CN117546833A - 一种类器官冻存液的制备方法 - Google Patents
一种类器官冻存液的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117546833A CN117546833A CN202311221728.2A CN202311221728A CN117546833A CN 117546833 A CN117546833 A CN 117546833A CN 202311221728 A CN202311221728 A CN 202311221728A CN 117546833 A CN117546833 A CN 117546833A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- organoid
- stock solution
- frozen stock
- injection
- sodium chloride
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 title claims abstract description 77
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 title claims abstract description 74
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 11
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 70
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims abstract description 38
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims abstract description 38
- 239000008354 sodium chloride injection Substances 0.000 claims abstract description 38
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 claims abstract description 35
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 claims abstract description 35
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 30
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 27
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 22
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 15
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 15
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 15
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 claims description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 10
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 10
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 claims description 10
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 claims description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 6
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 5
- DZTHIGRZJZPRDV-LBPRGKRZSA-N N-acetyl-L-tryptophan Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)C)C(O)=O)=CNC2=C1 DZTHIGRZJZPRDV-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims description 5
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 5
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 claims description 5
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 claims description 5
- -1 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 claims description 5
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000011591 potassium Substances 0.000 claims description 5
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 5
- BYKRNSHANADUFY-UHFFFAOYSA-M sodium octanoate Chemical compound [Na+].CCCCCCCC([O-])=O BYKRNSHANADUFY-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 5
- 238000007710 freezing Methods 0.000 abstract description 14
- 230000008014 freezing Effects 0.000 abstract description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 6
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 abstract description 6
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 abstract description 3
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000035699 permeability Effects 0.000 abstract description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 abstract description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 2
- 230000006910 ice nucleation Effects 0.000 abstract description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000004017 vitrification Methods 0.000 abstract description 2
- 238000004781 supercooling Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 7
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 6
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000008238 biochemical pathway Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008723 osmotic stress Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本发明涉及冻存液技术领域，本发明公开了一种类器官冻存液，包括以下成分：二甲基亚砜、羟乙基淀粉40氯化钠注射液、人血白蛋白注射剂、D‑海藻糖和Y‑27632。本发明还公开了一种类器官冻存液的制备方法，包括以下步骤：S1：准备试剂；S2：准备耗材；S3：配液；S4：类器官冻存液制备。本发明采用的二甲基亚砜能够作为渗透性保护剂（玻璃化剂）进入细胞内，能够改变过冷状态，使胞内外压力接近，通过极高的冷冻速率以绕过结冰过程，进而防止冰成核与细胞内冰生长引发的细胞损伤，羟乙基淀粉能够作为非渗透性保护剂与二甲基亚砜合用，在冷冻和复温过程中能够有效的阻止二甲基亚砜所引起的细胞肿胀，能够发挥渗透性和非渗透性两种冻存保护剂的协同作用。
Description
技术领域
本发明涉及冻存液技术领域，具体为一种类器官冻存液的制备方法。
背景技术
类器官是成体干细胞或多能干细胞进行体外三维培养而形成的具有一定空间结构的组织类似物，类器官空间结构较大并呈现出明显异质性，类器官冻存液含有多种保护因子且不含动物血清，更适合类器官细胞的深低温长期保存，低温长期保存细胞是生物医学基础研究的一项重要技术，但是低温不是冷冻保存引起的损伤的直接原因，而是冷冻和解冻过程出现多种现象对细胞造成损害，为了减小冷冻保存引起的细胞损伤，最常见的是采用二甲基亚砜和甘油来作为冷冻保护剂，尽管它们具有实用性，但某些细胞仍然难以冷冻保存和恢复，抑或是引发了多潜力细胞分化。
将水溶液冷却到平衡冰点以下将不可避免地导致细胞外介质中冰晶的形成和样品中水溶剂量的降低，这将导致在细胞膜上形成渗透梯度，导致细胞脱水，随着冰晶在细胞外介质中继续生长，最终导致渗透性休克或受到毒性损伤，复苏解冻时，脱水细胞暴露于大量水或缓冲溶液会导致水流入细胞膜，并可能导致肿胀和细胞裂解，冰重结晶现象也可能发生，导致机械和渗透应力损伤。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种类器官冻存液的制备方法，具有最大程度在低温条件下长时间保护细胞，使之免受损伤并维持较高活性的优点。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种类器官冻存液，包括以下成分：二甲基亚砜、羟乙基淀粉40氯化钠注射液、人血白蛋白注射剂、D-海藻糖和Y-27632。
优选的，所述二甲基亚砜在类器官冻存液中体积占比为5%，所述二甲基亚砜的纯度要求≥99.7%。
优选的，所述羟乙基淀粉40氯化钠注射液在类器官冻存液中质量浓度为4.2%，所述羟乙基淀粉40氯化钠注射液的规格为：每500ml注射液含30g的羟乙基淀粉40与氯化钠4.5g。
优选的，所述人血白蛋白注射剂类器官冻存液中质量浓度为5%，所述人血白蛋白注射剂的规格：每50ml注射液含10g蛋白质总量，其中白蛋白含量不低于96.0%，钠0.17g、钾不超过0.004g、乙酰色氨酸不超过19.62mg/g白蛋白、辛酸钠不超过13.30mg/g白蛋白。
优选的，所述D-海藻糖在类器官冻存液中质量浓度为3%，所述D-海藻糖的纯度要求≥98%。
优选的，所述Y-27632在类器官冻存液中摩尔浓度为10μM，所述Y-27632的纯度要求≥99.97%。
一种类器官冻存液的制备方法，包括以下步骤：
S1：准备试剂：二甲基亚砜、羟乙基淀粉40氯化钠注射液、人血白蛋白注射剂、D-海藻糖、0.9%氯化钠注射液、Y-27632；
S2：准备耗材：PET材质125ml培养基方形瓶、医用无菌一次性50ml注射器、0.22um一次性针式滤器、10ml移液管、10ul移液器枪头；
S3：配液：5mgY-27632加入4.0430ml的0.9%氯化钠注射液，超声波并加热到50-70℃使其完全溶解，即为5mM Y-27632母液；
S4：类器官冻存液制备：包括以下步骤：
S41：取125ml培养基方形瓶，加入羟乙基淀粉40氯化钠注射液、二甲基亚砜和人血白蛋白注射剂制得混合液；
S42：称取D-海藻糖3g加入步骤S41制得的混合液内溶解混匀；
S43：抽取200ul Y-27632母液加入步骤S42制得的混合液内混匀；
S44：医用无菌一次性50ml注射器抽取步骤S42制得的混合溶液，装上0.22um一次性针式滤器过滤至新的125ml培养基方形瓶内，此即为类器官冻存液；
S45：取步骤S44制得的类器官冻存液进行无菌、支原体、细菌内毒素检查，其中无菌、支原体检查应为阴性，细菌内毒素检查应＜0.5EU/ml的为合格类器官冻存液。
优选的，所述步骤S41中加入65-75ml羟乙基淀粉40氯化钠注射液、4-6ml二甲基亚砜和20-30ml人血白蛋白注射剂制得混合液。
本发明提供了一种类器官冻存液的制备方法，有益效果在于：
本发明采用的二甲基亚砜能够作为渗透性保护剂（玻璃化剂）进入细胞内，能够改变过冷状态，使胞内外压力接近，通过极高的冷冻速率以绕过结冰过程，进而防止冰成核与细胞内冰生长引发的细胞损伤。
本发明采用的羟乙基淀粉能够作为非渗透性保护剂与二甲基亚砜合用，在冷冻和复温过程中能够有效的阻止二甲基亚砜所引起的细胞肿胀，能够发挥渗透性和非渗透性两种冻存保护剂的协同作用。
本发明采用的人血白蛋白由于低温和冻融过程中的氧化反应，会产生一定量的活性氧自由基，这些自由基会对细胞造成损伤，人血白蛋白中的抗氧化物质可以减少氧自由基的生成，减轻细胞受损程度，有助于维持细胞的存活率和功能完整性，在冻存过程中，细胞有时会出现凝聚或凝集现象，人血白蛋白还可以起到分散细胞的作用，防止细胞凝聚，有利于冷冻细胞的均匀分散并提高存活率。
本发明采用的海藻糖是一种天然糖类，能够在高温、高寒、干燥失水等恶劣条件下在细胞表面形成特殊的保护膜，保持细胞膜、蛋白质及核酸的完整性，同时，在冻存过程中细胞代谢会受到很大影响，海藻糖可保护细胞代谢的正常进行，减少细胞死亡。
本发明采用的Y-27632：Rho相关卷曲激酶（ROCK）活性位点抑制剂，能够减少细胞凋亡，可以通过调节生化途径而不是冷冻保存过程本身来改善类器官解冻后结局。
实施方式
为了更好地了解本发明的目的、结构及功能，对本发明一种类器官冻存液的制备方法做进一步详细的描述。
实施例
本发明公开了一种类器官冻存液，包括以下成分：二甲基亚砜、羟乙基淀粉40氯化钠注射液、人血白蛋白注射剂、D-海藻糖和Y-27632。
本实施例的二甲基亚砜在类器官冻存液中体积占比为5%，所述二甲基亚砜的纯度要求≥99.7%。
本实施例的羟乙基淀粉40氯化钠注射液在类器官冻存液中质量浓度为4.2%，所述羟乙基淀粉40氯化钠注射液的规格为：每500ml注射液含30g的羟乙基淀粉40与氯化钠4.5g。
本实施例的人血白蛋白注射剂类器官冻存液中质量浓度为5%，所述人血白蛋白注射剂的规格：每50ml注射液含10g蛋白质总量，其中白蛋白含量不低于96.0%，钠0.17g、钾不超过0.004g、乙酰色氨酸不超过19.62mg/g白蛋白、辛酸钠不超过13.30mg/g白蛋白。
本实施例的D-海藻糖在类器官冻存液中质量浓度为3%，所述D-海藻糖的纯度要求≥98%。
本实施例的Y-27632在类器官冻存液中摩尔浓度为10μM，所述Y-27632的纯度要求≥99.97%。
本发明还公开了一种类器官冻存液的制备方法，包括以下步骤：
S1：准备试剂：二甲基亚砜、羟乙基淀粉40氯化钠注射液、人血白蛋白注射剂、D-海藻糖、0.9%氯化钠注射液、Y-27632；
S2：准备耗材：PET材质125ml培养基方形瓶、医用无菌一次性50ml注射器、0.22um一次性针式滤器、10ml移液管、10ul移液器枪头；
S3：配液：5mgY-27632加入4.0430ml的0.9%氯化钠注射液，超声波并加热到50℃使其完全溶解，即为5mM Y-27632母液；
S4：类器官冻存液制备：包括以下步骤：
S41：取125ml培养基方形瓶，加入65ml羟乙基淀粉40氯化钠注射液、4ml二甲基亚砜和20ml人血白蛋白注射剂制得混合液；
S42：称取D-海藻糖3g加入步骤S41制得的混合液内溶解混匀；
S43：抽取200ul Y-27632母液加入步骤S42制得的混合液内混匀；
S44：医用无菌一次性50ml注射器抽取步骤S42制得的混合溶液，装上0.22um一次性针式滤器过滤至新的125ml培养基方形瓶内，此即为类器官冻存液；
S45：取步骤S44制得的类器官冻存液进行无菌、支原体、细菌内毒素检查，其中无菌、支原体检查应为阴性，细菌内毒素检查应＜0.5EU/ml的为合格类器官冻存液。
实施例
本发明公开了一种类器官冻存液，包括以下成分：二甲基亚砜、羟乙基淀粉40氯化钠注射液、人血白蛋白注射剂、D-海藻糖和Y-27632。
本实施例的二甲基亚砜在类器官冻存液中体积占比为5%，所述二甲基亚砜的纯度要求≥99.7%。
本实施例的羟乙基淀粉40氯化钠注射液在类器官冻存液中质量浓度为4.2%，所述羟乙基淀粉40氯化钠注射液的规格为：每500ml注射液含30g的羟乙基淀粉40与氯化钠4.5g。
本实施例的人血白蛋白注射剂类器官冻存液中质量浓度为5%，所述人血白蛋白注射剂的规格：每50ml注射液含10g蛋白质总量，其中白蛋白含量不低于96.0%，钠0.17g、钾不超过0.004g、乙酰色氨酸不超过19.62mg/g白蛋白、辛酸钠不超过13.30mg/g白蛋白。
本实施例的D-海藻糖在类器官冻存液中质量浓度为3%，所述D-海藻糖的纯度要求≥98%。
本实施例的Y-27632在类器官冻存液中摩尔浓度为10μM，所述Y-27632的纯度要求≥99.97%。
本发明还公开了一种类器官冻存液的制备方法，包括以下步骤：
S1：准备试剂：二甲基亚砜、羟乙基淀粉40氯化钠注射液、人血白蛋白注射剂、D-海藻糖、0.9%氯化钠注射液、Y-27632；
S2：准备耗材：PET材质125ml培养基方形瓶、医用无菌一次性50ml注射器、0.22um一次性针式滤器、10ml移液管、10ul移液器枪头；
S3：配液：5mgY-27632加入4.0430ml的0.9%氯化钠注射液，超声波并加热到60℃使其完全溶解，即为5mM Y-27632母液；
S4：类器官冻存液制备：包括以下步骤：
S41：取125ml培养基方形瓶，加入70ml羟乙基淀粉40氯化钠注射液、5ml二甲基亚砜和25ml人血白蛋白注射剂制得混合液；
S42：称取D-海藻糖3g加入步骤S41制得的混合液内溶解混匀；
S43：抽取200ul Y-27632母液加入步骤S42制得的混合液内混匀；
S44：医用无菌一次性50ml注射器抽取步骤S42制得的混合溶液，装上0.22um一次性针式滤器过滤至新的125ml培养基方形瓶内，此即为类器官冻存液；
S45：取步骤S44制得的类器官冻存液进行无菌、支原体、细菌内毒素检查，其中无菌、支原体检查应为阴性，细菌内毒素检查应＜0.5EU/ml的为合格类器官冻存液。
实施例
本发明公开了一种类器官冻存液，包括以下成分：二甲基亚砜、羟乙基淀粉40氯化钠注射液、人血白蛋白注射剂、D-海藻糖和Y-27632。
本实施例的二甲基亚砜在类器官冻存液中体积占比为5%，所述二甲基亚砜的纯度要求≥99.7%。
本实施例的羟乙基淀粉40氯化钠注射液在类器官冻存液中质量浓度为4.2%，所述羟乙基淀粉40氯化钠注射液的规格为：每500ml注射液含30g的羟乙基淀粉40与氯化钠4.5g。
本实施例的人血白蛋白注射剂类器官冻存液中质量浓度为5%，所述人血白蛋白注射剂的规格：每50ml注射液含10g蛋白质总量，其中白蛋白含量不低于96.0%，钠0.17g、钾不超过0.004g、乙酰色氨酸不超过19.62mg/g白蛋白、辛酸钠不超过13.30mg/g白蛋白。
本实施例的D-海藻糖在类器官冻存液中质量浓度为3%，所述D-海藻糖的纯度要求≥98%。
本实施例的Y-27632在类器官冻存液中摩尔浓度为10μM，所述Y-27632的纯度要求≥99.97%。
本发明还公开了一种类器官冻存液的制备方法，包括以下步骤：
S1：准备试剂：二甲基亚砜、羟乙基淀粉40氯化钠注射液、人血白蛋白注射剂、D-海藻糖、0.9%氯化钠注射液、Y-27632；
S2：准备耗材：PET材质125ml培养基方形瓶、医用无菌一次性50ml注射器、0.22um一次性针式滤器、10ml移液管、10ul移液器枪头；
S3：配液：5mgY-27632加入4.0430ml的0.9%氯化钠注射液，超声波并加热到70℃使其完全溶解，即为5mM Y-27632母液；
S4：类器官冻存液制备：包括以下步骤：
S41：取125ml培养基方形瓶，加入75ml羟乙基淀粉40氯化钠注射液、6ml二甲基亚砜和30ml人血白蛋白注射剂制得混合液；
S42：称取D-海藻糖3g加入步骤S41制得的混合液内溶解混匀；
S43：抽取200ul Y-27632母液加入步骤S42制得的混合液内混匀；
S44：医用无菌一次性50ml注射器抽取步骤S42制得的混合溶液，装上0.22um一次性针式滤器过滤至新的125ml培养基方形瓶内，此即为类器官冻存液；
S45：取步骤S44制得的类器官冻存液进行无菌、支原体、细菌内毒素检查，其中无菌、支原体检查应为阴性，细菌内毒素检查应＜0.5EU/ml的为合格类器官冻存液。
可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。
Claims (8)
1.一种类器官冻存液，其特征在于，包括以下成分：二甲基亚砜、羟乙基淀粉40氯化钠注射液、人血白蛋白注射剂、D-海藻糖和Y-27632。
2.根据权利要求1所述的一种类器官冻存液，其特征在于，所述二甲基亚砜在类器官冻存液中体积占比为5%，所述二甲基亚砜的纯度要求≥99.7%。
3.根据权利要求1所述的一种类器官冻存液，其特征在于，所述羟乙基淀粉40氯化钠注射液在类器官冻存液中质量浓度为4.2%，所述羟乙基淀粉40氯化钠注射液的规格为：每500ml注射液含30g的羟乙基淀粉40与氯化钠4.5g。
4.根据权利要求1所述的一种类器官冻存液，其特征在于，所述人血白蛋白注射剂类器官冻存液中质量浓度为5%，所述人血白蛋白注射剂的规格：每50ml注射液含10g蛋白质总量，其中白蛋白含量不低于96.0%，钠0.17g、钾不超过0.004g、乙酰色氨酸不超过19.62mg/g白蛋白、辛酸钠不超过13.30mg/g白蛋白。
5.根据权利要求1所述的一种类器官冻存液，其特征在于，所述D-海藻糖在类器官冻存液中质量浓度为3%，所述D-海藻糖的纯度要求≥98%。
6.根据权利要求1所述的一种类器官冻存液，其特征在于，所述Y-27632在类器官冻存液中摩尔浓度为10μM，所述Y-27632的纯度要求≥99.97%。
7.一种类器官冻存液的制备方法，其特征在于，包括权利要求1-6任一项所述的类器官冻存液，还包括以下步骤：
S1：准备试剂：二甲基亚砜、羟乙基淀粉40氯化钠注射液、人血白蛋白注射剂、D-海藻糖、0.9%氯化钠注射液、Y-27632；
S2：准备耗材：PET材质125ml培养基方形瓶、医用无菌一次性50ml注射器、0.22um一次性针式滤器、10ml移液管、10ul移液器枪头；
S3：配液：5mgY-27632加入4.0430ml的0.9%氯化钠注射液，超声波并加热到50-70℃使其完全溶解，即为5mM Y-27632母液；
S4：类器官冻存液制备：包括以下步骤：
S41：取125ml培养基方形瓶，加入羟乙基淀粉40氯化钠注射液、二甲基亚砜和人血白蛋白注射剂制得混合液；
S42：称取D-海藻糖3g加入步骤S41制得的混合液内溶解混匀；
S43：抽取200ul Y-27632母液加入步骤S42制得的混合液内混匀；
S44：医用无菌一次性50ml注射器抽取步骤S42制得的混合溶液，装上0.22um一次性针式滤器过滤至新的125ml培养基方形瓶内，此即为类器官冻存液；
S45：取步骤S44制得的类器官冻存液进行无菌、支原体、细菌内毒素检查，其中无菌、支原体检查应为阴性，细菌内毒素检查＜0.5EU/ml的为合格类器官冻存液。
8.根据权利要求7所述的一种类器官冻存液的制备方法，其特征在于，所述步骤S41中加入65-75ml羟乙基淀粉40氯化钠注射液、4-6ml二甲基亚砜和20-30ml人血白蛋白注射剂制得混合液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311221728.2A CN117546833A (zh) | 2023-09-21 | 2023-09-21 | 一种类器官冻存液的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311221728.2A CN117546833A (zh) | 2023-09-21 | 2023-09-21 | 一种类器官冻存液的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117546833A true CN117546833A (zh) | 2024-02-13 |
Family
ID=89813526
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311221728.2A Pending CN117546833A (zh) | 2023-09-21 | 2023-09-21 | 一种类器官冻存液的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117546833A (zh) |
-
2023
- 2023-09-21 CN CN202311221728.2A patent/CN117546833A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4824677B2 (ja) | シリンジでの大きな細胞塊の送出、および細胞を凍結保存する関連の方法 | |
| US7939316B2 (en) | Systems and methods for cryopreservation of cells | |
| US9877475B2 (en) | Systems and methods for cryopreservation of cells | |
| CN104663649B (zh) | 人类卵母细胞冷冻保护剂 | |
| CN109329271A (zh) | 一种临床用间充质干细胞冷冻保存液及其制备方法 | |
| CN104186459A (zh) | 一种离体肾脏亚常温或低温保存装置 | |
| CN105941389A (zh) | 一种无动物源血清的细胞冻存液 | |
| CN106342787A (zh) | 一种器官保存液及其制备方法 | |
| CN109468269A (zh) | 细胞玻璃化解冻液及解冻方法 | |
| CN113490414A (zh) | 干细胞的保存 | |
| CN107232183A (zh) | 卵母细胞非渗透性保护剂皱缩法序贯玻璃化冷冻液及使用方法 | |
| CN113854280A (zh) | 一种新型的低温保存液及其制备方法和应用 | |
| CN117546833A (zh) | 一种类器官冻存液的制备方法 | |
| CN111357739A (zh) | 一种玻璃化冷冻液及其生产方法 | |
| Fahy | Vitrification as an approach to organ cryopreservation: past, present, and future | |
| ES2695223T3 (es) | Medio de crioconservación de células con adición de boro | |
| WO2024026996A1 (zh) | 细胞保存液、细胞保存方法 | |
| Shishova et al. | The prospects of the application of gases and gas hydrates in cryopreservation | |
| CN111202051A (zh) | 一种用于人类辅助生殖的精子冷冻液及其制备方法 | |
| RU2804972C2 (ru) | Способ криоконсервации клеток, органов, тканей и организмов | |
| CN114424766B (zh) | 一种肝脏的超低温保存溶液及保存方法 | |
| JP2014217356A (ja) | 生殖細胞を凍結保存するための自動植氷機能を持った容器の製造方法 | |
| CA2647664C (en) | Systems and methods for cryopreservation of cells | |
| Pereira | Principles of cryopreservation and applicabilities in intestinal organoids | |
| Talwar | Overview of Cryobiology in Assisted Reproductive Technology |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |