JP2005501805A - Thermus科の微生物の発酵によるタンパク質の生成のためのプロセス、このようにして得られたタンパク質の混合物、およびそれらを含有する美容用組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、Thermus科由来の微生物、詳細には、大深度の熱水源に隣接する海水において収集された微生物のための発酵培地、特にGY1211株を用いて得られた発酵培地の用途に関する。本発明はまた、特定の美容用組成物に関する。この美容用組成物は、前記微生物のための1つ以上のタイプの発酵培地を含み、詳細には、皮膚のケア、とりわけ顔面、身体、頭皮、および毛髪のケアのために、そして皮膚のセラミド濃度を調節するために、免疫系を刺激するために、詳細には酸素過酸化物に関する、シャペロン効果による防御、ならびに解毒効果および抗フリーラジカル効果を提供するために、用いられる。
Description
【技術分野】
【0001】
皮膚は、他人の視線に対して各自が与える最初のイメージであり、そして常にその外見は関心のもたれている課題である。
【0002】
生存期間中に、太陽ならびに種々の汚染物質に対する職業上の曝露(露光)および私的な曝露の両方によって、化学的および物理的な攻撃が生じ、これが異なる形態の酸素ラジカルの因子のリストの中の生成物をもたらす。これらの後者が、詳細には皮膚のレベルで、不可逆な損傷を生じ、その結果は少なくとも紅斑、日射病、皮膚の早期老化、そしてひどければ皮膚癌である。
【0003】
挫創の兆候の悪化、皮膚の柔軟性の消失、皮膚の乾燥、およびシワの出現は、老化の最初の肉眼的兆候に相当する。したがって、太陽に対する最初の曝露(露光)の際に出現する、皮膚細胞のレベルでの分子の変異(侵襲的かつ最先端の方法によってのみ計測され得る)は、なお一層悪性である。なぜなら、それらの変異は一般の人々には検出不能であるからである。
【0004】
太陽が、酸素のフリーラジカルの生成の唯一の原因ではない。多数の重要な生化学的反応(例えば、アミノ酸の酸化または脂肪酸の酸化、プロスタグランジンの合成…)が、これらの高反応型の酸素を全く天然に生じ、この酸素は、全身の組織にとって、および特定の皮膚にとって極めて有毒である。
【0005】
ヒトは、進化の過程で発達した以下のような生理学的調節によって、酸素ラジカルの有害な影響に対して天然に保護されている:春に開始する進行性の日焼け(紅斑に至らない皮膚への影響に対する)、スーパーオキシドジスムターゼおよびカタラーゼのような抗ラジカル酵素の存在、炎症反応および/または免疫反応の低下、表皮の肥厚、等々。
【背景技術】
【0006】
これらの問題を解決するために、美容産業界は、太陽光フィルター、SOD(スーパーオキシドディスムターゼ)のような皮膚に存在する天然の酵素を含む組成物、野菜抽出物などのいずれかを含有するあらゆる種類の製品を市場に出している。
【0007】
別の天然の酵素であるカタラーゼは、美容用組成物および皮膚用医薬品組成物には用いられ得ない。なぜなら、カタラーゼは、1993年6月14日の欧州指令(European Directive)93/35の付属文書II(1)の美容用製品の組成物中に入れることができない物質のリストにみられる(74番として)からである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
従って、美容産業界および皮膚用医薬品産業界においては、この化学的汚染物の有害な影響に対して皮膚が、よりよく抵抗し、なおかつ補充し、そして修復することを補助する製品を供給することが論理的である。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本出願の目的である本発明は、生物工学的な技術によって、従来用いられている微生物から、強力な抗ラジカル効果を有する有効成分を得ることを可能にするという発見に立脚する。
【0010】
該当の微生物は、海底の熱噴出孔で発見された新しい系統の好熱性の集団の一部である。
【0011】
これらの細菌は、通常はタンパク質が変性される温度で、そして細胞がその内部媒体と外部媒体との間で恒常性を維持できないような圧力下でも生存可能である。
【0012】
現在まで、好熱生微生物は、「PCR」(ポリメラーゼ連鎖反応)と呼ばれる、細胞の溶解物からの新しい増幅技術において有用なDNAを調製するために、生物工学において用いられている。
【0013】
従って、このような微生物からの有効成分の生成は、以下の2つの主な経路において興味深い:
・リボソーム16SのRNA配列を比較する系統発生的研究によって、全ての原核生物は、疑いなく同じ共通の好熱性の先祖から由来したことが示された。従って、これらの好熱性の集団は、おそらく元来の物質、およびそれらの新しい治療効果または美容的効果さえ有するように適合された元来の物質から構成される。
・これらの好熱性細菌によって生成される特定の代謝物は、熱安定性(このことはそれらの特性が高温でも維持されることをいう)である。分子の活性の寿命によって、それらは、最終の美容用製品中で長期にわたって安定にされ得る。
【0014】
本出願による微生物の発酵によるタンパク質の生成のためのプロセスは、Thermus属の株、詳細には、Thermus thermophilus、GY1211種を使用し、そしてこの株は、グアヤナ海盆(カルフォルニア湾)の東太平洋海嶺の海底の熱水噴出孔(深度2000メートル)から単離した。これらは、グラム陰性の桿菌であり、その大きさは、実質的に0.5μm×10μmに等しく、そして好気性、ヘテロトロピック、非胞子形成性、好熱性、圧力耐性であり、そして培養時には、オレンジ色で、丸く、不規則でない、円滑な、波形でないコロニーを生じる。
【0015】
この株は、パリのパスツール研究所の国立微生物培養コレクション(National Culture Collection of Micro−organism)において番号I−2715として登録されている。
【0016】
本発明者らは、好熱性集団のこれらの株が、美容分野および皮膚用医薬品の分野において有用な多くの生理学的活性を有する分子を生成または提供し得ることを発見した。
【0017】
それらの株がこれらの分子を排出するようにそれらを培養すること、または得られたバイオマスを使用することはいずれも特に興味深い。
【0018】
以下の例は、これらの2つの目的を達成するための培養条件を最適化するために得られた結果を示す。
【0019】
(バイオマスの生成の最適化)
産業的適用のためには、できるだけ簡単かつ経済的な培養培地を用いながら、最大のバイオマスを得ることが必要である。細菌培養に対する異なる物理化学的パラメーターの影響を評価し、それによって以下に列挙される限定要因を決定することが必要であった:
・GY/01培地中の栄養素の組成物:酵母抽出物およびNH4Clo色および匂いのような従来の問題を回避するため、その濃度を必要最小限に制限することが必要である。酵母抽出物に関しては、0.25%の濃度が限界濃度であること、および1.0%では、0.5%の時よりも多いバイオマスが得られるわけではないことが確認された。従って、選択された酵母抽出液の濃度は0.5%である。選択されるNH4Clの使用の最適濃度は、0.3%である。
・塩および微量元素の組成
Thermusは海洋細菌であるため、塩化ナトリウムの含量は、極めて重要であり、そして本発明者らの条件下では、本発明者らは、培養倍地中に1.0%のNaClを用いることを選択した。より高い濃度では得られるバイオマスの量が低下する。
【0020】
さらに、本発明者らは、培養の間に調節することなく、7.2に等しいpHで、撹拌しながら、72〜75℃の温度で発酵を実行することを選択した。
【0021】
これらの条件下では、集団が二倍になる時間は、47分に等しく、0.386(H−1)に等しい成長量μmをともなっている。
【0022】
(タンパク質の生成の最適化)
ほとんどのタンパク質は一般に細胞内にある。
濾過(0.2μm)の後、その培地を最初に20倍に濃縮した場合にのみ、GY1211を用いて発酵させた培地の一次元の電気泳動によって、いくつかのタンパク質バンドのうちに唯一の存在が、実証される。従って、タンパク質を細胞から離させるための技術的な方法を見出す必要があった。
【0023】
多くの実験によって、本発明者らは大量のタンパク質抽出のいくつかの手順を開発することができた。その手順は、満足のゆくものであり、工業的用途にも完全に適する。
【0024】
全体的満足度を与える手順の1つは以下の通りである:培養後、0.1%の最終濃度でCrodasinic LS30(CRODA)を30分間、添加する。
【0025】
培養培地中のタンパク質の用量は、一次元電気泳動によって多数のバンドの存在(従って、抽出された広範な種々のタンパク質)が実証されるとき、簡易熱量測定法によって、Thermusのタンパク質の0.2%に等しい最小濃度を示す。この処理がタンパク質の四次構造を変更しない(なぜなら測定された酵素活性は変更されていない)ことに注意のこと。最後に、相補的試験によって、20分間100℃の熱処理後に得られたタンパク質の電気泳動プロフィールの不変性が(質的および量的の両方で)実証されたことに注目することが重要である。この性質は、用いられた発酵プロトコールの妥当性を実証する。なぜなら、得られたタンパク質は、もとの微生物Thermusのタンパク質、そして特にGY1211株のタンパク質と同じ特徴を有するからである。
【0026】
あるいはこのCrodasinic LS30での界面活性剤処理の代わりに、高圧ホモジナイズによる従来の技術(ただし、この手順は長い)を用いてもよい。
【0027】
従って、倍地中の細菌タンパク質を回収するための簡便かつコストの少ない方法として、発酵の最後にCrodasinic LS30を使用することによって全てのパラメーターを最適化した発酵のおかげで、本発明者らは、バイオマスの生成、およびThermusから求めるタンパク質の質を最適化することに成功した。
【0028】
本特許出願では回収の単一の例を記載しているが、タンパク質の発酵および抽出の他のプロセスを用いてもよく、従って他の任意のタンパク質の発酵および抽出のプロセスも本出願の範囲内で用いられ得る。
【0029】
例えば、この製品中のタンパク質の量を増大するため、任意の物理的プロセスまたは化学的プロセス、例えば、限定はしないが、Crodasinic LS30の添加の前に細菌を濃縮するめの0.2μm濾過によって、さもなければ低分子量のカットの閾値での濾過(閾値20kDでの接線限外濾過)(これは、塩(沈殿の潜在的な原因)、小ペプチド(時々、着色、および所望されない匂いを生じる)、およびCrodasinic LS30の一部の排除を可能にする)によって、発酵培地を濃縮することが可能である。当業者は、生成の特定の必要性に応じて、それらの用途を最適化するために技術を適合および改変することができる。
【0030】
発酵および濾過の後に得られた生成産物を、以下のような、種々のタイプの処理に供してもよい:浄化、濃縮または希釈、保存、精製、沈殿による分画、クロマトグラフィーによる分画、凍結乾燥、または噴霧。
【0031】
本発明の好ましい実施形態の1つは、界面活性剤処理および限外濾過による濃縮後のGY1211の発酵培地によって、構成される。
【0032】
処置のうちどれか1つ、またはいくつかの処置の後に得られる生成産物(溶液、粉末、結晶、エマルジョン、…)は、美容術および皮膚薬学において従来の任意の生薬形態で用いられてもよい。以下の2つの組成物は、非限定的な例のつもりで示す。
【実施例1】
【0033】
実施例1.デイクリーム(day cream)
Volpo S20 2.4
Volpo S2 2.6
Prostearyl 15 8.0
蜜蝋 0.5
Abil(登録商標)ZP2434 3.0
プロピレングリコール 3.0
Carbopol(登録商標)941 0.25
トリエタノールアミン 0.25
発酵した培地 5.0
水および防腐剤QSP 100g
【実施例2】
【0034】
実施例2,ボディミルク(body milk)
Crillet 3 2.5
Novol 0.9
フルイラン(fluilan) 2.5
Carbopol(登録商標)940 0.3
蜜蝋 2.0
トリエタノールアミン 0.1
グリセリン 5.0
発酵した培地 3.0
水および防腐剤QSP 100g
【0035】
この生成物(製品)の使用の間に発見された多くの有益な効果のなかで、言及するに価するより重要な効果は、皮膚のセラミドの濃度の調節、ヒトのケラチノサイトのインビトロで観察されたCD40の免疫刺激効果、シャペロン型タンパク質の防御効果、および本出願による培養培地中のメナキノンの存在による異なる高反応性フリーラジカルに対する解毒効果である。このうち以下の実施例によって、過酸化水素のみに関する効果が示されるが、過酸化水素だけが問題のラジカルというわけではない。
【実施例3】
実施例3 インビトロでの「カタラーゼ様」活性
【0036】
「カタラーゼ様(catalase−like)」活性を実証するための最も簡易な方法は、以下の式によるH2O2の分解を分光光度法によって測定することにある:
【0037】
240nmでのH2O2吸収(従って、240nmでのDOの低下)は、H2O2の分解に比例し、これによって、ウシカタラーゼから測定されたスペクトルとの比較により、未知の標本の酵素活性または偽酵素活性を測定することが可能になる。
【0038】
以下の表には、25℃で実施した8つの独立した実験の間に、Crodasinicまたは高圧(APV材料)のいずれかによって処理した培養培地のカタラーゼタイプの偽酵素活性(平均±SEM)を整理して示してある。ここで[C]係数は、生成した培地の濃度を示す。
【0039】
Thermusを用いて発酵した標本の全てについて、酵素活性が観察されるが、発酵されていない培養培地自体は、酵素活性を有さない。さらに、測定された活性の間の比は、生じた濃度の比と一貫している。
【0040】
用いた処理が、得られた酵素活性に関して等価であることに注目することも可能である。
【0041】
結局、ウシのカタラーゼの活性が、試験を実施する温度内におさまる場合(45℃対25℃で約25%の活性)、Thermusを用いた発酵培地の偽酵素活性は、温度にともなってかなり増大する(ただし、45℃では、4.5の係数を掛けられる)ことを指摘することが特に重要である。その天然の環境において、Thermus GY1211は、70℃程度の温度で生存するので、これらの防御機構が、高温では特に有効であることは論理的である。美容的な観点から、この、熱による「活性化(activation)」は、かなりの利点を構成する。従って、太陽に曝される、そしてカタラーゼ様活性が最も必要なのは主に夏である。しかし、これらの条件下では、皮膚の温度は、30℃より高い温度に達し得る。
【0042】
45℃を超えては活性を測定していない。なぜなら本発明者らは、次に、インビボにおける皮膚の温度と適合しない条件について述べているからである。
【0043】
従って、ペルオキシダーゼ的な、カタラーゼ様の、抗ラジカルの、グリコシル化の阻害的な酵素活性、そしてコラーゲンの合成を改変する酵素活性を有する、上記の培養された培地は、天然のUVに対する曝露の間の、皮膚のケアのために、詳細には、フリーラジカルの有害な影響に対して、および老化(これは、皮膚の老化、生理学的老化、または早期老化である)に対するフリーラジカルのあらゆる結果に対して保護するために、さもなければ皮膚の、詳細には顔面、身体、頭皮、および毛髪のケアのために;皮膚のセラミド濃度を調節するために、免疫系を刺激するために、シャペロンの影響による防御的効果を得るために、そして異なる高反応性フリーラジカル、特にオゾンについての解毒物として(本出願の目的である培養培地中のメナキノンの存在によって)、用いられ得る。
【0044】
本発明において用いられる組成物において、発酵された培地は一般に、濃縮された培地、凍結乾燥された培地、または噴霧された培地については、0.001乾燥重量%(p/p)から2乾燥重量%(p/p)の間で、そして液体形態で発酵した培地については、一般に0.1%(p/p)から10.0%(p/p)の間で用いられる。
【0045】
この発酵した培地は、美容術または皮膚薬学において使用される、以下の任意の生薬形態で用いられ得る:O/Wエマルジョン、およびW/Oエマルジョン、ミルク、ローション、ポマード、キャピラリーローション、シャンプー、石鹸、スティックおよびペンシル、スプレー、ボディーオイル(ただし、このリストは限定的なものではない)。
【0046】
この発酵した培地を、リポソーム、カイロミクロン、マクロ粒子、ミクロ粒子およびナノ粒子、ならびに、マクロカプセル、ミクロカプセルおよびナノカプセルのような美容用ベクター中に組みむこと、それらを粉末化有機ポリマー、タルク、ベントナイト、および他の鉱物支持体上に吸収させることが可能である。
【0047】
この発酵した培地は、化粧品中で従来用いられる以下の任意の他の成分とともに美容用組成物中で合わせられ得る:抽出物、および/または合成された脂質、ゲル化ポリマー、および増粘ポリマー、テンシオアクティブ(tensioactive)、および乳化剤、水溶性有効成分または脂溶性有効成分、他の植物の抽出物、組織抽出物、他の海洋抽出物。
【0048】
この発酵した培地を含有する美容用組成物または皮膚用医薬品組成物は、クリーム、バーム、またはゲル、またはローション、または日焼け止めクリーム、および日焼け後クリーム、髭剃り後製品、脱毛クリームまたは脱毛後クリームであってもよい。
【0049】
この発酵した培地を含有する美容用組成物または皮膚用医薬品組成物は、皮膚のケアのために、詳細には、フリーラジカルの有害な影響に対して、および天然のUVまたは人工的UVに対する暴露の間の皮膚の老化、生理学的老化、または早期老化に対するフリーラジカルの全ての結果に対して保護するために、ならびに皮膚、詳細には顔面、身体、頭皮、および毛髪のケアのために;皮膚のセラミド濃度を調節するために、免疫系を刺激するために、シャペロンの影響による防御的効果を得るために、そして特にオゾンに関して解毒物および抗ラジカルとして適合される。
【0050】
この発酵した培地を含有する美容用組成物または皮膚用医薬品組成物は、皮膚のケアのため、詳細には、フリーラジカルの有害な影響に対して、および天然のUVに対する曝露の間の皮膚の老化、生理学的老化、または早期老化に対するフリーラジカルの全ての結果に対して保護するために、ならびに皮膚、詳細には顔面、身体、頭皮、および毛髪のケアのために;皮膚のセラミド濃度を調節するために、免疫系を刺激するために、シャペロンの影響による防御的効果を得るために、そして特にオゾンに関して解毒および抗ラジカル活性のために適合された医薬の調製のために用いられる。
【0051】
この発酵した培地はまた、直接に皮膚へまたは毛髪と接触して連続的な局所適用を提供にするために、単独で用いられても、または美容用組成物もしくは皮膚用医薬品組成物中に組み込まれても、寝間着または昼間用の衣類または下着類を作製するために用いられるように適合された織物、合成ファイバー、または天然のファイバー、ウール、および任意の材料上にまたはその中に、適用するために、マクロ粒子、ミクロ粒子およびナノ粒子、または、マクロカプセル、ミクロカプセルおよびナノカプセルの形態として結合されても、または組み込まれても、または吸収されても、または吸着されてもよい。
【0001】
皮膚は、他人の視線に対して各自が与える最初のイメージであり、そして常にその外見は関心のもたれている課題である。
【0002】
生存期間中に、太陽ならびに種々の汚染物質に対する職業上の曝露(露光)および私的な曝露の両方によって、化学的および物理的な攻撃が生じ、これが異なる形態の酸素ラジカルの因子のリストの中の生成物をもたらす。これらの後者が、詳細には皮膚のレベルで、不可逆な損傷を生じ、その結果は少なくとも紅斑、日射病、皮膚の早期老化、そしてひどければ皮膚癌である。
【0003】
挫創の兆候の悪化、皮膚の柔軟性の消失、皮膚の乾燥、およびシワの出現は、老化の最初の肉眼的兆候に相当する。したがって、太陽に対する最初の曝露(露光)の際に出現する、皮膚細胞のレベルでの分子の変異(侵襲的かつ最先端の方法によってのみ計測され得る)は、なお一層悪性である。なぜなら、それらの変異は一般の人々には検出不能であるからである。
【0004】
太陽が、酸素のフリーラジカルの生成の唯一の原因ではない。多数の重要な生化学的反応(例えば、アミノ酸の酸化または脂肪酸の酸化、プロスタグランジンの合成…)が、これらの高反応型の酸素を全く天然に生じ、この酸素は、全身の組織にとって、および特定の皮膚にとって極めて有毒である。
【0005】
ヒトは、進化の過程で発達した以下のような生理学的調節によって、酸素ラジカルの有害な影響に対して天然に保護されている:春に開始する進行性の日焼け(紅斑に至らない皮膚への影響に対する)、スーパーオキシドジスムターゼおよびカタラーゼのような抗ラジカル酵素の存在、炎症反応および/または免疫反応の低下、表皮の肥厚、等々。
【背景技術】
【0006】
これらの問題を解決するために、美容産業界は、太陽光フィルター、SOD(スーパーオキシドディスムターゼ)のような皮膚に存在する天然の酵素を含む組成物、野菜抽出物などのいずれかを含有するあらゆる種類の製品を市場に出している。
【0007】
別の天然の酵素であるカタラーゼは、美容用組成物および皮膚用医薬品組成物には用いられ得ない。なぜなら、カタラーゼは、1993年6月14日の欧州指令(European Directive)93/35の付属文書II(1)の美容用製品の組成物中に入れることができない物質のリストにみられる(74番として)からである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
従って、美容産業界および皮膚用医薬品産業界においては、この化学的汚染物の有害な影響に対して皮膚が、よりよく抵抗し、なおかつ補充し、そして修復することを補助する製品を供給することが論理的である。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本出願の目的である本発明は、生物工学的な技術によって、従来用いられている微生物から、強力な抗ラジカル効果を有する有効成分を得ることを可能にするという発見に立脚する。
【0010】
該当の微生物は、海底の熱噴出孔で発見された新しい系統の好熱性の集団の一部である。
【0011】
これらの細菌は、通常はタンパク質が変性される温度で、そして細胞がその内部媒体と外部媒体との間で恒常性を維持できないような圧力下でも生存可能である。
【0012】
現在まで、好熱生微生物は、「PCR」(ポリメラーゼ連鎖反応)と呼ばれる、細胞の溶解物からの新しい増幅技術において有用なDNAを調製するために、生物工学において用いられている。
【0013】
従って、このような微生物からの有効成分の生成は、以下の2つの主な経路において興味深い:
・リボソーム16SのRNA配列を比較する系統発生的研究によって、全ての原核生物は、疑いなく同じ共通の好熱性の先祖から由来したことが示された。従って、これらの好熱性の集団は、おそらく元来の物質、およびそれらの新しい治療効果または美容的効果さえ有するように適合された元来の物質から構成される。
・これらの好熱性細菌によって生成される特定の代謝物は、熱安定性(このことはそれらの特性が高温でも維持されることをいう)である。分子の活性の寿命によって、それらは、最終の美容用製品中で長期にわたって安定にされ得る。
【0014】
本出願による微生物の発酵によるタンパク質の生成のためのプロセスは、Thermus属の株、詳細には、Thermus thermophilus、GY1211種を使用し、そしてこの株は、グアヤナ海盆(カルフォルニア湾)の東太平洋海嶺の海底の熱水噴出孔(深度2000メートル)から単離した。これらは、グラム陰性の桿菌であり、その大きさは、実質的に0.5μm×10μmに等しく、そして好気性、ヘテロトロピック、非胞子形成性、好熱性、圧力耐性であり、そして培養時には、オレンジ色で、丸く、不規則でない、円滑な、波形でないコロニーを生じる。
【0015】
この株は、パリのパスツール研究所の国立微生物培養コレクション(National Culture Collection of Micro−organism)において番号I−2715として登録されている。
【0016】
本発明者らは、好熱性集団のこれらの株が、美容分野および皮膚用医薬品の分野において有用な多くの生理学的活性を有する分子を生成または提供し得ることを発見した。
【0017】
それらの株がこれらの分子を排出するようにそれらを培養すること、または得られたバイオマスを使用することはいずれも特に興味深い。
【0018】
以下の例は、これらの2つの目的を達成するための培養条件を最適化するために得られた結果を示す。
【0019】
(バイオマスの生成の最適化)
産業的適用のためには、できるだけ簡単かつ経済的な培養培地を用いながら、最大のバイオマスを得ることが必要である。細菌培養に対する異なる物理化学的パラメーターの影響を評価し、それによって以下に列挙される限定要因を決定することが必要であった:
・GY/01培地中の栄養素の組成物:酵母抽出物およびNH4Clo色および匂いのような従来の問題を回避するため、その濃度を必要最小限に制限することが必要である。酵母抽出物に関しては、0.25%の濃度が限界濃度であること、および1.0%では、0.5%の時よりも多いバイオマスが得られるわけではないことが確認された。従って、選択された酵母抽出液の濃度は0.5%である。選択されるNH4Clの使用の最適濃度は、0.3%である。
・塩および微量元素の組成
Thermusは海洋細菌であるため、塩化ナトリウムの含量は、極めて重要であり、そして本発明者らの条件下では、本発明者らは、培養倍地中に1.0%のNaClを用いることを選択した。より高い濃度では得られるバイオマスの量が低下する。
【0020】
さらに、本発明者らは、培養の間に調節することなく、7.2に等しいpHで、撹拌しながら、72〜75℃の温度で発酵を実行することを選択した。
【0021】
これらの条件下では、集団が二倍になる時間は、47分に等しく、0.386(H−1)に等しい成長量μmをともなっている。
【0022】
(タンパク質の生成の最適化)
ほとんどのタンパク質は一般に細胞内にある。
濾過(0.2μm)の後、その培地を最初に20倍に濃縮した場合にのみ、GY1211を用いて発酵させた培地の一次元の電気泳動によって、いくつかのタンパク質バンドのうちに唯一の存在が、実証される。従って、タンパク質を細胞から離させるための技術的な方法を見出す必要があった。
【0023】
多くの実験によって、本発明者らは大量のタンパク質抽出のいくつかの手順を開発することができた。その手順は、満足のゆくものであり、工業的用途にも完全に適する。
【0024】
全体的満足度を与える手順の1つは以下の通りである:培養後、0.1%の最終濃度でCrodasinic LS30(CRODA)を30分間、添加する。
【0025】
培養培地中のタンパク質の用量は、一次元電気泳動によって多数のバンドの存在(従って、抽出された広範な種々のタンパク質)が実証されるとき、簡易熱量測定法によって、Thermusのタンパク質の0.2%に等しい最小濃度を示す。この処理がタンパク質の四次構造を変更しない(なぜなら測定された酵素活性は変更されていない)ことに注意のこと。最後に、相補的試験によって、20分間100℃の熱処理後に得られたタンパク質の電気泳動プロフィールの不変性が(質的および量的の両方で)実証されたことに注目することが重要である。この性質は、用いられた発酵プロトコールの妥当性を実証する。なぜなら、得られたタンパク質は、もとの微生物Thermusのタンパク質、そして特にGY1211株のタンパク質と同じ特徴を有するからである。
【0026】
あるいはこのCrodasinic LS30での界面活性剤処理の代わりに、高圧ホモジナイズによる従来の技術(ただし、この手順は長い)を用いてもよい。
【0027】
従って、倍地中の細菌タンパク質を回収するための簡便かつコストの少ない方法として、発酵の最後にCrodasinic LS30を使用することによって全てのパラメーターを最適化した発酵のおかげで、本発明者らは、バイオマスの生成、およびThermusから求めるタンパク質の質を最適化することに成功した。
【0028】
本特許出願では回収の単一の例を記載しているが、タンパク質の発酵および抽出の他のプロセスを用いてもよく、従って他の任意のタンパク質の発酵および抽出のプロセスも本出願の範囲内で用いられ得る。
【0029】
例えば、この製品中のタンパク質の量を増大するため、任意の物理的プロセスまたは化学的プロセス、例えば、限定はしないが、Crodasinic LS30の添加の前に細菌を濃縮するめの0.2μm濾過によって、さもなければ低分子量のカットの閾値での濾過(閾値20kDでの接線限外濾過)(これは、塩(沈殿の潜在的な原因)、小ペプチド(時々、着色、および所望されない匂いを生じる)、およびCrodasinic LS30の一部の排除を可能にする)によって、発酵培地を濃縮することが可能である。当業者は、生成の特定の必要性に応じて、それらの用途を最適化するために技術を適合および改変することができる。
【0030】
発酵および濾過の後に得られた生成産物を、以下のような、種々のタイプの処理に供してもよい:浄化、濃縮または希釈、保存、精製、沈殿による分画、クロマトグラフィーによる分画、凍結乾燥、または噴霧。
【0031】
本発明の好ましい実施形態の1つは、界面活性剤処理および限外濾過による濃縮後のGY1211の発酵培地によって、構成される。
【0032】
処置のうちどれか1つ、またはいくつかの処置の後に得られる生成産物(溶液、粉末、結晶、エマルジョン、…)は、美容術および皮膚薬学において従来の任意の生薬形態で用いられてもよい。以下の2つの組成物は、非限定的な例のつもりで示す。
【実施例1】
【0033】
実施例1.デイクリーム(day cream)
Volpo S20 2.4
Volpo S2 2.6
Prostearyl 15 8.0
蜜蝋 0.5
Abil(登録商標)ZP2434 3.0
プロピレングリコール 3.0
Carbopol(登録商標)941 0.25
トリエタノールアミン 0.25
発酵した培地 5.0
水および防腐剤QSP 100g
【実施例2】
【0034】
実施例2,ボディミルク(body milk)
Crillet 3 2.5
Novol 0.9
フルイラン(fluilan) 2.5
Carbopol(登録商標)940 0.3
蜜蝋 2.0
トリエタノールアミン 0.1
グリセリン 5.0
発酵した培地 3.0
水および防腐剤QSP 100g
【0035】
この生成物(製品)の使用の間に発見された多くの有益な効果のなかで、言及するに価するより重要な効果は、皮膚のセラミドの濃度の調節、ヒトのケラチノサイトのインビトロで観察されたCD40の免疫刺激効果、シャペロン型タンパク質の防御効果、および本出願による培養培地中のメナキノンの存在による異なる高反応性フリーラジカルに対する解毒効果である。このうち以下の実施例によって、過酸化水素のみに関する効果が示されるが、過酸化水素だけが問題のラジカルというわけではない。
【実施例3】
実施例3 インビトロでの「カタラーゼ様」活性
【0036】
「カタラーゼ様(catalase−like)」活性を実証するための最も簡易な方法は、以下の式によるH2O2の分解を分光光度法によって測定することにある:
【0037】
240nmでのH2O2吸収(従って、240nmでのDOの低下)は、H2O2の分解に比例し、これによって、ウシカタラーゼから測定されたスペクトルとの比較により、未知の標本の酵素活性または偽酵素活性を測定することが可能になる。
【0038】
以下の表には、25℃で実施した8つの独立した実験の間に、Crodasinicまたは高圧(APV材料)のいずれかによって処理した培養培地のカタラーゼタイプの偽酵素活性(平均±SEM)を整理して示してある。ここで[C]係数は、生成した培地の濃度を示す。
【0039】
Thermusを用いて発酵した標本の全てについて、酵素活性が観察されるが、発酵されていない培養培地自体は、酵素活性を有さない。さらに、測定された活性の間の比は、生じた濃度の比と一貫している。
【0040】
用いた処理が、得られた酵素活性に関して等価であることに注目することも可能である。
【0041】
結局、ウシのカタラーゼの活性が、試験を実施する温度内におさまる場合(45℃対25℃で約25%の活性)、Thermusを用いた発酵培地の偽酵素活性は、温度にともなってかなり増大する(ただし、45℃では、4.5の係数を掛けられる)ことを指摘することが特に重要である。その天然の環境において、Thermus GY1211は、70℃程度の温度で生存するので、これらの防御機構が、高温では特に有効であることは論理的である。美容的な観点から、この、熱による「活性化(activation)」は、かなりの利点を構成する。従って、太陽に曝される、そしてカタラーゼ様活性が最も必要なのは主に夏である。しかし、これらの条件下では、皮膚の温度は、30℃より高い温度に達し得る。
【0042】
45℃を超えては活性を測定していない。なぜなら本発明者らは、次に、インビボにおける皮膚の温度と適合しない条件について述べているからである。
【0043】
従って、ペルオキシダーゼ的な、カタラーゼ様の、抗ラジカルの、グリコシル化の阻害的な酵素活性、そしてコラーゲンの合成を改変する酵素活性を有する、上記の培養された培地は、天然のUVに対する曝露の間の、皮膚のケアのために、詳細には、フリーラジカルの有害な影響に対して、および老化(これは、皮膚の老化、生理学的老化、または早期老化である)に対するフリーラジカルのあらゆる結果に対して保護するために、さもなければ皮膚の、詳細には顔面、身体、頭皮、および毛髪のケアのために;皮膚のセラミド濃度を調節するために、免疫系を刺激するために、シャペロンの影響による防御的効果を得るために、そして異なる高反応性フリーラジカル、特にオゾンについての解毒物として(本出願の目的である培養培地中のメナキノンの存在によって)、用いられ得る。
【0044】
本発明において用いられる組成物において、発酵された培地は一般に、濃縮された培地、凍結乾燥された培地、または噴霧された培地については、0.001乾燥重量%(p/p)から2乾燥重量%(p/p)の間で、そして液体形態で発酵した培地については、一般に0.1%(p/p)から10.0%(p/p)の間で用いられる。
【0045】
この発酵した培地は、美容術または皮膚薬学において使用される、以下の任意の生薬形態で用いられ得る:O/Wエマルジョン、およびW/Oエマルジョン、ミルク、ローション、ポマード、キャピラリーローション、シャンプー、石鹸、スティックおよびペンシル、スプレー、ボディーオイル(ただし、このリストは限定的なものではない)。
【0046】
この発酵した培地を、リポソーム、カイロミクロン、マクロ粒子、ミクロ粒子およびナノ粒子、ならびに、マクロカプセル、ミクロカプセルおよびナノカプセルのような美容用ベクター中に組みむこと、それらを粉末化有機ポリマー、タルク、ベントナイト、および他の鉱物支持体上に吸収させることが可能である。
【0047】
この発酵した培地は、化粧品中で従来用いられる以下の任意の他の成分とともに美容用組成物中で合わせられ得る:抽出物、および/または合成された脂質、ゲル化ポリマー、および増粘ポリマー、テンシオアクティブ(tensioactive)、および乳化剤、水溶性有効成分または脂溶性有効成分、他の植物の抽出物、組織抽出物、他の海洋抽出物。
【0048】
この発酵した培地を含有する美容用組成物または皮膚用医薬品組成物は、クリーム、バーム、またはゲル、またはローション、または日焼け止めクリーム、および日焼け後クリーム、髭剃り後製品、脱毛クリームまたは脱毛後クリームであってもよい。
【0049】
この発酵した培地を含有する美容用組成物または皮膚用医薬品組成物は、皮膚のケアのために、詳細には、フリーラジカルの有害な影響に対して、および天然のUVまたは人工的UVに対する暴露の間の皮膚の老化、生理学的老化、または早期老化に対するフリーラジカルの全ての結果に対して保護するために、ならびに皮膚、詳細には顔面、身体、頭皮、および毛髪のケアのために;皮膚のセラミド濃度を調節するために、免疫系を刺激するために、シャペロンの影響による防御的効果を得るために、そして特にオゾンに関して解毒物および抗ラジカルとして適合される。
【0050】
この発酵した培地を含有する美容用組成物または皮膚用医薬品組成物は、皮膚のケアのため、詳細には、フリーラジカルの有害な影響に対して、および天然のUVに対する曝露の間の皮膚の老化、生理学的老化、または早期老化に対するフリーラジカルの全ての結果に対して保護するために、ならびに皮膚、詳細には顔面、身体、頭皮、および毛髪のケアのために;皮膚のセラミド濃度を調節するために、免疫系を刺激するために、シャペロンの影響による防御的効果を得るために、そして特にオゾンに関して解毒および抗ラジカル活性のために適合された医薬の調製のために用いられる。
【0051】
この発酵した培地はまた、直接に皮膚へまたは毛髪と接触して連続的な局所適用を提供にするために、単独で用いられても、または美容用組成物もしくは皮膚用医薬品組成物中に組み込まれても、寝間着または昼間用の衣類または下着類を作製するために用いられるように適合された織物、合成ファイバー、または天然のファイバー、ウール、および任意の材料上にまたはその中に、適用するために、マクロ粒子、ミクロ粒子およびナノ粒子、または、マクロカプセル、ミクロカプセルおよびナノカプセルの形態として結合されても、または組み込まれても、または吸収されても、または吸着されてもよい。
Claims (19)
- 微生物の発酵によるタンパク質の生成、その後の該生成したタンパク質の抽出のためのプロセスであって、該微生物が、Thermus科の微生物である、プロセス。
- 請求項1に記載のタンパク質の生成のためのプロセスであって、前記微生物が、大深度の熱水源に隣接して位置する海水由来である、プロセス。
- 請求項1または2のいずれか1項に記載のタンパク質の生成のためのプロセスであって、前記微生物が、パリのパスツール研究所の国立微生物培養コレクションに受付番号1−2715として寄託された、GY1211株の微生物である、プロセス。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のタンパク質の生成のためのプロセスであって、前記発酵が、約7.2のpHを有し、かつ約0.25%から1%の濃度の酵母抽出物、塩化アンモニウム、1%を超えない濃度の塩化ナトリウム、および微量元素を含む栄養培地中で実行される、プロセス。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のタンパク質の生成のためのプロセスであって、前記発酵が、撹拌を伴い、約72℃から75℃の間で生じる、プロセス。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のタンパク質の生成のためのプロセスであって、前記発酵が、前記タンパク質の抽出を可能にする界面活性剤処理を伴う、プロセス。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のタンパク質の生成のためのプロセスであって、前記発酵が、0.2μmでの濾過の工程、および/または限外濾過の工程を伴う、プロセス。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のプロセスによって得られるタンパク質の混合物であって、該タンパク質は、100℃まで熱安定性である、タンパク質の混合物。
- メナキノンを含む、請求項8に記載のタンパク質の混合物。
- 請求項8に記載のタンパク質の混合物であって、該混合物は、酵素的、ペルオキシダーゼ的、カタラーゼ様、抗ラジカル的、グリコシル化の抑制的な活性、およびコラーゲンの合成の調節の活性を有する、タンパク質の混合物。
- 請求項8〜10のうちの1項に記載のタンパク質の混合物を含む美容用組成物または皮膚用医薬品組成物。
- 請求項11に記載の美容用組成物または皮膚用医薬品組成物であって、前記発酵させた培地が、濃縮されるか、凍結乾燥されるか、または噴霧された培地については、一般に0.001乾燥重量%(p/p)から2乾燥重量%(p/p)の間で、そして液体形態で発酵した培地については、一般に0.1%(p/p)から10.0%(p/p)の間で、用いられる、美容用組成物または皮膚用医薬品組成物。
- 請求項10〜12のうちの1項に記載の美容用組成物または皮膚用医薬品組成物であって、美容術または皮膚薬学において使用される、O/Wエマルジョン、およびW/Oエマルジョン、ミルク、ポマード、キャピラリーローション、シャンプー、石鹸、スティックおよびペンシル、スプレー、ボディーオイルの任意の生薬形態、
で存在する、美容用組成物または皮膚用医薬品組成物。 - 請求項10〜13のうちの1項に記載の美容用組成物または皮膚用医薬品組成物であって、前記混合物が、リポソーム、カイロミクロン、マクロ粒子、ミクロ粒子およびナノ粒子、ならびに、マクロカプセル、ミクロカプセルおよびナノカプセルとして美容用ベクター中に組み込まれるか、または粉末化有機ポリマー、タルク、ベントナイト、もしくは他の鉱物支持体上に吸収される、美容用組成物または皮膚用医薬品組成物。
- 請求項10〜14のうちの1項に記載の美容用組成物または皮膚用医薬品組成物であって、前記混合物が、化粧品中で従来用いられる、以下の任意の他の成分:
抽出された脂質、および/または合成された脂質、ゲル化ポリマー、および増粘剤、界面活性物質、および乳化剤、水溶性有効成分または脂溶性有効成分、他の植物の抽出物、組織抽出物、他の海洋抽出物、
とともに用いられる、美容用組成物または皮膚用医薬品組成物。 - 請求項10〜15のいずれか1項に記載の美容用組成物または皮膚用医薬品組成物であって、クリーム、バーム、またはゲル、ローションまたは日焼け止めクリームまたは日焼け後クリーム、髭剃り後製品、脱毛クリームまたは脱毛後クリームの形態である、美容用組成物または皮膚用医薬品組成物。
- 請求項10〜16に記載の美容用組成物または皮膚用医薬品組成物であって、皮膚のケアのために、詳細には、フリーラジカルの有害な影響に対して、および天然のUVまたは人工的UVに対する暴露の間の皮膚の老化、生理学的老化、または早期老化に対するフリーラジカルの全ての結果に対して保護するために、ならびに皮膚、詳細には顔面、身体、頭皮、および毛髪のケアのために、皮膚のセラミド濃度を調節するために、免疫系を刺激するために、シャペロンの影響による防御的効果を得るために、そして異なる高反応性フリーラジカル、特にオゾンについての解毒物として、適合された、美容用組成物または皮膚用医薬品組成物。
- 請求項8〜10に記載の混合物、または請求項11〜17に記載の美容用組成物または皮膚用医薬品組成物の使用であって、皮膚のケアのために適合された医薬の調製のため、
詳細には、フリーラジカルの有害な影響に対して、および天然のUVに対する曝露の間の皮膚の老化、生理学的老化、または早期老化に対するフリーラジカルの全ての結果に対して保護するため、さもなければ皮膚、詳細には顔面、身体、頭皮、および毛髪のケアのための、使用。 - 寝間着または昼間用の衣類または下着類を作製するために用いられるように適合された織物、合成ファイバー、または天然のファイバー、ウール、および任意の材料中に、マクロ粒子、ミクロ粒子およびナノ粒子、または、マクロカプセル、ミクロカプセルおよびナノカプセルの形態で、結合されるか、または組み込まれるか、または吸収されるか、または吸着されて、直接皮膚または毛髪と接触して、連続的な局所適用が可能になる、請求項8〜10に記載の混合物、または請求項11〜17に記載の美容用組成物または皮膚用医薬品組成物の、使用。
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