CN114164117B - 一种适用饵料微藻的培养基、培养方法及应用 - Google Patents

一种适用饵料微藻的培养基、培养方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种适用饵料微藻的培养基、培养方法及应用，每升培养基中包括以下组分：氮盐30‑120mg、磷盐4‑20mg、铁盐1.5‑5mg、Na2EDTA 5‑20mg、藻粉水提物0.1‑10ml、蚯蚓粉水提物0.1‑10ml，其余为水，本方案突破性将藻粉及蚯蚓粉水提后得到的营养液搭配其他优先的氮盐、磷盐、铁盐等形成培养基，试验表明，该培养基在海链藻的扩繁培养中表现优异。该方案中无需研究藻粉、蚯蚓粉中可能对藻类培养起作用的各种成分，以及对各成分进行精提，仅以水煮的方式将藻粉中可促进微藻生长的有机、无机物质提取，以及将蚯蚓粉中维生素、氨基酸、微量元素等提取，微藻培养的成本进一步降低。

Description

一种适用饵料微藻的培养基、培养方法及应用
技术领域
本发明涉及微藻培养技术领域，具体涉及一种适用饵料微藻的培养基，微藻的培养方法以及培养基、蚯蚓水提物或藻粉水提物在微藻培养中的应用，尤其是海链藻的扩繁培养。
背景技术
海链藻是微藻类的一种，含有丰富的DHA和ARA，可作为水产养殖动物幼体的饵料，如太平洋牡蛎、扇贝等软体动物、石斑鱼幼苗、虾、蟹幼苗类水产幼苗以及培养轮虫、卤虫、桡足类等次级饵料生物的营养强化食物，海链藻可以提高南美白对虾的免疫能力，显著改善各项生理生化指标，提高虾苗成活率及抗病抗应激能力，同时海链藻具有丰富的营养价值，还有各种珍贵的生物活性分子，适应性强，可以有效的抑制其他藻类的生长等优点，对水产动物的养殖起到重要的作用。
现有的海链藻培育方式存在以下问题：产量低，生长速度缓慢，同时在单位面积的生长区域内海链藻生长较为稀疏，培养周期较长，同时培育效率较低等。
如申请号CN2015105408789，名称为一种促进海链藻生长的培养液及培养方法，公开了以硝酸铵、磷酸二氢钠、柠檬酸铁、硅酸钠组成的培养液，但从其实施例可以看出扩繁情况不理想。申请号为CN2015106869392，名称为大规模培养海链藻的大量元素营养盐配方，公开了以EDTA-2Na、FeCl3、Na2HPO4、NH4HCO3等组成的营养盐配方，从其实施例可以看出扩繁结果虽有所提高，但依然不能满足需求。以及部分企业中在基础培养基中加入各种昂贵的营养组分，扩繁结果虽有所提高，但不能满足需求，且存在成本高的缺陷，需改进。
发明内容
为解决上述至少一个技术缺陷，本发明提供了如下技术方案：
本申请文件公开一种适用饵料微藻的培养基，每升培养基中包括以下组分：氮盐30-120mg、磷盐4-20mg、铁盐1.5-5mg、Na2EDTA 5-20mg、藻粉水提物0.1-10ml、蚯蚓粉水提物0.1-10ml，其余为水，以质量计，藻粉水提物指将藻粉与水混合并加热水煮、过滤后得到的液体，蚯蚓粉水提物指将蚯蚓粉与水混合并加热水煮、过滤后得到的液体。
本方案突破性将藻粉及蚯蚓粉水提后得到的营养液搭配其他优先的氮盐、磷盐、铁盐等形成培养基，试验表明，该培养基在海链藻的扩繁培养中表现优异。该方案中无需研究藻粉、蚯蚓粉中可能对藻类培养起作用的各种成分，以及对各成分进行精提，仅以水煮的方式将藻粉中可促进微藻生长的有机、无机物质提取，以及将蚯蚓粉中维生素、氨基酸、微量元素等提取，微藻培养的成本进一步降低。
进一步，以质量计，将蚯蚓粉置于3-5倍的水中浸泡3-6h，然后煮沸1次或多次，每次持续0.2-1.5h，过滤后得到的蚯蚓粉混液为所述培养基用的蚯蚓粉水提物，对于蚯蚓粉水提物，蚯蚓粉可直接自市面上采购，或是自己晒干蚯蚓进行制备等均可，蚯蚓粉优选干燥后的蚯蚓粉，更好控制混合的物料比例，干燥的蚯蚓粉与水混合后，静置浸泡3-6h，如3h、3.5h、 4h、4.5h、5h、5.5h、5.8h、6h等均可，浸泡后直接升温至沸腾状态，保持0.2-1.5h，如0.2h、0.3h、0.4h、0.5h、1h、1.2h、1.3h、1.5h等，可1次、2次、3次等，过滤后得到的营养液为蚯蚓粉水提物。优选将蚯蚓粉置于其质量3-5倍的水中，煮沸过滤后的营养液适用上述培养基，能有效促进微藻生长，当然在应用至其他培养基时，也可采用蚯蚓粉与其他质量比的水混合。
进一步，以质量计，将藻粉置于3-5倍的水中，煮沸1次或多次，每次持续0.2-1.5h，过滤后得到藻粉混液为所述培养基用的藻粉水提物，该质量比下藻粉与水混合煮沸过滤后得到的营养液添加至上述配方中能有效促进微藻的生长，当然在应用至其他培养基时，也可采用藻粉与其他质量比的水混合。
进一步，所述藻粉包括牟氏角毛藻、三角褐指藻、小新月菱形藻、中肋骨条藻、海链藻中一种或多种，可单一使用，或多种混合使用，当混合时，各藻的质量比较为随意，并无任何的限制，如任选两个、三个、四个、五个组成，如牟氏角毛藻、三角褐指藻等质量混合，或1:2，1:3，2:1,4:1等质量比混合均可；如牟氏角毛藻、三角褐指藻、小新月菱形藻三者等质量混合，或按照1:2:2，1:1:2,2:1:2等混合均可；如牟氏角毛藻、三角褐指藻、小新月菱形藻、中肋骨条藻等质量混合，或1:1：2，2:1:2,2:2:3等均可；如牟氏角毛藻、三角褐指藻、小新月菱形藻、中肋骨条藻、海链藻等质量混合，或1:2:1:2:2，2:1:1:3,1:3:2:1等均可，藻粉可自市面直接采购，或自身制备，优选喷雾干燥、自然阴干、晒干或冻干的藻粉，藻粉经过破壁或不破壁，优选三种以上混合的藻粉。
优选，所述藻粉包括牟氏角毛藻、三角褐指藻、小新月菱形藻、中肋骨条藻、海链藻，以质量计，藻粉中各藻含量相同，该比例下藻粉进一步提升藻类的扩繁速度。
进一步，所述氮盐包括硝酸盐、铵盐或尿素中一种或多种；
所述铁盐包括氯化铁、氯化亚铁、硫酸铁、硫酸亚铁、林檬酸铁、林檬酸铁铵中一种或多种；
所述磷盐包括含磷酸一氢根或磷酸二氢根的钠盐、钾盐中一种或多种。
进一步，所述硝酸盐包括硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙中一种或多种，所述铵盐包括硝酸铵、氯化铵、硫酸铵中一种或多种。
进一步，每升培养基中包括以下组分：KNO3 30-120mg，KH2PO4 4-20mg，柠檬酸铁铵1.5-5mg， Na2EDTA 5-20mg，藻粉水提物0.1-10mL，蚯蚓粉水提物0.1-10ml，其余为水。
本申请文件公开一种微藻的培养方法，包括上述的培养基，所述微藻为海链藻，将微藻接种在所述培养基中，在光照强度60-100μmol.m-2.s-1，温度20-28℃，光周期10-14h/d的条件下通气培养。
上述培养基在应用至微藻的培养时，优选上述光照强度、温度、光周期等条件下进行培养，进一步提升扩繁速度。
本申请文件公开蚯蚓水提物、藻粉水提物或上述的培养基在饵料微藻培养中的应用，如蚯蚓水提物、藻粉水提物优选以添加至培养基的应用方式。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1、本发明突破性将藻粉水提物、蚯蚓水提物搭配优选组分组成培养基，在海链藻的扩繁培养中效果优异。
附图说明
图1：不同用量的藻粉提取液和蚯蚓粉提取液下海链藻生长趋势图；
图2：海链藻在不同培养基中生长趋势图；
图3：海链藻在本申请培养基中和f/2+Si培养基中生化组分变化趋势图。
其中，图1中“a藻b蚯”表示培养基中添加a毫升的藻粉提取液，添加b毫升的蚯蚓粉提取液。
图1、图2、图3中横轴为时间，单位为d；纵轴为藻细胞浓度，单位为104cells/mL。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
对于蚯蚓粉水提物的制备，蚯蚓粉直接自市面上采购，含水率为5％，蚯蚓粉与其4倍质量的矿泉水混合，干燥的蚯蚓粉与水混合后，静置浸泡4h，浸泡后直接升温至沸腾状态，保持0.5h，降温使沸腾状态停止，再次升温加热至沸腾状态，循环三次，最后过滤残渣后得到蚯蚓粉水提物营养液。
对于藻粉水提物的制备，藻粉采用冻干的藻粉，藻粉与其4倍质量的矿泉水混合，混合后直接升温至沸腾状态，保持0.5h，降温使沸腾状态停止，再次升温加热至沸腾状态，过滤残渣后得到藻粉水提物营养液。
实施例1
将处于对数期的海链藻接入培养基，光照强度80μmol.m-2.s-1，温度25℃条件下进行三角瓶液体通气培养,每升培养基中含KNO3 60mg，KH2PO4 8mg，柠檬酸铁铵1.5mg，Na2EDTA 10mg，藻粉水提物amL，蚯蚓粉水提物bmL，其余为海水。用于海链藻通气培养实验的三角瓶体积为 2L(培养基1L)，培养5天后，结果如图1所示。表明：对于海链藻而言，培养基中添加一定量的藻粉提取液和硅藻粉提取液有明显的促进生长作用，当提取液用量分别为1mL/L时，藻生物量为320×104cells/ml，优于其余的处理组。
实施例2：藻粉提取液和蚯蚓粉提取液对藻影响对比实验
依照实施例1的实验方案对海链藻进行培养，每升培养基中组分：NaNO3 60mg，NaH2PO4 8mg，柠檬酸铁铵1.5mg，Na2EDTA 10mg，藻粉水提物1mL，蚯蚓粉水提物1mL，其余为海水。
对照组1：每升培养基中组分：NaNO3 60mg，NaH2PO4 8mg，柠檬酸铁铵1.5mg，Na2EDTA 10mg，藻粉水提物1ml，其余为海水。
对照组2：每升培养基中组分：NaNO3 60mg，NaH2PO4 8mg，柠檬酸铁铵1.5mg，Na2EDTA 10mg，蚯蚓粉水提物1ml，其余为海水。
对照组3：每升培养基中组分：NaNO3 60mg，NaH2PO4 8mg，柠檬酸铁铵1.5mg，Na2EDTA 10mg，其余为海水。
对照组4：以常用培养基f/2。
对照组1/2/3/4，与实施例在相同培养条件下进行培养。
结果如图2所示，表明：海链藻在本申请培养基中生长时生长效果好，培养5d，生物量为310×104cells/ml，优于f/2正常培养基的值125×104cells/ml；且单添加藻粉提取液或蚯蚓粉提取液都要比f/2培养基中好。
同时依据如下培养基，实施例1中培养条件进行海链藻的培养，以f/2正常培养基为对照。
第一、每升培养基中组分：NaNO3 30mg，NaH2PO4 10mg，柠檬酸铁铵5mg，Na2EDTA10mg，藻粉水提物1mL，蚯蚓粉水提物1mL，其余为海水。
第二、每升培养基中组分：NaNO3120mg，NaH2PO4 15mg，柠檬酸铁铵20mg，Na2EDTA20mg，藻粉水提物8mL，蚯蚓粉水提物7mL，其余为海水。
第三、每升培养基中组分：NaNO3 80mg，NaH2PO4 4mg，柠檬酸铁铵1.5mg，Na2EDTA15mg，藻粉水提物5mL，蚯蚓粉水提物8mL，其余为海水。
结果表明，5天后上述培养基中海链藻的浓度均高于f/2对照组两倍以上。
实施例3：海链藻在实施例中藻细胞生化组分及主要脂肪酸变化，对照为f/2+Si培养基。
除对照组培养基外，其余与实施例1的培养条件一致，5d后采收海链藻并测生化组成，结果如图3所示。相对对照组，本申请培养基中藻多糖和油脂含量都有所升高。。
尤为重要的是，海链藻在本申请培养基下培养5d，多不饱和脂肪酸C20:5、C22:6的组分含量比正常f/2培养基中的相应值约分别提高20％和30％，可以看出本申请培养基不仅可促进海链藻的培养速度，还可提升营养价值。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种适用饵料微藻的培养基，其特征在于，每升培养基中包括以下组分：氮盐30-120mg、磷盐4-20mg、铁盐1.5-5mg、Na2EDTA 5-20mg、藻粉水提物0.1-10ml、蚯蚓粉水提物0.1-10ml，其余为水，以质量计，藻粉水提物指将藻粉与水混合并加热水煮、过滤后得到的液体，所述藻粉包括牟氏角毛藻、三角褐指藻、小新月菱形藻、中肋骨条藻、海链藻中一种或多种，蚯蚓粉水提物指将蚯蚓粉与水混合并加热水煮、过滤后得到的液体。
2.如权利要求1所述的一种适用饵料微藻的培养基，其特征在于：以质量计，将蚯蚓粉置于3-5倍的水中浸泡3-6h，然后煮沸1次或多次，每次持续0.2-1.5h，过滤后得到的蚯蚓粉混液为所述培养基用的蚯蚓粉水提物。
3.如权利要求1所述的一种适用饵料微藻的培养基，其特征在于：以质量计，将藻粉置于3-5倍的水中，煮沸1次或多次，每次持续0.2-1.5h，过滤后得到藻粉混液为所述培养基用的藻粉水提物。
4.如权利要求3所述的一种适用饵料微藻的培养基，其特征在于：所述藻粉包括牟氏角毛藻、三角褐指藻、小新月菱形藻、中肋骨条藻和海链藻，以质量计，藻粉中各藻含量相同。
5.如权利要求1所述的一种适用饵料微藻的培养基，其特征在于：所述氮盐包括硝酸盐、铵盐或尿素中一种或多种；
所述铁盐包括氯化铁、氯化亚铁、硫酸铁、硫酸亚铁、柠檬酸铁、柠檬酸铁铵中一种或多种；
所述磷盐包括含磷酸一氢根或磷酸二氢根的钠盐、钾盐中一种或多种。
6.如权利要求5所述的一种适用饵料微藻的培养基，其特征在于：所述硝酸盐包括硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙中一种或多种，所述铵盐包括硝酸铵、氯化铵、硫酸铵中一种或多种。
7.如权利要求1所述的一种适用饵料微藻的培养基，其特征在于：每升培养基中包括以下组分：KNO3 30-120mg，KH2PO4 4-20mg，柠檬酸铁铵1.5-5mg，Na2EDTA 5-20mg，藻粉水提物0.1-10mL，蚯蚓粉水提物0.1-10ml，其余为水。
8.一种微藻的培养方法，使用权利要求1-7中任一项所述的培养基培养，其特征在于：所述微藻为海链藻，将微藻接种在所述培养基中，在光照强度60-100μmol.m-2.s-1，温度20-28℃，光周期10-14h/d的条件下通气培养。
9.权利要求1-7任一项所述的培养基在海链藻培养中的应用。
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海带渣提取物对四种微藻油脂积累及组成的影响;郑世燕;万方学位论文;第1-172页 *
饵料藻类的研究进展;邱楚雯;王韩信;;水产科技情报(第03期);第127-132页 *

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