CN110194756A - 一种制备低聚合度原花青素的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种制备低聚合度原花青素的方法，包括使用含表面活性剂的碱液处理的步骤，其中表面和活性剂优选吐温60或吐温80，碱液优选氢氧化钠或碳酸氢钠溶液。
Description
技术领域
本申请属于生物工程技术领域，具体地，本申请提供了一种制备低聚合度原花青素的方法，包括使用含表面活性剂的碱液处理的步骤。
背景技术
原花青素(Proanthocyanidin简写为PC)是一种黄烷醇类物质，天然状态下会聚合产生1-40聚合度的聚合物混合物，其上众多的酚羟基可以被氧化，进而成为花青素。原花青素是天然产物中最强的抗氧化剂之一，超过维生素C和E，对于治疗心血管病和癌症、提高机体免疫力都有着良好的效果，在药品、保健品、化妆品、食品中都有广泛的应用。
原花青素在蓝莓和葡萄中含量较高，在落叶松、黑枸杞、蔓越莓、紫薯苹果中也有存在。葡萄籽是制造葡萄酒中产生的废弃物，来源广泛，价格低廉，是目前制备原花青素最常用的原料。据报道，葡萄籽中原花青素中一半以上以聚合度大于4的高聚体形式存在，但人体能吸收利用的仅有低聚原花青素，因此制备原花青素产品过程中经常需要使用乙酸乙酯萃取等方法富集低聚原花青素。
对于葡萄籽中原花青素中占多数的高聚原花青素，目前研究采用酸处理、碱处理、亲核试剂处理、酶处理等方法将其降解为低聚花青素来利用。其中效果最好/产率最高的是处理条件温和的酶处理法，但其处理时间长达数日且需要使用价格较高的乙酰神经氨酸裂解酶等酶，造成该方法不适合大规模使用，特别是制造食品、保健品时使用。现有文献显示碱处理方法裂解效果很好，但该方法容易产生大量小片段，造成单体和二聚体原花青素产率较低，仅有酶法的一半左右。
因此，本领域中有寻找新的高产率快速处理高聚原花青素制备低聚原花青素的需求。
发明简述
发明人在研究碱法降解高聚原花青素时发现，向碱降解溶液中加入适量的表面活性剂特别是吐温80，通过影响寡聚原花青素的团聚状态，可以有效的防止单体/二聚体原花青素进一步降解为其他小分子物质，从而提高单体/二聚体原花青素产量。从而提供了一种廉价、快速、高效制备低聚合度原花青素的方法。
一方面，本申请提供了一种制备低聚合度原花青素的方法，其特征在于，包括使用含表面活性剂的碱液处理的步骤。
进一步地，其中碱液为氢氧化钠或碳酸氢钠溶液，表面活性剂为吐温60或吐温80。
进一步地，其中碱液为1M-2M的氢氧化钠或碳酸氢钠溶液，表面活性剂吐温60或吐温80的含量为0.5％-1％v/v。
进一步地，其中碱液为1M的氢氧化钠溶液，表面活性剂为1％v/v的吐温60。
进一步地，其中碱液为1M的氢氧化钠溶液，表面活性剂为1％v/v的吐温80。
进一步地，其中处理温度为40-60℃，处理时间为40分钟。
进一步地，其中处理温度为60℃。
进一步地，其中所处理的原料为原花青素粗体物、高聚原花青素、葡萄籽或脱脂葡萄籽。
进一步地，其中所处理的原料为乙酸乙酯萃取提取低聚花青素后水相中所剩余的高聚原花青素。
另一方面，本申请提供了根据上述方法制备的低聚合度原花青素产品。
本申请方法的原料可以采用各种常见的葡萄种类，包括但不限于酿酒葡萄如赤霞珠、品丽珠、皮诺、梅洛、西拉等，适合直接食用的葡萄品种如巨峰、玫瑰、红提、牛奶等以及各种野山葡萄，以及其他生产花青素的原料如蓝莓、黑枸杞、蔓越莓、紫薯、苹果等生产的原花青素粗提物。
本申请方法的原料可以采用以各种方法，包括但不限于水提、醇提、其他有机溶剂提取、超声辅助提取等提取方法生产的原青素粗提物。
本申请方法中所用的试剂可以为符合食品、药学相关标准的国产或进口型号。
相比酸、碱降解法，本发明的方法有效控制了高温、长时间降解过程中原花青素的过度降解，低聚合度原花青素的产率显著提升；相比酶法降解，本发明的方法在产率略低的情况下，大大节约了处理时间和处理费用。本发明中方法中使用的碱和吐温类表面活性剂均为食品、药品领域中常用的相对廉价的试剂/辅料，有利于保障安全性和产品的进一步加工处理。
具体实施方式
试剂和仪器
葡萄籽提取物(粗提物)：购自西安瑞盈生物科技有限公司，根据厂家描述该提取物是使用赤霞珠和梅洛酿酒葡萄籽为原料，采用超声波辅助方法水提获得；
儿茶素标准品产自SIGMA/MERCK；
吐温60和吐温80产自国药集团；
液质联方案：安捷伦/agilent 1290-6460；
反向C18柱:维美希/YMC；
其余试剂和仪器均为国产或进口的常规种类，色谱中使用色谱纯，其余为分析纯。
实施例1高聚原花青素的制备
向葡萄籽提取物中加入150倍质量的纯净水溶解，转入分液漏斗，加入450倍质量的乙酸乙酯萃取过夜(萃取三次)，所得乙酸乙酯相合并后旋转蒸发得低聚原花青素(OPC)，所得水相合并后旋转蒸发得高聚原花青素(PPC)。以上操作在避光条件下进行。
实施例2原花青素聚合度的计算和
花青素聚合度的计算
采用香草醛-甲醇法测定原花青素的质量：配制15mg/mL的香草醛甲醇溶液以及13％的盐酸溶液，两者等体积混合成为显色液；
将儿茶素标准品以甲醇定容，稀释至0.40、0.20、0.10、0.05、0.025、0.0125mg/mL，取1mL与显色液5mL混合，避光反应15分钟，测定500nm光吸收，绘制标准曲线(Y＝0.3584X+0.0110，R2＝0.9995)；
根据标准曲线测定样品中原花青素的质量浓度/质量。
采用香草醛-乙酸法测定原花青物质量：
配制15mg/mL的香草醛甲醇溶液以及3.5％的盐酸溶液，两者等体积混合成为显色液；
将儿茶素标准品以甲醇定容，稀释至0.16、0.08、0.04、0.02、0.01、0.005μmol/mL，取1mL与显色液5mL混合，避光反应15分钟，测定500nm光吸收，绘制标准曲线(Y＝1.2533X-0.0243，R2＝0.9964)；
根据标准曲线测定样品中原花青素的物质量。
根据公式计算聚合度：聚合度＝原青花素质量(μg)/290(单体儿茶素分子量)×物质的量(μmol)
RPHPLC-MS检测单体和二聚体原花青素
流动相乙腈和5％磷酸；流速0.8mL/min；柱温：28℃；280nm检测；MS检测确定m/z＝289和577的成分含量(已经使用儿茶素、表儿茶素、二聚体原花青素B1和B2纯品验证过此检测方法的可靠性)。
实施例3低温度短时间处理降解高聚原花青素
响应面条件设计和参数验证试验数据未完全显示，仅展示部分有代表性的数据。
基本处理方法为将一定量高聚原花青素加入约20倍质量的，预热到所需温度的降解溶液中；在氮气气氛下反应所需时间；使用盐酸中和至pH7终止反应；按照实施例2的方法RPHPLC-MS检测单体和二聚体原花青素的浓度和含量，并据此计算单体和二聚体原花青素的产率；并按照实施例2的方法检测聚合度。
方案1：
降解溶液为：1M NaOH；降解温度为：60℃；反应时间为：40分钟(经过优化的，效果较好的碱降解方案)；
方案2：
降解溶液为：含1％v/v吐温60的1M NaOH；降解温度为：60℃；反应时间为：40分钟；
方案3：
降解溶液为：含1％v/v吐温60的1M NaOH；降解温度为：40℃；反应时间为：40分钟；
方案4：
降解溶液为：含0.5％v/v吐温60的1M NaOH；降解温度为：60℃；反应时间为：40分钟；
方案5：
降解溶液为：含2％v/v吐温60的1M NaOH；降解温度为：60℃；反应时间为：40分钟；
方案6：
降解溶液为：含1％v/v吐温80的1M NaOH；降解温度为：60℃；反应时间为：40分钟；
方案7：
降解溶液为：含0.5％v/v吐温60的2M NaHCO3；降解温度为：60℃；反应时间为：40分钟。
实施例4实验结果和分析
各方案的产物聚合度和单体和二聚体原花青素的产率如下表所示：
*乙酸乙酯萃取后水相中剩余的高聚原花青素聚合度测定为约5.73。
由以上结果可见，优选地各种方案均有效降低了原花青素聚合度，但未加入表面活性剂时，由于产生大量过度降解的小分子片段造成单体和二聚体原花青素产率较低(结果与先前文献结果相近；液相结果显示此时小分子峰面积已经超过了单体和二聚体原花青素峰；响应面实验中如果减少时间、降低温度，聚合度会明显上升，对单体和二聚体原花青素产率同样不利，难以达到平衡)，明显不及国内论文中记载的50mg/g的酶解处理产率。
加入0.5％v/v-2％v/v的吐温60或吐温80可以有效提高单体和二聚体原花青素产率(提高约30％)，甚至可以进一步降低处理温度而基本不影响产率(可以更好的保持原青花素产品的营养价值/节约生产成本)，对比液相结果和文献中记载的酶处理结果，可以推测这种改善应该是源于表面活性剂对寡聚原花青素的团聚状态的影响，使得碱对C-C键的断裂更能按照需要进行。
Claims (10)
1.一种制备低聚合度原花青素的方法，其特征在于，包括使用含表面活性剂的碱液处理的步骤。
2.根据权利要求1的方法，其中碱液为氢氧化钠或碳酸氢钠溶液，表面活性剂为吐温60或吐温80。
3.根据权利要求2的方法，其中碱液为1M-2M的氢氧化钠或碳酸氢钠溶液，表面活性剂吐温60或吐温80的含量为0.5％-1％v/v。
4.根据权利要求3的方法，其中碱液为1M的氢氧化钠溶液，表面活性剂为1％v/v的吐温60。
5.根据权利要求3的方法，其中碱液为1M的氢氧化钠溶液，表面活性剂为1％v/v的吐温80。
6.根据权利要求4或5的方法，其中处理温度为40-60℃，处理时间为40分钟。
7.根据权利要求6的方法，其中处理温度为60℃。
8.根据权利要求1-7任一项的方法，其中所处理的原料为高聚原花青素、葡萄籽或脱脂葡萄籽。
9.根据权利要求8的方法，其中所处理的原料为乙酸乙酯萃取提取低聚花青素后水相中所剩余的高聚原花青素。
10.根据权利要求1-9任一项的方法制备的低聚合度原花青素产品。
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