CN108753698A - 一种玻璃化解冻液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种玻璃化解冻液及其制备方法，属于人类辅助生殖技术领域。所述玻璃化解冻液，是将聚蔗糖、海藻糖和蔗糖溶解于含有抗菌素和指示剂的基础盐缓冲溶液中配制而成。本发明所述的解冻液内添加高浓度的蔗糖，可以有效地阻止解冻过程中水的内流速度，防止冰晶的形成，增加存活率，不仅可以有效地保存卵子和胚胎及组织细胞的活力，而且还可以保存DNA的完整性，提高辅助生殖技术的成功率，同时，也为辅助生殖技术的安全性提供了有力保证。

Description

一种玻璃化解冻液及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种玻璃化解冻液及其制备方法，属于人类辅助生殖技术领域。
背景技术
人类辅助生殖技术中，玻璃化解冻液主要应用于卵子、胚胎以及睾丸、卵巢组织的解冻等流程。目前，临床使用的常规的玻璃化解冻液为仅以HEPES或者MOPS或者碳酸氢钠为缓冲的基础盐溶液，不能完整有效地保持精子、卵子、胚胎的活力和DNA的完整性，尤其对卵子的冷冻保存，解冻存活率很低。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种各项质控达标的玻璃化解冻液，不仅可以有效地保持精子、卵子和胚胎的活力，提高辅助生殖技术的成功率，而且也为辅助生殖技术的安全性提供了有力保证。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：
一种玻璃化解冻液，其特征在于：包括解冻液、稀释液和洗涤液；
所述解冻液、稀释液均为将聚蔗糖、海藻糖、蔗糖、白蛋白溶解于含有抗菌素、指示剂的基础盐缓冲溶液中配制而成；其中，所述解冻液中，聚蔗糖的终浓度为5-15mg/mL，海藻糖的终浓度为0.20-0.70mol/L，蔗糖的终浓度为0.9-1.1mol/L，白蛋白的终浓度为6-15mg/mL；所述稀释液中，聚蔗糖的终浓度为5-15mg/mL，海藻糖的终浓度为0.20-0.70mol/L，蔗糖的终浓度为0.3-0.6mol/L，白蛋白的终浓度为6-15mg/mL；
所述洗涤液为将白蛋白溶解于含有抗菌素、指示剂的基础盐缓冲溶液中配制而成，其中白蛋白的终浓度为6-15mg/mL；
所述白蛋白为重组人血清白蛋白，是采用医疗级的重组人血清白蛋白干粉溶解于盐水溶液中制备而成。
进一步说：所述抗菌素为庆大霉素，终浓度为5-21μg/mL。
进一步说：所述指示剂为酚红，终浓度4.5-10.0μg/mL。
进一步说：所述基础盐缓冲溶液是以HEPES或MOPS为缓冲剂，以钠、钾、镁、钙离子为基础，并以葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠为能量物质的化合物溶液；其中包含：氯化钠97.00-102.00mmol/L、氯化钾4.50-4.70mmol/L、硫酸镁0.10-0.25mmol/L、氯化钙1.90-2.20mmol/L、碳酸氢钠3.80-4.20mmol/L、HEPES或MOPS 18.00-22.00mmol/L、葡萄糖2.60-2.88mmol/L、丙酮酸钠0.28-0.35mmol/L、乳酸钠21.00-22.66mmol/L、磷酸二氢钾0.35-0.39mmol/L。
本发明所述玻璃化解冻液的制备方法，包括以下步骤：
1、配制基础盐缓冲溶液：先按照基础盐缓冲溶液的各组分及用量称量好各种组分，备用；然后，将除了抗菌素、指示剂、碳酸氢钠以外的各组分溶于超纯注射级用水中，溶解过程中遵循先固体后液体的原则；所述超纯注射级用水经0.1-0.2μM滤膜过滤，内毒素＜0.015EU/mL；再依次加入称量好的抗菌素、指示剂、碳酸氢钠，制得基础盐缓冲溶液；
2、检测步骤1所得基础盐缓冲溶液的渗透压和pH值，并记录最终渗透压和pH值；所述渗透压保持为265-285mOsm/Kg，所述pH值保持为7.30-7.50；
3、制备解冻液：将聚蔗糖、海藻糖、蔗糖、白蛋白分别按照终浓度为5-15mg/mL、0.20-0.70mol/L、0.9-1.1mol/L、6-15mg/mL溶解在基础盐缓冲溶液中，得到解冻液；
4、制备稀释液：将聚蔗糖、海藻糖、蔗糖、白蛋白分别按照终浓度为5-15mg/mL、0.20-0.70mol/L、0.3-0.6mol/L、6-15mg/mL溶解在基础盐缓冲溶液中，得到稀释液；
5、制备洗涤液：按照预配置的容量，将白蛋白按终浓度为6-15mg/mL溶解在基础盐缓冲溶液中，得到洗涤液；
6、将步骤3、4、5所得溶液分别经过0.2μm滤膜过滤灭菌后，取样测试；测试参数如下：
解冻液：10-25℃条件下pH值为7.10-7.90；渗透压为586-756mOsm/Kg；内毒素为＜1.0EU/mL；一细胞鼠胚培养到96小时：≥80％的囊胚形成率；
稀释液：10-25℃条件下pH值为7.10-7.90；渗透压为795-922mOsm/Kg；内毒素为＜1.0EU/mL；一细胞鼠胚培养到96小时：≥80％的囊胚形成率；
洗涤液：10-25℃条件下pH值为7.10-7.90；渗透压为257-277mOsm/Kg；内毒素为＜1.0EU/mL；一细胞鼠胚培养到96小时：≥80％的囊胚形成率；
7、将步骤3、4、5所得溶液分别在百级GMP车间进行无菌分装和标签。
有益效果：与现有技术相比，本发明所述的解冻液内添加高浓度的蔗糖，可以有效地阻止解冻过程中水的内流速度，防止冰晶的形成，增加存活率，不仅可以有效地保存卵子和胚胎及组织细胞的活力，而且还可以保存DNA的完整性，提高辅助生殖技术的成功率，同时，也为辅助生殖技术的安全性提供了有力保证。
具体实施方式
下面结合具体实施实施方式对本发明做进一步说明。
本发明所述的玻璃化解冻液，包括解冻液、稀释液和洗涤液。
所述解冻液、稀释液均为将聚蔗糖、海藻糖、蔗糖、白蛋白溶解于含有抗菌素、指示剂的基础盐缓冲溶液中配制而成。其中：所述解冻液中，聚蔗糖的终浓度为5-15mg/mL，海藻糖的终浓度为0.20-0.70mol/L，蔗糖的终浓度为0.9-1.1mol/L，白蛋白的终浓度为6-15mg/mL。所述稀释液中，聚蔗糖的终浓度为5-15mg/mL，海藻糖的终浓度为0.20-0.70mol/L，蔗糖的终浓度为0.3-0.6mol/L，白蛋白的终浓度为6-15mg/mL。
所述洗涤液为将白蛋白溶解于含有抗菌素、指示剂的基础盐缓冲溶液中配制而成，其中白蛋白的终浓度为6-15mg/mL。
所述白蛋白为重组人血清白蛋白，是采用医疗级的重组人血清白蛋白干粉溶解于盐水溶液中制备而成。所述抗菌素为庆大霉素，终浓度为5-21μg/mL。所述指示剂为酚红，终浓度4.5-10.0μg/mL。
所述基础盐缓冲溶液是以HEPES或MOPS为缓冲剂，以钠、钾、镁、钙离子为基础，并以葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠为能量物质的化合物溶液；其中包含：氯化钠97.00-102.00mmol/L、氯化钾4.50-4.70mmol/L、硫酸镁0.10-0.25mmol/L、氯化钙1.90-2.20mmol/L、碳酸氢钠3.80-4.20mmol/L、HEPES或MOPS 18.00-22.00mmol/L、葡萄糖2.60-2.88mmol/L、丙酮酸钠0.28-0.35mmol/L、乳酸钠21.00-22.66mmol/L、磷酸二氢钾0.35-0.39mmol/L。
本发明所述玻璃化解冻液的制备方法，包括以下步骤：
1、配制基础盐缓冲溶液：先按照基础盐缓冲溶液的各组分及用量称量好各种组分，备用；然后，将除了抗菌素、指示剂、碳酸氢钠以外的各组分溶于超纯注射级用水中，溶解过程中遵循先固体后液体的原则；所述超纯注射级用水经0.1-0.2μM滤膜过滤，内毒素＜0.015EU/mL；再依次加入称量好的抗菌素、指示剂、碳酸氢钠，制得基础盐缓冲溶液；
2、检测步骤1所得基础盐缓冲溶液的渗透压和pH值，并记录最终渗透压和pH值；所述渗透压保持为265-285mOsm/Kg，所述pH值保持为7.30-7.50；
3、制备解冻液：将聚蔗糖、海藻糖、蔗糖、白蛋白分别按照终浓度为5-15mg/mL、0.20-0.70mol/L、0.9-1.1mol/L、6-15mg/mL溶解在基础盐缓冲溶液中，得到解冻液；
4、制备稀释液：将聚蔗糖、海藻糖、蔗糖、白蛋白分别按照终浓度为5-15mg/mL、0.20-0.70mol/L、0.3-0.6mol/L、6-15mg/mL溶解在基础盐缓冲溶液中，得到稀释液；
5、制备洗涤液：按照预配置的容量，将白蛋白按终浓度为6-15mg/mL溶解在基础盐缓冲溶液中，得到洗涤液；
6、将步骤3、4、5所得溶液分别经过0.2μm滤膜过滤灭菌后，取样测试；测试参数如下：
解冻液：10-25℃条件下pH值为7.10-7.90；渗透压为586-756mOsm/Kg；内毒素为＜1.0EU/mL；一细胞鼠胚培养到96小时：≥80％的囊胚形成率；
稀释液：10-25℃条件下pH值为7.10-7.90；渗透压为795-922mOsm/Kg；内毒素为＜1.0EU/mL；一细胞鼠胚培养到96小时：≥80％的囊胚形成率；
洗涤液：10-25℃条件下pH值为7.10-7.90；渗透压为257-277mOsm/Kg；内毒素为＜1.0EU/mL；一细胞鼠胚培养到96小时：≥80％的囊胚形成率；
7、将步骤3、4、5所得溶液分别在百级GMP车间进行无菌分装和标签。
【存储说明和稳定性】
存储：将分装好的解冻液、稀释液、洗涤液分别于2℃-4℃的环境中冷藏；避免液体暴露于CO2环境和空气中，防止pH降低到7.0或更低的水平；不要暴露在高于39℃的温度下。
稳定性：产品稳定性可以直到标签上显示的到期日期；使用无菌程序除去所需体积的产品，一旦移除，不要将任何量的产品返回原始容器；如果产品变色、浑浊或有微生物污染迹象，请勿使用；为避免污染问题，使用无菌技术进行处理，并在完成操作后丢弃瓶子或小瓶中剩余的任何多余产品。
【具体使用方法】
1、将解冻液、稀释液、洗涤液从2-4℃冰箱中取出，平衡至室温(23-27℃)；
2、使用之前，取约200-300μL的解冻液至已标记的有盖培养皿或组织培养皿中预热至37℃；
3、在无菌室温条件下，取稀释液和洗涤液各两滴(每滴50-100μL)分别置于falcon培养皿中；
4、从液氮罐中取出装有患者信息载杆(以下简称载杆)的铝架，放置在一个盛有液氮的聚乙烯泡沫盒或其他容器中，使患者信息载杆完全浸没在液氮中，并核查标签上患者的信息；
5、用长镊子夹住载杆的杆体，并将其从铝架中取出；
6、用长镊子夹住外套并拉出，此过程始终在液氮中进行；
7、迅速从液氮中取出载杆的杆体(标志面朝下)，在显微镜载物台或层流工作台上，面朝下置于预热的解冻液的液滴中，于37℃条件下平衡1分钟；然后，将卵母细胞或胚胎从解冻液转移至稀释液中，卵母细胞放置3分钟，胚胎放置2分钟；
8、将卵母细胞或胚胎从稀释液转移至洗涤液中，分别放置2分钟；然后，在培养基中洗涤一次，放入培养箱中培养；
9、补充说明：若卵母细胞解冻时，需增加以下两步操作：(1)在解冻液解冻之后，将卵母细胞置于解冻液∶稀释液(1∶1)混合液滴中平衡3分钟。(2)在稀释液第二次平衡之后，将卵母细胞置于稀释液∶洗涤液(1∶1)混合溶液中平衡2分钟。

Claims (5)

1.一种玻璃化解冻液，其特征在于：包括解冻液、稀释液和洗涤液；
所述解冻液、稀释液均为将聚蔗糖、海藻糖、蔗糖、白蛋白溶解于含有抗菌素、指示剂的基础盐缓冲溶液中配制而成；其中，所述解冻液中，聚蔗糖的终浓度为5-15mg/mL，海藻糖的终浓度为0.20-0.70mol/L，蔗糖的终浓度为0.9-1.1mol/L，白蛋白的终浓度为6-15mg/mL；所述稀释液中，聚蔗糖的终浓度为5-15mg/mL，海藻糖的终浓度为0.20-0.70mol/L，蔗糖的终浓度为0.3-0.6mol/L，白蛋白的终浓度为6-15mg/mL；
所述洗涤液为将白蛋白溶解于含有抗菌素、指示剂的基础盐缓冲溶液中配制而成，其中白蛋白的终浓度为6-15mg/mL；
所述白蛋白为重组人血清白蛋白，是采用医疗级的重组人血清白蛋白干粉溶解于盐水溶液中制备而成。
2.根据权利要求1所述的玻璃化解冻液，其特征在于：所述抗菌素为庆大霉素，终浓度为5-21μg/mL。
3.根据权利要求2所述的玻璃化解冻液，其特征在于：所述指示剂为酚红，终浓度4.5-10.0μg/mL。
4.根据权利要求3所述的玻璃化解冻液，其特征在于：所述基础盐缓冲溶液是以HEPES或MOPS为缓冲剂，以钠、钾、镁、钙离子为基础，并以葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠为能量物质的化合物溶液；其中包含：氯化钠97.00-102.00mmol/L、氯化钾4.50-4.70mmol/L、硫酸镁0.10-0.25mm0l/L、氯化钙1.90-2.20mmol/L、碳酸氢钠3.80-4.20mmol/L、HEPES或MOPS18.00-22.00mmol/L、葡萄糖2.60-2.88mmol/L、丙酮酸钠0.28-0.35mmol/L、乳酸钠21.00-22.66mmol/L、磷酸二氢钾0.35-0.39mmol/L。
5.如权利要求4所述玻璃化解冻液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)配制基础盐缓冲溶液：先按照基础盐缓冲溶液的各组分及用量称量好各种组分，备用；然后，将除了抗菌素、指示剂、碳酸氢钠以外的各组分溶于超纯注射级用水中，溶解过程中遵循先固体后液体的原则；所述超纯注射级用水经0.1-0.2μM滤膜过滤，内毒素＜0.015EU/mL；再依次加入称量好的抗菌素、指示剂、碳酸氢钠，制得基础盐缓冲溶液；
(2)检测步骤(1)所得基础盐缓冲溶液的渗透压和pH值，并记录最终渗透压和pH值；所述渗透压保持为265-285mOsm/Kg，所述pH值保持为7.30-7.50；
(3)制备解冻液：将聚蔗糖、海藻糖、蔗糖、白蛋白分别按照终浓度为5-15mg/mL、0.20-0.70mol/L、0.9-1.1mol/L、6-15mg/mL溶解在基础盐缓冲溶液中，得到解冻液；
(4)制备稀释液：将聚蔗糖、海藻糖、蔗糖、白蛋白分别按照终浓度为5-15mg/mL、0.20-0.70mol/L、0.3-0.6mol/L、6-15mg/mL溶解在基础盐缓冲溶液中，得到稀释液；
(5)制备洗涤液：按照预配置的容量，将白蛋白按终浓度为6-15mg/mL溶解在基础盐缓冲溶液中，得到洗涤液；
(6)将步骤(3)、(4)、(5)所得溶液分别经过0.2μm滤膜过滤灭菌后，取样测试；测试参数如下：
解冻液：10-25℃条件下pH值为7.10-7.90；渗透压为586-756mOsm/Kg；内毒素为＜1.0EU/mL；一细胞鼠胚培养到96小时：≥80％的囊胚形成率；
稀释液：10-25℃条件下pH值为7.10-7.90；渗透压为795-922mOsm/Kg；内毒素为＜1.0EU/mL；一细胞鼠胚培养到96小时：≥80％的囊胚形成率；
洗涤液：10-25℃条件下pH值为7.10-7.90；渗透压为257-277mOsm/Kg；内毒素为＜1.0EU/mL；一细胞鼠胚培养到96小时：≥80％的囊胚形成率；
(7)将步骤(3)、(4)、(5)所得溶液分别在百级GMP车间进行无菌分装和标签。
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