン純度は、特許第４６５９４０７号に示された方法に準じた方法で求めた。具体的には、以下の方法で純度を求めた。
　まず、上記調製例で調製したワイン用ブドウ圧搾物由来プロアントシアニジン画分各１．０ｍｇに０．６Ｎ　塩酸／ブタノールを１．０ｍＬ加え、これを９０℃にて２時間反応させ、オリゴメリックプロアントシアンジン類をシアニジンに分解した。得られた反応溶液について、後記の高速液体クロマトグラフィーの分析条件にて分析を行い、反応溶液中に含まれるシアニジン量を定量した後、下に示す計算式によりオリゴメリックプロアントシアンジン純度を算出した。また、標準物質には、プロアントシアニジンＢ－１（ＰＢ－１、フナコシ株式会社：ＮＩＵ－Ｎ２１０）を使用した。
（高速液体クロマトグラフィー分析条件）
　検出波長：５２０ｎｍ
　カラム：YMC-Pack ODS A-312 (φ6.0 × 150.0 mm、商品名、ワイエムシー株式会社製）
　溶媒：水：メタノール：酢酸＝６７．５：１７．５：１５．０（体積比）
　カラム温度：４０℃
　流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
（オリゴメリックプロアントシアニジン純度計算式）
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
（２）ワイン用ブドウ由来プロアントシアニジン画分中のオリゴメリックプロアントシアニジンの重合度の測定方法
　上記調製例で調製されたワイン用ブドウ由来プロアントシアニジン画分のオリゴメリックプロアントシアンジン重合度を、以下に示すＨＰＬＣの条件で測定した。また検量線の作成には、Shodex社のSL-105（Lot. 00301）及び（＋）－カテキン水和物（Sigma株式会社：C1251）を用いた。
（高速液体クロマトグラフィー分析条件）
検出器：ＲＩ
カラム：Shodex（登録商標） OHpak SB-806MHQ (φ7.6×250 mm)（昭和電工株式会社製）
　　　Shodex（登録商標） OHpak SB-802.5HQ（φ7.6×250 mm）（昭和電工株式会社製）
　　　（Guard column：Shodex（登録商標） OHpak SB-G）（昭和電工株式会社製）
溶媒（移動相）：２０ｍＭ　ＬｉＢｒ／ＤＭＦ
カラム温度：４０℃
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
評価サンプルは、５０ｍｇ／ｍＬになるよう２０ｍＭ　ＬｉＢｒ／ＤＭＦで溶解後、１０ｕＬインジェクトした。
　オリゴメリックプロアントシアンジンの平均重合度は、上記HPLCによる測定結果からGPCソフトウェア（株式会社島津製作所）を使用して数平均分子量を算出し、得られた数平均分子量をカテキンの分子量（Mw 290）で除して計算した。
（３）Ｂ１６メラノーマ細胞を用いたメラニン生成抑制試験法
１）培地
　10％仔牛血清含有イーグル最小必須培地（以下、単に培地という）。
２）試験サンプル
　試験濃度の２００倍のＤＭＳＯ溶液を作製し、試験時に培地で２００倍希釈して試験に用いた。対照にはＤＭＳＯ溶液を、陽性対照は１０ｍＭ　アルブチン（Arbutin）のＤＭＳＯ溶液を作製し、いずれも試験時に培地で２００倍希釈して試験に用いた。
３）培養
　１日目：１．５×１０５個のＢ１６メラノーマ細胞を、５ｍＬの培地とともに６０ｍｍ×１５ｍｍシャーレに播種し、ＣＯ２インキュベータ（３７℃、ＣＯ２分圧５％）で培養した。なお、試験はｎ＝２で行なった。
　２日目：試験サンプルを含む培地と交換し、ＣＯ２インキュベータで３日間培養した。
　５日目：２日目と同じ試験サンプルを含む培地と交換し、ＣＯ２インキュベータでさらに２日間培養した。
　７日目：培養した細胞を破砕し、メラニン量と蛋白量を測定した。
４）細胞破砕
　培地を除去し、５ｍＬのＰＢＳ（－）で細胞を洗浄した。洗浄液を除去後、０．０２％ＥＤＴＡ・ＰＢＳ（－）１ｍＬを加え、３７℃、５分インキュベート後、ピペッティングを行なって細胞を懸濁させた。細胞懸濁液０．９ｍＬを２．０ｍＬ容のエッペンドルフチューブにとり、遠心（５０００ｒｐｍ、１分）後、上澄を除いた。ＰＢＳ（－）　０．９ｍＬを添加してボルテックスミキサーで細胞を分散させ、遠心（５０００ｒｐｍ、１分）後、上澄を除いた。５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ　６．８）０．４５ｍＬを添加してボルテックスミキサーで細胞を分散させた後、超音波破砕装置（コスモバイオ社、型番ＵＣＤ－２５０ＨＳＡ）で細胞を氷冷条件下で破砕した。
　破砕条件：出力250W　30 sec ON/30 sec OFF/Total 5 min
５）メラニン測定
　細胞破砕液４００μＬを２．０ｍＬ容のエッペンドルフチューブにとり、同量の４Ｎ－ＮａＯＨを添加し、６０℃、２時間加熱してメラニンの溶出処理を行なった。処理液を９６穴マイクロプレートに２００μＬずつ３ｗｅｌｌにとり、４９２ｎｍの吸光度を測定して平均値を求めた。各サンプルともｎ＝２で試験を行なったので、さらにそれらの平均値を求め、メラニン（ナカライテスク社）を用いてあらかじめ作成しておいたメラニンの検量線からメラニン量を算出した。
６）蛋白量測定
　細胞破砕液３５μＬを等量の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ　６．８）で希釈し、９６穴マイクロプレートに５μＬずつ３ｗｅｌｌにとり、ＤＣプロテインアッセイキット　ＩＩ（バイオ・ラッド社）を用いて反応させ、６９０ｎｍの吸光度を測定して平均値を求めた。各サンプルともｎ＝２で試験を行なったので、さらにそれらの平均値を求め、アッセイキットのウシ血清アルブミンを用いてあらかじめ作成しておいた蛋白の検量線から蛋白量を算出した。
７）試験データのまとめ
　対照（ＤＭＳＯ）のメラニン量、蛋白量を１００として、ブランク、アルブチン（陽性対照）、及び各サンプルのメラニン量、及び蛋白量の比を算出した。さらに対照（ＤＭＳＯ）の（メラニン量／蛋白量）比を１００としてアルブチン（陽性対照）及びサンプルの（メラニン量／蛋白量）比を算出し、１００からこの値を差し引いてアルブチン（陽性対照）及びサンプルのメラニン生成抑制率を求めた。また、試験例１、３及び４においては、試料濃度を公比２倍で希釈して抑制率を求め、各試験濃度のメラニン生成抑制率から、５０％抑制する試料濃度「IC50（μg/mL）」を内挿法により求めた。「IC50（μg/mL）」は、メラニン生成を５０％抑制するために必要な濃度を示し、より低い値を示す化合物は抑制剤としての活性がより高いと言える。
（４）ヒアルロニダーゼ阻害試験
　ワイン用ブドウ由来オリゴメリックプロアントシアニジンのヒアルロニダーゼ阻害試験は、文献（前田有美恵ら、食品衛生学雑誌31(3),233-237(1990)）の方法を改変し、以下の方法にて実施した。ヒアルロン酸はヒアルロニダーゼによりＮ－アセチルへキソサミンに分解される。還元末端のＮ－アセチルグルコサミンを、ｐ－ジメチルアミノベンズアルデヒド（和光純薬工業株式会社製、以下ｐ－ＤＡＢと略す）標識による発色により吸光度で定量することにより、ヒアルロニダーゼ阻害活性を測定した。
　１０％ＤＭＳＯに溶解した試料溶液４０μＬに、０．１Ｍ　酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解した１０００Ｕ／ｍＬヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）を２０μＬ混合し、３７℃で２０分間予備加温した。同緩衝液に溶解した０．５ｍｇ／ｍＬ compound 48/80（Sigma社製）を４０μＬ添加し、３７℃で２０分間静置してヒアルロニダーゼを活性化させた。この溶液に最終濃度０．４ｍｇ／ｍＬとなるよう０．８ｍｇ／ｍＬヒアルロン酸カリウム溶液　１００μＬを添加し、３７℃で４０分間反応させた後、０．４Ｎ水酸化ナトリウム溶液を４０μＬを添加し、氷冷して反応を停止させた。６Ｎ　ＮａＯＨでｐＨ９．１に調整した０．８Ｍホウ酸溶液を４０μＬ反応液に加え、１００℃で３分間煮沸した。氷中で室温まで冷却し、これに、遮光した１０ｍｇ／ｍＬ　ｐ－ジメチルアミノベンズアルデヒド（ｐ－ＤＡＢ）溶液を１．２ｍＬ添加し、３７℃で２０分間反応させた後、５８５ｎｍの吸光度（A585）を測定した。試料のヒアルロニダーゼ阻害活性は次式から求められる阻害率で表した。
　阻害率（%）={1-(a-b)/(c-d)}×100

　ａ：酵素を添加した試料溶液のA585
　ｂ：酵素を添加していない試料溶液のA585
　ｃ：酵素を添加した対照溶液のA585
　ｄ：酵素を添加していない対照溶液のA585
　また、比較対照には試料溶液の代わりに、４００μｇ／ｍＬ（モル濃度０．８７３ｍｍＭ）の（－）－エピガロカテキン－３－Ｏ－ガレート（和光純薬株式会社製、以下ＥＧＣＧと略す）を４０μＬ添加して用いた。
（５）コラゲナーゼ阻害試験
　ワイン用ブドウ由来オリゴメリックプロアントシアニジンのコラゲナーゼ阻害試験は、文献（Wunschら、Hoppe Seylers Z Physiol Chem., 333,149-51（1963））の方法を改変し、以下の方法にて実施した。
　酵素溶液は、１００μｇ／ｍＬ（５５．１unit/mL）の濃度になるよう、コラゲナーゼTypeIV（シグマ社）１０mgを蒸留水１mLに溶解し、使用時に５０倍に希釈して使用した。基質溶液には、PZ-ペプチド（4-phenylazo-benzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D- Arg-OH）（Pz-Pro-Leu-Gly-Pro-D- Arg-OH、Ｓｉｇｍａ社製）の濃度が０．５μg/mLになるように２０nmol/Lの塩化カルシウムを含有するトリス塩酸緩衝液（pH７．１）に溶解して使用した。１０％ＤＭＳＯに溶解した試料溶液２０μLに、酵素溶液２０μL及び基質溶液１６０μLを混合し、３７℃で３０分間反応させた。次いで２５mMクエン酸溶液４００μLを加えて反応を停止させ、反応液中のPz-Pro-Leuを酢酸エチル２mLで抽出した。得られた酢酸エチル層の波長３２０nmにおける吸光度を、酢酸エチルを対照として測定した。また、各試料の阻害活性は、次の式で求められる阻害率で算出した。
コラゲナーゼ阻害率（%）= { １ －（ a－b ）/（ c －d ）} ×１００

　ａ：試料添加時　反応３０分後の吸光度
　ｂ：試料添加時　反応０分後の吸光度
　ｃ：試料無添加　反応３０分後の吸光度
　ｄ：試料無添加　反応０分後の吸光度
　上記式において、コラゲナーゼの活性が完全に阻害された場合には、コラゲナーゼ阻害率（％）は１００％となる。高い「阻害率（％）」を示す化合物が、阻害剤としての活性がより高いと言える。
　コラゲナーゼ阻害試験においては、陽性対照には試料溶液の代わりに、８００μg/mL（モル濃度０．１７６ｍＭ）のIsoamylphosphonyl-Glycyl-L-Proly-L-Alaine, dipotassium salt；C15H26K2N3O6P（Elastin Products Company, Inc.製、以下IP304と略す）を２０μL添加（反応時の濃度は８０μg/mL）して用いた。
試験例１
　調製例１で調製した白ワイン用ブドウ由来プロアントシアニジン画分１～６について、上記評価方法により効能等を評価したところ、表１に示す結果を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　３０％～５０％含水エタノール水溶液で抽出した白ワイン用ブドウ由来プロアントシアニジン画分に、高いメラニン生成抑制作用があることが明らになった。その活性は、含まれるオリゴメリックプロアントシアニジンの純度及びその重合度と相関が認められた。また、３０％～５０％含水エタノール水溶液で抽出を行うと、原料に含まれる高重合度のオリゴメリックプロアントシアニジンを高収率かつ高純度で抽出できることが分かった。
試験例２
　調製例２で調製した赤ワイン用ブドウ由来プロアントシアニジン画分１～８について、上記評価方法により効能等を評価し、表２に示す結果を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　３０％～６０％含水エタノール水溶液で抽出した赤ワイン用ブドウ由来プロアントシアニジン画分に高いメラニン生成抑制効果、及びヒアルロニダーゼ阻害作用があることが明らかになった。３０％～６０％含水エタノール水溶液で抽出を行うと、原料に含まれる高重合度のオリゴメリックプロアントシアニジンを高収率かつ高純度で抽出できることが分かった。
試験例３
　調製例３で調製したワイン用ブドウ由来プロアントシアニジン画分について、上記評価方法により効能等を評価し、表３に示す結果を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　今回検討を行った各種ブドウ由来プロアントシアニジン画分のメラニン生成抑制及びヒアルロニダーゼ阻害活性は、オリゴメリックプロアントシアニジンの純度又は重合度に比例していた。中でもシャルドネ、カベルネ・ソーヴィニヨン、及び甲州から得られるブドウ由来プロアントシアニジン画分は、高い美容効果が得られることが分かった。
試験例４
　調製例４で調製したワイン用ブドウ由来プロアントシアニジン画分について、上記評価方法により効能等を評価し、表４及び表５に示す結果を得た。シャルドネ由来プロアントシアニジン画分の結果を表４に、カベルネ・ソーヴィニヨン由来プロアントシアニジン画分の結果を表５に示す。表４及び表５の移行率とは、調製例４で調製したワイン用ブドウ由来プロアントシアニジン画分に含まれる単純フェノール画分量、カテキン・エピカテキン画分量、低分子ＯＰＣ画分量及び高分子ＯＰＣ画分量の合計を１００とした場合の、単純フェノール画分量、カテキン・エピカテキン画分量、低分子ＯＰＣ画分量及び高分子ＯＰＣ画分量から計算されるそれぞれの画分の割合である。例えば単純フェノール画分の移行率は、以下の式により計算される。下記式中、「カテキン・エピカテキン画分」は「カテキン画分」と略記している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　試験例１～４から、ブドウ由来プロアントシアニジン画分の分画物についてメラニンの生成抑制効果及びヒアルロニダーゼ阻害の評価を行ったところ、いずれも高分子オリゴメリックプロアントシアニジン画分に高い効果が認められた。よって高い美容効能を得るにはオリゴメリックプロアントシアニジンの中でも高い重合度を持つ抽出物が必要であることが分った。上記検討により、３０ｖ／ｖ％～６０ｖ／ｖ％、好ましくは３０ｖ／ｖ％～５０ｖ／ｖ％の含水エタノール水溶液で抽出したブドウ由来プロアントシアニジン画分に高い重合度を有するオリゴメリックプロアントシアニジンが豊富に含まれることが分かり、高い美容効果を有するオリゴメリックプロアントシアニジンを高純度で得るには、抽出する溶媒が重要であることが分った。また、特に３０～６０％のエタノール水溶液を用いると、オリゴメリックプロアントシアニジンを効率よく抽出でき、かつ高重合度のオリゴメリックプロアントシアニジンを多く含む抽出物が得られた。
試験例５
　調製例２で調製した赤ワイン用ブドウ由来プロアントシアニジン画分１～８を、８００μg/mLの１０％ＤＭＳＯ溶液に調整し、上記（５）コラゲナーゼ阻害試験の評価方法により各画分のコラゲナーゼ阻害活性を評価し、表６に示す結果を得た。表６に示すコラゲナーゼ阻害率は、上記のコラゲナーゼ阻害率の計算式から求めた値である。陽性対照（IP304）のコラゲナーゼ阻害率（上記のコラゲナーゼ阻害率の計算式から求めた値）は、７１．１％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
試験例６
　調製例３で調製した熱水抽出のワイン用ブドウ由来プロアントシアニジン画分を、８００μg/mLの１０％ＤＭＳＯ溶液に調整し、上記（５）コラゲナーゼ阻害試験の評価方法により各画分のコラゲナーゼ阻害活性を評価し、表７に示す結果を得た。表７に示すコラゲナーゼ阻害率は、上記のコラゲナーゼ阻害率の計算式から求めた値である。陽性対照（IP304）のコラゲナーゼ阻害率（上記のコラゲナーゼ阻害率の計算式から求めた値）は、８４．０％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
試験例７
　調製例４で調製したカベルネ・ソーヴィニヨン由来プロアントシアニジン画分を、８００μg/mLの１０％ＤＭＳＯ溶液に調整し、上記（５）コラゲナーゼ阻害試験の評価方法により各画分のコラゲナーゼ阻害活性を評価し、表８に示す結果を得た。表８に示すコラゲナーゼ阻害率は、上記のコラゲナーゼ阻害率の計算式から求めた値である。陽性対照（IP304）のコラゲナーゼ阻害率（上記のコラゲナーゼ阻害率の計算式から求めた値）は、８４．６％であった。表８の移行率とは、表５における移行率と同じである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　試験例５～７から、ブドウ由来プロアントシアニジン画分の分画物についてコラゲナーゼ阻害の評価を行ったところ、いずれも高分子オリゴメリックプロアントシアニジン画分に高い効果が認められた。よって、オリゴメリックプロアントシアニジンの中でも高い重合度を持つ抽出物が、高い美容効能を有することが分かった。例えば３０ｖ/ｖ％～６０ｖ/ｖ％、好ましくは３０ｖ/ｖ％～５０ｖ/ｖ％の含水エタノール水溶液で抽出したブドウ由来プロアントシアニジン画分には高い重合度を有するオリゴメリックプロアントシアニジンが豊富に含まれ、高いコラゲナーゼ阻害活性を示した。
　本発明により、飲食品、化粧品又は医薬品等の分野において有用なオリゴメリックプロアントシアニジンを高純度で精製することができる。例えば、本発明の精製方法により得られるオリゴメリックプロアントシアニジンは、優れた美白作用、ヒアルロニダーゼ阻害作用、及びコラゲナーゼ阻害作用を有し、化粧品、医薬品等の分野において有用である。

Claims (25)

  1. 　重合度の異なる複数種のオリゴメリックプロアントシアニジンを含有する原料を、水又はアルコール水溶液を抽出溶媒として抽出する抽出工程を含み、該抽出工程において、目的とするオリゴメリックプロアントシアニジンの重合度に応じて該抽出溶媒のアルコール濃度を設定し、目的の重合度のオリゴメリックプロアントシアニジンを抽出することを特徴とするオリゴメリックプロアントシアニジンの精製方法。
  2. 　抽出温度が、７０～１００℃未満である請求項１に記載の方法。
  3. 　アルコールがエタノールである請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　精製方法が、（Ａ）平均重合度が５～８未満のオリゴメリックプロアントシアニジンの精製方法である、又は（Ｂ）平均重合度が８以上のオリゴメリックプロアントシアニジンの精製方法である請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　（Ａ）精製方法が、平均重合度が５～８未満のオリゴメリックプロアントシアニジンの精製方法であり、抽出溶媒のアルコール濃度を０～２０ｖ／ｖ％とする、又は（Ｂ）精製方法が、平均重合度が８以上のオリゴメリックプロアントシアニジンの精製方法であり、抽出溶媒のアルコール濃度を３０～６０ｖ／ｖ％とする請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　精製方法が、平均重合度が８～１０のオリゴメリックプロアントシアニジンの精製方法であり、抽出溶媒が４０～５０ｖ／ｖ％のエタノール水溶液である請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　重合度の異なる複数種のオリゴメリックプロアントシアニジンを含有する原料が、植物由来である請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　植物由来の原料が、ブドウ果実、ブドウ種皮及びブドウの種子からなる群より選択される少なくとも１種のブドウ由来の原料である請求項７に記載の方法。
  9. 　ブドウ果実、ブドウ種皮及びブドウの種子からなる群より選択される少なくとも１種のブドウ由来の原料を、７０～１００℃未満で３０～６０ｖ／ｖ％のアルコール水溶液中で抽出する抽出工程を含むことを特徴とするメラニン生成抑制作用を有するオリゴメリックプロアントシアニジンの精製方法。
  10. 　オリゴメリックプロアントシアニジンを有効成分とし、該オリゴメリックプロアントシアニジンが、ブドウ果実、ブドウ種皮及びブドウの種子からなる群より選択される少なくとも１種のブドウ由来の原料を３０～６０ｖ／ｖ％のアルコール水溶液中で抽出して得られる抽出液、又は抽出物に含有されるものであることを特徴とするヒアルロニダーゼ阻害剤。
  11. 　抽出温度が、７０～１００℃未満である請求項１０に記載のヒアルロニダーゼ阻害剤。
  12. 　オリゴメリックプロアントシアニジンを有効成分とし、該オリゴメリックプロアントシアニジンが、ブドウ果実、ブドウ種皮及びブドウの種子からなる群より選択される少なくとも１種のブドウ由来の原料を３０～６０ｖ/ｖ％のアルコール水溶液中で抽出して得られる抽出液、又は抽出物に含有されるものであることを特徴とするコラゲナーゼ阻害剤。
  13. 　抽出温度が、７０～１００℃未満である請求項１２に記載のコラゲナーゼ阻害剤。
  14. 　アルコールがエタノールである請求項１０～１３のいずれか一項に記載の阻害剤。
  15. 　アルコール水溶液が、４０～５０ｖ／ｖ％のエタノール水溶液である請求項１０～１４のいずれか一項に記載の阻害剤。
  16. 　オリゴメリックプロアントシアニジンの平均重合度が、８～１０である請求項１０～１５のいずれか一項に記載の阻害剤。
  17. 　平均重合度が８～１０のオリゴメリックプロアントシアニジンを有効成分とすることを特徴とするヒアルロニダーゼ阻害剤。
  18. 　平均重合度が８～１０のオリゴメリックプロアントシアニジンを有効成分とすることを特徴とするコラゲナーゼ阻害剤。
  19. 　オリゴメリックプロアントシアニジンが、ブドウ果実、ブドウ種皮及びブドウの種子からなる群より選択される少なくとも１種のブドウ由来の原料に含まれるものである請求項１７又は１８に記載の阻害剤。
  20. 　オリゴメリックプロアントシアニジンの平均重合度が８．５～９．５である請求項１７～１９のいずれか一項に記載の阻害剤。
  21. 　オリゴメリックプロアントシアニジンが、ブドウ果実、ブドウ種皮及びブドウの種子からなる群より選択される少なくとも１種のブドウ由来の原料を、７０～１００℃未満で３０～６０ｖ／ｖ％のアルコール水溶液中で抽出して得られる抽出液、又は抽出物に含まれるものである請求項１７～２０のいずれか一項に記載の阻害剤。
  22. 　ブドウが、カベルネ・ソーヴィニヨンである請求項１９～２１のいずれか一項に記載の阻害剤。
  23. 　皮膚外用剤又は化粧品である請求項１０～２２のいずれか一項に記載の阻害剤。
  24. 　重合度の異なる複数種のオリゴメリックプロアントシアニジンを含有する原料を、水又はアルコール水溶液を抽出溶媒として抽出する抽出工程を含み、該抽出工程において、目的とするオリゴメリックプロアントシアニジンの重合度に応じて該抽出溶媒のアルコール濃度を設定し、目的の重合度のオリゴメリックプロアントシアニジンを抽出することを特徴とするオリゴメリックプロアントシアニジンの重合度の調整方法。
  25. 　（Ａ）抽出溶媒のアルコール濃度を０～２０ｖ／ｖ％とすることにより、抽出液中のオリゴメリックプロアントシアニジンの平均重合度を５～８未満に調整する、又は（Ｂ）抽出溶媒のアルコール濃度を３０～６０ｖ／ｖ％とすることにより、抽出液中のオリゴメリックプロアントシアニジンの平均重合度を８以上に調整する請求項２４に記載の方法。
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