CN109497044A

CN109497044A - 一种哺乳动物早期胚胎冻存液及冻存方法

Info

Publication number: CN109497044A
Application number: CN201811622899.5A
Authority: CN
Inventors: 陈润锦; 邓家健
Original assignee: Shenzhen Yujie Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Yujie Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-12-28
Filing date: 2018-12-28
Publication date: 2019-03-22

Abstract

本发明公开了一种哺乳动物早期胚胎冻存液及冻存方法，所述的胚胎冻存液包括卵磷脂、乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、甘油、聚乙二醇、牛血清白蛋白和EBSS缓冲液的混合配制而成。其中，渗透性冷冻保护液有卵磷脂、乙二醇和甘油；非渗透性冷冻保护液有聚蔗糖、蔗糖、聚乙二醇和牛血清白蛋白；利用EBSS缓冲液维持胚胎冻存液的稳定性。本发明通过改良冻存液配方降低冻存液毒性，同时提高溶液粘度，提高溶液渗透效率，通过改进冻存方法，提高冻存玻璃化速度，综上，可提高胚胎存活率以及解冻后发育率、着床率和产仔率。

Description

一种哺乳动物早期胚胎冻存液及冻存方法

技术领域

本发明涉及哺乳动物或转基因动物辅助生殖及保种领域，特别涉及一种哺乳动物早期胚胎冻存液及冻存方法。

背景技术

胚胎冻存，是哺乳动物或转基因动物辅助生殖及珍稀动物保种过程常用的技术手段。胚胎冻存分为短期保存和长期保存。短期保存是将胚胎放于0-4℃的低温环境下，在此条件下胚胎暂停发育，但只能存放2-3天，仅作为辅助生殖前或受精后暂存。长期保存是将胚胎贮存在-196℃的超低温环境中，该种保存方式大大提高了胚胎移植技术的可能，为长期保存珍稀哺乳动物、人类辅助生殖、转基因小鼠和种畜引种等方面提供了必要条件。然而，长期胚胎保存面临的最大问题是在冷冻保存过程中，胚胎细胞内出现冰晶，造成胚胎损伤。防止上述损伤的第一种解决办法是使用冷冻保护剂进行慢速程序冷冻法。该种冷冻保存方法最早成功于1972年,Whittingham等人首次对利用慢速程序冷冻法对小鼠的胚胎冷冻保存获得成功，并在解冻后移植产下了后代，其保存的胚胎80％具有继续发育的能力。这种方法经过30年的发展,效果已基本稳定,目前仍然在世界范围内广泛使用。然而，慢速程序冷冻法虽然大大缓解了细胞损伤，但仍然不能避免细胞内出现冰晶。因此，第二种解决办法即胚胎玻璃化冷冻出现。玻璃化是指某些高浓度溶液在快速降温过程中直接跳过冰晶形成，即不发生结晶形成一种无规则结构的稳定玻璃样固体，在该玻璃化结构中，胚胎细胞可免受冰晶损伤。上述两种方法经过多年发展均有较多应用。其中，全球最大的转基因小鼠研究中心美国杰克逊实验室便利用慢速程序冷冻法进行了超过两百万次胚胎冻存；但是，由于慢速程序冷冻法缺点较为明显，胚胎玻璃化冷冻更具有升级发展的潜力，现今人类的辅助生殖技术中，也大多应用胚胎玻璃化冷冻技术进行长期胚胎冻存。

目前，影响胚胎玻璃化冷冻的重要因素是玻璃化抗冻保护液的选择，玻璃化的重要一环就是胚胎处于一个高浓度抗冻保护液环境。冷冻保护剂根据其是否穿透细胞膜可分为渗透型和非渗透型两类。渗透型冷冻保护剂：可以渗透到细胞内，主要包括甘油、DMSO、丙二醇、乙酰胺、甲醇等；非渗透型冷冻保护剂：不能渗透到细胞内，主要包括蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖和白蛋白等。现有的解决方案多采用上述两种类型保护剂结合，但由于主要的渗透型抗冻保护均具有较大毒性，因此通过研发改良抗冻保护液配方，使其具有低毒性和强渗透率，成为提高胚胎冻存技术的关键。

发明内容

本发明目的在于提供一种哺乳动物早期胚胎冻存液及冻存方法，通过改良冻存液配方降低冻存液毒性，同时提高溶液粘度，提高溶液渗透效率，通过改进冻存方法，提高冻存玻璃化速度，综上，可提高胚胎存活率以及解冻后发育率、着床率和产仔率。

为了实现上述功能，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种哺乳动物早期胚胎冻存液，包括卵磷脂、乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、甘油、聚乙二醇、牛血清白蛋白和EBSS缓冲液的混合物。

一种哺乳动物早期胚胎冻存液包括如下组分：

卵磷脂	2.5％-5.5％	v/v
			乙二醇	15％-20％	v/v
甘油	10％-15％	v/v
			聚乙二醇	2.5％	w/v
聚蔗糖	1％	w/v
			蔗糖	0.3％	w/v
牛血清白蛋白	0.5％	w/v
			EBSS缓冲液	补齐余量

此外，本发明提供一种平衡液，包括如下组分：

卵磷脂	1.25-2.25％	v/v
			乙二醇	7.5-10％	v/v
甘油	5％-7.5％	v/v
			EBSS缓冲液	补齐余量

冻存前平衡液上述组分浓度需根据冻存液具体组分浓度上进行减半原则。

另外，本发明还提供一种胚胎冻存方法，所述胚胎冻存方法包括：

冻存胚胎准备工作：根据上述胚胎冻存液和平衡液配方提前配置所需溶液，提前30min将平衡液制成多个液滴置于37℃，提前将胚胎冻存液制作成多个液滴放于室温，制作多个EBSS缓冲液液滴，将胚胎由常规培养液或操作液转移至EBSS缓冲液中，按顺序进行漂洗3-5次，之后将胚胎转移至提前孵育的平衡液液滴中，快速漂洗1次，转入新的平衡液滴，37℃孵育2mins，随后将胚胎转移至胚胎冻存液液滴中，快速漂洗1次，在30s内，转入新的胚胎冻存液液滴，随后利用吸管吸取有冻存液包裹的胚胎进入冻存细管内，封口后迅速放入也液氮中冷冻保存。

进一步地，所述胚胎包括2细胞胚胎、4细胞胚胎、8细胞胚胎、桑椹胚和囊胚。

进一步地，所述动物包括小鼠、大鼠、狗、羊、牛、猴、人类，但不限于上述的哺乳动物。

本发明通过改良冻存液配方，包括卵磷脂、乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、甘油、聚乙二醇、牛血清白蛋白和EBSS缓冲液的混合物，上述组分毒性均较低，对细胞损伤较小，由于卵磷脂的加入以及与甘油和乙二醇合适比例可以更好的渗透进入细胞内，加速细胞脱水和充分渗透，同时通过改进冻存方法，使玻璃化溶液提前平衡，进一步降低了各组分对细胞的毒性，短时间使胚胎细胞脱水和渗透提高，更好的完成玻璃化状态，提高冷冻和解冻后的胚胎存活率。

较为概括地，本发明第一方面提供了一种组合物，所述组合物包括卵磷脂、乙二醇、甘油、聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、牛血清白蛋白和EBSS缓冲液。

在一些实施方式中，所述组合物包括2.5％-5.5％v/v卵磷脂、15％-20％v/v乙二醇、10％-15％v/v甘油、2.5％w/v聚乙二醇、0.6-1％w/v聚蔗糖、0.2-0.3％w/v蔗糖、0.3-0.5％w/v牛血清白蛋白和余量的EBSS缓冲液。

在一些实施方式中，所述组合物包括5.5％v/v卵磷脂、20％v/v乙二醇、15％v/v甘油、2.5％w/v聚乙二醇、1％w/v聚蔗糖、0.3％w/v蔗糖、0.5％w/v牛血清白蛋白和余量的EBSS缓冲液。

在一些实施方式中，所述组合物是哺乳动物早期胚胎冻存液。

在一些实施方式中，所述动物包括小鼠、大鼠、狗、羊、牛、猴、人类等。

在一些实施方式中，所述胚胎选自2细胞胚胎、4细胞胚胎、8细胞胚胎、桑椹胚和囊胚。

本发明第二方面提供了一种在哺乳动物早期胚胎冻存中与本发明第一方面所述的组合物配合使用的平衡液，所述平衡液包括：卵磷脂、乙二醇、甘油和EBSS缓冲液。

在一些实施方式中，所述平衡液包括：1.25-2.25％v/v卵磷脂、7.5-10％v/v乙二醇、5％-7.5％v/v甘油和余量的EBSS缓冲液，优选，所述平衡液包括：2.25％v/v卵磷脂、10％v/v乙二醇、7.5％v/v甘油和余量的EBSS缓冲液。

本发明第三方面提供了一种胚胎冻存方法，所述方法包括如下步骤：

(a)在EBSS缓冲液中漂洗胚胎；

(b)在本发明第二方面所述的平衡液中温育所述胚胎；

(c)在本发明第一方面所述的组合物中漂洗所述胚胎；

(d)在本发明第一方面所述的组合物中冷冻保存所述胚胎。

在一些实施方式中，步骤(a)中，漂洗1-5次；和/或

在步骤(a)与步骤(b)之间，在权利要求7或8所述的平衡液中漂洗所述胚胎；和/或

步骤(b)中，37℃温育1-3mins；和/或

步骤(c)与步骤(d)间隔25-35s；和/或

步骤(d)中，所述冷冻保存为液氮中保存。

具体实施方式

本发明提供了一种哺乳动物早期胚胎冻存液及冻存方法，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明

本发明提供的哺乳动物早期胚胎冻存液及冻存方法中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例一：

1.一种哺乳动物早期胚胎冻存液包括如下组分：

一种平衡液，包括如下组分：

卵磷脂	2.25％	v/v
			乙二醇	10％	v/v
甘油	7.5％	v/v
			EBSS缓冲液	补齐余量

2.根据胚胎常用冻存液配方配置对照冻存液1，如下组分：

乙二醇	20％	v/v
			二甲基亚砜	20％	v/v
EBSS缓冲液	补齐余量

对照平衡液1，包括如下组分：

乙二醇	10％	v/v
			二甲基亚砜	10％	v/v
EBSS缓冲液	补齐余量

3.根据胚胎常用冻存液配方配置对照冻存液2，如下组分：

对照平衡液2，包括如下组分：

丙三醇	10％	v/v
			EBSS缓冲液	补齐余量

4.冻存胚胎准备工作：根据上述胚胎冻存液和平衡液配方提前各配置5ml，提前30min将各平衡液分别制成30个液滴置于37℃，提前将各胚胎冻存液分别制作成30个液滴放于室温，制作60个EBSS缓冲液液滴。

5.取第8周雄鼠精子与第6周雌鼠卵子进行体外受精后进行体外培养，在受精第6天后得到囊胚期胚胎，取40个囊胚期胚胎，转移至M2体外操作液，随后转移至EBSS缓冲液中，按顺序进行漂洗3-5次，之后无差别随机分成4组，鲜移植组，发明改良组，对照组1，对照组2，每组10个囊胚期胚胎。

6.根据鲜移植组分组，将胚胎利用辅助生殖手术，将10个囊胚期胚胎移植于假孕鼠子宫内，两侧子宫各5个。移植完毕后，将小鼠放回笼内，等待后续监测。

7.根据发明改良组分组，将胚胎转移至提前孵育的平衡液液滴中。快速漂洗1次，转入新的平衡液滴，37℃孵育2mins，随后将胚胎转移至胚胎冻存液液滴中，快速漂洗1次，在30s内，转入新的胚胎冻存液液滴，随后利用吸管吸取有冻存液包裹的胚胎进入冻存细管内，封口后迅速放入也液氮中冷冻保存。一周后，将冻存胚胎从液氮中取出放入0.5M蔗糖溶液，37℃孵育2min，之后转入0.25M蔗糖溶液，37℃孵育3min，随后将胚胎移入KSOM胚胎培养液，37℃孵育5min，之后转入新的KSOM胚胎培养液，37℃孵育2h，最后利用辅助生殖手术，将10个囊胚期胚胎移植于假孕鼠子宫内，两侧子宫各5个。移植完毕后，将小鼠放回笼内，等待后续监测。

8.根据对照组1分组，将胚胎转移至提前孵育的对照组1平衡液液滴中。快速漂洗1次，转入新的平衡液滴，室温孵育5mins，随后将胚胎转移至对照组1冻存液液滴中，快速漂洗1次，在30s内，转入新的对照组1冻存液液滴，随后利用吸管吸取有冻存液包裹的胚胎进入冻存细管内，封口后迅速放入也液氮中冷冻保存。一周后，将冻存胚胎从液氮中取出放入0.5M蔗糖溶液，37℃孵育2min，之后转入0.25M蔗糖溶液，37℃孵育3min，随后将胚胎移入KSOM胚胎培养液，37℃孵育5min，之后转入新的KSOM胚胎培养液，37℃孵育2h，最后利用辅助生殖手术，将10个囊胚期胚胎移植于假孕鼠子宫内，两侧子宫各5个。移植完毕后，将小鼠放回笼内，等待后续监测。

9.根据对照组2分组，将胚胎转移至提前孵育的对照组2平衡液液滴中。快速漂洗1次，转入新的平衡液滴，室温孵育10mins，随后将胚胎转移至对照组2冻存液液滴中，快速漂洗1次，在30s内，转入新的对照组2冻存液液滴，随后利用吸管吸取有冻存液包裹的胚胎进入冻存细管内，封口后迅速放入也液氮中冷冻保存。一周后，将冻存胚胎从液氮中取出放入0.5M蔗糖溶液，37℃孵育2min，之后转入0.25M蔗糖溶液，37℃孵育3min，随后将胚胎移入KSOM胚胎培养液，37℃孵育5min，之后转入新的KSOM胚胎培养液，37℃孵育2h，最后利用辅助生殖手术，将10个囊胚期胚胎移植于假孕鼠子宫内，两侧子宫各5个。移植完毕后，将小鼠放回笼内，等待后续监测。

10.在胚胎移植后，假孕鼠妊娠第9.5天和第15.5天，进行B超检查胚胎着床和存活情况，并进行记录统计。

11.在胚胎移植后，记录假孕鼠妊娠结果，即产仔率和畸形率。

12.重复上述分组实验3次。

13.结果与分析

如表1所示，通过改良冻存液和平衡液的组分配方，以及改进冻存方法后，发明改良组胚胎移植和妊娠结果在胚胎着床率、胚胎存活率和产仔率中均表现较好，其中胚胎着床率和胚胎存活率均高于其他组，并且在胎儿畸形方面并未发现异常，而对照组1的胚胎移植后出现畸形小鼠，可能是受冻存液中二甲基亚砜的影响，同时该畸形小鼠也未能正常出生。囊胚的状态良好与否与其着床率有着密不可分的关系，由移植结果可知，鲜移植和对照组1的囊胚状态不如对照组2和发明改良组的囊胚，同时也说明，冻存囊胚的状态不一定比新鲜囊胚状态差。综上所述，在新鲜的胚胎移植对比，以及和保存7天后的胚胎移植对比，可见本发明提供的一种哺乳动物早期胚胎冻存液及冻存方法可较好的保存小鼠囊胚，并且优于目前常见的冻存方法。

表1.各组胚胎移植妊娠结果统计

以上各个实施例只是用于进一步说明本发明，并不是用来限制本发明的保护范围，凡是基于本发明的构思所作出的等同变换及对本发明的各个技术方案显而易见的改进，均落入本发明的保护范围。

附：各培养液和操作液配方：

1LEBSS配方：NaCl 6.80g；KCl 0.40g；CaCl₂0.20g；MgSO₄·7H₂O0.20g；Na₂HPO₄.12H₂O 2.29g；NaHCO₃2.20g；葡萄糖1.00g；调平PH为7.4。

100mlM2小鼠操作液配方：NaCl 0.55319g；KCl 0.03563g；CaCl₂·2H₂O0.02514g；KH₂PO₄0.016195g；MgSO₄0.0143276g；NaHCO₃0.035g；Hepes0.496855g；乳酸钠0.4349g；丙酮酸钠0.00363g；葡萄糖0.1001912g；BSA0.4g；青霉素0.006g；链霉素0.005g；酚红钠0.001g；调平PH为7.2-7.4。

100ml KSOM小鼠培养液配方：NaCl 0.555g；KCl 0.0186g；CaCl₂·2H₂O0.025g；KH₂PO₄0.00476g；MgSO₄0.00244g；NaHCO₃0.21g；Hepes0.496855g；乳酸钠0.112g；丙酮酸钠0.0022g；D-葡萄糖0.0036g；谷氨酰胺0.0146g；BSA0.1g；EDTA0.00038g；MEM NEAA0.5ml；MEM EAA1.0ml；调平PH为7.2-7.4。

Claims

1.一种组合物，所述组合物包括卵磷脂、乙二醇、甘油、聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、牛血清白蛋白和EBSS缓冲液。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述组合物包括2.5％-5.5％v/v卵磷脂、15％-20％v/v乙二醇、10％-15％v/v甘油、2.5％w/v聚乙二醇、0.6-1％w/v聚蔗糖、0.2-0.3％w/v蔗糖、0.3-0.5％w/v牛血清白蛋白和余量的EBSS缓冲液。

3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述组合物包括5.5％v/v卵磷脂、20％v/v乙二醇、15％v/v甘油、2.5％w/v聚乙二醇、1％w/v聚蔗糖、0.3％w/v蔗糖、0.5％w/v牛血清白蛋白和余量的EBSS缓冲液。

4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述组合物是哺乳动物早期胚胎冻存液。

5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于：所述动物包括小鼠、大鼠、狗、羊、牛、猴、人类等。

6.如权利要求4所述的组合物，其特征在于：所述胚胎选自2细胞胚胎、4细胞胚胎、8细胞胚胎、桑椹胚和囊胚。

7.一种在哺乳动物早期胚胎冻存中与如权利要求1-6中任一项所述的组合物配合使用的平衡液，所述平衡液包括：卵磷脂、乙二醇、甘油和EBSS缓冲液。

8.如权利要求7所述的平衡液，其特征在于，所述平衡液包括：1.25-2.25％v/v卵磷脂、7.5-10％v/v乙二醇、5％-7.5％v/v甘油和余量的EBSS缓冲液，优选，所述平衡液包括：2.25％v/v卵磷脂、10％v/v乙二醇、7.5％v/v甘油和余量的EBSS缓冲液。

9.一种胚胎冻存方法，所述方法包括如下步骤：

(a)在EBSS缓冲液中漂洗胚胎；

(b)在权利要求7或8所述的平衡液中温育所述胚胎；

(c)在权利要求1-6中任一项所述的组合物中漂洗所述胚胎；

(d)在权利要求1-6中任一项所述的组合物中冷冻保存所述胚胎。

10.如权利要求9所述的胚胎冻存方法，其特征在于：

步骤(a)中，漂洗1-5次；和/或

步骤(b)中，37℃温育1-3mins；和/或

步骤(c)与步骤(d)间隔25-35s；和/或

步骤(d)中，所述冷冻保存为液氮中保存。