CN109329272B - 一种精子冻存液及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及精子冻存领域，特别涉及一种精子冻存液及其制备方法和应用。一种精子冻存液，包括以下组分：氯化钾、硫酸镁、氯化钙、碳酸氢钠、磷酸氢二钾、丙酮酸钠、乳酸钙、葡萄糖、蔗糖、谷氨酰胺、甘氨酸、HEPES、庆大霉素、甘油、人血清白蛋白、维生素E、维生素C、维生素B12。本发明提供的精子冻存液，各组分共同配合，更全面的维持精子的渗透压、抵抗外界环境变化的应变能力等，该冻存液用于精子液体的低温保存后，能较长期限的保持精子的存活率以及活性。

Description

一种精子冻存液及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及精子冻存领域，具体而言，涉及一种精子冻存液及其制备方法和应用。

背景技术

人类精子冻存对于人类生殖健康十分重要。短期内不愿意生育者可以在年轻时冻存有活力的精子，待需要时解冻后进行人工受精。又或者要接受放疗或者化疗的病人，或者即将要进入对生殖健康有害的工作前，可以将精子冻存起来，方便以后获得健康的后代。

精子冻存的过程主要是通过逐渐降温使得精子最终冻存在液氮中，冻存过程中产生的冰晶对精子细胞损害极大。精子冻存液的作用就是保护精子在冻存过程中免受伤害。

目前市面上已有的精子冻存液大部分添加了卵黄物质，但是卵黄来源于鸡蛋，潜在生物风险。并且蛋黄里面的生物活性蛋白物质可以潜在过敏反应，在后期清洗中难以去除。

在逐级低温的过程中，精子细胞会发生氧化应激反应，导致精子细胞凋亡。因此，在冷冻的过程中需要防止精子细胞的氧化应激。而目前的产品几乎没有针对氧化应激的措施。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种精子冻存液及其制备方法和应用，该精子冻存液杜绝了在冻存过程中的潜在过敏反应，并且在冻存过程中能有效防止精子的氧化应激反应，经过较长时间的保存后，精子成活率高，且质量高。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种精子冻存液，以所述冻存液的体积计，包括以下组分：氯化钾5.5±0.2mM，硫酸镁0.40±0.05mM，氯化钙2.0±0.1mM，碳酸氢钠25.0±0.5mM，磷酸氢二钾0.20±0.01mM，丙酮酸钠0.20±0.01mM，乳酸钙2.00±0.05mM，葡萄糖8.0±0.2mM，蔗糖40.0±0.5mM，谷氨酰胺0.10±0.01mM，甘氨酸1.00±0.05mM，HEPES 20.0±0.5mM，庆大霉素1.0±0.05mg/ml，甘油体积百分数10％±1％，人血清白蛋白5±0.2mg/ml，维生素E 100±10μg/ml，维生素C100±10μg/ml，维生素B12 100±10μg/ml。

本发明提供的精子冻存液，各组分共同配合，更全面的维持精子的渗透压、抵抗外界环境变化的应变能力等，该冻存液用于精子液体的低温保存后，能较长期限的保持精子的存活率以及活性。

本发明提供的精子冻存液，冻存液的溶剂为水，一般用超纯注射用水。

进一步地，所述精子冻存液的pH值为7.1-7.5，渗透压为590-610mOsm/kg。

进一步地，内毒素含量小于1.0EU/ml。

本发明还提供了上述的精子冻存液的制备方法，包括以下步骤：

(a)氯化钾、硫酸镁、氯化钙、碳酸氢钠、磷酸氢二钾、丙酮酸钠、乳酸钙、葡萄糖、蔗糖和HEPES加水制成溶液；

(b)加入谷氨酰胺、甘氨酸、庆大霉素、甘油、维生素E、维生素C和维生素B12，混合均匀；

(c)加入人血清白蛋白，定容即可。

本发明提供的精子冻存液的制备方法中，先将无机盐和糖类等混合，然后加入氨基酸和维生素类物质等，得到的混合液中加入血清白蛋白，防止血清白蛋白活性的破坏，得到的溶液各组分处于一定均衡的平衡体系中。

其中，在开始时加水制成溶液步骤中，水的量一般在总水量的70％-90％，以便于各组分的混合均匀。

进一步地，步骤(a)中制成的溶液进行过滤后再进行步骤(b)的步骤。该步骤的过滤主要是去除杂质和微生物。

进一步地，所述过滤采用0.22μm滤膜过滤。

进一步地，步骤(b)得到的溶液的渗透压为580-600mOsm/kg，pH值为7.0-7.4。

进一步地，步骤(c)定容后还包括过滤的步骤，该过滤采用0.22μm滤膜过滤。该步骤的过滤是进一步纯化液体。

本发明还提供了一种精子的保存方法，精子液体与上述的精子冻存液以体积比为1:2混合，进行梯度低温冻存，然后保存在液氮中。

本发明提供的精子的保存方法，采用本发明提供的精子冻存液进行，杜绝了在冻存过程中的潜在过敏反应，并且在冻存过程中能有效防止精子的氧化应激反应，并能在液氮保存过程中能更好的保护精子，经过较长时间的保存后，精子成活率高，且质量高。

进一步地，所述梯度低温冻存按以下程序进行：

4℃5分钟；

-20℃5分钟；

-80℃5分钟。

进一步地，所述精子液体与所述精子冻存液混合后，室温静置5分钟。本发明

本发明中，室温是指15-25℃。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的精子冻存液，特别的添加了特定的维生素，各组分共同配合，更全面的维持精子的渗透压、抵抗外界环境变化的应变能力等。

(2)本发明提供的精子冻存液，用于精子液体的低温保存后，能较长期限的保持精子的存活率以及活性。

(3)本发明提供的精子冻存液的制备方法，简便易行，易于产业化生产。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

(1)冻存液的配制(以10L为例)

A.按照表1中的组分配制，按照先固体后溶液配制，定容到10L后用0.22μm过滤。

表1组分情况

a.将氯化钾、硫酸镁、氯化钙、碳酸氢钠、磷酸氢二钾、丙酮酸钠、乳酸钙、葡萄糖、蔗糖和HEPES固体组份称量准确，用超纯注射用水溶解。

b.将上述液体经过0.22μm滤膜过滤。

c.加入组分中的谷氨酰胺、甘氨酸、庆大霉素、甘油、维生素E、维生素C和维生素B12，测量溶液的渗透压以及pH值，此时，溶液渗透压为580-600mOsm/kg，pH值为7.0-7.4。

d.加入重组人血清白蛋白，使得最终白蛋白浓度为5mg/ml。

e.将上述溶液定容，然后再次经过0.22μm滤膜过滤。

取一定样品进行测试实验，检测指标如下：

1)32-37℃条件下pH 7.1-7.5；2)渗透压：590-610mOsm/kg；3)内毒素<1.0EU/ml；4)鼠胚培养120小时，≥80％的囊胚形成率；5)细菌检测；6)解冻复苏率>75％。

f.将配置好的溶液无菌分装，2-8度存储保存，尽量避光。

B.在室温30℃下，三次各抽取20ml测量pH值为7.32,7.40,7.38,平均值为7.36，处于7.2-7.4的范围。

C.取精子冻存液三次测量渗透压为605mOms/kg，590mOms/kg,600mOms/kg，三次平均值为598mOms/kg。

(2)精子冻存液细胞毒性试验

按照GB/T 16886.5进行细胞毒性试验，当前精子冻存液成品毒性试验积分为0.3，小于1分，洗涤液毒性试验合格。

(3)致敏性检测

按照GB/T 16886.10进行致敏性检测，向20只成年小鼠注射该洗涤液，20分钟后无异常无过敏反应。

(4)细菌内毒素检测

采用鲎试剂凝胶法进行检测，检测值为0.5EU/ml，小于规定的1EU/ml，产品合格。

对比例1

按照申请号为201810435420.0的实施例1制得的冻存液，具体内容如下：

A、取消毒后洁净容量瓶，量取50毫升五蒸水，加入柠檬酸钠0.3克，加入五蒸水中，搅拌至充分溶解；

B、称取三羟甲基氨基甲烷0.8克，三羟甲基甲胺基乙磺酸0.3克，加入上述溶液，搅拌至充分溶解；

C、用0.1mol/L的柠檬酸溶液调节上述溶液至pH7.5；

D、称取海藻糖5.5克，加入上述溶液，缓慢搅拌，避免气泡产生，至充分溶解；

E、量取甘油10毫升，加入上述溶液，缓慢较慢，避免气泡产生，至充分溶解；

F、使用孔径为0.45微米过滤器过滤上述溶液，过滤后溶液放入无菌清洁容器中暂存；

G、使用0.22微米过滤器过滤上述溶液，取部分过滤后溶液进行病原体培养，其余溶液分装冻存至-80℃冰箱。

对比例2

按照申请号为201710375384.9的实施例4制得的冻存液，具体内容如下：

一种不含卵黄的人精子冷冻保护液，包括以下组分且在保存人精子时各组分的终浓度为：氯化钠105mmol/L、氯化钾5.5mmol/L、硫酸镁0.4mmol/L、氯化钙3.2mmol/L、磷酸二氢钠0.4mmol/L、碳酸氢钠32mmol/L、甘氨酸140mmol/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸23mmol/L、葡萄糖7mmol/L、蔗糖55mmol/L、乳酸钠14mmol/L、甘油90mL/L，余量为超纯水。

上述不含卵黄的人精子冷冻保护液的制备过程：用分析天平准确称取各组分即氯化钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、甘氨酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖、蔗糖、乳酸钠和甘油，然后将各组分溶于超纯水中，制成各组分的母液，其母液浓度的配制主要是根据所要保存的人精子浓度情况而定，然后将各组分混合，用磁力搅拌器充分搅拌均匀，同时要保证溶液pH值为7.4，最后采用孔径为0.22μm的过滤器过滤除菌，无菌保存。

对比例3

按照申请号为201511028340.6的实施例1制得的冻存液，具体内容如下：

一种精子冷冻保护剂，其配方成分及含量如下：

蔗糖16g，碳酸氢钠0.5g，甘油36mL，20％(g/mL)人血白蛋白25mL，五蒸水60mL。

上述精子冷冻保护剂的制备方法包括以下步骤：

1、电子天平称取蔗糖16g，碳酸氢钠0.5g；

2、量筒量取甘油36mL，20％(g/mL)人血白蛋白25mL，及60mL五蒸水(按常规方法自制，将水反复蒸馏五次所得)备用；

3、先将60mL五蒸水加入250mL烧杯中，然后放入搅拌磁珠；

4、将烧杯放置于磁力搅拌器上，先将转速调至最低，打开电源，再将转速调至适当速度，以保持较大转速而烧杯中液体不飞溅出来；

5、依次加入蔗糖，甘油及碳酸氢钠，共搅拌15分钟使之充分溶解；

6、用孔径为0.45um的滤芯过滤，在滤过液中加入人血白蛋白，再次搅拌15分钟；

7、在无菌的环境下分装成25mL装小瓶，保存于4℃备用。

对比例4

与实施例1不同的是，去除维生素E、维生素C和维生素B12，其他均不变。

实验例1

采用实施例1以及对比例1-3制得的冻存液进行冻存试验，具体如下：

a.将精子液体(约0.5ml)加入1ml冻存液，室温静置5分钟；

b.将冻存管置于4℃5分钟；

c.冻存管置于-20℃5分钟；

d.冻存管置于-80℃5分钟；

e.冻存管冻存于液氮中。

在液氮中保存一段时间后，按照以下步骤进行复苏：

将冻存管从液氮中取出后迅速在37℃振荡复温2min，然后加入洗涤液清洗。

复苏之后再次计算前向运动的精子比例。

本实验例中，选取的精子密度为40-80×10⁶个/ml，活率为35％-70％，体积为5ml以上的样本，共有20份样本。每个冻存液做4个样本，每个样本分成3份，每个样本的每份分别保存1小时,1个月后取出测定精子活性，计算得到冻存复苏率，检测结果如表2所示。

冻存复苏率＝冻前活率/冻后活率*100％。

表2冻存复苏率

从表2可以看出，本发明实施例提供的冻存液的冻存效果明显优于对照组。

实验例2

对冻存前，以及冻存1h复苏后的精子质量进行检测，检测精子形态正常率，结果如表3所示。

表3精子质量

	1号样本	2号样本	3号样本
				冻存前	81.96％	85.38％	86.20％
实施例1	79.94％	83.20％	80.80％
				对比例1	76.04％	79.10％	74.83％
对比例2	75.94％	77.38％	72.19％
				对比例3	74.01％	76.10％	70.07％
对比例4	76.50％	75.01％	74.80％

从表3可以看出，本发明实施例提供的冻存液能更好的保证精子的质量，效果明显优于对比例。尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (9)

1.一种人类精子冻存液，其特征在于，以所述冻存液的体积计，由以下组分组成：氯化钾5.5±0.2mM，硫酸镁0.40±0.05mM，氯化钙2.0±0.1mM，碳酸氢钠25.0±0.5mM，磷酸氢二钾0.20±0.01mM，丙酮酸钠0.20±0.01mM，乳酸钙2.00±0.05mM，葡萄糖8.0±0.2mM，蔗糖40.0±0.5mM，谷氨酰胺0.10±0.01mM，甘氨酸1.00±0.05mM，HEPES20.0±0.5mM，庆大霉素1.0±0.05mg/ml，甘油体积百分数10％±1％，人血清白蛋白5±0.2mg/ml，维生素E100±10μg/ml，维生素C100±10μg/ml，维生素B12 100±10μg/ml；

所述精子冻存液的pH值为7.1-7.5，渗透压为590-610mOsm/kg；

进一步地，内毒素含量小于1.0EU/ml。

2.权利要求1所述的人类精子冻存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)氯化钾、硫酸镁、氯化钙、碳酸氢钠、磷酸氢二钾、丙酮酸钠、乳酸钙、葡萄糖、蔗糖和HEPES加水制成溶液；

(b)加入谷氨酰胺、甘氨酸、庆大霉素、甘油、维生素E、维生素C和维生素B12，混合均匀；

(c)加入人血清白蛋白，定容即可。

3.根据权利要求2所述的人类精子冻存液的制备方法，其特征在于，步骤(a)中制成的溶液进行过滤后再进行步骤(b)的步骤。

4.根据权利要求3所述的人类精子冻存液的制备方法，其特征在于，所述过滤采用0.22μm滤膜过滤。

5.根据权利要求2所述的人类精子冻存液的制备方法，其特征在于，步骤(b)得到的溶液的渗透压为580-600mOsm/kg，pH值为7.0-7.4。

6.根据权利要求2所述的人类精子冻存液的制备方法，其特征在于，步骤(c)定容后还包括过滤的步骤，该过滤采用0.22μm滤膜过滤。

7.一种人类精子的保存方法，其特征在于，精子液体与权利要求1提供的所述的精子冻存液以体积比为1:2混合，进行梯度低温冻存，然后保存在液氮中。

8.根据权利要求7所述的人类精子的保存方法，其特征在于，所述梯度低温冻存按以下程序进行：

4℃5分钟；

-20℃5分钟；

-80℃5分钟。

9.根据权利要求7或8所述的人类精子的保存方法，其特征在于，所述精子液体与所述人类精子冻存液混合后，室温静置5分钟后进行冻存程序。