CN117546833A - 一种类器官冻存液的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及冻存液技术领域，本发明公开了一种类器官冻存液，包括以下成分：二甲基亚砜、羟乙基淀粉40氯化钠注射液、人血白蛋白注射剂、D‑海藻糖和Y‑27632。本发明还公开了一种类器官冻存液的制备方法，包括以下步骤：S1：准备试剂；S2：准备耗材；S3：配液；S4：类器官冻存液制备。本发明采用的二甲基亚砜能够作为渗透性保护剂（玻璃化剂）进入细胞内，能够改变过冷状态，使胞内外压力接近，通过极高的冷冻速率以绕过结冰过程，进而防止冰成核与细胞内冰生长引发的细胞损伤，羟乙基淀粉能够作为非渗透性保护剂与二甲基亚砜合用，在冷冻和复温过程中能够有效的阻止二甲基亚砜所引起的细胞肿胀，能够发挥渗透性和非渗透性两种冻存保护剂的协同作用。
Description
技术领域
本发明涉及冻存液技术领域，具体为一种类器官冻存液的制备方法。
背景技术
类器官是成体干细胞或多能干细胞进行体外三维培养而形成的具有一定空间结构的组织类似物，类器官空间结构较大并呈现出明显异质性，类器官冻存液含有多种保护因子且不含动物血清，更适合类器官细胞的深低温长期保存，低温长期保存细胞是生物医学基础研究的一项重要技术，但是低温不是冷冻保存引起的损伤的直接原因，而是冷冻和解冻过程出现多种现象对细胞造成损害，为了减小冷冻保存引起的细胞损伤，最常见的是采用二甲基亚砜和甘油来作为冷冻保护剂，尽管它们具有实用性，但某些细胞仍然难以冷冻保存和恢复，抑或是引发了多潜力细胞分化。
将水溶液冷却到平衡冰点以下将不可避免地导致细胞外介质中冰晶的形成和样品中水溶剂量的降低，这将导致在细胞膜上形成渗透梯度，导致细胞脱水，随着冰晶在细胞外介质中继续生长，最终导致渗透性休克或受到毒性损伤，复苏解冻时，脱水细胞暴露于大量水或缓冲溶液会导致水流入细胞膜，并可能导致肿胀和细胞裂解，冰重结晶现象也可能发生，导致机械和渗透应力损伤。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种类器官冻存液的制备方法，具有最大程度在低温条件下长时间保护细胞，使之免受损伤并维持较高活性的优点。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种类器官冻存液，包括以下成分：二甲基亚砜、羟乙基淀粉40氯化钠注射液、人血白蛋白注射剂、D-海藻糖和Y-27632。
优选的，所述二甲基亚砜在类器官冻存液中体积占比为5%，所述二甲基亚砜的纯度要求≥99.7%。
优选的，所述羟乙基淀粉40氯化钠注射液在类器官冻存液中质量浓度为4.2%，所述羟乙基淀粉40氯化钠注射液的规格为：每500ml注射液含30g的羟乙基淀粉40与氯化钠4.5g。
优选的，所述人血白蛋白注射剂类器官冻存液中质量浓度为5%，所述人血白蛋白注射剂的规格：每50ml注射液含10g蛋白质总量，其中白蛋白含量不低于96.0%，钠0.17g、钾不超过0.004g、乙酰色氨酸不超过19.62mg/g白蛋白、辛酸钠不超过13.30mg/g白蛋白。
优选的，所述D-海藻糖在类器官冻存液中质量浓度为3%，所述D-海藻糖的纯度要求≥98%。
优选的，所述Y-27632在类器官冻存液中摩尔浓度为10μM，所述Y-27632的纯度要求≥99.97%。
一种类器官冻存液的制备方法，包括以下步骤：
S1：准备试剂：二甲基亚砜、羟乙基淀粉40氯化钠注射液、人血白蛋白注射剂、D-海藻糖、0.9%氯化钠注射液、Y-27632；
S2：准备耗材：PET材质125ml培养基方形瓶、医用无菌一次性50ml注射器、0.22um一次性针式滤器、10ml移液管、10ul移液器枪头；
S3：配液：5mgY-27632加入4.0430ml的0.9%氯化钠注射液，超声波并加热到50-70℃使其完全溶解，即为5mM Y-27632母液；
S4：类器官冻存液制备：包括以下步骤：
S41：取125ml培养基方形瓶，加入羟乙基淀粉40氯化钠注射液、二甲基亚砜和人血白蛋白注射剂制得混合液；
S42：称取D-海藻糖3g加入步骤S41制得的混合液内溶解混匀；
S43：抽取200ul Y-27632母液加入步骤S42制得的混合液内混匀；
S44：医用无菌一次性50ml注射器抽取步骤S42制得的混合溶液，装上0.22um一次性针式滤器过滤至新的125ml培养基方形瓶内，此即为类器官冻存液；
S45：取步骤S44制得的类器官冻存液进行无菌、支原体、细菌内毒素检查，其中无菌、支原体检查应为阴性，细菌内毒素检查应＜0.5EU/ml的为合格类器官冻存液。
优选的，所述步骤S41中加入65-75ml羟乙基淀粉40氯化钠注射液、4-6ml二甲基亚砜和20-30ml人血白蛋白注射剂制得混合液。
本发明提供了一种类器官冻存液的制备方法，有益效果在于：
本发明采用的二甲基亚砜能够作为渗透性保护剂（玻璃化剂）进入细胞内，能够改变过冷状态，使胞内外压力接近，通过极高的冷冻速率以绕过结冰过程，进而防止冰成核与细胞内冰生长引发的细胞损伤。
本发明采用的羟乙基淀粉能够作为非渗透性保护剂与二甲基亚砜合用，在冷冻和复温过程中能够有效的阻止二甲基亚砜所引起的细胞肿胀，能够发挥渗透性和非渗透性两种冻存保护剂的协同作用。
本发明采用的人血白蛋白由于低温和冻融过程中的氧化反应，会产生一定量的活性氧自由基，这些自由基会对细胞造成损伤，人血白蛋白中的抗氧化物质可以减少氧自由基的生成，减轻细胞受损程度，有助于维持细胞的存活率和功能完整性，在冻存过程中，细胞有时会出现凝聚或凝集现象，人血白蛋白还可以起到分散细胞的作用，防止细胞凝聚，有利于冷冻细胞的均匀分散并提高存活率。
本发明采用的海藻糖是一种天然糖类，能够在高温、高寒、干燥失水等恶劣条件下在细胞表面形成特殊的保护膜，保持细胞膜、蛋白质及核酸的完整性，同时，在冻存过程中细胞代谢会受到很大影响，海藻糖可保护细胞代谢的正常进行，减少细胞死亡。
本发明采用的Y-27632：Rho相关卷曲激酶（ROCK）活性位点抑制剂，能够减少细胞凋亡，可以通过调节生化途径而不是冷冻保存过程本身来改善类器官解冻后结局。
实施方式
为了更好地了解本发明的目的、结构及功能，对本发明一种类器官冻存液的制备方法做进一步详细的描述。
实施例
本发明公开了一种类器官冻存液，包括以下成分：二甲基亚砜、羟乙基淀粉40氯化钠注射液、人血白蛋白注射剂、D-海藻糖和Y-27632。
本实施例的二甲基亚砜在类器官冻存液中体积占比为5%，所述二甲基亚砜的纯度要求≥99.7%。
本实施例的羟乙基淀粉40氯化钠注射液在类器官冻存液中质量浓度为4.2%，所述羟乙基淀粉40氯化钠注射液的规格为：每500ml注射液含30g的羟乙基淀粉40与氯化钠4.5g。
本实施例的人血白蛋白注射剂类器官冻存液中质量浓度为5%，所述人血白蛋白注射剂的规格：每50ml注射液含10g蛋白质总量，其中白蛋白含量不低于96.0%，钠0.17g、钾不超过0.004g、乙酰色氨酸不超过19.62mg/g白蛋白、辛酸钠不超过13.30mg/g白蛋白。
本实施例的D-海藻糖在类器官冻存液中质量浓度为3%，所述D-海藻糖的纯度要求≥98%。
本实施例的Y-27632在类器官冻存液中摩尔浓度为10μM，所述Y-27632的纯度要求≥99.97%。
本发明还公开了一种类器官冻存液的制备方法，包括以下步骤：
S1：准备试剂：二甲基亚砜、羟乙基淀粉40氯化钠注射液、人血白蛋白注射剂、D-海藻糖、0.9%氯化钠注射液、Y-27632；
S2：准备耗材：PET材质125ml培养基方形瓶、医用无菌一次性50ml注射器、0.22um一次性针式滤器、10ml移液管、10ul移液器枪头；
S3：配液：5mgY-27632加入4.0430ml的0.9%氯化钠注射液，超声波并加热到50℃使其完全溶解，即为5mM Y-27632母液；
S4：类器官冻存液制备：包括以下步骤：
S41：取125ml培养基方形瓶，加入65ml羟乙基淀粉40氯化钠注射液、4ml二甲基亚砜和20ml人血白蛋白注射剂制得混合液；
S42：称取D-海藻糖3g加入步骤S41制得的混合液内溶解混匀；
S43：抽取200ul Y-27632母液加入步骤S42制得的混合液内混匀；
S44：医用无菌一次性50ml注射器抽取步骤S42制得的混合溶液，装上0.22um一次性针式滤器过滤至新的125ml培养基方形瓶内，此即为类器官冻存液；
S45：取步骤S44制得的类器官冻存液进行无菌、支原体、细菌内毒素检查，其中无菌、支原体检查应为阴性，细菌内毒素检查应＜0.5EU/ml的为合格类器官冻存液。
实施例
本发明公开了一种类器官冻存液，包括以下成分：二甲基亚砜、羟乙基淀粉40氯化钠注射液、人血白蛋白注射剂、D-海藻糖和Y-27632。
本实施例的二甲基亚砜在类器官冻存液中体积占比为5%，所述二甲基亚砜的纯度要求≥99.7%。
本实施例的羟乙基淀粉40氯化钠注射液在类器官冻存液中质量浓度为4.2%，所述羟乙基淀粉40氯化钠注射液的规格为：每500ml注射液含30g的羟乙基淀粉40与氯化钠4.5g。
本实施例的人血白蛋白注射剂类器官冻存液中质量浓度为5%，所述人血白蛋白注射剂的规格：每50ml注射液含10g蛋白质总量，其中白蛋白含量不低于96.0%，钠0.17g、钾不超过0.004g、乙酰色氨酸不超过19.62mg/g白蛋白、辛酸钠不超过13.30mg/g白蛋白。
本实施例的D-海藻糖在类器官冻存液中质量浓度为3%，所述D-海藻糖的纯度要求≥98%。
本实施例的Y-27632在类器官冻存液中摩尔浓度为10μM，所述Y-27632的纯度要求≥99.97%。
本发明还公开了一种类器官冻存液的制备方法，包括以下步骤：
S1：准备试剂：二甲基亚砜、羟乙基淀粉40氯化钠注射液、人血白蛋白注射剂、D-海藻糖、0.9%氯化钠注射液、Y-27632；
S2：准备耗材：PET材质125ml培养基方形瓶、医用无菌一次性50ml注射器、0.22um一次性针式滤器、10ml移液管、10ul移液器枪头；
S3：配液：5mgY-27632加入4.0430ml的0.9%氯化钠注射液，超声波并加热到60℃使其完全溶解，即为5mM Y-27632母液；
S4：类器官冻存液制备：包括以下步骤：
S41：取125ml培养基方形瓶，加入70ml羟乙基淀粉40氯化钠注射液、5ml二甲基亚砜和25ml人血白蛋白注射剂制得混合液；
S42：称取D-海藻糖3g加入步骤S41制得的混合液内溶解混匀；
S43：抽取200ul Y-27632母液加入步骤S42制得的混合液内混匀；
S44：医用无菌一次性50ml注射器抽取步骤S42制得的混合溶液，装上0.22um一次性针式滤器过滤至新的125ml培养基方形瓶内，此即为类器官冻存液；
S45：取步骤S44制得的类器官冻存液进行无菌、支原体、细菌内毒素检查，其中无菌、支原体检查应为阴性，细菌内毒素检查应＜0.5EU/ml的为合格类器官冻存液。
实施例
本发明公开了一种类器官冻存液，包括以下成分：二甲基亚砜、羟乙基淀粉40氯化钠注射液、人血白蛋白注射剂、D-海藻糖和Y-27632。
本实施例的二甲基亚砜在类器官冻存液中体积占比为5%，所述二甲基亚砜的纯度要求≥99.7%。
本实施例的羟乙基淀粉40氯化钠注射液在类器官冻存液中质量浓度为4.2%，所述羟乙基淀粉40氯化钠注射液的规格为：每500ml注射液含30g的羟乙基淀粉40与氯化钠4.5g。
本实施例的人血白蛋白注射剂类器官冻存液中质量浓度为5%，所述人血白蛋白注射剂的规格：每50ml注射液含10g蛋白质总量，其中白蛋白含量不低于96.0%，钠0.17g、钾不超过0.004g、乙酰色氨酸不超过19.62mg/g白蛋白、辛酸钠不超过13.30mg/g白蛋白。
本实施例的D-海藻糖在类器官冻存液中质量浓度为3%，所述D-海藻糖的纯度要求≥98%。
本实施例的Y-27632在类器官冻存液中摩尔浓度为10μM，所述Y-27632的纯度要求≥99.97%。
本发明还公开了一种类器官冻存液的制备方法，包括以下步骤：
S1：准备试剂：二甲基亚砜、羟乙基淀粉40氯化钠注射液、人血白蛋白注射剂、D-海藻糖、0.9%氯化钠注射液、Y-27632；
S2：准备耗材：PET材质125ml培养基方形瓶、医用无菌一次性50ml注射器、0.22um一次性针式滤器、10ml移液管、10ul移液器枪头；
S3：配液：5mgY-27632加入4.0430ml的0.9%氯化钠注射液，超声波并加热到70℃使其完全溶解，即为5mM Y-27632母液；
S4：类器官冻存液制备：包括以下步骤：
S41：取125ml培养基方形瓶，加入75ml羟乙基淀粉40氯化钠注射液、6ml二甲基亚砜和30ml人血白蛋白注射剂制得混合液；
S42：称取D-海藻糖3g加入步骤S41制得的混合液内溶解混匀；
S43：抽取200ul Y-27632母液加入步骤S42制得的混合液内混匀；
S44：医用无菌一次性50ml注射器抽取步骤S42制得的混合溶液，装上0.22um一次性针式滤器过滤至新的125ml培养基方形瓶内，此即为类器官冻存液；
S45：取步骤S44制得的类器官冻存液进行无菌、支原体、细菌内毒素检查，其中无菌、支原体检查应为阴性，细菌内毒素检查应＜0.5EU/ml的为合格类器官冻存液。
可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。
Claims (8)
1.一种类器官冻存液，其特征在于，包括以下成分：二甲基亚砜、羟乙基淀粉40氯化钠注射液、人血白蛋白注射剂、D-海藻糖和Y-27632。
2.根据权利要求1所述的一种类器官冻存液，其特征在于，所述二甲基亚砜在类器官冻存液中体积占比为5%，所述二甲基亚砜的纯度要求≥99.7%。
3.根据权利要求1所述的一种类器官冻存液，其特征在于，所述羟乙基淀粉40氯化钠注射液在类器官冻存液中质量浓度为4.2%，所述羟乙基淀粉40氯化钠注射液的规格为：每500ml注射液含30g的羟乙基淀粉40与氯化钠4.5g。
4.根据权利要求1所述的一种类器官冻存液，其特征在于，所述人血白蛋白注射剂类器官冻存液中质量浓度为5%，所述人血白蛋白注射剂的规格：每50ml注射液含10g蛋白质总量，其中白蛋白含量不低于96.0%，钠0.17g、钾不超过0.004g、乙酰色氨酸不超过19.62mg/g白蛋白、辛酸钠不超过13.30mg/g白蛋白。
5.根据权利要求1所述的一种类器官冻存液，其特征在于，所述D-海藻糖在类器官冻存液中质量浓度为3%，所述D-海藻糖的纯度要求≥98%。
6.根据权利要求1所述的一种类器官冻存液，其特征在于，所述Y-27632在类器官冻存液中摩尔浓度为10μM，所述Y-27632的纯度要求≥99.97%。
7.一种类器官冻存液的制备方法，其特征在于，包括权利要求1-6任一项所述的类器官冻存液，还包括以下步骤：
S1：准备试剂：二甲基亚砜、羟乙基淀粉40氯化钠注射液、人血白蛋白注射剂、D-海藻糖、0.9%氯化钠注射液、Y-27632；
S2：准备耗材：PET材质125ml培养基方形瓶、医用无菌一次性50ml注射器、0.22um一次性针式滤器、10ml移液管、10ul移液器枪头；
S3：配液：5mgY-27632加入4.0430ml的0.9%氯化钠注射液，超声波并加热到50-70℃使其完全溶解，即为5mM Y-27632母液；
S4：类器官冻存液制备：包括以下步骤：
S41：取125ml培养基方形瓶，加入羟乙基淀粉40氯化钠注射液、二甲基亚砜和人血白蛋白注射剂制得混合液；
S42：称取D-海藻糖3g加入步骤S41制得的混合液内溶解混匀；
S43：抽取200ul Y-27632母液加入步骤S42制得的混合液内混匀；
S44：医用无菌一次性50ml注射器抽取步骤S42制得的混合溶液，装上0.22um一次性针式滤器过滤至新的125ml培养基方形瓶内，此即为类器官冻存液；
S45：取步骤S44制得的类器官冻存液进行无菌、支原体、细菌内毒素检查，其中无菌、支原体检查应为阴性，细菌内毒素检查＜0.5EU/ml的为合格类器官冻存液。
8.根据权利要求7所述的一种类器官冻存液的制备方法，其特征在于，所述步骤S41中加入65-75ml羟乙基淀粉40氯化钠注射液、4-6ml二甲基亚砜和20-30ml人血白蛋白注射剂制得混合液。
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