CN109468269A - 细胞玻璃化解冻液及解冻方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞冷冻、解冻领域，提供了一种细胞玻璃化解冻液，包括稀释液、涮洗液和融解液。本发明的解冻液用保护效果更好的海藻糖代替蔗糖，更有利于提高囊胚胞膜的稳定性，使囊胚更耐受渗透损伤，有助于提高复苏囊胚的存活率。

Description

细胞玻璃化解冻液及解冻方法
技术领域
本发明属于细胞冷冻领域，涉及冷冻细胞的解冻。
背景技术
“玻璃化”的概念是指水或者溶液快速降温达到或低于-110～-100摄氏度的温度范围时，形成一种高黏度的介于液态和固态之间、非晶体的、透明的玻璃态。因此。玻璃化冷冻技术的基本原理就是用高浓度的解冻保护剂溶液将细胞内水分置换出来，经急速降温由液态转化为外形似玻璃状的非晶体状固体状态，这一状态的变化无冰晶形成，避免了冰晶形成对细胞脂质膜及细胞骨架结构的损伤，而玻璃化解冻技术就是一种逆转玻璃化冷冻的过程，通过利用浓度逐级递减的保护剂溶液，将冷冻过程中进入细胞内的冷冻保护剂用水替换出来，并在解冻、替换的过程中无冰晶损伤。
十几年来，玻璃化解冻技术获得了很大的进步，冻融后存活率得到了较大的提高。又因为囊胚期胚胎相较于卵裂期胚胎具有更好的发育潜能和耐解冻损伤性，因此囊胚期胚胎的玻璃化解冻逐渐替代卵裂期胚胎的玻璃化解冻，成为胚胎保存、解冻的一大重要手段，并在全世界大部分生殖中心广泛使用。
在胚胎玻璃化解冻过程中，需要注意防止冰晶、冷休克、溶质效应、破碎损伤、重结晶、渗透性休克等冷冻融解损伤，基于提高胚胎复苏存活率的考虑，囊胚的玻璃化冷冻融解方案为：采用快速复温的方法，将细胞内高渗透压的囊胚置于含有一定浓度梯度的冷冻保护剂的培养液中，从而使得细胞内外的渗透压差距逐渐减小，减缓细胞体积的变化速度，避免解冻过程中造成的胚胎损伤。
目前公知的、辅助生殖临床广泛使用的大多采用解冻液为含0.33M蔗糖的基础液，稀释液为含0.2M蔗糖的基础液，洗涤液即为基础液的三步法解冻操作，操作时间分别解冻液2min，稀释液3min，洗涤液5min。也有其他蔗糖浓度轻微浮动的解冻液，采用四步法解冻，如日本加藤公司玻璃化解冻试剂盒，分为解冻液、稀释液、洗涤液1、洗涤液2，操作时间分别为1min、3min、3min、3min。但本领域中依然需要更稳定、效果更佳的解冻液。
发明内容
本发明的目的在于提供一种稳定性高、解冻保护效果更佳的细胞玻璃化解冻液以及使用该解冻液解冻的方法。
第一个方面，本发明提供一种细胞玻璃化解冻液，包括涮洗液(WS)、稀释液(DS)和融解液(TS)，其中，
所述的涮洗液(WS)为含有蛋白添加物的基础液，所述基础液为改良的人输卵管液(mHTF)、TCM199或平衡盐溶液PBS；所述蛋白添加物为在涮洗液中终浓度是2％～10％(V/V)的人血清白蛋白(HSA)或血清替代物(SSS)等；
作为一个优选方案的涮洗液，其中的基础液为改良的人输卵管液，蛋白添加物为人血清白蛋白(HSA)；优选地，蛋白添加物的浓度为5％(V/V)；
所述的稀释液(DS)为含在稀释液中终浓度为0.1～0.3M海藻糖的涮洗液；
作为一个优选方案的稀释液(DS)为含在稀释液中终浓度为0.2M海藻糖的涮洗液；
所述的融解液(TS)为含在融解液中终浓度为0.3～0.5M海藻糖的涮洗液，优选地，所述融解液(TS)为含在融解液中终浓度为0.33M海藻糖的涮洗液。
在第二个方面，本发明提供冷冻细胞的解冻方法，使用本发明的解冻液，包括，将待解冻细胞从液氮环境中拿出，在温台上，分别浸入融解液(TS)中1～5min、经稀释液(DS)作用1～6min和经涮洗液(WS)作用3～10min后，转移到细胞培养液中培养待用。
作为一个优选方案的将待解冻细胞从液氮环境中拿出，在温台上，分别浸入融解液(TS)中2min、经稀释液(DS)作用3min和经涮洗液(WS)作用5min后，转移到细胞培养液中培养待用。
优选地，涉及液体置换的步骤均在温台上操作，温台温度在35～39摄氏度之间，优选的温台温度为37摄氏度。
优选地，所述细胞为非人哺乳动物的囊胚期胚胎，为胚胎发育到囊胚期阶段的四期、五期及六期囊胚，所述非人哺乳动物如兔子和小鼠。
本发明的优点在于：
(1)用保护效果更好的海藻糖代替蔗糖，更有利于提高囊胚胞膜的稳定性，使囊胚更耐受渗透损伤，有助于提高复苏囊胚的存活率。
海藻糖(trehalose)是由两个葡萄糖基分子通过半缩醛基缩合而成的非还原性双糖。海藻糖最初被发现于1832年，早期的研究只知道海藻糖是一种能量的储存形式，1985年之后，研究才逐渐发现海藻糖的许多不同于其他双糖的特殊功效。研究发现海藻糖在对生物的抗脱水、抗解冻、抗高渗保护、对生物制品的干燥与保存等不同方面的保护作用均优于自然界中如蔗糖、葡萄糖等其他糖类。
(2)操作简单，不同熟练程度的操作者均可获得非常稳定的高存活率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的内容不限于此。
以下实施例中，如果没有特殊说明，所使用的试剂和仪器都是本领域常规试剂和仪器，可以通过商购方式获得；所使用的基础操作都是本领域常规方法，本领域技术人员根据描述的内容可以实现所述操作并得到相应的结果。其中，HSA(Vitrolife-10064)，mHTF(SAGE-18200226)，海藻糖(SIGMA-T0167)。
以下实施例中使用的兔子和小鼠的囊胚，均来自于本实验室，任何商购的兔子或小鼠的囊胚均可使用。
实施例1：玻璃化解冻液的配制方法
1.以10ml为例配制涮洗液(WS)，含5％(V/V)的人血清白蛋白(HSA)的改良的人输卵管液(mHTF)，即取9.5ml的mHTF，再加入0.5ml的HSA。
2.海藻糖溶液的配制：以10ml为例配制含1.0M海藻糖溶液，即取9.5ml的mHTF溶解3.783g的海藻糖，再加入0.5ml的HSA。
3.按照海藻糖溶液：涮洗液为1:4的比例混合两种液体，即为含0.2M海藻糖的稀释液(DS)。
4.按照海藻糖溶液：涮洗液为1:2的比例混合两种液体，即为含0.33M海藻糖的融解液(TS)。
实施例2：四期囊胚玻璃化解冻方法
本实施例使用实施例1中配制的解冻液。
1.将待解冻的兔子四期囊胚从液氮环境中拿出，在37℃温台上，快速浸入融解液(TS)中，在融解液中静置2min。
2.将融解液中的四期囊胚转移到稀释液(DS)中作用3min。
3.将稀释液中的四期囊胚转移到涮洗液(WS)中作用5min。
4.将解冻完成的四期囊胚由涮洗液转移到囊胚培养液中，放入培养箱培养待用。
共分三次，解冻前期玻璃化冷冻的总共16枚兔子四期囊胚。第一次解冻6枚，第二次解冻5枚，第三次解冻5枚，解冻后，均没有死亡的细胞，37℃培养箱培养一段时间后，囊腔均重新复张、扩张，16枚四期囊胚全部解冻成功。证明以海藻糖代替蔗糖，更有利于提高囊胚胞膜的稳定性，使囊胚更耐受渗透损伤，有助于提高复苏囊胚的存活率。
实施例3：五期囊胚三步法玻璃化解冻方法
本实施例使用实施例1中配制的解冻液。
1.将待解冻的小鼠五期囊胚从液氮环境中拿出，在37℃温台上，快速浸入融解液(TS)中，在融解液中静置2min。
2.将融解液中的五期囊胚转移到稀释液(DS)中作用3min。
3.将稀释液中的五期囊胚转移到涮洗液(WS)中作用5min。
4.将解冻完成的五期囊胚由涮洗液转移到囊胚培养液中，放入培养箱培养待用。
共分两次，解冻前期玻璃化冷冻的总共15枚小鼠五期囊胚。第一次解冻8枚，第二次解冻7枚，解冻后，仅有1枚囊胚死亡，其它囊胚培在37℃培养箱培养一段时间后，囊腔均重新复张、扩张，并顺利进行后续实验。
实施例4：六期囊胚三步法玻璃化解冻方法
本实施例使用实施例1中配制的解冻液。
1.将待解冻的小鼠六期囊胚从液氮环境中拿出，在37℃温台上，快速浸入解冻液(TS)中，在解冻夜中静置2min。
2.将解冻液中的六期囊胚转移到稀释液(DS)中作用3min。
3.将稀释液中的六期囊胚转移到涮洗液(WS)中作用5min。
4.将解冻完成的六期囊胚由涮洗液转移到囊胚培养液中，放入培养箱培养待用。
共分三次，解冻前期玻璃化冷冻的总共18枚小鼠六期囊胚。第一次解冻7枚，第二次解冻7枚，第三次解冻4枚，解冻后，仅有1枚囊胚死亡，其它囊胚培在37℃培养箱培养一段时间后，囊腔均重新复张、扩张，并顺利进行后续实验。

Claims (10)

1.一种细胞玻璃化解冻液，包括稀释液、涮洗液和融解液，其中，
所述的涮洗液为含有蛋白添加物的基础液，所述基础液为改良的人输卵管液、TCM199或平衡盐溶液PBS；所述蛋白添加物为在涮洗液中终浓度是2％～10％(V/V)的人血清白蛋白或血清替代物；
所述的稀释液为含在稀释液中终浓度为0.1～0.3M海藻糖的涮洗液；
所述的融解液为含在融解液中终浓度为0.3～0.5M海藻糖的涮洗液。
2.根据权利要求1所述的解冻液，其中，所述涮洗液中，其中的基础液为改良的人输卵管液，蛋白添加物为人血清白蛋白，蛋白添加物的浓度为5％(V/V)。
3.根据权利要求1所述的解冻液，其中，所述稀释液为含在稀释液中终浓度为0.2M海藻糖的涮洗液。
4.根据权利要求1所述的解冻液，其中，所述融解液为含在融解液中终浓度为0.33M海藻糖的涮洗液。
5.一种冷冻细胞的解冻方法，使用权利要求1～4任一项所述的解冻液，包括：将待解冻细胞从液氮环境中拿出，在温台上，分别浸入融解液中1～5min、经稀释液作用1～6min和经涮洗液作用3～10min后，转移到细胞培养液中培养待用。
6.根据权利要求5所述的解冻方法，包括：将待解冻细胞从液氮环境中拿出，在温台上，分别浸入融解液中2min、经稀释液作用3min和经涮洗液作用5min后，转移到细胞培养液中培养待用。
7.根据权利要求5或6所述的解冻方法，其中，所述温台的温度在35～39摄氏度之间。
8.根据权利要求7所述的解冻方法，其中，所述温台的温度为37摄氏度。
9.根据权利要求5～8任一项所述的解冻方法，其中，所述细胞为非人哺乳动物的囊胚期胚胎。
10.根据权利要求9所述的解冻方法，其中，所述细胞为胚胎发育到囊胚期阶段的四期、五期或六期囊胚。
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