CN109055460A - 一种低分子量岩藻多糖及其在制备化妆品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种低分子量岩藻多糖及其在制备化妆品中的应用。本发明利用保藏编号为CGMCC NO.14855的黄杆菌经过发酵生产岩藻多糖降解酶，并进一步利用岩藻多糖降解酶对岩藻多糖进行降解，获得了所述低分子量岩藻多糖。本发明经实验证明，所述低分子岩藻多糖可显著抑制酪氨酸酶活性，同时具有显著的抗氧化活性。本发明所述低分子量岩藻多糖具有制备成美白和抗衰老化妆品的潜力；并且其原料来源于海带，属于纯天然提取物，安全无刺激，具有良好的市场应用前景。

Description

一种低分子量岩藻多糖及其在制备化妆品中的应用
技术领域
本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种低分子量岩藻多糖及其在制备化妆品中的应用。
背景技术
岩藻多糖是一种硫酸化的褐藻杂多糖，主要由岩藻糖、半乳糖、甘露糖及硫酸基等组成，已有多篇文献研究表明，岩藻多糖具有多种生物活性，如抗凝血、抗肿瘤、抗氧化、抗感染等，但因其分子量大，化学组成复杂，吸收性差，所以在应用上受到限制。而将大分子质量的岩藻多糖降解为相对小分子质量的多糖，不仅可以解决上述应用难题，而且在某些情况还可以增强其活性。酶解法可以特异性、选择性地切断岩藻聚糖链上的糖苷键，反应过程容易控制，易于得到所需分子质量范围的多糖产品，且产物含量高，功能性强。是目前公认的降解岩藻多糖最理想的方法。
决定皮肤色调的主要因素是皮肤内的黑色素，肤色的深浅主要决定于细胞合成黑色素的能力。黑色素的生成与酪氨酸酶、多巴醌互变异构酶和5，6-二羟基吲哚-2-羧酸氧化酶的作用有关，即“三酶理论”。在这个过程中，酪氨酸酶是皮肤黑素生物合成的关键酶、限速酶，可以酪氨酸酶为靶点筛选增白美容的药物。世面上的许多美白产品主要是采用添加熊果苷的方式，来抑制酪氨酸酶活性，但这种方法会在抑制酪氨酸酶的同时，对人体健康造成损伤。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种低分子量岩藻多糖及其在制备化妆品中的应用，本发明的技术方案获得的低分子量岩藻多糖具有活性高、稳定性好，无污染的优点，可显著抑制酪氨酸酶活性，同时具有显著的抗氧化活性；更重要的是，它来源于褐藻，安全无毒，具有开发成美白和抗衰老化妆品的潜力。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种低分子量岩藻多糖，所述低分子量岩藻多糖通过以下制备方法制得：
(1)利用保藏编号为CGMCC No.14855的黄杆菌RC2-3mut菌株发酵制备岩藻多糖酶；
(2)将所述岩藻多糖酶加入到岩藻多糖中进行酶解反应，制备得到低分子量岩藻多糖。
进一步的：将黄杆菌RC2-3mut菌株接种于液体培养基中，在温度30-35℃下摇床培养得种子液；再将种子液接种于发酵培养基中，培养24-72h，发酵液离心，弃上清液取沉淀，再用Tris-HCl溶液溶解沉淀，在冰浴保护下进行超声波破碎细胞，离心取上清液，得到岩藻多糖酶，冻干保存。
进一步的：所述步骤(1)制得的岩藻多糖酶的最适温度为60℃，最适pH值为9.5。
进一步的：所述步骤(2)中的低分子量岩藻多糖通过以下制备方法制得：将岩藻多糖酶用蒸馏水溶解，并与岩藻多糖溶液等体积混合，放置于水浴摇床中酶解后，置于沸水浴保温灭酶，离心后取上清液，将上清液用超滤系统分级成不同分子量段的低分子量岩藻多糖。
进一步的：所述岩藻多糖溶液的质量浓度为0.2％-2％。
进一步的：所述低分子量岩藻多糖的分子量段分别为：小于5kDa、5-10kDa、10-50kDa、50-100kDa、大于100kDa。
本发明还提供了所述的低分子量岩藻多糖在制备化妆品中的应用。
进一步的：分子量段为5-10kDa的所述低分子量岩藻多糖具有抑制酪氨酸酶活性和抗氧化活性。
进一步的：所述分子量段为5-10kDa的低分子量岩藻多糖具有清除DPPH自由基、清除羟自由基、提高还原力和金属离子螯合的能力。
进一步的，其特征在于：所述化妆品包括美白面膜原液和抗衰老面膜原液。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下优点：本发明利用黄杆菌RC2-3mut菌株发酵制备岩藻多糖酶，并进一步利用制得的岩藻多糖酶来制备低分子量的岩藻多糖，制得的所述低分子量岩藻多糖经过试验证明不仅具有抑制酪氨酸酶活性，而且还具有抗氧化活性，所以可以将其开发用于具有美白功效的化妆品；同时所述低分子量岩藻多糖还具有多种保健功效，来源属于纯天然，无副作用，并且本发明的技术方案工艺简单，重复性好，便于扩大生产，因此具有良好的市场应用前景。
附图说明
图1是本发明温度对所述岩藻多糖酶酶活力的影响；
图2是本发明pH对所述岩藻多糖酶酶活力的影响；
图3是本发明NaCl浓度对所述岩藻多糖酶酶活力的影响；(注：不同字母表示具有显著性差异(P＜0.05)；
图4是本发明所述酶解时间对酪氨酸酶抑制率的影响；
图5是本发明所述岩藻多糖分子量对酪氨酸酶抑制率的影响；
图6是本发明所述岩藻多糖分子量对抗氧化活性(DPPH自由基和羟自由基清除率)的影响。
图7是本发明所述岩藻多糖分子量抗氧化活性(还原力和金属离子螯合能力)的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
实施例1、所述低分子量岩藻多糖酶的制备
(1)产酶微生物
本发明首先制备岩藻多糖酶，所使用的微生物为黄杆菌株(Flavobacteriaceaesp.)RC2-3mut，该菌株目前已进行菌种保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏日期：2017年11月03日，保藏编号：CGMCC No.14855。该菌株RC2-3mut菌落呈黄色，圆形隆起状，边缘整齐，不运动，细胞革兰氏染色阴性，接触酶阴性，氧化酶阳性，在海水中生长，1％NaCl中生长。
(2)RC2-3mut的产酶方法
将微生物为黄杆菌(Flavobacteriaceae sp.)RC2-3mut株接种于液体培养基中，30-35℃下，180-250rpm摇床培养12-24h得种子液；再将种子液按10％接种量接种于发酵培养基中，在5L发酵罐(装料3-4L)内发酵，30-35℃，150-200rpm条件下培养24-72h；发酵液在4℃10000rpm离心5min，弃上清液取沉淀，再用5倍体积20mM、pH 8.0的Tris-HCl溶液溶解沉淀，在冰浴保护下，500-1000w条件进行超声波破碎细胞，时间为5-15min，4℃下离心5分钟，取上清液，得岩藻多糖酶，冷冻干燥，冰箱保存。
所述液体培养基的组分包括岩藻多糖1％(占培养基的质量比)、蛋白胨1-2％(质量比)和硝酸铵5-10mg/mL，用过膜海水配制，pH自然；所述发酵培养基包括岩藻多糖0.5-1％(质量比)，牛肉膏1-2％(质量比)，用过膜海水配制，pH自然。
(3)酶学性质
将RC2-3mut利用上述方法培养，获得的岩藻多糖酶具有下述特殊性质(如图1-图3所示)：酶的最适温度为60℃，显著高于已经报道的岩藻多糖酶；最适pH值为9.5，在没有NaCl存在的时候，不显示酶活力，当NaCl浓度为0.8-1.0mol/L时具有最大酶活力。上述性质显著不同于已经报道的岩藻多糖酶，说明该酶是一种新的岩藻多糖酶(FUCenzyme)。
实施例2、岩藻多糖的制备
本发明所述低分子量岩藻多糖的制备方法如下：将冻干的岩藻多糖酶用蒸馏水溶解，与质量比为0.2％-2％的岩藻多糖溶液等体积混合，放置于27℃、120rpm的水浴摇床中酶解27h后，置于100℃水浴保温20min，8000rpm离心10min，取上清液。将上清液用Vivaflow超滤系统分级成不同分子量段的低分子量岩藻多糖(分子量段为小于5kDa、5-10kDa、10-50kDa、50-100kDa、大于100kDa)。
实施例3、低分子量岩藻多糖具有美白活性
(1)酪氨酸酶抑制活性
按照表1方法测定酪氨酸酶抑制活性。将L-酪氨酸、样品、PBS缓冲液、酪氨酸酶依次加到编号为A1、A2、B1、B2组各管中，将各管置于37℃水浴摇床，准确反应15min，冰浴10min停止反应，测定475nm处吸光度，并计算抑制率。抑制率计算公式为：
A1空白组有酶体系吸光度；A2空白组无酶体系吸光度；B1样品组有酶体系吸光度；B2样品组无酶体系吸光度。
表1抑制酪氨酸酶活性加样量
利用上述方法测定不同酶解时间、不同分子量段的岩藻多糖抑制酪氨酸酶的活性，结果如图4、图5所示。结果表明，酶解27h获得的组分具有最强的酪氨酸酶抑制活性。通过超滤分级，发现分子量为5-10kDa的组分酪氨酸酶抑制活性最强。显著高于岩藻多糖和其他分子量段组分，说明分子量对酪氨酸酶抑制活性具有显著影响。
(2)抗氧化活性
①DPPH自由基清除率测定
DPPH自由基清除率测定方法参考学术论文[王莹.岩藻聚糖硫酸酯酶产生菌的筛选、酶学性质研究及酶解产物抗氧化活性预测系统的建立.博士学位论文，中国海洋大学，2013]，具体加样步骤见表2。
表2 DPPH自由基清除率的测定方法单位：mL
按照表2顺序加入试剂，充分混匀，室温黑暗处静置反应30min，517nm测定吸光度，以蒸馏水为空白。DPPH清除率计算公式如下：DPPH清除率(％)＝(1-(Ai-Aj)/A0)×100％。
②羟自由基清除率清除活性
羟自由基清除率清除活性测定方法参考上述学术论文，稍作修改，具体加样步骤见表3。
表3羟自由基清除率清除活性测定方法 单位：mL
按表3顺序加入试剂后旋涡混匀，室温静置30min，于6000rpm常温离心5min，在510nm处测吸光值，以蒸馏水为空白。羟自由基清除率计算公式：羟自由基清除率(％)＝[1-(Ai-Aj)/A0]×100％。
③还原力的测定
还原力测定方法参考上述学术论文，稍作修改，具体加样步骤见表4。
表4铁还原力测定加样方法 单位：mL
按表4顺序加入试剂后混匀，在37℃水浴保温30min后，分别加入2.5mL 10％三氯乙酸，于4000rpm常温离心20min，再取分别取上清液2mL，加入3mL蒸馏水和3mL 0.1％FeCl3溶液后混匀，避光反应20min，700nm测吸光度，以蒸馏水为空白，吸光度越大，还原力越强。
④金属离子螯合能力测定
金属离子螯合能力测定方法参考上述学术论文，稍作修改，具体加样步骤见表5。
表5金属离子螯合能力测定加样方法 单位：mL
按表5顺序加入试剂后充分震荡混匀，室温下静置10min，于562nm测定吸光值，以蒸馏水为空白。金属离子螯合能力计算公式：螯合率(％)＝(1-A样品/A对照)*100％。
抗氧化活性测定结果见图6、图7，结果表明5-10KDa的组分具有最高的DPPH自由基清除率和羟自由基清除率，与未经酶解的组分具有显著的差异。
综上所述，通过微生物RC2-3mut发酵产酶，再通过酶解技术获得的5-10kDa的小分子量组分，具有显著的抑制酪氨酸酶活性和抗氧化活性，具有开发美白化妆品的潜力。
实施例4、低分子量岩藻多糖美白面膜原液的制备
将本发明所述的低分子量岩藻多糖用来制备美白面膜原液，其中：
A相：所述5-10kDa低分子量岩藻多糖1-10份，高分子透明质酸1-5份，低分子透明质酸0.15-0.5份，纳诺透明质酸0.1-0.5份，甘油3-5份，玫瑰纯露10-15份，卢芭油1-5份，NMF-50为2-5份，纯水70-80份，汉生胶1-5份，燕麦β-葡聚糖0.5-2份；
B相：水溶性神经酰胺0.5-2份；
C相：1，2-已二醇2-5份，对羟基苯乙酮0.5-1份；
上述均以重量份计；
制备方法：将A相边搅拌边升温至70℃完全溶解后降温，降温至40℃以下加入B、C相，混合物即为美白面膜原液。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实例对本发明进行了详细的说明，对本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种低分子量岩藻多糖，其特征在于：所述低分子量岩藻多糖通过以下制备方法制得：
（1）利用保藏编号为CGMCC No.14855的黄杆菌RC2-3mut菌株发酵制备岩藻多糖酶；
（2）将所述岩藻多糖酶加入到岩藻多糖中进行酶解反应，制备得到低分子量岩藻多糖。
2.根据权利要求1所述的低分子量岩藻多糖，其特征在于：所述步骤（1）中的岩藻多糖酶的制备方法为：将黄杆菌RC2-3mut菌株接种于液体培养基中，在温度30-35℃下摇床培养得种子液；再将种子液接种于发酵培养基中，培养24-72 h，发酵液离心，弃上清液取沉淀，再用Tris-HCl溶液溶解沉淀，在冰浴保护下进行超声波破碎细胞，离心取上清液，得到岩藻多糖酶，冻干保存。
3.根据权利要求1所述的低分子量岩藻多糖，其特征在于：所述步骤（1）制得的岩藻多糖酶的最适温度为60℃，最适pH值为9.5。
4.根据权利要求1所述的低分子量岩藻多糖，其特征在于：所述步骤（2）中的低分子量岩藻多糖通过以下制备方法制得：将岩藻多糖酶用蒸馏水溶解，并与岩藻多糖溶液等体积混合，放置于水浴摇床中酶解后，置于沸水浴保温灭酶，离心后取上清液，将上清液用超滤系统分级成不同分子量段的低分子量岩藻多糖。
5.根据权利要求4所述的低分子量岩藻多糖，其特征在于：所述岩藻多糖溶液的质量浓度为0.2%-2%。
6.根据权利要求4所述的低分子量岩藻多糖，其特征在于：所述低分子量岩藻多糖的分子量段分别为：小于5 kDa、5-10 kDa、10-50 kDa、50-100 kDa、大于100 kDa。
7.权利要求1-6任一项所述的低分子量岩藻多糖在制备化妆品中的应用。
8.根据权利要求7所述的低分子量岩藻多糖在制备化妆品中的应用，其特征在于：分子量段为5-10 kDa的所述低分子量岩藻多糖具有抑制酪氨酸酶活性和抗氧化活性。
9.根据权利要求8所述的低分子量岩藻多糖在制备化妆品中的应用，其特征在于：所述分子量段为5-10 kDa的低分子量岩藻多糖具有清除DPPH自由基、清除羟自由基、提高还原力和金属离子螯合的能力。
10.根据权利要求7所述的低分子量岩藻多糖在制备化妆品中的应用，其特征在于：所述化妆品包括美白面膜原液和抗衰老面膜原液。
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