JP2019199437A - 皮膚外用剤 - Google Patents

Abstract

【課題】生体安全性及び有効性にすぐれた天然物由来成分からなる新規の皮膚外用の有効成分の提供。【解決手段】イソフラボンであるフォルモノネチン及びバイオカニンＡ又はそれらイソフラボンを含む植物又はその抽出物を有効成分として配合した皮膚外用剤。好ましくは上記植物がマメ科シャジクソウ属（Trifolium）の植物であることを特徴とする皮膚外用剤。低酸素誘導因子の転写活性抑制作用を指標とする皮膚菲薄化の改善剤のスクリーニング方法。【選択図】なし

Description

本発明は、植物由来のイソフラボンを有効成分とする皮膚外用剤に関するものである。

従来、加齢に伴い、細胞増殖・分化の不活化や、ホルモン分泌の低下、皮膚を構成する細胞外マトリックス成分（コラーゲン、ラミニン等）の量的低下、さらに、筋繊維の減少による筋力低下等の理由により、肌の老化現象（シワ、タルミ等）が生じることが知られている。

細胞の不健全化や老化を予防及び改善する目的で、従来、種々の活性成分が提案され、それら活性成分を配合した化粧品、飲食品及び医薬品が上市されている。例えば、α−ヒドロキシカルボン酸、胎盤抽出液、γ−アミノ−β−ヒドロキシ酪酸等の細胞賦活成分；コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸又はその塩等の細胞外マトリックス成分；尿素等の保湿剤；が挙げられる。

従来、細胞の老化現象や不健全化のメカニズムに基づいて、植物抽出物を有効成分とする保湿剤や抗炎症剤が提案されている（特許文献１，２）。

特開2001-064192号 特開2001-122730号

従来、植物等の天然物由来で、新たな有効性を発揮する皮膚外用の有効成分が求められている。

本出願人は、上記課題を解決するために、紫外線、加齢又はホルモン分泌の低下等の原因で皮膚が薄くなる現象（菲薄化）に着目し、皮膚の菲薄化を予防、改善することで、皮膚のバリア機能を改善するための有効成分を見出すことを目的とする。
すなわち、本発明は、植物由来のイソフラボン（フォルモノネチン及びバイオカニンＡ）、又はそれらイソフラボン又を含む植物抽出物を有効成分とする皮膚外用剤である。

本発明によれば、本発明の有効成分により、皮膚の菲薄化を予防、改善するができる皮膚外用剤を提供することができる。

以下、本発明の好ましい実施の形態について詳細に説明する。
本発明の有効成分であるイソフラボンは、フォルモノネチン（formononetin）及びバイオカニンＡ（Biochanin A）である。また、本発明の有効成分は、それら２種のイソフラボンに加えて、他のイソフラボン他のイソフラボン（プエラリン、ダイジン、ゲニスチン、ダイゼイン、グリシテイン、ゲニステイン、プラテンセイン、シュードバプチゲニン、イリロン、又はプルネチン）を含むことでもよい。

本発明の有効成分である２種のイソフラボンを含む植物としては、マメ科植物が挙げられる。本発明においては、マメ科シャジクソウ属（Trifolium）の植物が好ましいが、上記２種のイソフラボンを含む植物も使用可能である。シャジクソウ属の植物としては、例えば、アカツメクサ（別名：ムラサキツメクサ、Trifolium pratense）、シロツメクサ（Trifolium repens）、コメツブツメクサ（Trifolium dubium）、クスダマツメクサ（Trifolium campestre）、及びモモイロツメクサ（Trifolium repens L. form. roseum Peterm.）、ベニバナツメクサ（Trifolium incarnatum L.）等が挙げられる。抽出に使用可能な部位としては、全草、葉、花、茎又は根が挙げられる。

本発明の有効成分を含む植物抽出物の調製は、抽出対象物である植物を、必要ならば予め水洗して異物を除いた後、これをそのままもしくは乾燥し、さらに必要ならば細切或いは粉砕した上、浸漬法、向流抽出法、水蒸気蒸留法等の常法に従って抽出溶媒と接触させることによって行うことができる。また、本発明において、超臨界抽出法を採用してもよい。

抽出物処理に使用する抽出溶媒としては、水；メタノール、エタノール、プロパノールなどの低級アルコール類；エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリンなどの多価アルコール類；酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチルなどのエステル類；アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類；エチルエーテル、イソプロピルエーテルなどのエーテル類；ｎ−ヘキサン、トルエン、クロロホルムなどの炭化水素系溶媒などが挙げられ、それらは単独でもしくは二種以上混合して用いられる。

抽出物の調製に当たって、抽出液のｐＨに特に制限はないが、一般にはｐＨ３〜９の範囲とすることが好ましい。ｐＨの調整は、前記した抽出溶媒中に、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ性調整剤や、クエン酸、塩酸、リン酸、硫酸などの酸性調整剤等を配合することによって行うことができる。

抽出温度、時間等の抽出条件は、用いる溶媒の種類やｐＨ、或いは植物素材の大きさ等によっても異なるが、例えばメタノール又はエタノール、或いは水と低級アルコール又は多価アルコールとの混合溶媒を抽出溶媒とする浸漬法の場合であれば、抽出温度は０〜８０℃の範囲である。抽出時間は、４℃の冷温抽出の場合で１時間〜７日間の範囲とするのがよく、また、４０℃付近の中温抽出では、１時間〜３日間の範囲とするのがよく、７０〜８０℃の高温抽出の場合は、１時間〜２４時間の範囲とするのがよい。浸漬法の場合、浴比は重量比で、植物素材に対して溶媒が一般に１〜２００倍量、好ましくは１〜１００倍量の範囲となるようにするのがよい。

以上のようにして調製される植物抽出物は、さらに、活性炭処理、イオン交換樹脂処理、合成吸着剤、シリカゲル、及び再結晶処理のいずれか１種又は２種以上を組み合わせて、環状アデノシンモノリン酸を高濃度に含む抽出物に調製することが好ましい。活性炭としては、松等の木、竹、椰子殻、胡桃殻等の植物質のほか、石炭質、石油質等を原材料として、それらの原材料に水蒸気や二酸化炭素、空気等のガスを使う高温炭化法等の物理的な方法や塩化亜鉛等の化学薬品を使って処理した上で加熱し、多孔質にする化学的な方法による活性化処理を施して得られる活性炭等何れを用いても良い。また、イオン交換樹脂としては、弱塩基性陰イオン交換樹脂、強酸性陽イオン交換樹脂、強塩基性インイオン交換樹脂、弱酸性陽イオン交換樹脂等が挙げられる。また、合成吸着剤としては、キレート樹脂、強酸性陽イオン吸着樹脂、スチレン／ジビニルベンゼン共重合体、メタクリル酸エステル重合体等の非イオン性樹脂が挙げられる。

以上のように抽出処理されて得られる抽出物に含まれるイソフラボン量は、フォルモノネチンの場合、少なくとも４０ｐｐｍ以上が好ましく、より好ましくは５０ｐｐｍ以上であり、さらに好ましくは、８０ｐｐｍ以上である。また、バイオカニンＡの場合、２０ｐｐｍ以上が好ましく、より好ましくは３０ｐｐｍ以上であり、さらに好ましくは８０ｐｐｍ以上である。さらに、本発明においては、抽出物に含まれるフォルモノネチン及びバイオカニンAの合計量が、６０ｐｐｍ以上が好ましく、より好ましくは８０ｐｐｍ以上であり、さらに好ましくは１００ｐｐｍ以上である。

本発明においては、皮膚外用剤とは、化粧料、医薬部外品、外用医薬品を含み、例えば、乳液、クリーム、ローション、エッセンス、パック、口紅、ファンデーション、リクイドファンデーション、メイクアッププレスパウダー、ほほ紅、白粉、洗顔料、ボディシャンプー、スリミング剤、毛髪用シャンプー、石けん等が挙げられ、また、浴剤等も挙げられるが、勿論これらに限定されるものではない。

皮膚外用剤には、本発明に係る抽出物の他に、皮膚外用剤に用いられる成分、例えば油性成分、界面活性剤（合成系、天然物系）、保湿剤、増粘剤、防腐・殺菌剤、粉体成分、紫外線吸収剤、抗酸化剤、色素、香料等を必要に応じて適宜配合することができる。また、本発明に係る抽出物、加水分解物又は発酵物の有効性、特長を損なわない限り、他の生理活性成分を組み合わせて配合することも何ら差し支えない。

本発明に係る発酵物を皮膚外用剤に利用する場合、それらに配合可能な成分、例えば、油性成分、界面活性剤（合成系、天然物系）、乳化剤、保湿剤、増粘剤、防腐・殺菌剤、消泡剤、粉体成分、抗酸化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、色素、香料等を必要に応じて適宜配合することができる。また、本発明に係る発酵物の有効性、特長を損なわない限り、他の生理活性成分と組み合わせて配合することも何ら差し支えない。

ここで、油性成分としては、例えば、ハス油、オリーブ油、ホホバ油、ヒマシ油、大豆油、米油、米糠油、米胚芽油、ヤシ油、カミツレ油、パーム油、カカオ油、メドウフォーム油、ベルガモット油、ローズヒップ油、アラビアコーヒーノキ種子油、ランベンダー油、シアーバター、ティーツリー油、アボガド油、マカデミアナッツ油、バニラ油、植物由来スクワラン等の植物由来の油脂類；ミンク油、タートル油等の動物由来の油脂類；ミツロウ、カルナウバロウ、ライスワックス、ラノリン等のロウ類；流動パラフィン、ワセリン、パラフィンワックス、スクワラン等の炭化水素類；ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、イソステアリン酸、エイコセン酸等の脂肪酸類；ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコール等の高級アルコール類；ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、オレイン酸ブチル、イソオクタン酸セチル、２−エチルヘキシルグリセライド、高級脂肪酸オクチルドデシル（ステアリン酸オクチルドデシル等）等の合成エステル類及び合成トリグリセライド類等が挙げられる。

また、界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル等の非イオン界面活性剤；脂肪酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレン脂肪アミン硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル燐酸塩、α−スルホン化脂肪酸アルキルエステル塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル燐酸塩等のアニオン界面活性剤；第四級アンモニウム塩、第一級〜第三級脂肪アミン塩、トリアルキルベンジルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩、２−アルキル−１−アルキル−１−ヒドロキシエチルイミダゾリニウム塩、Ｎ，Ｎ−ジアルキルモルフォルニウム塩、ポリエチレンポリアミン脂肪酸アミド塩等のカチオン界面活性剤；Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−アルキル−Ｎ−カルボキシメチルアンモニオベタイン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリアルキル−Ｎ−アルキレンアンモニオカルボキシベタイン、Ｎ−アシルアミドプロピル−Ｎ′，Ｎ′−ジメチル−Ｎ′−β−ヒドロキシプロピルアンモニオスルホベタイン等の両性界面活性剤等を使用することができる。

また、乳化剤又は乳化助剤としては、酵素処理ステビア等のステビア誘導体、サポニン又はその誘導体、カゼイン又はその塩（ナトリウム等）、糖と蛋白質の複合体、ショ糖又はそのエステル、ラクトース、大豆由来の水溶性多糖、大豆由来蛋白質と多糖の複合体、ラノリン又はその誘導体、コレステロール、ステビア誘導体（ステビア酵素発酵物等）、ケイ酸塩（アルミニウム、マグネシウム等）、炭酸塩（カルシウム、ナトリウム等）、サポニン及びその誘導体、レシチン及びその誘導体（水素添加レシチン等）、乳酸菌醗酵米、乳酸菌醗酵発芽米、乳酸菌醗酵穀類（麦類、豆類、雑穀等）等を配合することもできる。

また、保湿剤としては、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトール、キシリトール、ピロリドンカルボン酸ナトリウム、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン・メタクリル酸ブチル共重合体液等があり、さらにトレハロース等の糖類、ムコ多糖類（例えば、ヒアルロン酸及びその誘導体、コンドロイチン及びその誘導体、ヘパリン及びその誘導体等）、チューベロース多糖体、エラスチン及びその誘導体、コラーゲン及びその誘導体、ＮＭＦ関連物質、加水分解コンキオリン、加水分解シルク、スフィンゴモナス培養物、スフィンゴ糖脂質、セラミド、乳酸、尿素、高級脂肪酸オクチルドデシル、海藻抽出物、シラン根（白及）抽出物、各種アミノ酸及びそれらの誘導体が挙げられる。

また、増粘剤としては、例えば、アルギン酸、寒天、カラギーナン、フコイダン等の褐藻、緑藻又は紅藻由来成分；シラン根（白及）抽出物；ペクチン、ローカストビーンガム、アロエ多糖体、アルカリゲネス産生多糖体等の多糖類；キサンタンガム、トラガントガム、ローストビーンガム、グアーガム等のガム類；カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース等のセルロース誘導体；ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、マスチック樹脂、アクリル酸・メタクリル酸共重合体等の合成高分子類；ヒアルロン酸及びその誘導体；ポリグルタミン酸及びその誘導体等が挙げられる。

また、防腐・殺菌剤としては、例えば、尿素；パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル等のパラオキシ安息香酸エステル類；フェノキシエタノール、ジクロロフェン、ヘキサクロロフェン、塩酸クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、サリチル酸、エタノール、ウンデシレン酸、フェノール類、ジャマール（イミダゾデイニールウレア）、ポリリン酸、プロパンジオール、１，２−ペンタンジオール、各種精油類、樹皮乾留物、大根発酵液、サトウキビ等の植物由来のエタノール又は１，３−ブチレングリコール等がある。

また、粉体成分としては、例えば、セリサイト、酸化チタン、タルク、カオリン、ベントナイト、酸化亜鉛、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、酸化ジルコニウム、硫酸バリウム、無水ケイ酸、雲母、ナイロンパウダー、ポリエチレンパウダー、シルクパウダー、セルロース系パウダー、穀類（米、麦、トウモロコシ、キビ等）のパウダー、豆類（大豆、小豆等）のパウダー等がある。

また、紫外線吸収剤としては、例えば、パラアミノ安息香酸エチル、パラジメチルアミノ安息香酸エチルヘキシル、サリチル酸アミル及びその誘導体、パラメトキシ桂皮酸２−エチルヘキシル、桂皮酸オクチル、オキシベンゾン、２，４−ジヒドロキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン−５−スルホン酸塩、４−ターシャリーブチル−４−メトキシベンゾイルメタン、２−（２−ヒドロキシ−５−メチルフェニル）ベンゾトリアゾール、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチル、アロエ抽出物等がある。

また、消泡剤とは、例えば、エタノール、イソプロパノール、ジシロキサン、ジメチルポリシクロサン、ジメチコンケイ酸シリカ、トリシロキサン、シリル化シリカ、ジメチコン、トリメチルシロキシケイ酸、ＤＰＧイソボルニルエーテル等がある。

また、抗酸化剤としては、例えば、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、没食子酸プロピル、ムラサキシキブの抽出物、シラン根の抽出物、シャクヤク抽出物、ビタミンＥ及びその誘導体（例えば、ビタミンＥニコチネート、ビタミンＥリノレート等）等がある。

また、キレート剤としては、例えば、エチレンジアミンヒドロキシエチル三酢酸三ナトリウム、エデト酸又はその塩類、グルコン酸、フィチン酸、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、ヒドロキシエタンジホスホン酸四ナトリウム等がある。

また、ｐＨ調整剤としては、例えば、クエン酸又はその塩類、乳酸又はその塩類、グリコール酸、コハク酸、塩酸、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等がある。

また、美白剤としては、ｔ−シクロアミノ酸誘導体、コウジ酸及びその誘導体、アスコルビン酸及びその誘導体、ハイドロキノン又はその誘導体、エラグ酸及びその誘導体、ニコチン酸及びその誘導体、レゾルシノール誘導体、トラネキサム酸及びその誘導体、４−メトキシサリチル酸カリウム塩、マグノリグナン（5,5'−ジプロピル−ビフェニル−2,2’−ジオール）、ヒドロキシ安息香酸及びその誘導体、ビタミンＥ及びその誘導体、α−ヒドロキシ酸、ＡＭＰ（アデノシンモノホスフェイト、アデノシン１リン酸）が挙げられ、これらを単独で配合しても、複数を組み合わせて配合しても良い。

また、上記のコウジ酸誘導体としては、例えばコウジ酸モノブチレート、コウジ酸モノカプレート、コウジ酸モノパルミテート、コウジ酸ジブチレート等のコウジ酸エステル類、コウジ酸エーテル類、コウジ酸グルコシド等のコウジ酸糖誘導体等が、アスコルビン酸誘導体としては、例えばＬ−アスコルビン酸−２−リン酸エステルナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸エステルマグネシウム、Ｌ−アスコルビン酸−２−硫酸エステルナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸−２−硫酸エステルマグネシウム等のアスコルビン酸エステル塩類、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド、Ｌ−アスコルビン酸−５−グルコシド、アスコルビルトコフェリルマレイン酸、アスコルビルトコフェリルリン酸Ｋ、ミリスチル３−グリセリルアスコルビン酸、カプリリル２−グリセリルアスコルビン酸等のアスコルビン酸糖誘導体、それらアスコルビン酸糖誘導体の６位アシル化物（アシル基は、ヘキサノイル基、オクタノイル基、デカノイル基等）、Ｌ−アスコルビン酸テトライソパルミチン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸テトララウリン酸エステル等のＬ−アスコルビン酸テトラ脂肪酸エステル類、３−Ｏ−エチルアスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸−６−Ｏ−パルミテートナトリウム、グリセリルアスコルビン酸又はそのアシル化誘導体、ビスグリセリルアスコルビン酸等のアスコルビン酸グルセリン誘導体、Ｌ−アスコルビン酸リン酸アミノプロピル、Ｌ−アスコルビン酸のヒアルロン酸誘導体、３−Ｏ−Ｄラクトース−Ｌ−アスコルビン酸、イソステアリルアスコルビルリン酸塩等が、ハイドロキノン誘導体としては、アルブチン（ハイドロキノン−β−Ｄ−グルコピラノシド）、α−アルブチン（ハイドロキノン−α−Ｄ−グルコピラノシド）等が、トラネキサム酸誘導体としては、トラネキサム酸エステル（例えば、トラネキサム酸ラウリルエステル、トラネキサム酸ヘキサデシルエステル、トラネキサム酸セチルエステル又はその塩）、トラネキサム酸のアミド体（例えば、トラネキサム酸メチルアミド）等が挙げられ、レゾルシノール誘導体としては、例えば、４−ｎ−ブチルレゾルシノール、４−イソアミルレゾルシノール等が、２，５−ジヒドロキシ安息香酸誘導体としては、例えば２，５−ジアセトキシ安息香酸、２−アセトキシ−５−ヒドロキシ安息香酸、２−ヒドロキシ−５−プロピオニルオキシ安息香酸等が、ニコチン酸誘導体としては、例えばニコチン酸アミド、ニコチン酸ベンジル等が、α−ヒドロキシ酸としては、例えば乳酸、リンゴ酸、コハク酸、クエン酸、α−ヒドロキシオクタン酸等がある。

また、生理活性成分としては、例えば、胎盤抽出液、ソウハクヒ抽出物、ユキノシタ抽出物、シソ抽出物、米糠抽出物又はその加水分解物、白芥子抽出物又はその加水分解物、白芥子の発酵物、シャクヤク抽出物又はその加水分解物、乳酸菌醗酵米、ムラサキシキブ抽出物、ハス種子抽出物又はその加水分解物、ハス種子発酵物、ハトムギ加水分解物、ハトムギ種子発酵物、ローヤルゼリー発酵物、酒粕抽出物又はそれに含まれるセラミド、酒粕発酵物、パンダヌス・アマリリフォリウス(Pandanus amaryllifolius Roxb.)抽出物、アルカンジェリシア・フラバ（Arcangelicia flava Merrilli）抽出物、カミツレ抽出物等が挙げられる。また、サンゴ草抽出物、イネの葉の抽出物又はその加水分解物、ナス（ハス、長ナス、賀茂ナス、米ナス等）抽出物又はその加水分解物、アンズ果実の抽出物、カタメンキリンサイ等の海藻の抽出物、アマモ等の海産顕花植物の抽出物、豆乳発酵物、クラゲ水、米抽出物又はその加水分解物、米醗酵エキス、発芽米抽出物又はその加水分解物、発芽米発酵物、黒豆抽出物又はその加水分解物、黒糖抽出物又はその発酵物、ダマスクバラの花の抽出物、イランイラン花抽出物、タケノコの皮の抽出物、リノール酸及びその誘導体もしくは加工物（例えばリポソーム化リノール酸等）、動物又は魚由来のコラーゲン及びその誘導体、エラスチン及びその誘導体、グリチルリチン酸及びその誘導体（ジカリウム塩等）、ｔ−シクロアミノ酸誘導体、ビタミンＡ及びその誘導体、アラントイン、ジイソプロピルアミンジクロロアセテート、γ−アミノ−β−ヒドロキシ酪酸、ゲンチアナ抽出物、甘草抽出物、ニンジン抽出物、オタネニンジン抽出物又はその発酵物、ツバキ抽出物、紅参抽出物、ミツイシコンブ抽出物、ヘチマ抽出物、アナアオサ抽出物、モモ抽出物、ウメ抽出物、桃仁抽出物、キウイ抽出物、ヒマワリ抽出物、ジュアゼイロ（Zizyphus joazeiro)抽出物、パウダルコ樹皮抽出物、萱草（デイリリー）抽出物または発酵物、ハイビスカスの花抽出物または発酵物、ハゴロモグサ抽出物、チェリモヤ抽出物、マンゴー抽出物、マンゴスチン抽出物、フノリ抽出物、烏龍茶抽出物、紅富貴抽出物、シラン抽出物、サツマイモ抽出物、山椒果皮又は種皮の抽出物または加水分解物、ベニバナ花抽出物、カサブランカ抽出物、甘藷抽出物又はその発酵物、グアバ葉抽出物、オリーブ葉抽出物、セイヨウトチノキ抽出物、ショウガ抽出物、バニラ抽出物、ドクダミ抽出物、晩白柚抽出物、アロエ抽出物、アロエベラ抽出物、イチジク花抽出物、リンゴ抽出物、ホワイトアスパラガス抽出物等がある。

次に、製造例、処方例及び試験例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。なお、以下において、部はすべて重量部を、また％はすべて重量％を意味する。

本発明の有効成分である２種のイソフラボンを含む植物抽出物の調製方法を以下に示す。

製造例１．抽出物の調製（１）
アカツメクサの花乾燥物粉砕物１００ｇに、精製水とエタノールの混合液（１：１）を１０００ｇ加え、４０℃で２時間抽出し、これを濾過して、褐色透明のアカツメクサ花抽出物（固形分濃度１．２８％）９４７ｇを得た。

製造例２．抽出物の調製（２）
アカツメクサの花乾燥物粉砕物１００ｇに、精製水とエタノールの混合液（７：３）を１０００ｇ加え、４０℃で２時間抽出し、これを濾過して、褐色透明のアカツメクサ花抽出物（固形分濃度１．３０％）９５０ｇを得た。

製造例３．抽出物の調製（３）
水洗したアカツメクサの花乾燥物粉砕物１００ｇに、精製水とエタノールの混合液（１：１）を１０００ｇ加え、室温で４日間抽出し、抽出液を濾過して、褐色透明のアカツメクサ花抽出物（固形分濃度１．４３％）９６２ｇを得た。

製造例４．抽出物の調製（４）
アカツメクサの花乾燥物粉砕物１００ｇに、精製水と１，３−プロパンジオールの混合液（３：７）を１０００ｇ加え、室温で４日間抽出し、抽出液を濾過して、褐色透明のアカツメクサ花抽出物（固形分濃度１．３１％）９１８ｇを得た。

比較製造例１．抽出物の調製
アカツメクサの花乾燥物粉砕物１００ｇに、精製水を１０００ｇ加え、４０℃で２時間抽出し、これを濾過して、褐色透明のアカツメクサ花抽出物（固形分濃度１．６６％）９３８ｇを得た。

試験例１．イソフラボンの定量
［定量法］
製造例１〜３及び比較製造例１の抽出液２．０ｇを精密に量り、７０％エタノール水溶液に溶かして正確に１０ｍＬとし、試料溶液とした。試料溶液１０μＬを正確にとり、次の試験条件で液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により試験を行った。予め作成した検量線から、本品中のフォルモノネチンおよびバイオカニンＡの含量（％）を算出した。
本品中のフォルモノネチン又はバイオカニンＡの含量(ppm)＝検量線より求めた試料溶液中の成分量の含量（ppm）×(２／本品の採取量(ｇ))×５
［検量線の作成］
定量用のフォルモノネチン、及びバイオカニンＡの約１０．０ｍｇを精密に量り、７０％エタノール水溶液に溶かして正確に１００ｍＬとし、これを標準原液とした。次に、標準原液から１ｍＬと２ｍＬを各々正確に量り、７０％エタノール水溶液を加えて正確に１０ｍＬとし、標準溶液とした。標準原液を試料溶液と同一条件で、液体クロマトグラフィーにより試験を行う．得られたクロマトグラムから，横軸にピーク面積，縦軸に標準溶液中の標準品の濃度（ｗ／ｖ％）とし、検量線を作成した。
［試験条件］
（１）検出器：紫外吸光光度計（測定波長：２５５ｎｍ）
（２）カラム：内径４．６ｍｍ，長さ１５０ｍｍのステンレス管に平均粒径５μｍの液体クロマトグラフィー用オクタデシルシリル化シリカゲルを充填した。
（３）カラム温度：３０℃付近の一定温度
（４）移動相Ａ：アセトニトリル／ギ酸（１００）混液（９９．９：０．１）
（５）移動相Ｂ：水/ギ酸（１００）混液（９９．９：０．１）
（６）移動相の送液：移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比を次のように変えて濃度勾配を制御する。
（i）注入後の時間：0〜40分，移動相A(Vol％)：5→40, 移動相B(Vol％)：95→60
（ii）注入後の時間：40〜55分，移動相A(Vol％)：40, 移動相B(Vol％)：60
（８）流量：毎分１．０ｍＬ
（９）面積測定範囲：試料注入後５５分間

製造例１〜３の抽出物、及び比較製造例１の抽出物に含まれるフォルモノネチン及びバイオカニンＡの測定結果を表１に示す。
［表１］

比較製造例１の抽出物に含まれるフォルモノネチン及びバイオカニンＡの量はごく微量であり、本発明の効果を奏する実質的な量を含まないことが確認された。

以下、本発明に係る有効成分と、皮膚の菲薄化の予防、改善効果の評価について説明する。本実施の形態においては、表皮細胞に分化する細胞であって、皮膚のバリア機能及びターンオーバーに関与する表皮幹細胞に着目し、本発明に係る有効成分による表皮幹細胞の維持及び分化に関与する因子への作用について評価した。

本実施の形態においては、幹細胞の維持や炎症の制御などの恒常性維持機構に関与している低酸素誘導因子（ＨＩＦ）−１α（生化学，第85巻，第3号，pp187-195，2013）に着目し、本発明に係る有効成分によるＨＩＦ−１αの転写活性促進効果を評価した。

試験例１．ＨＩＦ−１αの転写活性評価
正常ヒト表皮細胞を増殖添加剤含有Humedia-KG2［クラボウ社製］にて１×１０^５個／ｍＬ調製し、９６穴マイクロプレートに１００μＬを播種して、５％ＣＯ_２、飽和水蒸気下、３７℃で培養した。２４時間培養後、ＨＩＦ−１αが結合する塩基配列(HRE)を組み込んだホタルルシフェラーゼレポーターベクターおよび内部標準としてのウミシイタケルシフェラーゼを組み込んだベクター（Cignal HIF Pathway Reporter Assay Kit）[QIAGEN社製]を細胞へViaFectトランスフェクション試薬 (Promega) を用いて導入した。更に２４時間後、製造例１〜３の抽出物を試料溶液として培地に添加した。ここで、試料溶液は、培地中に対する溶液としての最終濃度が０．５％，１．０％となるように添加した。２４時間後、細胞内容物を抽出し、細胞抽出液のルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼアッセイシステム(Promega)を用い、ルミノメーター (Promega GloMax-Multi＋Detection System)にて測定した。ホタルルシフェラーゼの測定値（HRE転写量）をウミシイタケルシフェラーゼの測定値 (細胞量) で割った数値を細胞あたりのＨＩＦ−１α転写活性作用とし、試料溶液の代わりに比較対照として５０％１，３−ブチレングリコール（１．０％）を添加した区（コントロール）のＨＩＦ―１α転写活性作用を１００としてその相対値を算出した。また、比較製造例１の抽出物とのＨＩＦ−１α転写活性作用を比較するために、同時にその抽出物について０．５％，１．０％の濃度にて試験を行った。

試験例２の結果を表２に示す。
［表２］

表２に示すように、本発明に係る有効成分（フォルモノネチン及びバイオカニンＡ）を含む抽出物は、濃度依存的にＨＩＦ−１α転写活性亢進効果を有することが確認された。一方で、フォルモノネチン及びバイオカニンＡを実質的に含まない比較製造例１は、ＨＩＦ−１α転写活性亢進効果が認められなかった。

次に、表皮幹細胞のマーカータンパク質であるＭＣＳＰ（Melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan）を使用して、本発明に係る有効成分のＭＣＳＰ発現促進効果を評価した。

試験例３．ＭＣＳＰ発現促進効果の評価
正常表皮角化細胞（NHEK(F)）を８×１０^３cell/wellで９６ウェルプレートに播種後、HuMedia-KG2培地（倉敷紡績株式会社）を用いて、３７℃で２４時間培養した。培養後、当該培地に製造例１，２の抽出物を試料溶液として添加し、さらに、４８時間培養した。ここで、試料溶液は、試験培地中の溶液としての最終濃度がそれぞれ０．５％，１．０％となるように添加した。培養終了後、ＭＣＳＰ抗体を用いた免疫的検出を行った。すなわち、ＰＢＳ（−）洗浄後、細胞を１５％中性緩衝ホルマリン液にて３０分処理して固定、０．５％Triton X-100溶液で１時間浸透処理、５倍希釈ブロッキングワンＰ（ナカライテスク社）溶液で２時間処理によるブロッキングを行った後、ＭＣＳＰ抗体を添加し、室温で１時間静置した。次にＰＢＳ（−）洗浄し、蛍光ラベルした二次抗体を添加してさらに暗所で一定時間静置した。その後ＰＢＳ（−）洗浄し、蛍光強度の測定を行った。まず、蛍光マイクロプレートリーダー（フルオロスキャンアセント、Thermo Fisher Scientific社製）を使用し、二次抗体の蛍光ラベル（Alexa Fluor488）をEx＝485nm、Em＝520nmで測定し、その後、Hoechst33342によるDNA染色を行い、Ex＝355nm、Em＝460nmの測定を行った。それぞれの試験区のAlexa Fluor488の蛍光強度をHoechst33342の蛍光強度で割ることで、ＭＣＳＰ発現量を求めた。試料溶液に代えて５０％１，３−ブチレングリコール（１．０％）を添加した試料無添加の場合（コントロール）についても上記と同様の操作を行った。ここに得られたＭＣＳＰ発現量に対する各試料添加時のＭＣＳＰ発現量の相対値を求め、ＭＣＳＰ発現促進量（％）とした。

試験例３の結果を表３に示す。
［表３］

表３に示すように、本発明に係る有効成分（フォルモノネチン及びバイオカニンＡ）を含む抽出物は濃度依存的にＭＣＳＰ発現促進効果を有することが確認された。一方で、フォルモノネチン及びバイオカニンＡを実質的に含まない比較製造例１では、ＭＣＳＰ発現促進効果が認められなかった。

試験例４．表皮３次元モデル未分化維持効果
ヒト表皮モデル作製キットを使用して表皮細胞を培養カップに播種し、製造例１〜２の抽出物を試料溶液としてそれぞれ１．０％含有した培地を添加して３週間培養した。培地は２日おきに交換した。培養終了後、切片を作成し、ＨＥ染色とＭＳＣＰ蛍光免疫染色を行い、それぞれ光学顕微鏡と蛍光顕微鏡を用いて切片を観察した。また、試料溶液に代えて、５０％１，３−ブチレングリコール（１．０％）を含む培地（コントロール）で培養した細胞と、比較製造例１の抽出物を含む培地（比較対象）で培養した細胞についても同様に観察を行った。

試験例４の観察結果により、コントロール及び比較対象の抽出物と比較して、本発明に係る有効成分（フォルモノネチン及びバイオカニンＡ）を含む抽出物が３週間経過時点でも表皮幹細胞の未分化を維持することができることを確認した。

試験例１〜４の結果から、本発明に係る有効成分は、ＨＩＦ−１αの転写活性を促進し、表皮幹細胞の維持に関与していることが示唆された。このことから、本発明に係る有効成分は、皮膚の菲薄化を予防、改善することで、皮膚のバリア機能を改善し、また、皮膚の老化、不健全化及び皮膚の色調（赤み等）の予防、改善することが期待される。

処方例１．化粧水
［成分］ 部
オリーブ油 １．０
ポリオキシエチレン（５．５）セチルアルコール ５．０
ブチルパラベン ０．１
製造例１の抽出物 ５．０
エタノール ５．０
グリセリン ５．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
水酸化カリウム 適量
精製水 全量が１００部となる量
香料 適量

処方例２．化粧水
処方例１に含まれる製造例１の抽出物に代えて、製造例２の抽出物５．０部を用いるほかは、処方例１と同様にして化粧水を得た。

処方例３．化粧水
処方例１に含まれる製造例１の抽出物に代えて、製造例３の抽出物５．０部を用いるほかは、処方例１と同様にして化粧水を得た。

処方例４．化粧水
処方例１に含まれる製造例１の抽出物に代えて、製造例４の抽出物５．０部を用いるほかは、処方例１と同様にして化粧水を得た。

処方例５．乳液
［成分］ 部
流動パラフィン ６．０
ヘキサラン ４．０
ホホバ油 １．０
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート １．０
親油型ステアリン酸グリセリル １．０
大豆レシチン １．５
製造例３の抽出物 ３．０
Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド ２．０
水酸化カリウム ０．５
グリセリン ３．０
１、３−ブチレングリコール ２．０
カルボキシメチルセルロース ０．３
ヒアルロン酸ナトリウム ０．０１
精製水 全量が１００部となる量
香料 適量

処方例６．乳液
処方例５の成分中、製造例３の抽出物３．０に代えて、製造例１の抽出物３．０部を用いるほかは処方例５と同様にして乳液を得た。

処方例７．乳液
処方例５の成分中、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド２．０部及び水酸化カリウム０．５部に代えてアルブチン３．０部を用いるほかは処方例５と同様にして乳液を得た。

処方例８．乳液
処方例５の成分中、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド２．０部及び水酸化カリウム０．５部に代えてトラネキサム酸２．０部を用いるほかは処方例５と同様にして乳液を得た。

処方例９．乳液
処方例５の成分中、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド２．０部及び水酸化カリウム０．５部に代えてニコチン酸アミド３．０部を用いるほかは処方例５と同様にして乳液を得た。

処方例１０．ローション
［成分］ 部
製造例１の抽出物 １０．０
エタノール １０．０
グリセリン ３．０
１、３−ブチレングリコール ２．０
メチルパラベン ０．２
クエン酸 ０．１
クエン酸ナトリウム ０．３
カルボキシビニルポリマー ０．１
キサンタンガム ０．１
香料 適量
水酸化カリウム 適量
精製水 全量が１００部となる量

処方例１１．エッセンス
［成分］ 部
エタノール ２．０
グリセリン ５．０
１、３−ブチレングリコール ５．０
メチルパラベン ０．１
ヒアルロン酸 ０．１
製造例３の抽出物 ５．０
クエン酸 ０．３
クエン酸ナトリウム ０．６
精製水 全量が１００部となる量

処方例１２．エッセンス
処方例１１の成分中、製造例３の抽出物５．０部に代えて製造例２の抽出物５．０部を用いるほかは処方例１１と同様にしてエッセンスを得た。

実施例１３．リキッドファンデーション
［成分］ 部
ステアリン酸 ２．４
モノステアリン酸プロピレングリコール ２．０
セトステアリルアルコール ０．２
液状ラノリン ２．０
流動パラフィン ３．０
ミリスチン酸イソプロピル ８．５
プロピルパラベン ０．０５
製造例１の抽出物 ５．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム ０．２
ベントナイト ０．５
プロピレングリコール ４．０
トリエタノールアミン １．１
メチルパラベン ０．１
精製水 全量が１００部となる量
酸化チタン ８．０
タルク ４．０
着色顔料 適量

処方例１４．ボディシャンプー
［成分］ 部
Ｎ−ラウロイルメチルアラニンナトリウム ２５．０
ヤシ油脂肪酸カリウム液（４０％） ２６．０
ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド ３．０
メチルパラベン ０．１
製造例２の抽出物 ５．０
１，３−ブチレングリコール ２．０
精製水 全量が１００部となる量

処方例１５．ヘアシャンプー
［成分］ 部
Ｎ−ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム １０．０
ポリオキシエチレン（３）アルキルエーテル硫酸ナトリウム ２０．０
ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン １０．０
ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド ４．０
メチルパラベン ０．１
クエン酸 ０．１
製造例３の抽出物 ２．０
１、３−ブチレングリコール ２．０
精製水 全量が１００部となる量

実施例１６．ヘアコンディショナー
［成分］ 部
ポリオキシエチレン（１０）硬化ヒマシ油 １．０
塩化ジステアリルジメチルアンモニウム １．５
塩化ステアリルトリメチルアンモニウム ２．０
２−エチルヘキサン酸グリセリル １．０
セタノール ３．２
ステアリルアルコール １．０
メチルパラベン ０．１
製造例３の抽出物 ２．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
精製水 全量が１００部となる量

Claims (5)

1. フォルモノネチン及びバイオカニンＡを有効成分とする皮膚外用剤。
2. フォルモノネチン及びバイオカニンＡを含む植物又はその抽出物を有効成分とする皮膚外用剤。
3. 請求項２に記載の植物がマメ科シャジクソウ属（Trifolium）の植物であることを特徴とする皮膚外用剤。
4. 低酸素誘導因子の転写活性抑制作用を指標とする皮膚菲薄化の改善剤のスクリーニング方法。
5. 低酸素誘導因子の転写活性抑制作用を指標とする皮膚バリア機能の改善剤のスクリーニング方法。