JP2016525884A - シュードアルテロモナス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属由来の単離された細菌の使用、シクロリポペプチド、及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、プロバイオティクスとして使用されるシュードアルテロモナス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属由来の単離された細菌、保存料としての当該株の使用、当該細菌から取得され得るシクロリポペプチド、１つ以上の当該シクロリポペプチドを含有する組成物、及びそれらの使用に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、プロバイオティクスとして使用されるシュードアルテロモナス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属由来の単離された細菌、保存料としての当該株の使用、当該細菌から取得され得るシクロリポペプチド、１つ以上の当該シクロリポペプチドを含有する組成物、及びそれらの使用に関する。

水産養殖は、水性媒体中でのあらゆる動物又は植物の生産活動を含む。水産養殖は、海洋、河川又は湖沼で実施される。人工岩礁又はアトラクター又は濃縮機器（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｄｅｖｉｃｅ）の幾つかのシステムは、食料又は支持（例えば鉱物が豊富な水の上昇からの間接的に生産される）の直接提供が存在する瞬間から水産養殖と同化され得る。それは魚類の生産（魚類養殖）、貝類の生産（貝類養殖）、甲殻類の生産（ザリガニ養殖（ａｓｔａｃｉｃｕｌｔｕｒｅ）及びエビ養殖）、アワビの生産（水産養殖）、カキの生産（カキ養殖）又は更に藻類の生産（藻類養殖）にも関する。

水産養殖は、魚類乱獲や魚類の需要増大への対抗策の一つである。２００８年に、水産養殖が、人間に消費される淡水魚の７６．４％、回遊性魚類の６８．２％、軟体動物の６４．１％、甲殻類の４６．４％及び海水魚の２．６％を提供した。

食料として消費される以外の目的で水産養殖が使用される場合もあり、例えば欧州において１８５０年〜１８７０年に、又は日本において、過剰搾取され、又は他の原因（汚染等）で見られなくなったエビやアワビを環境に再導入するための「魚類養殖ステーション」が多く構築されている。

現在、生産方法の強化及び天候の変動が、水産養殖及びカキ養殖の発達を特に脆弱にしている。

健康な野生動物由来のプロバイオティクスの使用は、水産養殖種における天然の生体防御戦略に含まれる。プロバイオティクスは畜産において広く使用されているが、それらの水産養殖における使用は、尚も新規である。

これらの種を保護するための生物学的及び効率的な方策の開発は、動物飼養の生産者及び実業家にとって紛れもなく有益である。

更に、抗微生物剤の革新は、公衆及び獣医学的健康上優先される。それらの過剰及び不適切な使用は、治療的な死の結末を引き起こす多耐性株の選択を引き起こしている（ＥＥＣにおいて年間死者２５，０００名、ＷＨＯ ２０１１）。

抗グラム陽性抗生物質の新しいファミリーは３０年は市場に登場していない。従って抗微生物特性を有する新規化合物の探索は、根源的かつ急を要する課題である。

並行して、植物衛生処理の分野において、環境に有害でなく、有効な殺細菌活性を維持する、代替的な製品を同定する実質的な需要も現在存在する。

本発明の範囲内で、発明者らは、動物の健康、特に水産養殖において有用な性質を有する海洋性細菌を単離した。

この海洋性細菌は、発明者らが構造及び機能性レベルで特定した抗細菌化合物を顕著に生産する。

この細菌は、シュードアルテロモナス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属に属する。

シュードアルテロモナス属は、Ｇａｕｔｈｉｅｒらによって１９９５年に提唱され、現在３９種で構成されている（Ｇａｕｔｈｉｅｒ， Ｇ．， Ｇａｕｔｈｉｅｒ， Ｍ． ＆ Ｃｈｒｉｓｔｅｎ， Ｒ． （１９９５）． Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｒａ Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ， Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ， ａｎｄ Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ Ｕｓｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ Ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ Ｓｍａｌｌ−Ｓｕｂｕｎｉｔ ｒＲＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｕｓ Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｉｎｔｏ Ｔｗｏ Ｇｅｎｅｒａ， Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ （Ｅｍｅｎｄｅｄ） ａｎｄ Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｇｅｎ． ｎｏｖ．， ａｎｄ Ｐｒｏｐｏｓａｌ ｏｆ Ｔｗｅｌｖｅ Ｎｅｗ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ． Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ４５， ７５５-７６１）。

従って、本願の発明者らは、シュードアルテロモナス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）ｈＣｇ−６細菌を単離し、当該細菌は、抗細菌化合物、特に、ヘプタペプチド環及び４〜２０個の炭素原子の炭化水素鎖を含むシクロリポペプチド、より具体的には式Ａ：
（式中：
Ｒは、以下：
− ４〜２０個の炭素原子を含むアルキル基であるがノニル又はウンデシル基ではない；− ４〜２０個の炭素原子を含むアルキレン基であるがウンデク−４−イレン又はトリデク−６−イレン基ではない；
− −ＯＨ基で置換され、４〜２０個の炭素原子を含むアルキル基；及び
− −ＯＨ基で置換され、４〜２０個の炭素原子を含むアルキレン基；
からなる群から選択される）
のシクロリポペプチドを生産できる。

尚も更に具体的には、前記単離された細菌は、ブダペスト条約に従い２０１３年５月２２日にＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ （ＣＮＣＭ， Ｐａｒｉｓ， Ｆｒａｎｃｅ）に受託番号Ｉ−４７５３で寄託されたシュードアルテロモナスｈＣｇ−６細菌である。

前記ｈＣｇ−５株は、クラソストレア（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ）カキの血リンパから単離され、血リンパ及び様々な培養培地の上澄中に抗細菌化合物を分泌することが可能であった。

この株の生化学的及び遺伝的特徴を研究することによって、下記の例に示唆されるような新しい種を規定することができた。

前記細菌は、培養上澄中に、病原性細菌に対する活性抗細菌化合物を分泌する点で、特に水産養殖又は植物防御の分野で、最も具体的に興味を引いている。

これらの側面に一つにおいて、本発明は、動物の交配、特に水産養殖のためのプロバイオティクスとして使用される、上記単離された細菌に関する。

尚も更に具体的には、本発明は、魚類養殖、貝類養殖、ザリガニ養殖（ａｓｔａｃｉｃｕｌｔｕｒｅ）、エビ養殖、水産養殖、カキ養殖又は藻類養殖のためのプロバイオティクスとして使用される、上記単離された細菌に関する。尚も特に具体的には、本発明は、魚類の、貝類、甲殻類、アワビ、カキ又は更に藻類の健康の改善のために使用される、上記単離された細菌に関する。

本発明は、特に魚類養殖、貝類養殖、ザリガニ養殖、エビ養殖、水産養殖、カキ養殖又は藻類養殖のためのプロバイオティクスとしての、上記単離された細菌の使用に関する。尚も特に具体的には、本発明は、魚類の、貝類、甲殻類、アワビ、カキ又は更に藻類の健康の改善のための、上記単離された細菌の使用に関する。

他のこれらの側面において、本発明は、魚類の、貝類、甲殻類、アワビ、カキ又は更に藻類を処理する方法に関し、当該方法は、本発明の最近を有効量投与する工程を含む。具体的には、当該方法は、魚類の、貝類、甲殻類、アワビ、カキ又は更に藻類の健康を改善することが意図される。

「プロバイオティクス」は、動物の試料に導入されることが意図される本発明の単離された細菌を有効量含有する食品添加物を意味する。ＯＭＳによると、プロバイオティクスは、適切な量で投与されると宿主の健康に有益な生きた微生物である（ＷＨＯ、２００１年）。

「有効量」は、所望の効果を示すことができる細菌の量を意味する。特に、１０^３〜１０^１０ ＣＦＵ．ｍｌ^−１の量を意味する。

他のこれらの側面において、本発明は、植物衛生剤としての上記細菌の使用に関する。

本発明は、他のこれらの側面によると、植物衛生処理方法であって、当該方法は、特に植物、真菌又は昆虫に、本発明の最近を有効量投与する工程を含む。

更に発明者らは、シクロリポペプチドの元のファミリーを単離した。本発明のシクロリポペプチドは、様々な長さ、不飽和度及びヒドロキシル化レベルを有する炭化水素鎖によりアシル化されたヘプタペプチド鎖を含む。

従って、本発明は、式Ａ：
（式中：
Ｒは、以下：
− ４〜２０個の炭素原子を含むアルキル基であるがノニル又はウンデシル基ではない；
− ４〜２０個の炭素原子を含むアルキレン基であるがウンデク−４−イレン又はトリデク−６−イレン基ではない；
− −ＯＨ基で置換され、４〜２０個の炭素原子を含むアルキル基；及び
− −ＯＨ基で置換され、４〜２０個の炭素原子を含むアルキレン基；
からなる群から選択される）
のシクロリポペプチドにも関する。

「アルキル」基は、直鎖又は分岐鎖の、任意で環状の、飽和脂肪族基で、４〜２０個の炭素原子、より具体的には６〜１４個の炭素原子を有するものを意味する。例えば、ブチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、ドデシル、及びトリデシル基等が挙げられる。

「アルキレン」基は、直鎖又は分岐鎖の、任意で環状の、不飽和脂肪族基で、４〜２０個の炭素原子、より具体的には６〜１４個の炭素原子を有し、１つ又は幾つか、特に１〜３個の二重結合を有するものを意味する。例えば、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、オクチレン、ノニレン、デシレン、ウンデシレン、ドデシレン、トリデシレン基等が挙げられる。特に、ノニレン、特にノニル−２−エン、オクチレン、デシレン、ドデシレン、デシルジエン、トリデシルトリエン基が挙げられる。

−ＯＨ基で置換されたアルキル基として、例えばノナノール、特にノナン−２−オールが挙げられる。

−ＯＨ基で置換されたアルキレン基として、例えばオクタノールが挙げられる。

より具体的には、本発明のシクロリポペプチドは、上記式（Ａ）のシクロリポペプチドであって、ここでＲは、以下：
− ６〜１４個の炭素原子を含むアルキル基であるがノニル又はウンデシル基ではない；
− ６〜１４個の炭素原子を含むアルキレン基であるがウンデク−４−イレン又はトリデク−６−イレン基ではない；
− −ＯＨ基で置換され、６〜１４個の炭素原子を含むアルキル基；及び
− −ＯＨ基で置換され、６〜１４個の炭素原子を含むアルキレン基；
からなる群から選択される。

尚も特に具体的には、本発明のシクロリポペプチドは、上記式（Ａ）のシクロリポペプチドであって、ここでＲは：ノニレン、特にノニル−２−エン、ノナノール、特にノナン−２−オール、ヘプチル、オクチレン、オクチル、デシルジエン、デカニル、デカノール、デシレン、オクテノール、ドデシレン及びトリデシルトリエン：から成る群から選択される。

本発明の一つの側面において、本願に記載のシクロリポペプチドは、本発明の範囲内に記載の細菌から取得されてもよい。

従って、本発明は、上記シクロリポペプチドを生産する方法にも関し、当該方法は、当該シクロリポペプチドの生産が可能な条件下で、上記細菌を培養する工程を含む。

特に、前記細菌は、前記シクロリポペプチドを生産するのに理想的な培養条件、特に培養温度を決定する方法を知っている当業者によって適合され得る条件下で培養される。

より具体的には、前記細菌は、２４〜９６時間、好ましくは７２時間、４〜２５℃、好ましくは１２〜１８℃で、７０〜１３０ｒｐｍ、好ましくは１００ｒｐｍの速度で撹拌しながら培養される。

前記培養培地は、特にマリンブロス培地（Ｄｉｆｃｏ（登録商標））又は、リン酸緩衝剤４７ ｍＭ、ｐＨ ７．４（７．６ ｇ Ｋ_２ＨＰＯ_４， ３ ｇのＫＨ_２ＰＯ_４ -Ｓｉｇｍａ（登録商標））、３％海水塩（ＳｅａＳａｌｔｓ−Ｓｉｇｍａ（登録商標））、５０ ｍＭサッカロース及び２０ｍｌ／ｌのＭＥＭ ５０Ｘを含有するＦ２９培地という合成培地であり、好ましくはＦ２９培地である。

これらの側面の一つにおいて、前記生産方法は、細菌回収工程の後、シクロリポペプチドを単離する工程を含む。

特に、この単離は、培養物を遠心分離して培養上澄を回収することによって達成される。

これらの側面の一つにおいて、前記生産方法は、上記単離工程の後、シクロリポペプチドを精製する工程を含む。

特に、前記精製は、例えば液体クロマトグラフィーと生化学機能解析とを併用する組み合わせによって、当業者にとって適切なクロマトグラフィー法を用いて達成される。

従って、これらの側面の一つにおいて、本発明のシクロリポペプチドを生産する方法は、以下：
ａ）シクロリポペプチドの生産が可能な条件下、特に本発明の範囲内に記載されるようにＦ２９培養培地中で、本発明の範囲内に記載される細菌を培養する工程；及び／又は
ｂ）シクロリポペプチドを単離する工程；及び／又は
ｃ）シクロリポペプチドを精製する工程；
を含む。

本発明のシクロリポペプチドは、グラム陰性細菌に対して強力かつ選択的な活性を有する。

従って、本発明は、薬物として使用される本発明の１つ以上のシクロリポペプチドに関する。より具体的には、当該発明は、薬物として使用される本発明のシクロリポペプチドに関する。

これらの側面の一つにおいて、本発明は、抗微生物剤として使用される本発明の１つ以上のシクロリポペプチドに関する。より具体的には、本発明は、抗微生物剤として使用される本発明のシクロリポペプチドに関する。

特に、前記シクロリポペプチドは、皮膚の洗浄、より具体的には手の洗浄に使用され、又は衛生用品、より具体的には身体衛生用品の有効成分として使用される。

これらの他の側面における本発明は、本発明の１つ以上のシクロリポペプチド、特に本発明の１つのシクロリポペプチドを有効量投与することを含む、治療方法に関する。当該治療方法は、特に、抗細菌治療方法であり、特に皮膚の洗浄、手の洗浄、又は身体衛生の方法である。

これらの側面の他に、本発明は、植物衛生剤としての、特に植物、真菌又は昆虫を保護するための、本発明の１つ以上のシクロリポペプチドの使用にも関する。より具体的には、本発明は、植物衛生剤としての、特に植物、真菌又は昆虫を保護するための、本発明の１つのシクロリポペプチドの使用にも関する。本発明のこれらの側面の他に、植物衛生処理方法にも関し、当該方法は、有効量の１つ以上の、特に１つの、本発明のシクロリポペプチドを、特に植物、真菌又は昆虫に投与する工程を含む。

更にこれらの側面の他に、本発明は、本発明の１つ以上のシクロリポペプチドを、農業食品産業又は美容産業における保存料として使用することに関する。

本発明は、農業食品産業又は美容産業を意図した製品の保存性を改善する方法に関し、当該方法は、保存する製品に本発明の１つ以上のシクロリポペプチドを添加することを含む。

尚も更にこれらの側面の他に、本発明は、生理的に許容される担体中に本発明の１つ以上のシクロリポペプチドを含有する、美容用及び／又は皮膚科用組成物に関する。好ましくは、当該組成物は、本発明の１つのシクロリポペプチドを含有する。より具体的には、当該シクロリポペプチドは、助剤又は溶媒と組み合わせられる。

「美容用組成物」とは、排他的に又は主に、浄化、美化、芳香、表面の改変、保護、良好な状態の維持、又は体臭の是正のために、人体の様々な表面部分、特に表皮、毛髪及び毛管系、爪、唇及び外性器と、又は歯及び頬粘膜と接触するように適用することが意図される、物質又は調製品を意味する。

「皮膚科用組成物」は、皮膚の病理を予防及び／又は治療するために、人体の様々な表面部分、特に表皮、毛髪及び毛管系、爪、唇及び外性器と、又は歯及び頬粘膜と接触するように適用することが意図される、物質又は調製品を意味する。皮膚科用組成物は、治療的使用が意図される。

本発明は、医薬として許容される担体中に本発明の１つ以上のシクロリポペプチドを含有する、医薬組成物に関する。好ましくは、当該組成物は、本発明の１つのシクロリポペプチドを含有する。より具体的には、当該シクロリポペプチドは、助剤又は溶媒と組み合わせられる。

従って、本発明のシクロリポペプチドは、食料品保存の分野を意図した用途に、及び人間を意図した用途に、例えば薬物、又は微生物、細菌、特に皮膚、より具体的には手の表面に存在するものの除去をもたらす皮膚科剤として、使用されてもよい。本発明のシクロリポペプチドは、美容分野で使用されてもよい。更に、それは、植物衛生の用途で使用されてもよい。

医薬として許容される賦形剤は、当業者に知られる利用可能な賦形剤の中から、医薬的形態及び所望の投与方法に基づいて選択される。

経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、局所（ｌｏｃａｌ， ｔｏｐｉｃａｌ）、気管内、鼻腔内、経皮、又は直腸内投与用の本発明の医薬組成物において、上記シクロリポペプチドは、単位用量形態として、動物又は人間に、標準的な医薬的担体と混合して投与されてもよい。

前記適切な投与形態は、経口形態、例えば錠剤、ソフト又はハードゼラチンカプセル、粉末、顆粒及び経口溶液又は懸濁物、舌下、頬、気管内、眼球内、鼻腔内、吸入投与形態、局所、非経口投与形態、例えば経皮、皮下、筋肉内、又は静脈内投与、直腸投与形態及びインプラントを含む。局所適用において、クリーム、ジェル、軟膏又はローションの形態で本発明のシクロリポペプチドを使用できる。

錠剤の形態の固形組成物が調製される場合、シクロリポペプチドは、ゼラチン、澱粉、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、タルカム、アラビアゴム等の医薬担体と混合されてもよい。

前記錠剤は、サッカロース、セルロース誘導体、又は他の適切な材料で被覆されてもよく、又は更にそれらは、延長又は遅延活性を有するように、及び所定の量の有効成分を持続的に放出するように処理されてもよい。

ゼラチンカプセル調製品は、例えば、有効成分を希釈剤と混合し、得られた混合物をソフト又はハードゼラチンカプセルに注ぎ込んでも良い。

本発明のシクロリポペプチドを含有する医薬組成物は、液体形態、例えば溶液、乳液、懸濁物又はシロップ、特に経口又は鼻腔内投与等に適した形態で存在してもよい。適切な液体担体は、例えば水、有機溶媒、例えばグリコール又はグリセロール、並びにそれらの様々な比率での混合物、水溶液であってもよい。

シロップ又はエリキシール又は液滴としての投与のための調製品は、甘味料、例えば無カロリー（ａｃａｌｏｒｉｃ）甘味料、及び風味を付ける剤、及び適切な着色料と共に、有効成分を含有してもよい。

水中に分散可能な粉末又は顆粒が、例えば、分散剤又は水和剤、又は適切な懸濁剤、例えばポリビニルピロリドン及び甘味料又は風味調整剤との混合物中の有効成分を含有してもよい。

各患者、ヒト又は動物に対して１日に投与される量は、投与方法、患者の体重及び応答に従って、医師又は獣医師による通常の業務において決定され得る。一般に、本発明のシクロリポペプチドの１日の用量は、所望の治療効果を生じ得る最小のシクロリポペプチドの有効量であり得る。

「有効量」は、１つ又は幾つかの想定される有効性のパラメーターを改善する組成物の何らかの量を意味する。

より高い又は低い用量が適切である特定の場合があってもよく、そのような用量は、本発明の範囲から逸脱しない。

本発明の美容用又は皮膚科用組成物において、生理的に許容される賦形剤は、当該美容用又は皮膚科用形態及び所望の投与方法に従い、当業者に知られる利用可能な賦形剤の中から選択される。

生理的に許容される媒体は、非毒性媒体で、人間の皮膚及び付属器上に適用され得、快適な表面、匂い及び感触を有する。

経口経路を経た投与において、本発明の皮膚科用又は美容用組成物は、任意の適切な形態、特に飲用溶液、又は錠剤、ゼラチンカプセル、カプセル又は更に食料品又は栄養補助品の形態で存在してもよい。

皮膚上の局所適用において、前記組成物は、水性又は油性溶液又は分散物、ローション又はシロップ型、水相中に油相を分散させ（Ｏ／Ｗ）、又はその逆（Ｗ／Ｏ）によって得られるミルク型の液体又は半液体の一貫性を有する乳液、又は水性又は無水ゲル又はクリーム型の柔らかい一貫性を有する懸濁物又は乳液、又は更に微小カプセル又は微小顆粒、又はイオン性及び／又は非イオン性のビヒクル分散物、又は泡塊の形態を有しても良い。これらの組成物は、慣用方法によって調製される。

本発明の美容用又は皮膚科用組成物中のシクロリポペプチドの量は、０．１％〜３％、好ましくは０．２％〜０．５％である。

本発明の美容用又は皮膚科用組成物は、例えば、顔、手、足、大きい解剖学的折り畳み又は身体用の洗浄、保護、治療又はケアクリーム（例えばデイケアクリーム、ナイトケアクリーム）、身体ケア又は保護ミルク、ローション、ゲル又は皮膚のケア用の泡、例えばクリーニングローション、消臭組成物を形成してもよい。

前記組成物は、石鹸又はクリーニングバーを形成する固形調製品を形成してもよい。

前記組成物は、圧縮噴射剤と共に含有されるエアロゾル用の組成物としてパッケージされてもよい。

特に、本発明の皮膚科又は美容組成物は、消臭剤又はクリーニングミルク又はフォーミングゲルから選択され得る。下記図面及び実施例は、その範囲を限定せず本発明を例示する。

カキスパット（ｓｐａｔ）の生存率に対するｈＣｇ−６株の効果を評価するための実験手順を示す。

病原体（ビブリオ・スプレンディドゥス（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐｌｅｎｄｉｄｕｓ ）ＬＧＰ３２）の存在下、シュードアルテロモナスｈＣｇ−６株で（■）、及びシュードアルテロモナス・プリドゼンシス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｐｒｙｄｚｅｎｓｉｓ）で（▲）予め液浴した、又はしない（●）、無処理の二倍体のカキにおける、死亡率の変化を示す。

本発明のシクロリポペプチドの抗細菌洗浄力のＲＡＰＡ検定： −（Ａ）：対照ディッシュ、未処理及び無播種。 −（Ｂ）及び（Ｃ）：ディッシュを試料で処理せず、それぞれＥ． ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２及びＥ． ｃｏｌｉ Ｐ７を播種。 −（Ｄ）及び（Ｅ）：ディッシュを２００μｇの本発明のシクロリポペプチドで処理し、それぞれＥ． ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２及びＥ． ｃｏｌｉ Ｐ７を播種。による評価を示す。

（ｉ）シュードアルテロモナスｈＣｇ−６株の単離及び同定
細菌株ｈＣｇ−６は、クラソストレア・ギガス（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ）の血リンパから単離された。

これらのカキは、フランスリュイス半島のモルビアン湾（ＷＧＳ８４システム、北緯４７°３０’５０、西経２°３７’５０）で採集された。殻を慎重に開け、使い捨ての滅菌針を使用して、心膜腔中の血リンパを回収した。細菌を回収するために、血リンパ（１．５ｍｌ）の各個別の試料を、自動播種装置（ＷＡＳＰ， ＡＥＳ Ｃｈｅｍｕｎｅｘ， Ｆｒａｎｃｅ）を用いてマリンアガー（Ｄｉｆｃｏ（登録商標） ２２１６）上に展開し、１８℃で７２時間インキュベーションした。

ｈＣｇ−６の遺伝的及び生化学的特徴を研究することにより、新しい種を規定することが可能である。

移動性及び形態に関する試験は、光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５０）を使用して実施された。Ｔｗｅｅｎ ４０及び８０を加水分解する細菌株の能力は、Ｌｅｌｌｉｏｔ ａｎｄ Ｓｔｅａｄの方法（１９８７）に従い試験された。酵素活性及び生化学的特性は、ＡＰＩ ２０ Ｅ， ＡＰＩ ５０ ＣＨ及びＡＰＩ ＺＹＭ （Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）のキットを使用して、説明書に従って決定された。Ｐａｒｋら（２００５）の示唆に従い、播種キットにおいて使用されたＢｉｏｍｅｒｉｅｕｘ製の培地は、２％ｗ／ｗの海水塩（Ｓｉｇｍａ）で補完された。最後に、脂肪酸濃度に関する解析は、に記載の方法に従い実施された。

このグラム陰性細菌が胞子を形成しなかったことを断定できたのは、僅かな褐色のコロニーを形成できる移動体（ｍｏｂｉｌｅ ｏｒｇａｎｉｓｍ）（幅０．６−０．９μｍ、長さ１．９−３ μｍ）である。

４℃〜３０℃で増殖が観察された（最適の増殖は２５〜３０℃）。

主要な脂肪酸の組成は、以下の通りであった：３＝Ｃ１６：１ ω７ｃ／ｉ−Ｃ１５：０ ２−ＯＨ （３６．６％）， Ｃ１８：１ω７ｃ （１８．６％）， Ｃ１６：０ （１３．８％）。

ｈＣｇ−６細菌株の他の生理的及び生化学的特性を、下記表１にまとめる。これらの結果に加えて、当該株がカタラーゼ−、オキシダーゼ＋、Ｔｗｅｅｎ４０及び８０を加水分解することも決定された。ＡＰＩ ＺＹＭキットを使用した解析において、ｈＣｇ−６株は、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、ナフトール−ＡＳ−ＢＩ−ホスホヒドロラーゼ、アルファ−グルコシダーゼ及びＮ−アセチル−ベータ−グルコサミニダーゼに対して正の反応を示した。ＡＰＩ ＺＹＭに含まれる他の酵素活性において、反応の消失が観察された。ＡＰＩ ２０ ＮＥキットにより実施された解析は、以下の試験がポジティブであった：硝酸塩の還元、エスクリンの加水分解、グルコース、マルトース、Ｎ−アセチル−グルコサミン、リンゴ酸塩、及びクエン酸塩の同化。以下の物質は使用されない：Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ又はＬ−アラビノース、Ｄ又はＬ−アラビトール及びＤ−メリビオース。細菌株ｈＣｇ−６は、グルコース、サッカロース、トレハロース、フルクトース、Ｄ−セロビオース及びＤ−マルトースを、炭素及びエネルギー源として使用する。

前記株は、ポリマイキシン（５０μｇ）及びセファレキシンに耐性であるが、エンロフロキサシン、セフキノム３０、ゲンタマイシン、オキソリン酸、テトラサイクリン及びアモキシシリンに感受性である。

表１：ｈＣｇ−６株の生理的及び生化学的特性
＋、陽性；−、陰性；ｆ：僅かな反応

この株は、ブダペスト条約に従い２０１３年５月２２日にＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ （ＣＮＣＭ， Ｐａｒｉｓ， Ｆｒａｎｃｅ）に受託番号Ｉ−４７５３で寄託に供された。

（ｉｉ）水産養殖におけるシュードアルテロモナスｈＣｇ−６株の活性
ｈＣｇ−６株の生物保護効果を評価するため、無処理二倍体カキ（１８ヶ月齢スパット）のビブリオ・スプレンディドゥス（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐｌｅｎｄｉｄｕｓ）ＬＧＰ３２による実験的な感染（閉殻筋への注射）を、ｈＣｇ−６株によって予め液浴した場合としない場合について実施した。実験手順を図１に示す。

ｈＣｇ−６株の存在下でカキ（ｎ＝１９）を予め液浴した場合、死亡率の顕著な低下がもたらされた（図２）。実際に、６０時間後、全体の死亡率は３５％に安定化され、一方ｈＣｇ−６株で液浴していないカキ（ｎ＝２２）の死亡率のレベルは８６％となり、またシュードアルテロモナス・プリドゼンシス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｐｒｙｄｚｅｎｓｉｓ）株（対照）で液浴したもの（ｎ＝１６）の死亡率は９４％であった。

（ｉｉｉ）シクロリポペプチドの生産及び単離
シュードアルテロモナスｈＣｇ−６株を、合成培地Ｆ２９（リン酸緩衝剤４７ ｍＭ、ｐＨ ７．４（７．６ ｇ Ｋ_２ＨＰＯ_４， ３ ｇのＫＨ_２ＰＯ_４ -Ｓｉｇｍａ（登録商標））、３％海水塩（ＳｅａＳａｌｔｓ−Ｓｉｇｍａ（登録商標））、５０ ｍＭサッカロース及び２０ｍｌ／ｌのＭＥＭ ５０Ｘ）中、７２時間１８℃で撹拌（１００ｒｐｍ）培養し、当該培養物の、有効成分を含有する上澄を、３０分間７５００ｒｐｍ４℃で遠心分離することにより回収した。生物機能解析と液体クロマトグラフィーとの組み合わせを行い、当該培養上澄中に存在する有効成分を精製した。２つの溶媒が使用された：Ｈ_２Ｏ ｍｉｌｌｉＱ ０．０７％ ＴＦＡ （Ｓｉｇｍａ（登録商標（溶媒Ａ）及びアセトニトリル（Ｃａｒｌｏ Ｅｒｂａ（登録商標）） ０．０７％ ＴＦＡ（溶媒Ｂ）。培養上澄がＳＰＥカラム（Ｕｐｔｉ Ｃｌｅａｎ ｃｏｌｕｍｎｓ Ｃ１８−Ｓ−Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ（登録商標））に充填され、説明書に従い事前にパッケージされた。溶媒Ａ及びＢの混合物（９０／１０）でカラムを洗浄した後、溶媒Ａ及びＢの混合物（６０／４０）（ｖ／ｖ）により溶出が行われた。

溶出した分画を、ＨＴｅｃカラム（２５０ ｍｍ Ｘ ４．６ ｍｍ − Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ（登録商標））で逆相クロマトグラフィーにおいて解析した。溶出物を２２０及び２８０ｎｍで追跡し、流速０．８ ｍｌ．ｍｉｎ^−１、４０℃で溶媒Ｂの二相性線形グラディエント（８分以内に２０〜２８％、そして１５分以内に２８〜３３％）によって確保した。吸光度ピークは手動で集められ、凍結乾燥され、それらの抗細菌活性が試験され、そして−２０℃で保存された。異なる保持時間を有する１１個の生物活性化合物が精製され、マススペクトロメトリーによって解析された（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ Ａｕｔｏｆｌｅｘ ＩＩＩ ｓｍａｒｔｂｅａｍ （Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）、使用マトリックス： ＨＣＣＡ、低質量又はＬＩＦＴ法）。

前記活性化合物の分子イオン（Ｍ＋Ｈ＋）の分子量を以下に示す：９２７， ９７１， ９４１， ９５３， ９３９， ９６７， ９６５， ９８５， ９９５， １００５及び９６８。

（ｉｖ）シクロリポペプチドの構造的特徴
核磁気共鳴（ＮＭＲ）及びマススペクトロメトリー（Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ／ＴＯＦ）によって、前記１１個の生物活性化合物の構造的特徴付けを行った。

ＮＭＲにより解析された試料は、ｐＨ５で水（９０％ Ｈ_２０及び１０％ Ｄ_２Ｏ）中に溶解した１ｍＭのペプチドを含有する。クライオプローブＴＸＩ ５ ｍｍ三重共鳴（^１Ｈ， ^１３Ｃ， ^１５Ｎ）を備えたＮＭＲ Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ５００スペクトロメーター上で、２９８ＫでのＮＭＲスペクトルが記録された。

化学シフトの帰属（ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｈｉｆｔ）は、等核及び異核１Ｄ及び２Ｄスペクトル： ＴＯＣＳＹ， ＮＯＥＳＹ， ^１３Ｃ−ＨＳＱＣ ａｎｄ ^１３Ｃ−ＨＭＢＣの標準的な配列（Ｂｒｕｋｅｒ）によって実施された。全ての実験において緩和時間１．４ｓを使用し、ＴＯＣＳＹ及びＮＯＥＳＹ実験においてそれぞれ混合時間１００ｍｓ及び２５０ｍｓを使用した。Ｆ２次元において２Ｋ又は４Ｋ、Ｆ１次元において３２０Ｋ〜４００Ｋのマトリックスのサイズが使用された。各ｔ１の値において、８〜３２回の走査が蓄積された。

化学シフトは水の残存の化学シフトによって較正された。ＴＯＰＳＰＩＮソフトウエアを使用して、得られたスペクトルを処理した。

前記解析は、前記１１個の化合物がリポペプチドの性質を有することを示した。それらは、下記表２に示すように、様々な長さ（８〜１４炭素原子）、不飽和度及びヒドロキシル化レベルを有する炭化水素鎖によってアシル化されたヘプタペプチド環を構成する。

表２：シュードアルテロモナスｈＣｇ−６株が生産したシクロリポペプチドの構造
＊二重結合が第３位ｃｉｓ配置にある。
＊＊ＯＨ基が第３位にある。

（ｖ）シクロリポペプチドの作用機序
Ｎｏ． ２のシクロリポペプチドは、カキから単離されたビブリオ・スプレンディドゥスの株のコレクションを用いて試験された。最小阻害濃度は、１．５６〜５０μＭであった。当該最小阻害濃度は、液体培地中で、Ｗｉｅｇａｎｄ， Ｈｉｌｐｅｒｔ， ａｎｄ Ｈａｎｃｏｃｋ ２００８の手順を使用して決定された。

第一相において、前記シクロリポペプチドの存在下で、カキ病原体Ｖ．スプレンディドゥスＬＧＰ３２の増殖能力の減衰が観察され、殺細菌効果が示唆された。フローサイトメトリー解析（ＦａｃｓＣａｌｉｂｕｒ）によって、細菌に対する殺細菌活性は、Ｓｙｔｏ９及びヨウ化プロビジウム（細菌膜の透過性のインジケーター）による二重標識を使用して確認された。

作用機序の詳細は、生理的状態の他の蛍光マーカーを用いたフローサイトメトリーによって明らかにされた。従って、前記シクロリポペプチドに晒されたＬＧＰ３２株の増殖能力の減衰は、膜呼吸の停止（ＣＴＣによるマーキングで明らかになった）。及び細胞膜の脱分極（ｄｉＢＡＣに透過性になった）と相関している。更に、ＬＧＰ３２の全細胞数（ＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎＩによるマーキングで明らかになった）は、溶解効果に関連して、前記シクロリポペプチドへの暴露に応じて低下した。

本発明のシクロリポペプチドの細菌リポ多糖類（ＬＰＳ）に結合する能力は、色素形成試験の「カブトガニ血球抽出成分アッセイ」によって測定された。本発明のシクロリポペプチドは、Ｅ．コリのＬＰＳに強力な親和性があることが実証された。斯かる本発明のシクロリポペプチドのＥ．コリのＬＰＳに対する親和性は、微小スケールで熱拡散（ｔｈｅｒｍｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）によって定量され、見掛けの解離定数は、１０．４μＭ＋／−６８０ｎＭと見積もられた。

（ｖｉ）シクロリポペプチドの生物活性
化合物Ｎｏ．１、２、３、５、７及び８の最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、Ｗｉｅｇａｎｄ， Ｈｉｌｐｅｒｔ， ａｎｄ Ｈａｎｃｏｃｋ ２００８の手順に従って、液体培地中で評価された。標的細菌の範囲は、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）細菌、拡大した範囲のβ−３−ラクタマーゼ活性を有するエスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の臨床株、及びシュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）等の幾つかのヒト病原体にまで拡張した。最適温度での２４時間インキュベーションの後、ＭＩＣが目視的に評価された。

結果は、前記シクロリポペプチドが、グラム陰性細菌に特異的な活性を有することを示した（表３）。得られたＭＩＣのオーダーはμＭである。

表３：シクロリポペプチドＮｏ．１、２、３、５、７及び８の活性範囲（ＭＩＣ）

Ｅ．コリＭＬ３５及びＳＢＳ３６３の株で得られた結果は、シクロリポペプチドに対する感受性における外膜（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ）の成分の役割を示唆する。実際に、ＳＢＳ３６３は、ＭＬ３５株のものよりも短い鎖を有するＬＰＳを暴露する。いずれにしても、この構造的変化は、シクロリポペプチドの抗細菌活性の増大をもたらす。

決定されたＭＩＣは、コリスチンとも呼ばれるポリマイキシンＢと同等であった。

本発明のシクロリポペプチドの細胞傷害活性も、線維芽細胞３Ｔ３細胞株に対するＭＴＴ（テトラゾリウム塩ＭＴＴ）を用いた試験によって評価された。当該結果は、細胞傷害性の用量依存的増大を示す。しかしながら、その値は２００μＭ近い濃度でも５０％未満にとどまった。

（ｖｉｉ）皮膚科学におけるシクロリポペプチドの活性
本発明のシクロリポペプチドのの抗細菌能力は、ＲＡＰＡ試験（Ａｎｓａｒｉ ｅｔ ａｌ， Ｉｎｔ． Ｊ．Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｓｃｉ， ２０１０， ３３ ：１０７−１０）によって評価された。手の洗浄を模倣するため、Ｔｒｙｔｏｎｅ Ｓｏｙ Ａｇａｒ （ＴＳＡ）を含有するペトリ皿が使用された。当該ＴＳＡは、試料で手動により洗浄され（４５秒）そして水で濯がれ、空気中で乾燥させられた。続いて標的細菌（２００ＣＦＵ）が播種された。当該皿を、最適増殖温度でインキュベーションした。その結果は、本発明のシクロリポペプチドが、実際に抗細菌洗浄能力を有することを示した（図３）。

Claims (17)

1. 単離された細菌シュードアルテロモナス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）ｈＣｇ−６であって、式Ａ：
   （式中：
   Ｒは、以下：
   − ４〜２０個の炭素原子を含むアルキル基であるがノニル又はウンデシル基ではない；
   − ４〜２０個の炭素原子を含むアルキレン基であるがウンデク−４−イレン又はトリデク−６−イレン基ではない；
   − −ＯＨ基で置換され、４〜２０個の炭素原子を含むアルキル基；及び
   − −ＯＨ基で置換され、４〜２０個の炭素原子を含むアルキレン基；
   からなる群から選択される）
   のシクロリポペプチドを生産し、動物の交配のための、特に水産養殖のためのプロバイオティクスとして使用される、単離された細菌。
2. 魚類養殖、貝類養殖、ザリガニ養殖（ａｓｔａｃｉｃｕｌｔｕｒｅ）、エビ養殖、水産養殖、カキ養殖又は藻類養殖に使用される、請求項１に記載の単離された細菌。
3. 式Ａ：
   （式中：
   Ｒは、以下：
   − ４〜２０個の炭素原子を含むアルキル基であるがノニル又はウンデシル基ではない；
   − ４〜２０個の炭素原子を含むアルキレン基であるがウンデク−４−イレン又はトリデク−６−イレン基ではない；
   − −ＯＨ基で置換され、４〜２０個の炭素原子を含むアルキル基；及び
   − −ＯＨ基で置換され、４〜２０個の炭素原子を含むアルキレン基；
   からなる群から選択される）
   のシクロリポペプチドを生産する単離された細菌シュードアルテロモナスｈＣｇ−６の、植物衛生剤（ｐｈｙｔｏｓａｎｉｔａｒｙ ａｇｅｎｔ）としての使用。
4. 前記単離された細菌が、ブダペスト条約に従い２０１３年５月２２日にＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ （ＣＮＣＭ， Ｐａｒｉｓ， Ｆｒａｎｃｅ）に受託番号Ｉ−４７５３で寄託されたシュードアルテロモナスｈＣｇ−６である、請求項１又は２のいずれか１項に記載の単離された細菌又は請求項３に記載の使用。
5. 式Ａ：
   （式中：
   Ｒは、以下：
   − ４〜２０個の炭素原子を含むアルキル基であるがノニル又はウンデシル基ではない；
   − ４〜２０個の炭素原子を含むアルキレン基であるがウンデク−４−イレン又はトリデク−６−イレン基ではない；
   − −ＯＨ基で置換され、４〜２０個の炭素原子を含むアルキル基；及び
   − −ＯＨ基で置換され、４〜２０個の炭素原子を含むアルキレン基；
   からなる群から選択される）
   のシクロリポペプチド。
6. 前記Ｒが、以下：
   − ６〜１４個の炭素原子を含むアルキル基であるがノニル又はウンデシル基ではない；
   − ６〜１４個の炭素原子を含むアルキレン基であるがウンデク−４−イレン又はトリデク−６−イレン基ではない；
   − −ＯＨ基で置換され、６〜１４個の炭素原子を含むアルキル基；及び
   − −ＯＨ基で置換され、６〜１４個の炭素原子を含むアルキレン基；
   からなる群から選択される、請求項５に記載のシクロリポペプチド。
7. Ｒが：ノニレン、特にノニル−２−エン、ノナノール、特にノナン−２−オール、ヘプチル、オクチレン、オクチル、デシルジエン、デカニル、デカノール、デシレン、オクテノール、ドデシレン及びトリデシルトリエン：から成る群から選択される、請求項５又は６のいずれか１項に記載のシクロリポペプチド。
8. 請求項１〜４のいずれか１項に規定される細菌から取得され得る、請求項５〜７のいずれか１項に記載のシクロリポペプチド。
9. 前記シクロリポペプチドが生産される条件下で請求項１〜４のいずれか１項に規定される細菌を培養する工程を含む、請求項５〜８のいずれか１項に記載のシクロリポペプチドを生産する方法。
10. 前記細菌が、リン酸緩衝剤４７ ｍＭ、ｐＨ ７．４、３％海水塩、５０ ｍＭサッカロース及び２０ｍｌ／ｌのＭＥＭ ５０Ｘを含有するＦ２９合成培地中で培養される、請求項９に記載の生産方法。
11. 請求項５〜８のいずれか１項に記載のシクロリポペプチドを生理的に許容される担体中に１つ以上含有する、美容用及び／又は皮膚科用組成物。
12. 請求項５〜８のいずれか１項に記載のシクロリポペプチドを医薬的に許容される担体中に１つ以上含有する、医薬組成物。
13. 薬物として使用される、請求項５〜８のいずれか１項に記載のシクロリポペプチド。
14. 抗細菌剤として使用される、請求項５〜８のいずれか１項に記載のシクロリポペプチド。
15. 皮膚の洗浄、特に手の洗浄のために使用される、又は衛生用品、特に身体衛生用品における有効成分として使用される、請求項１４に記載のシクロリポペプチド。
16. 農業食品産業又は美容産業における保存料としての、請求項５〜８のいずれか１項に記載の１つ以上のシクロリポペプチドの使用。
17. 植物衛生剤としての、請求項５〜８のいずれか１項に記載の１つ以上のシクロリポペプチドの使用。