CN113133446A - 一种外周血单个核细胞冻存液、配制及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种外周血单个核细胞冻存液、配制及使用方法，包括A液和B液，所述A液包括自体血浆、人血白蛋白、海藻糖和IL‑2；所述B液包括右旋糖苷和DMSO，所述A液和B液的占比为(80‑90V％)：(10‑20V％)，所述A液中自体血浆0‑100V％、人血白蛋白0‑100V％、海藻糖0‑0.4mg/mL和IL‑2 0‑5000IU/mL；所述B液中右旋糖苷0‑50V％和DMSO 50‑100V％。本发明属于生物技术领域，具体是指一种安全可靠、细胞复苏活力高的外周血单个核细胞冻存液、配制及使用方法。

Description

一种外周血单个核细胞冻存液、配制及使用方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是指一种外周血单个核细胞冻存液、配制及使用方法。

背景技术

外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，是指外周血中具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞(T\B\NK)，单核细胞、吞噬细胞、树突状细胞和其它少量细胞类型。现有技术可将分离的PBMC在不同刺激因子的作用下培养成具有不同生物学功能的效应细胞(例如DC、CIK、NK、CD3AK、γδT等细胞)，将健康的PBMC提前冻存起来，当身体出现免疫低下或其他症状时，将冻存的PBMC复苏后诱导扩增制备目标细胞，回输目标细胞，可以调节免疫力、抗衰老保健以及治疗疾病。此外，冷冻保存PBMC还可以解决现阶段免疫细胞诱导应用时需要多次采血且采集价格昂贵等问题。

目前细胞的长期保存主要是应用液氮冷冻保存法。通常情况下，液体冻结时会对细胞造成损伤，其中，一种情况是由于不适当的降温和复温导致细胞内形成冰晶和重结晶；另一种情况是由于冷冻使得电解质和溶质浓度升高所导致的溶质损伤。

现有细胞冻存液多采用10％的DMSO与90％的胎牛血清，但由于此浓度DMSO仍具有相当的毒性，细胞复苏后如DMSO去除不净会对病人身体不利。使用胎牛血清如果去除不当亦容易引起动物来源的病毒污染；而且此种冻存液冻存的细胞存活率以及细胞活性较低，直接制约冻存细胞的临床应用。

发明内容

为了解决上述难题，本发明提供了一种安全可靠、细胞复苏活力高的外周血单个核细胞冻存液、配制及使用方法。

为了实现上述功能，本发明采取的技术方案如下：一种外周血单个核细胞冻存液，包括A液和B液，所述A液包括自体血浆、人血白蛋白、海藻糖和IL-2；所述B液包括右旋糖苷和DMSO。

优选的，所述右旋糖苷为右旋糖苷40葡萄糖溶液。

优选的，所述自体血浆为自体灭活血浆。

优选的，所述A液和B液的占比为(80-90V％)：(10-20V％)。

优选的，所述A液中自体血浆0-100V％、人血白蛋白0-100V％、海藻糖0-0.4mg/mL和IL-2 0-5000IU/mL；所述B液中右旋糖苷0-50V％和DMSO 50-100V％。

优选的，所述每10mL细胞冻存液中包括A液8mL和B液2mL；其中A液中自体血浆4mL、人血白蛋白4mL、海藻糖3mg和IL-2 20000IU，B液中右旋糖苷40葡萄糖溶液1ml和DMSO 1mL。

本发明还包括一种外周血单个核细胞冻存液的配置方法，包括如下步骤：

1)取4mL自体血浆于50ml离心管中；

2)依次加入4mL人血白蛋白、3mg海藻糖和20000IU IL-2，吹打混匀即为A液；

3)取1mL DMSO溶液缓慢加入到1mL右旋糖苷40葡萄糖溶液中即为B液；

4)将B液置于4℃冰箱中预冷。

外周血单个核细胞冻存液的使用方法为现配现用。

本发明还包括一种外周血单个核细胞冻存液的使用方法，包括如下步骤：

1)用配好的A液重悬外周血单个核细胞，进行吹打混匀；

2)将4℃预冷的B液逐滴加入到含有细胞的A液中，滴加B液的时候，边加边摇。

本发明采取上述结构取得有益效果如下：本发明提供的一种外周血单个核细胞冻存液、配制及使用方法，选用自体血浆、人血白蛋白、右旋糖苷作为细胞的营养支持组分，保证细胞养分及维持良好的渗透压环境；选用渗透性及非渗透性保护剂DMSO、海藻糖联合，维持细胞稳定性，降低细胞毒性，提高复苏成活率；添加重组人白介素-2，提高复苏后培养目标细胞的活性和稳定性。同时自体血浆和人血白蛋白替代胎牛血清作为细胞的营养来源，还可以避免动物来源的病毒污染；此外，人血白蛋白中有存在大量高分子蛋白质，可形成水化膜，降低在冻存过程中形成的冰晶数量，继而可以降低细胞的机械损伤、死亡；而右旋糖苷在温度下降过程中，仍能保持良好的渗透环境，可以避免因温度下降、渗透压改变而引起细胞的死亡，进而提高长时间冻存复苏后的细胞活率。海藻糖是一种典型应激代谢物，能够在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面形成独特的保护膜，有效地保护生物分子结构不被破坏，从而维持生命体的生命过程和生物特征。

具体实施方式

下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明一种外周血单个核细胞冻存液，包括A液和B液，所述A液包括自体血浆、人血白蛋白、海藻糖和IL-2；所述B液包括右旋糖苷和DMSO。

所述右旋糖苷为右旋糖苷40葡萄糖溶液。

所述自体血浆为自体灭活血浆。

所述A液和B液的占比为(80-90V％)：(10-20V％)。

所述A液中自体血浆0-100V％、人血白蛋白0-100V％、海藻糖0-0.4mg/mL和IL-20-5000IU/mL；所述B液中右旋糖苷0-50V％和DMSO 50-100V％。

所述每10mL细胞冻存液中包括A液8mL和B液2mL；其中A液中自体血浆4mL、人血白蛋白4mL、海藻糖3mg和IL-2 20000IU，B液中右旋糖苷40葡萄糖溶液1ml和DMSO 1mL。

本发明还包括一种外周血单个核细胞冻存液的配置方法，包括如下步骤：

1)取4mL自体血浆于50ml离心管中；

2)依次加入4mL人血白蛋白、3mg海藻糖和20000IU IL-2，吹打混匀即为A液；

3)取1mL DMSO溶液缓慢加入到1mL右旋糖苷40葡萄糖溶液中即为B液；

4)将B液置于4℃冰箱中预冷。

外周血单个核细胞冻存液的使用方法为现配现用。

本发明还包括一种外周血单个核细胞冻存液的使用方法，包括如下步骤：

1)用配好的A液重悬外周血单个核细胞，进行吹打混匀；

2)将4℃预冷的B液逐滴加入到含有细胞的A液中，滴加B液的时候，边加边摇。

实施例1

一种外周血单个核细胞冻存液，包括A液和B液两种成分，所述A液主要组分为自体血浆、海藻糖、IL-2；所述B液主要组分为右旋糖苷、DMSO。

所述外周血单个核细胞冻存液的制备及使用方法，包括以下步骤：

取8mL灭活自体血浆于50mL离心管中，依次加入3mg海藻糖和10000IU IL-2，吹打混匀即为A液；

取1mL DMSO溶液缓慢加入到1mL右旋糖苷40葡萄糖溶液中即为B液，将B液置于4℃冰箱中预冷。

一种外周血单个核细胞冻存液的使用方法为现配现用，具体的为用配好的A液重悬PBMC，吹打混匀后逐滴加入4℃预冷的B液。滴加B液的时候注意缓慢摇匀，边加边摇。

实施案例2：

一种外周血单个核细胞冻存液，包括A液和B液两种成分，所述A液主要组分为自体血浆、人血白蛋白、海藻糖、IL-2；所述B液主要组分为右旋糖苷、DMSO。

所述外周血单个核细胞冻存液的制备及使用方法，包括以下步骤：

取6mL灭活自体血浆于50mL离心管中，依次加入3mL人血白蛋白、4mg海藻糖和20000IU IL-2，吹打混匀即为A液；

取0.5mL DMSO溶液缓慢加入到0.5mL右旋糖苷40葡萄糖溶液中即为B液，将B液置于4℃冰箱中预冷。

一种外周血单个核细胞冻存液的使用方法为现配现用，具体的为用配好的A液重悬PBMC，吹打混匀后，将4℃预冷的B液逐滴加入到含有细胞的A液中。滴加B液的时候注意缓慢摇匀，边加边摇。

以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种外周血单个核细胞冻存液，其特征在于：包括A液和B液，所述A液包括自体血浆、人血白蛋白、海藻糖和IL-2；所述B液包括右旋糖苷和DMSO。

2.根据权利要求1所述的一种外周血单个核细胞冻存液，其特征在于：所述右旋糖苷为右旋糖苷40葡萄糖溶液。

3.根据权利要求2所述的一种外周血单个核细胞冻存液，其特征在于：所述自体血浆为自体灭活血浆。

4.根据权利要求3所述的一种外周血单个核细胞冻存液，其特征在于：所述A液和B液的占比为(80-90V％)：(10-20V％)。

5.根据权利要求4所述的一种外周血单个核细胞冻存液，其特征在于：所述A液中自体血浆0-100V％、人血白蛋白0-100V％、海藻糖0-0.4mg/mL和IL-2 0-5000IU/mL；所述B液中右旋糖苷0-50V％和DMSO 50-100V％。

6.根据权利要求5所述的一种外周血单个核细胞冻存液，其特征在于：所述每10mL外周血单个核细胞冻存液中包括A液8mL和B液2mL；其中A液中自体血浆4mL、人血白蛋白4mL、海藻糖3mg和IL-2 20000IU，B液中右旋糖苷40葡萄糖溶液1ml和DMSO 1mL。

7.一种外周血单个核细胞冻存液的配置方法，包括如下步骤：

1)取4mL自体血浆于50ml离心管中；

2)依次加入4mL人血白蛋白、3mg海藻糖和20000IU IL-2，吹打混匀即为A液；

3)取1mL DMSO溶液缓慢加入到1mL右旋糖苷40葡萄糖溶液中即为B液；

4)将B液置于4℃冰箱中预冷。

8.一种外周血单个核细胞冻存液的使用方法，包括如下步骤：

1)用配好的A液重悬外周血单个核细胞，进行吹打混匀；

2)将4℃预冷的B液逐滴加入到含有细胞的A液中，滴加B液的时候，边加边摇。