CN105473704B

CN105473704B - 来自假交替单胞菌属的分离细菌的应用、环脂肽及其应用

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Publication number: CN105473704B
Application number: CN201480032821.1A
Authority: CN
Inventors: 弗洛里·德斯瑞卡; 雅尼克·弗勒里; 帕特里克·勒彻瓦利尔; 德尔芬·德斯图米厄; 马蒂厄·西蒙
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Rennes 1; Univerdite de Bretagne Occidentale
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Rennes 1; Univerdite de Bretagne Occidentale
Priority date: 2013-05-24
Filing date: 2014-05-23
Publication date: 2019-09-10
Anticipated expiration: 2034-05-23
Also published as: CA2913067A1; CN105473704A; JP2016525884A; US20180214509A1; FR3005963B1; AU2014270306A1; AU2014270306B2; FR3005963A1; US20160193284A1; EP3017069B1; US10772930B2; JP6506259B2; US9956262B2; CA2913067C; EP3017069A1; WO2014187993A1

Abstract

本发明涉及：来自假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)属的分离细菌用作益生菌的应用，所述菌株用作防腐剂，可由该细菌获得的环脂肽，至少包括上述环脂肽的组合物，以及它们的应用。

Description

来自假交替单胞菌属的分离细菌的应用、环脂肽及其应用

技术领域

本发明涉及：一种来自假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)属的分离的细菌用作益生菌，所述菌株作为防腐剂的应用，可由该细菌获得的环脂肽，包括至少上述环脂肽的组合物，以及它们的应用。

背景技术

水产养殖将所有的动物或植物生产活动都集中在水性介质中。通过在海洋、河流或池塘中进行水产养殖。从直接供应食物或载体(由例如加载了矿物质的水上升而间接产生的载体)开始，人工鱼礁或吸引区或浓缩装置(concentration)的某些系统就与水产养殖相似。水产养殖还涉及鱼类生产(鱼类养殖)、贝类生产(贝类养殖)、甲壳类动物的生产(鳌虾养殖(astaciculture)和对虾养殖(shrimp farming))、鲍鱼生产(水产养殖)、牡蛎生产(牡蛎养殖)或进一步的藻类生产(藻类养殖)。

水产养殖是对鱼类的过度捕捞和越来越大的需求所引起的响应之一。2008年，水产养殖为全球提供了人类消耗的76.4％的淡水鱼类、68.2％的洄游型鱼类、64.1％的软体动物、46.4％的甲壳类动物和2.6％的海水鱼类。

水产养殖有时用于除了食物消费之外的其它目的，例如在欧洲，经由从1850年至1870年建立的很多“鱼类养殖站”；或者在日本，为了将虾或鲍鱼重新引入到这些动物被过度开采或因为其它原因(污染等)而消失的环境中。

现今，生产方法的强化和气候变化使得水产养殖和牡蛎养殖的发展特别脆弱。

在水产养殖物种的天然生物防护策略中，使用了来自健康野生动物的益生菌。如果在养殖中广泛使用益生菌，则它们在水产养殖中的应用仍然是新颖的。

因此，对于动物育种的生产者和工业家来说，生物发展和保护这些物种的有效策略表现出不可否认的优点。

此外，抗微生物剂的更新是公众和兽医卫生的重点。但它们的过度和不适当使用选择出了多重耐药菌株，从而进入了治疗死胡同(在EEC中25,000死亡/年，WHO 2011)。

已经30年没有在市场上出售新的抗革兰氏阴性菌的抗生素。因此，对具有抗微生物性质的新的化合物的研究是重要，而且是迫切的。

平行地，在植物检疫处理的领域中还需要鉴定出对环境没有害，且仍然是有效的杀菌试剂的替代产品。

发明内容

在本发明的范围内，发明人分离出了在动物卫生领域，特别在水产养殖领域中具有有用性质的海洋细菌。

该海洋细菌尤其产生抗菌化合物，发明人已经对这些抗菌化合物在结构和功能水平上进行了表征。

该细菌属于Pseudoalteromonas属。

Gauthier等在1995年首先提出了Pseudoalteromonas属，并且迄今为止，Pseudoalteromonas属由39种细菌组成(Gauthier,G.,Gauthier,M.&Christen,R.(1995)Phylogenetic Analysis of the Genera Alteromonas,Shewanella,and MoritellaUsing Genes Coding for Small-Subunit rRNA Sequences and Division of the GenusAlteromonas into Two Genera,Alteromonas(Emended)and Pseudoalteromonasgen.nov.,and Proposal of Twelve New Species Combinations.Int J Syst Bacteriol45,755–761)。

本申请的发明人分离出了Pseudoalteromonas hCg-6细菌，该PseudoalteromonashCg-6细菌能产生抗菌化合物，特别是包括七肽环和4至20个碳原子的烃链的环脂肽，更特别是式A的环脂肽：

其中：

R选自由以下基团组成的组：

-除了壬基和十一烷基之外的含4至20个碳原子的烷基；或

-除了十一碳-4-烯基和十三碳-6-烯基之外的含4至20个碳原子的烯基；或

-经-OH基取代的且含4至20个碳原子的烷基；和

-经-OH基取代的且含4至20个碳原子的烯基。

更特别地，分离的上述细菌是细菌Pseudoalteromonas hCg-6，是根据布达佩斯条约于2013年5月22日保藏于微生物菌种国家保藏中心(CNCM，法国巴黎)的保藏编号为I-4753的菌株。

菌株hCg-6是从巨蛎属(Crassostrea)牡蛎的血淋巴中分离出来的，并且示出能在血淋巴和各种培养基的上清液中分泌抗菌化合物。

如在下面实施例中所示，通过研究该菌株的基因型和生化特征，能够定义新物种。

特别在水产养殖或植物保护领域中，对上述细菌最感兴趣的是，它在它的培养上清液中分泌抗病原菌的活性抗菌化合物。

根据这些方面之一，本发明涉及之前提到的分离的细菌，用作动物育种的益生菌，特别是用作水产养殖的益生菌。

更特别的是，本发明涉及如上所述的分离的细菌，用作鱼类养殖、贝类养殖、水产养殖、鳌虾养殖、对虾养殖、牡蛎养殖和藻类养殖的益生菌。更特别的是，本发明涉及如上所述的分离的细菌，用于改善鱼类、贝类、甲壳类动物、鲍鱼、牡蛎或进一步的藻类的健康。

本发明还涉及如上所述的分离的细菌作为益生菌的应用，特别用于鱼类养殖、贝类养殖、鳌虾养殖、对虾养殖、水产养殖、牡蛎养殖和藻类养殖。更特别的是，本发明涉及如上所述的分离的细菌的应用，用于改善鱼类、贝类、甲壳类动物、鲍鱼、牡蛎或进一步的藻类的健康。

根据这些方面的另一方面，本发明还涉及一种治疗鱼类、贝类、甲壳类动物、鲍鱼、牡蛎或进一步的藻类的方法，该方法包括给予有效量的根据本发明的细菌。特别是，该方法要改善鱼类、贝类、甲壳类动物、鲍鱼、牡蛎或进一步的藻类的健康。

“益生菌”指要被引入到动物食品中的食品添加剂，该食品添加剂包括有效量的根据本发明的分离的细菌。按照OMS，益生菌是以适当量给予的，并且对宿主的健康有益的活的微生物(OMS,2001)。

“有效量”指能实现所要求的效果的细菌的量。特别指在10³CFU.ml^-1至10¹⁰CFU.ml^-1之间的量。

根据这些方面的另一方面，本发明还涉及如上所述的细菌作为植物检疫剂的应用。

根据这些方面的另一方面，本发明还涉及一种植物检疫处理的方法，该方面包括向特别是植物、真菌或昆虫，给予有效量的根据本发明的细菌。

此外，发明人分离了一个新家族的环脂肽。根据本发明的环脂肽包括七肽环，该七肽环经被长度、不饱和度和羟基化水平可变的烃链酰化。

因此，本发明还涉及式A的环脂肽：

其中：

R选自由以下基团组成的组：

-除了壬基和十一烷基之外的含4至20个碳原子的烷基；或

-经-OH基取代的且含4至20个碳原子的烷基；和

-经-OH基取代的且含4至20个碳原子的烯基。

“烷基”指直链或支链的，任选地为环状的饱和脂肪族基团，该饱和脂肪族基团含4至20个碳原子，更特别含6至14个碳原子。例如，烷基可为丁基、戊基、己基、庚基、辛基、癸基、十二烷基和十三烷基等。

“烯基”指直链或支链的，任选地为环状的不饱和脂肪族基团，该不饱和脂肪族基团含4至20个碳原子，更特别含6至14个碳原子，并且包括一个或多个双键，尤其包括1至3个双键。例如，烯基可为丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基、十一碳烯基、十二碳烯基、十三碳烯基等。特别可以是壬烯基，特别是壬基-2-烯基，辛烯基，癸烯基，十二碳烯基，癸二烯基，十三烷基三烯基等。

例如，经-OH基取代的烷基可以是羟基壬基，特别是2-羟基壬基。

例如，经-OH基取代的烯基可以是羟基辛烯基。

更具体地，根据本发明的环脂肽是如上所述的式(A)的环脂肽，其中，R选自由以下基团组成的组：

-除了壬基和十一烷基之外的含6至14个碳原子的烷基；或

-除了十一碳-4-烯基和十三碳-6-烯基之外的含6至14个碳原子的烯基；或

-经-OH基取代的且含6至14个碳原子的烷基；和

-经-OH基取代的且含6至14个碳原子的烯基。

仍然更具体地，根据本发明的环脂肽选自如上定义的式(A)的环脂肽，其中，R选自由以下基团组成的组：壬烯基，特别是壬基-2-烯基，羟基壬基，特别是2-羟基壬基，庚基，辛烯基，辛基，癸基，羟基癸基，癸二烯基，癸烯基，羟基辛烯基，十二碳烯基和十三烷基三烯基。

根据本发明的多个方面之一，可从本发明范围内描述的细菌中获得本申请描述的环脂肽。

因此，本发明还涉及一种生产如上限定的环脂肽的方法，该方法包括以下步骤：在能产生所述环脂肽的条件下，培养如上所述的细菌。

具体地，在经本领域技术人员适应性改变的条件下培养细菌，其中本领域技术人员知道如何确定产生环脂肽的理想的培养条件，尤其是培养温度。

更具体地，在4℃至25℃的温度下，优选在12℃至18℃的温度下，同时以70至130rpm，优选100rpm的速度进行搅拌，将细菌培养24至96小时，优选72小时。

培养基具体是海洋肉汤培养基或被称为F29培养基的合成培养基，该合成培养基每升含有pH为7.4的47mM磷酸盐缓冲液(7.6g K₂HPO₄,3g)、3％的海盐50mM的蔗糖和20ml MEM50×，优选合成培养基F29。

根据这些方面之一，上述生产方法在细菌培养步骤之后还包括分离环脂肽的步骤。

具体地，通过收获培养上清液，例如通过对培养上清液进行离心，来实现上述分离。

根据这些方面之一，上述生产方法在上述分离步骤之后还包括纯化环脂肽的步骤。

具体地，使用本领域技术人员的任意适当的色谱法，例如通过液相色谱法与生物功能分析的组合，来实现上述纯化。

因此，根据这些方面之一，根据本发明的生产环脂肽的方法包括以下步骤：

a)在能产生环脂肽的条件下，具体在本发明范围内所述的培养基F29中，培养在本发明范围内所述的细菌；和/或

b)分离上述环脂肽；和/或

c)纯化上述环脂肽。

根据本发明的环脂肽对革兰氏阴性菌具有强大且有选择性的活性。

因此，本发明还涉及根据本发明的至少一种环脂肽，该环脂肽用作药物。更具体地，本发明涉及根据本发明的环脂肽，该环脂肽用作药物。

根据这些方面之一，本发明还涉及根据本发明的至少一种环脂肽，该环脂肽用作抗微生物剂。更具体地，本发明涉及根据本发明的一种环脂肽，该环脂肽用作抗微生物剂。

具体地，上述环脂肽用于清洁皮肤，尤其用于清洁手，或用作卫生产品中的活性试剂，更尤其用作身体卫生产品中的活性试剂。

根据这些方面的另一方面，本发明还涉及一种处理方法，该处理方法包括给予有效量的根据本发明的至少一种环脂肽，尤其是给予有效量的根据本发明的一种环脂肽。上述处理方法尤其是用于抗菌处理的方法，特别用于清洁皮肤、用于洗手或用于身体卫生。

根据这些方面的另一方面，本发明还涉及根据本发明的至少一种环脂肽作为植物检疫剂的应用，尤其用于保护植物、真菌和昆虫。更具体地，本发明涉及环脂肽作为植物检疫剂的应用，尤其用于保护植物、真菌和昆虫。根据这些方面的另一方面，本发明还涉及一种植物检疫的处理方法，该植物检疫的处理方法包括尤其向植物、真菌或昆虫，给予有效量的根据本发明的至少一种环脂肽，尤其是给予有效量的根据本发明的一种环脂肽。

根据这些方面的又一方面，本发明还涉及根据本发明的至少一种环脂肽作为农业食品工业或化妆品工业中的防腐剂的应用。

根据这些方面的另一方面，本发明涉及一种用于农业食品工业或化妆品工业的改善产品保存的方法，该方法包括向要保存的产品中添加根据本发明的至少一种环脂肽。

根据这些方面的又一方面，本发明涉及一种化妆品组合物和/或皮肤用组合物，包括在生理学上可接受的载剂中的根据本发明的至少一种环脂肽。优选地，上述组合物包括根据本发明的环脂肽。更具体地，上述环脂肽与佐剂或溶剂组合。

“化妆品组合物”指用于与人体的各表面部分接触的物质或制剂，特别是与表皮、毛发和毛细管系统、指甲、嘴唇和外生殖器，或与牙齿和颊粘膜接触的物质或制剂，以专一或主要地对它们进行清洁、美化，使其散发香味，改变其外观，对其进行保护，维持其良好状态或克服体臭。

“皮肤用组合物”指用于与人体的各表面部分接触的物质或制剂，特别是与表皮、毛发和毛细管系统、指甲、嘴唇和外生殖器，或与牙齿和颊粘膜接触的物质或制剂，以预防和/或治疗皮肤病状。皮肤用组合物用于治疗用途。

本发明还涉及一种药物组合物，该药物组合物包括在药学上可接受的载剂中的根据本发明的至少一种环脂肽。优选地，上述组合物包括根据本发明的一种环脂肽。更具体地，上述环脂肽与佐剂或溶剂组合。

因此，根据本发明的环脂肽可用于食物的应用中，更具体用于保存食料的领域中，并且可用于人类的应用中，例如用作药物或皮肤用试剂，可以去除微生物试剂，尤其是去除存在于皮肤表面，更尤其是在手上的细菌。根据本发明的环脂肽还可用于化妆品领域中。此外，根据本发明的环脂肽还可用于植物检疫的应用中。

根据剂型和期望的给药方法，从本领域技术人员已知的常规赋形剂中选择药学上可接受的赋形剂。

在本发明的用于口服给药、舌下给药、皮下给药、肌内给药、静脉内给药、外敷(topique)给药、局部(locale)给药、气管内给药、鼻内给药、经皮给药或直肠给药的药物组合物中，可向动物和人类给予与标准药物赋形剂混合的作为单位剂型的如上定义的环脂肽。

适当的给药形式包括：口服途径形式，诸如片剂、软胶囊或硬胶囊、粉剂、颗粒剂和口服溶液或混悬剂；舌下、口腔、气管内、眼内、鼻内、通过吸入的给药的形式，外敷、肠胃外给药形式，诸如经皮、皮下、肌内或静脉内的给药形式，直肠和植入物的给药形式。对于外敷应用，可使用霜、凝胶、油膏或洗剂形式的根据本发明的环脂肽。

当制备片剂形式的固体组合物时，可将环脂肽与药物载剂，诸如明胶、淀粉、乳糖、硬脂酸镁、滑石、阿拉伯树胶等混合。

还可使用蔗糖、纤维素衍生物或其它适当的材料涂敷片剂，或进一步对片剂进行处理，以便它们具有延长或延迟的活性，并且它们持续释放预定量的活性成分。

例如，可通过将活性成分与稀释剂混合，并将获得的混合物倾倒在软明胶胶囊或硬明胶胶囊中，来获得如明胶胶囊的制剂。

含有根据本发明的环脂肽的药物组合物还可呈现为液体形式，例如为溶液、乳剂、混悬剂或糖浆剂，并且尤其是用于例如口服或鼻内给药的适当形式。适当的液态载体可例如是水、有机溶剂(诸如甘油或甘醇)以及它们在水中的不同比例的混合物。

如糖浆剂或酏剂的制剂，或作为滴剂给药的制剂还可包含活性成分和甜味剂(例如无卡路里的甜味剂)，以及提供味道的试剂和适当的着色剂。

可分散在水中的粉剂或颗粒剂可例如含有与分散剂或润湿剂，或悬浮剂(如聚乙烯吡咯烷酮)，以及与甜味剂或调味剂混合的活性成分。

根据给药方法、体重和患者的响应，医师或兽医按照习惯确定每位患者、人或动物每天的给药量。通常，根据本发明的环脂肽的每日给药量，是环脂肽能产生所要求的治疗效果的最小有效量。

“有效量”指组合物改善所要求的一个或多个有效性参数的任意量。

可能存在适当的较高或较低剂量的特定情况，且这样的剂量并不偏离本发明的范围。

在根据本发明的化妆品组合物或皮肤用组合物中，根据美容形式或皮肤用形式，并且根据期望的给药方法，从本领域技术人员已知的常规赋形剂中选择生理学上可接受的赋形剂。

生理学上可接受的介质是无毒性介质，可涂敷在人类的皮肤和附器上，并且在气味和触感上具有令人愉快的方面。

对于经由口服途径的给药，根据本发明的化妆品组合物或皮肤用组合物可呈现为任意适当的形式，特别是可饮用的溶液、片剂、明胶胶囊、胶囊或其它食料或营养补充剂的形式。

对于皮肤上的外敷应用，上述组合物尤其可具有以下形式：洗剂或浆液类型的水性或油性溶液或分散剂，乳液类型的具有液态或半液态粘稠度的乳剂(通过将脂肪相分散在水相(O/W)或反之亦然(W/O)获得)，或者水性或无水凝胶或油脂类型的具有软的粘稠度的混悬剂或乳剂，或进一步为微胶囊或微颗粒，或离子和/或非离子型的囊泡分散剂(dispersions vésiculaires)，或泡沫。根据常规方法制备这些组合物。

在根据本发明的化妆品组合物或皮肤用组合物中，环脂肽的量在0.1％至3％之间，优选在0.2％至0.5％之间。

根据本发明的化妆品组合物或皮肤用组合物可例如形成：脸、手、足、大解剖皱褶或身体的清洁霜、防护霜、治疗霜或护理霜(例如日间护理霜、晚间护理霜)，身体护理或防护乳液，皮肤护理的水、凝胶或泡沫，如清洁露、除臭组合物。

上述组合物还可包括形成肥皂或清洁棒的固态制剂。

还可将上述组合物包装成还含有高压推进剂的气雾剂组合物。

具体地，根据本发明的皮肤用组合物或化妆品组合物可选自除臭剂、洁面乳或泡沫胶。下面的附图和实施例对本发明进行了解释，但并不限制本发明。

附图说明

图1：为了评价菌株hCg-6对牡蛎卵存活的效果而设置的实验程序。

图2：在与菌株Pseudoalteromonas hCg-6(■)和普里兹湾假交替单胞菌(Pseudoalteromonas prydzensis)(▲)进行(●)或者没有进行初始孵育的情况下，幼稚的二倍体牡蛎在病原体(灿烂弧菌(Vibrio splendidus)LGP32)的存在下的死亡率的变化。

图3：使用以下的RAPA测试，对根据本发明的环脂肽的抗菌清洁力进行的评价：

-(A)：未经处理且未经接种的对照平皿，

-(B)和(C)：未经样品处理，且分别接种了大肠杆菌(E.coli)ATCC 25922和E.coliP7的平皿，

-(D)和(E)：经200μg根据本发明的环脂肽处理，且分别接种了大肠杆菌(E.coli)ATCC 25922和E.coli P7的平皿。

具体实施方式

实施例

(i)菌株Pseudoalteromonas hCg-6的分离和鉴定

从长牡蛎(Crassostrea gigas)的血淋巴中分离出细菌菌株hCg-6。

在法国莫尔比昂省海湾(Golf of Morbihan)(47°30'50北，2°37'50西，WGS84系统)的瑞斯(Rhuys)半岛中捕获了这些牡蛎。在小心打开牡蛎之后，使用一次性无菌针，在心包腔中收集血淋巴。为了进行细菌分离，利用自动接种仪(WASP,AES Chemunex,法国)将血淋巴的每个单一样品(1.5ml)直接铺在海洋琼脂(2216)上，并且在18℃孵育72h。

通过研究hCg-6的基因型和生化特征，能够定义新的物种。

使用光学显微镜(Olympus BX50)，进行了死亡率和与形态学相关的研究。按照Lelliot和Stead方法(1987)，测试了该细菌菌株使吐温(Tween)40和吐温80水解的能力。使用以下试剂盒，按照供应商所提出的条件确定了酶活性和生化特征：API 20E、API 50CH和API ZYM(Biomérieux)。按照Park et al.(2005)的指示，在Biomérieux提供的接种试剂盒中所使用的培养基中添加了2％w/v海盐(Sigma)，以使培养基完整。最后，按照在&Kroppenstedt,1996；Kuykendall et al.,1988；Miller,1982中描述的方法，进行与脂肪酸构成相关的分析。

由此，可以确定，该革兰氏阴性细菌不形成孢子，是移动的有机体(宽0.6～0.9μm，长1.9～3μm)，能形成颜色略呈棕色的菌落。

在4℃至30℃观察到生长(在25℃至30℃之间观察到最佳生长)。

构成该细菌的主要脂肪酸如下：3＝C16:1 ω7c/i-C15:0 2-OH(36.6％)，C18:1ω7c(18.6％)，C16:0(13.8％)。

将细菌菌株hCg-6的其它生理学特征和生化特征总结在下面的表1中。除了这些结果之外，还确定了该菌株是过氧化氢酶-、氧化酶+，且水解吐温40和吐温80。在使用试剂盒API ZYM进行分析的过程中，菌株hCg-6对碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、α-葡萄糖苷酶和N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶示出阳性反应。而对试剂盒API ZYM中包括的其它酶活性，没有观察到反应。在使用试剂盒API 20NE进行分析之后，以下测试是阳性的：硝酸盐的还原，七叶灵(esculin)的水解，葡萄糖、麦芽糖、N-乙酰氨基葡萄糖、苹果酸盐和柠檬酸盐的同化。没有使用以下物质：D-半乳糖，L-鼠李糖，D-山梨醇，D-或L-阿拉伯糖，D-或L-阿拉伯糖醇，和D-蜜二糖。细菌菌株hCg-6使用葡萄糖、蔗糖、海藻糖、果糖、D-纤维二糖和D-麦芽糖作为碳和能量的来源。

该菌株对多粘菌素(50μg)和头孢氨苄具有抗性，但是对恩诺沙星、头孢喹诺(cefquinom)30、庆大霉素、噁喹酸、四环素、阿莫西林是敏感的。

表1：菌株hCg-6的生理学特征和生化特征：

+，阳性；-，阴性；f：轻微反应

根据布达佩斯条约，将该菌株于2013年5月22日保藏于微生物菌种国家保藏中心(CNCM，法国巴黎)，保藏编号为I-4753。

(ii)Pseudoalteromonas hCg-6菌株在水产养殖中的活性

为了评价菌株hCg-6的生物保护作用，在与菌株hCg-6进行或没有进行初始孵育的情况下，进行幼稚二倍体牡蛎(18个月大的幼牡蛎)被灿烂弧菌(Vibrio splendidus)LGP32(注射到闭壳肌中)感染的实验。实验程序示于图1中。

结果示出，在菌株hCg-6的存在下对牡蛎(n＝19)进行初始孵育之后，死亡率显著降低(图2)。实际上，在60h之后，总死亡率稳定至35％，而未与hCg-6孵育的一批牡蛎(n＝22)的死亡率水平是86％，并且与菌株Pseudoalteromonas prydzensis(对照)孵育的牡蛎(n＝16)的死亡率是94％。

(iii)环脂肽的产生和分离

菌株Pseudoalteromonas hCg-6在合成培养基F29(每升有pH为7.4的47mM磷酸盐缓冲液(7.6g K₂HPO₄,3g)、3％的海盐50mM蔗糖和20ml MEM 50X)中，在18℃搅拌(100rpm)下培养72h之后，通过在4℃，7,500rpm离心30分钟，收获含活性分子的培养上清液。使液相色谱法与生物功能分析组合，以纯化培养上清液中存在的活性化合物。使用两种溶剂：H₂O milliQ 0.07％TFA(溶剂A)和乙腈(Carlo)0.07％TFA(溶剂B)。将培养上清液注入到SPE柱子(Upti Clean columns)上，其中按照供应商的说明书预先对SPE柱子进行了装填。在使用溶剂A和溶剂B(90/10)的混合物冲洗过柱子之后，通过溶剂A和溶剂B的混合物60-40(v/v)进行洗脱。

然后，在HTec柱子上用反相色谱分析被洗脱的成分。在220nm和280nm处追踪洗脱，并且通过在40℃，以0.8ml.min^-1的流速的溶剂B(在8分钟内为20％至28％，然后在15分钟内为28％至33％)的双相线性梯度进行。手动收集吸收峰，冷冻干燥，测试它们的抗菌活性，并且储存在-20℃。通过质谱分析法(MALDITOF/TOF Autoflex III smartbeam(Bruker Daltonics)，所使用的基质：HCCA,低质量或LIFT方法)，纯化并且分析了具有不同保留时间的一系列11种生物活性化合物。

活性化合物的分子离子(M+H+)的分子质量如下：927、971、941、953、939、967、965、985、995、1005和968。

(iv)环脂肽的结构表征

通过核磁共振(NMR)和质谱分析法(Maldi-TOF/TOF)，进行11种生物活性化合物的结构表征。

通过NMR分析的样品包含：溶解在水(90％H₂O和10％D₂O)中的约1mM的肽，pH为5。在配备有冷冻探针TXI 5mm三共振(¹H、¹³C、¹⁵N)的NMR Bruker Avance 500光谱仪上，记录298K处的NMR光谱。

利用同核和杂核的1D和2D光谱TOCSY、NOESY、¹³C-HSQC和¹³C-HMBC的标准序列(Bruker)，进行化学位移的标定。所有实验都使用1.4s的弛豫时间，并且TOCSY和NOESY实验的混合时间分别是100ms和250ms。F2维中使用2K或4K的矩阵尺寸，在F1维中使用320K至400K的矩阵尺寸。t1的每个值都累计8至32次扫描。

通过水的残留的化学位移，对化学位移进行校准。使用TOPSPIN软件，处理获得的谱图。

分析示出，11种化合物具有脂肽的性质。如下面的表2所示，它们由被烃链酰化的七肽环组成，该烃链具有不同的长度(8至14个碳原子)、不饱和程度和羟基化程度。

表2：由菌株Pseudoalteromonas hCg-6产生的环脂肽的结构

*双键位于3位，顺式构型

**OH基位于3位

(V)环脂肽的作用机制

对从牡蛎中分离出来的Vibrio splendidus菌株的收集物，测试编号2的环脂肽。它的最小抑制浓度是1.56μM至50μM。使用Wiegand、Hilpert和Hancock程序(2008)，定义在液体培养基中的MIC。

在第一时期中，在环脂肽的存在下观察到牡蛎病原体V.splendidus LGP32的培养力(cultivabilité)丧失，这表明该环脂肽具有抗菌效果。通过流式细胞仪分析(FacsCalibur)，使用Syto9和碘化丙啶(一种细菌膜透化的指示物)的双标记，证明了对该细菌的抗菌活性。

利用生理学状态的其它荧光标记物，通过流式细胞仪显示了上述作用机制的细节。因此，暴露于环脂肽下的菌株LGP32的培养力丧失与膜呼吸的终止(通过用CTC标记显示出来)和细胞质膜的去极化(变得可透过diBAC)相关。此外，随着暴露于环脂肽，LGP32细胞的总数量(通过用SyberGreen I标记显示出来)减少，这表明环脂肽具有裂解效果。

利用颜色形成测试“内毒素鲎试剂测定法(limulus amebocyte lysate assay)”，测量根据本发明的环脂肽结合细菌脂多糖(LPS)的能力。证明了根据本发明的环脂肽对E.coli的LPS具有很强的亲和力。通过微型化热泳，对根据本发明的环脂肽对E.coli的LPS的亲和力进行量化，并且估计表观解离常数为10.4μM+/-680nM。

(vi)环脂肽的生物活性

在Wiegand、Hilpert和Hancock程序(2008)之后，在液体培养基中评价化合物1、2、3、5、7和8的最小抑制浓度(MIC)。将靶细菌谱延伸至某些人类病原体，诸如细菌肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、大肠杆菌(Escherichia coli)的具有超广谱β-3-内酰胺酶活性的临床菌株和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)。在最佳温度孵育24h之后，肉眼评价MIC。

结果示出，环脂肽具有特异性针对革兰氏阴性菌的活性(表3)。获得的MIC具有μM的量级。

使用大肠杆菌ML35和SBS363的菌株获得的结果表明，外膜组分在对环脂肽敏感性中起作用。实际上，与菌株ML35相比，菌株SBS363暴露出具有短链的LPS。在每一种情况中，该结构改变都导致环脂肽的抗菌活性升高。

定义的MIC与多粘菌素B(也被称为粘菌素)的MIC类似。

还通过对成纤维细胞3T3细胞系进行MTT(四唑盐MTT)测试，来评价根据本发明的环脂肽的细胞毒活性。结果示出，细胞毒性呈剂量依赖性升高。不过，接近200μM的浓度仍保留小于50％的细胞毒性。

(vii)环脂肽在皮肤病学中的活性

通过RAPA测试(Ansari et al,Int.J.Cosmetic Sci,2010,33:107-10)，评价根据本发明的环脂肽的抗菌能力。为了模拟洗手，使用含胰酶大豆琼脂(Trytone Soy Agar，TSA)的皮氏平皿。用样品人工冲洗TSA(45秒)，然后用水漂洗，并且在空气中干燥。随后放置靶细菌(200CFU)。将平皿在最佳生长温度下孵育。结果示出，根据本发明的环脂肽确实具有抗菌清洁能力(图3)。

Claims

1.一种式A的环脂肽：

其中：

R选自由以下基团组成的组：

除了壬基和十一烷基之外的含4至20个碳原子的烷基；或

除了十一碳-4-烯基和十三碳-6-烯基之外的含4至20个碳原子的烯基；

或

经-OH基取代的且含4至20个碳原子的烷基；和

经-OH基取代的且含4至20个碳原子的烯基。

2.根据权利要求1所述的环脂肽，其中，R选自由以下基团组成的组：

除了壬基和十一烷基之外的含6至14个碳原子的烷基；或

除了十一碳-4-烯基和十三碳-6-烯基之外的含6至14个碳原子的烯基；

或

经-OH基取代的且含6至14个碳原子的烷基；和

经-OH基取代的且含6至14个碳原子的烯基。

3.根据权利要求1所述的环脂肽，其中，R选自由以下基团组成的组：壬烯基，羟基壬基，庚基，辛烯基，辛基，癸二烯基，癸基，羟基癸基，癸烯基，羟基辛烯基，十二碳烯基和十三烷基三烯基。

4.根据权利要求1所述的环脂肽，该环脂肽可获自分离的细菌环脂肽假交替单胞菌hCg-6。

5.根据权利要求4所述的环脂肽，其中，所述分离的细菌是假交替单胞菌hCg-6，是根据布达佩斯条约于2013年5月22日保藏于微生物菌种国家保藏中心(CNCM，法国巴黎)的保藏编号为I-4753的菌株。

6.一种生产根据权利要求1限定的环脂肽的方法，包括以下步骤：在海洋肉汤培养基或被称为培养基F29的合成培养基中培养分离的细菌假交替单胞菌hCg-6，该合成培养基每升含有pH为7.4的47mM磷酸盐缓冲液、3％的海盐、50mM的蔗糖和20ml MEM 50×。

7.一种化妆品组合物和/或皮肤用组合物，包括在生理学上可接受的载剂中的，根据权利要求1限定的至少一种环脂肽。

8.一种药物组合物，包括在药学上可接受的载剂中的，根据权利要求1限定的至少一种环脂肽。

9.根据权利要求1所述的环脂肽在制造药物中的应用。

10.根据权利要求1所述的环脂肽的应用，用作抗微生物剂。

11.根据权利要求10所述的环脂肽的应用，用作清洁皮肤的抗微生物剂，或用作卫生产品中的活性试剂。

12.根据权利要求1所述的至少一种环脂肽的应用，用作农业食品工业或化妆品工业中的防腐剂。

13.根据权利要求1所述的至少一种环脂肽的应用，用作植物检疫剂。