CN105766892A - 一种利用重组光滑鳖甲抗冻蛋白对绵羊体外胚胎进行冷冻的方法 - Google Patents

一种利用重组光滑鳖甲抗冻蛋白对绵羊体外胚胎进行冷冻的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用重组光滑鳖甲抗冻蛋白对绵羊体外胚胎进行冷冻保护的方法,该方法包括步骤如下：（1）获取绵羊卵巢；（2）捡出卵母细胞；（3）加入装有体外受精液的液滴内，备用；（4）将解冻后的冻精加入步骤（3）的体外受精液滴中与卵母细胞孵育；（5）取出早期胚胎培养，统计囊胚率；（6）囊胚在添加ApAFP的冷冻液VS1和VS2中处理，最后装管液氮保存即可。通过这种方法能显著提高绵羊冷冻胚胎解冻后的存活率。

Description

一种利用重组光滑鳖甲抗冻蛋白对绵羊体外胚胎进行冷冻的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用重组光滑鳖甲抗冻蛋白对绵羊体外胚胎进行冷冻保护的方法。
背景技术
光滑鳖甲是广泛分布于新疆荒漠地区的一种拟步甲科(Tenebrionidae)昆虫，它能够通过抗冻蛋白的表达从而在长时间的低温和剧烈的温度变化等环境条件下生存。重组光滑鳖甲抗冻蛋白（anatolicapolitaantifreezeproteins，ApAFP），即是从新疆荒漠甲虫光滑鳖甲体内获得的抗冻蛋白基因ApAFP914，构建表达质粒，通过原核表达，得到的一种蛋白。其具有较强的热稳定性、酸碱耐受性和较高的亲水性的特点，并有明显的冰晶修饰作用。有文献报道，重组光滑鳖甲抗冻蛋白可提高红细胞对-3℃低温的耐受性，但目前还没有用于绵羊体外胚胎冷冻的报道。本发明以此为切入点，展开的研究方法具有科学性与实践性。
发明内容
本发明的目的在于：利用重组光滑鳖甲抗冻蛋白对绵羊卵母细胞体外受精后的囊胚期胚胎进行处理，找到一种适合绵羊体外胚胎冷冻的方法。
实现本发明的目的技术方案如下：一种利用重组光滑鳖甲抗冻蛋白对绵羊体外胚胎进行冷冻保护的方法，该方法包括步骤如下：
（1）获取宰杀后30分钟以内的绵羊卵巢，置入温度在30-35℃，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml链霉素的生理盐水中，3小时内用生理盐水清洗3-4次；
（2）然后，用吸有2ml抽卵液的注射器抽吸卵巢表面2-5mm大小的卵泡，将注射器内回收的卵泡液置于器皿中，在显微镜下捡出卵母细胞，用体外成熟液洗涤3-5次，备用；
（3）将步骤（2）中捡出的卵母细胞，在条件为5%CO2，95%空气，温度为38.6℃的CO2培养箱内培养22-24小时，用绵羊体外受精液洗涤2-4次，按25-30枚/滴的密度加入装有体外受精液的液滴内，备用；
（4）将解冻后的冻精，加入装有体外受精液的试管底部，CO2培养箱内上游20-25分钟，取上层精子混悬液，以1500转/分钟的转速离心4-5分钟，然后弃去上清液，用剩余的精子沉淀进行密度计算，按2-4×106个/ml的密度加入步骤（3）的体外受精液滴中与卵母细胞共同孵育；
（5）将步骤（4）中受精20-22小时的早期胚胎取出，移至体外培养液IVC内洗涤3-4次，并再次培养24-26小时，将未卵裂卵母细胞剔除，统计卵裂率，并继续培养，144-168小时后统计囊胚率；
（6）将步骤（5）中获得的囊胚用冷冻基础液洗涤3遍，在添加ApAFP的冷冻液VS1中平衡5分钟，在添加ApAFP914的冷冻液VS2中处理30秒，装管进行液氮保存即可。
有益效果：通过重组光滑鳖甲抗冻蛋白对绵羊卵母细胞体外受精后的囊胚期胚胎进行冷冻处理，能显著提高绵羊冷冻胚胎解冻后的存活率。为科研生产实践探索出一条新的生物学方法。
具体实施方式
实施例1、一种利用重组光滑鳖甲抗冻蛋白对绵羊体外胚胎进行冷冻保护的方法，该方法步骤如下：（1）在屠宰场获取宰杀后30分钟以内的绵羊卵巢，置入温度在30-35℃，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml链霉素的生理盐水中，3小时内用生理盐水清洗3-4次；（2）然后，用吸有2ml抽卵液注射器抽吸卵巢表面2-5mm大小的卵泡，将注射器内回收的卵泡液置于器皿中，在显微镜下捡出卵母细胞，用体外成熟液洗涤3-5次，备用；（3）将步骤（2）中选择的卵母细胞，在条件为5%CO2，95%空气，温度为38.6℃的CO2培养箱内培养22-24小时，用绵羊体外受精液洗涤2-4次，按25-30枚/滴的密度加入装有体外受精液的液滴内，备用；（4）将解冻后的冻精，放入装有体外受精液的试管底部，CO2培养箱内上游20-25分钟，取上层精子混悬液，以1500转/分钟的转速离心4-5分钟弃去上清液，用剩余的精子沉淀进行密度计算，按2-4×106个/ml的密度加入步骤（3）的体外受精液滴，与卵母细胞共同孵育；（5）将步骤（4）中受精20-22小时的早期胚胎取出，移至体外培养液IVC内洗涤3-4次，并再次培养24-26小时，将未卵裂卵母细胞剔除，统计卵裂率，并继续培养，144-168小时后统计囊胚率；（6）将步骤（5）中获得的囊胚用冷冻基础液洗涤3遍，在添加ApAFP的冷冻液VS1中平衡5分钟，在添加ApAFP914的冷冻液VS2中处理30秒，装入细管中投入液氮。
通过上述方法获得的冷冻胚胎在解冻液1中处理5分钟，再在解冻液2中处理5分钟，放入体外培养液IVC内培养4小时，统计解冻后的胚胎存活率，效果极其显著。
其中ApAFP914的制备：
将已构建好的含光滑鳖甲抗冻蛋白基因Apafp914（GenBankno.GU358704）的重组质粒pET28a-Apafp914转化EscherichiacoliBL21(DE3)。转化菌在0.8mMIPTG诱导下表达融合蛋白。经SDS-PAGE分析表明重组蛋白ApAFP914在E.coliBL21(DE3)中以包涵体形式高效表达。菌体超声裂解的沉淀经2%TritonX-100、0.2%脱氧胆酸和2M尿素洗涤后，溶解于8M脲中经Ni-NTA亲和层析纯化后，在复性液（20mMTris-HCl，1mMEDTA，0.2mM还原型谷胱甘肽GSH，0.02mM谷胱甘肽GSSG，pH8.0）中于4℃缓慢复性。复性液经浓缩后上凝胶过滤层析Superdex75纯化后，获得了高纯度的His-ApAFP914，分子量约为20kDa。纯化的His-ApAFP914经过SDS-PAGE鉴定和免疫印迹分析。用于低温保护分析测定的蛋白浓度初始浓度为0.1mg/mL。
其中实验液体的配置：
抽卵液：TCM199-hepes+1mg/mlPVA+0.7mg／ml肝素钠；
体外成熟液（IVM）：TCM199-HCO3+10%FBS+0.05IU/mlFSH+0.05IU/mlLH+1μg/ml雌二醇＋24.2μg/ml丙酮酸钠+100IU/ml青霉素+100IU/ml链霉素；
体外受精液(IVF)：SOF+20%FBS+6IU/ml肝素钠+100IU/ml庆大霉素；
体外培养液（IVC）：SOF+3mg/mlBSA；
其中所述合成输卵管液（SOF）：6.29mg/mlNaCL+0.534mg/mlKCL+0.162mg/mlKH2PO4+0.6μl/ml乳酸钠+0.089mg/mlMgSO4+2.1mg/mlNaHCO3+0.0357mg/ml丙酮酸钠+0.299mg/mlCaCL2·2H2O。
冷冻基础液：TCM199-hepes+10%FBS
冷冻液VS1：TCM199-hepes+10%EG+10%DMSO+5μg/mlApAFP914
冷冻液VS2：TCM199-hepes+20%EG+20%DMSO+5μg/mlApAFP914
对照组的冷冻液为不含ApAFP914的VS1和VS2。
解冻液1：TCM199-hepes+10%FBS+0.5mol/l蔗糖
解冻液2：TCM199-hepes+10%FBS+0.25mol/l蔗糖
实验结果及数据验证：用一组数据验证添加ApAFP914的有效性。
表1
组别 冷冻囊胚数（枚） 解冻后存活囊胚数（枚） 存活率（%）
对照组 127 103 81.1a
ApAFP 914 128 117 91.41b
注：同列不同字a-b差异极显著（P＜0.05）。
结论：上表结果表明：冷冻液中添加5μg/mlApAFP914能显著提高绵羊体外胚胎冷冻后的存活率。

Claims (1)

1.一种利用重组光滑鳖甲抗冻蛋白对绵羊体外胚胎进行冷冻保护的方法，其特征在于：该方法包括步骤如下：
（1）获取宰杀后30分钟以内的绵羊卵巢，置入温度在30-35℃，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml链霉素的生理盐水中，3小时内用生理盐水清洗3-4次；
（2）然后，用吸有2ml抽卵液的注射器抽吸卵巢表面2-5mm大小的卵泡，将注射器内回收的卵泡液置于器皿中，在显微镜下捡出卵母细胞，用体外成熟液洗涤3-5次，备用；
（3）将步骤（2）中捡出的卵母细胞，在条件为5%CO2，95%空气，温度为38.6℃的CO2培养箱内培养22-24小时，用绵羊体外受精液洗涤2-4次，按25-30枚/滴的密度加入装有体外受精液的液滴内，备用；
（4）将解冻后的冻精，加入装有体外受精液的试管底部，CO2培养箱内上游20-25分钟，取上层精子混悬液，以1500转/分钟的转速离心4-5分钟，然后弃去上清液，用剩余的精子沉淀进行密度计算，按2-4×106个/ml的密度加入步骤（3）的体外受精液滴中与卵母细胞共同孵育；
（5）将步骤（4）中受精20-22小时的早期胚胎取出，移至体外培养液IVC内洗涤3-4次，并再次培养24-26小时，将未卵裂卵母细胞剔除，统计卵裂率，并继续培养，144-168小时后统计囊胚率；
（6）将步骤（5）中获得的囊胚用冷冻基础液洗涤3遍，在添加ApAFP的冷冻液VS1中平衡5分钟，在添加ApAFP914的冷冻液VS2中处理30秒，装管进行液氮保存即可。
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