JP7355368B2 - 哺乳動物初期胚の凍結保存方法 - Google Patents

Description

本発明は、凍結保存後の哺乳動物初期胚を融解する方法や、凍結保存された哺乳動物初期胚を含む胚移植用キットに関する。

哺乳動物において、雌の生殖器から回収した受精卵（初期胚）や体外受精によって作製した胚を、レシピエント（受卵動物）に移植する胚移植技術は広く普及している。この技術において、胚は、レシピエントの性周期に応じた時期に移植する必要があるため、生存性や機能を低下させずに胚を凍結保存する技術が必要とされる。現在までに、胚の凍結保存として、緩慢法（非特許文献１）、ガラス化法（非特許文献２）、超急速ガラス化法（非特許文献３）等が知られている。

ガラス化法とは、グリセロールやエチレングリコール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などの耐凍剤を多量に含む水溶液の凝固点降下により、氷点下でも氷晶が形成されにくくなる原理を用いたものである。この水溶液を急速に液体窒素中で冷却させると氷晶が形成されないまま固体化させることができる。また、超急速ガラス化法とは、胚を少量のガラス化液とともに液体窒素に浸漬するという方法である。ガラス化保存法を用いると、細胞内外の何れにも氷晶が生じないために凍結時及び融解時の細胞への物理的障害（凍害）を回避することができるが、ガラス化液に含まれる耐凍剤には化学的毒性があり、細胞の凍結保存時にはガラス化液が少ない方が好ましく、さらには解凍後ただちにガラス化液を希釈する必要がある。

これらガラス化保存法を用いた卵子、胚の凍結保存法としては様々なものが提案されている。例えば、特許文献１及び２には、ストローにガラス化液を充満させた中で卵子又は胚をガラス化保存させ、解凍時に素早く希釈液と接触させて再生率を向上させる試みがなされている。また、特許文献３には、卵子又は胚の周囲に付着した余分なガラス化液を濾紙などの吸収体により吸収させることにより、優れた生存性で凍結保存させる方法が開示されている。さらに、特許文献４及び５では、人の不妊治療分野で使用されているクライオトップ法という方法で、卵付着保持用ストリップとして短冊状の可撓性かつ無色透明なフィルムを使用し、該フィルム上にごく少量のガラス化液と共に卵子又は胚を顕微鏡下で付着させ、凍結保存する方法が開示されている。

しかし、クライオトップ法は一度に１０個以下の少数の胚しか凍結保存できないこと、また、使用する器具が高額であるという問題点があり、ラット等の実験動物で使用することは実用的ではない。このため、胚の生存率や機能を維持しながら、より大量の胚を安価で凍結保存するための技術の開発が求められていた。

特開平５－１７６９４６号公報 特開平１０－２４８８６０号公報 特開２００５－４００７３号公報 特開２００２－３１５５７３号公報 特開２００６－２７１３９５号公報

Whittingham DG, Leibo SP, Mazur P: Survival of mouse embryos frozen to -196and -269℃, Science, 178, 411-141 (1972) Rall WF, Fahy GM: Ice-free cryopreservation ofmouse embryos at -196℃ by vitrification,Nature, 313, 573-575 (1985) Martino A, SongsasenN, Leibo SP: Development into blastocysts of bovineoocytes cryopreserved by ultra-rapid cooling, Biol Reprod, 54, 1059-1069 (1996)

本発明の課題は、クライオチューブ内で凍結保存された哺乳動物初期胚を、その生存率や質（例えば、胚発生能）を低下させることなく融解する方法を提供することにある。

本発明者らは、以前より上記課題を解決すべく鋭意研究を重ね、凍結保存された哺乳動物初期胚の融解速度が、融解後の胚の生存率及び質に大きな影響を及ぼす可能性を示唆してきた（Seki S and Mazur P, Cryobiology and Cryotechnology， 62, No. 2, 105-108, 2016、Seki S et al.Cryobiology, 81, 132-137, 2018）。しかし、当該技術分野においては、初期胚を含む動物細胞は、タンパク質の変性等を防ぐために生体内での温度（３７～３９度程度）以下の条件下で操作しなければならないと信じられており、上記文献においても、本発明者らは、融解速度を高めるために２３℃又は３７℃の溶液を使用するに留まっていた。

一方、本研究において、本発明者らは凍結保存されたラット及びウサギの１細胞期胚を、５０℃という高温の融解用液を用いて急速融解することより、いずれの動物種においても融解後の生存率、卵割率、及び／又は発生率が向上するという予想外の実験結果を得た。本発明の融解工程においては、ラット及びウサギの１細胞期胚は一時的に５０℃近い高温になるが、それでも、急速融解により胚の質が維持されたことは、当業者にとって驚くべきことである。本発明は、以上のような予想外の知見に基づいて、はじめて完成されたものである。

すなわち、本発明は、（１）凍結状態の哺乳動物初期胚を４０～６０℃の融解用液と接触させる融解工程を含む、凍結保存後の前記哺乳動物初期胚を融解する方法や、（２）融解用液が５０℃である、上記（１）に記載の方法や、（３）融解用液がスクロースを含む溶液である、上記（１）又は（２）に記載の方法や、（４）哺乳動物初期胚が、ガラス化されたものである、上記（１）～（３）のいずれかに記載の方法や、（５）哺乳動物初期胚が、クライオチューブ内で凍結保存されている、上記（１）～（４）のいずれかに記載の方法や、（６）哺乳動物が、ラット又はウサギである、上記（１）～（５）のいずれかに記載の方法や、（７）初期胚が、１細胞期胚である、上記（１）～（６）のいずれかに記載の方法や、（８）凍結保存後の哺乳動物初期胚の生存率及び／又は発生率を改善するための、上記（１）～（７）のいずれかに記載の方法に関する。

また、本発明は、（９）凍結状態の哺乳動物初期胚を４０～６０℃の融解用液と接触させる融解工程を行う旨が記載された説明書が共にパッケージされた、凍結保存された哺乳動物初期胚を含む胚移植用キットや、（１０）５０℃の融解用液と接触させる融解工程を行う旨が記載された説明書が共にパッケージされた、上記（９）に記載のキットや、（１１）スクロースを含む融解用液をさらに備える、上記（９）又は（１０）に記載のキットや、（１２）哺乳動物初期胚が、ガラス化されたものである、上記（９）～（１１）のいずれかに記載のキットや、（１３）哺乳動物初期胚が、クライオチューブ内で凍結保存されている、上記（９）～（１２）のいずれかに記載のキットや、（１４）哺乳動物が、ラット又はウサギである、上記（９）～（１３）のいずれかに記載のキットや、（１５）初期胚が、１細胞期胚である、上記（９）～（１４）のいずれかに記載のキットに関する。

本発明によれば、クライオトップよりも安価なクライオチューブを用いて、哺乳動物初期胚を大量に凍結保存することが可能となる。

本発明のラット又はウサギ１細胞期胚の凍結方法の概略を示す図である。 本発明のラット又はウサギ１細胞期胚の融解方法の概略を示す図である。 凍結ラット胚の生存率及び卵割率に及ぼす融解速度の影響を示す図である。 凍結ウサギ胚の卵割率及び胚盤胞期までの発生率に及ぼす融解速度の影響を示す図である。

本発明の「凍結保存後の哺乳動物初期胚を融解する方法」としては、凍結状態の哺乳動物初期胚を４０～６０℃の融解用液と接触させる融解工程を含むものであれば特に制限されない（以下、かかる方法を、「本発明の方法」と称する場合がある）。上記本発明の方法は、凍結保存後の哺乳動物初期胚の生存率及び／又は発生率を改善するために用いることができ、ここで「生存率及び／又は発生率を改善する」とは、融解工程において生じる哺乳動物初期胚への物理的又は機能的な損傷を軽減し、融解後の初期胚における（ｉ）生存率、（ii）卵割率、（iii）胚盤胞期までの発生率、又は（iv）受胎率の低下を抑制若しくは防止することを意味する。上記「哺乳動物初期胚」としては、ラット、ウサギ、マウス、ウシ、ブタ、ハムスター、イヌ、サル、ヤギ、ネコ、ヒツジ等の非ヒト哺乳動物由来の初期胚、及び／又はヒト由来の初期胚であれば特に制限されないが、非ヒト哺乳動物由来の初期胚であることが好ましく、ラット又はウサギ由来の初期胚であることがさらに好ましい。また、上記「初期胚」としては、１細胞期胚から胚盤胞段階までの発生初期段階の胚であればどのようなものであってもよいが、１細胞期胚（通常、胚発生開始後１６時間以内）、２細胞期胚（通常、胚発生開始後１６～２４時間の範囲内）、４細胞期胚（通常、胚発生開始後約４８時間）、又は８細胞期胚（通常、胚発生開始後約７２時間）であることが好ましく、１細胞期胚であることが特に好ましい（以下、かかる哺乳動物初期胚を単に「胚」と称する場合がある）。

本発明の方法に用いる「胚」は、緩慢法、ガラス化法、超急速ガラス化法などの公知の方法で凍結保存されたものであれば特に制限されない。ここで、「緩慢法」とは、比較的低濃度の凍結保護剤を含む保存液中で、胚を０．３～０．５℃／分の速度で－３０℃前後まで冷却した後に、液体窒素に浸漬して凍結する方法であり、大がかりな装置を用いることなく凍結保存後の胚を融解することが可能であるが、冷却過程において、細胞外に氷晶が形成され、この氷晶が胚に物理的な損傷を与えるため、胚の生存性及び受胎率が低くなる傾向があることが知られている。一方、「ガラス化法」とは、高濃度の凍結保護剤を含む保存液（ガラス化液）を用いて、胚を液体窒素に浸漬して液体窒素の温度まで急速に冷却する方法であり、また、「超急速ガラス化法」とは、胚を少量のガラス化液と共に液体窒素に浸漬する方法であり、これらの方法では、細胞内外での氷晶の形成を抑制して、細胞の内外をガラス化する方法であり、緩慢法と比較して胚の生存性及び受胎率を高く保つことができる。

したがって、本発明の方法に用いる「胚」は、ガラス化法又は超急速ガラス化法により凍結保存された胚、すなわち、細胞内に凍結保護剤が浸透するように処理された、ガラス化された胚であることが特に好ましい。上記「ガラス化液」としては、例えば、エチレングリコール、フィコール、スクロース、グリセロール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、プロピレングリコール（１，２－プロパンジオール）等の凍結保護剤を単独又は組み合わせて含有する溶液であれば特に制限されないが、エチレングリコール、フィコール、及びスクロースを組み合わせて含有するＥＦＳ溶液を特に好適に挙げることができる。また、上記「ガラス化された胚」は、上記ガラス化液に浸漬又は懸濁された状態で、クライオチューブ（低温チューブ）、クライオトップ、クライオストロー（低温ストロー）、クライオバッグ（低温バッグ）等の凍結保存用容器中に保存されていることが好ましく、クライオチューブ又はクライオトップ中に保存されていることがより好ましく、クライオチューブ中に保存されていることが特に好ましい。

本発明の方法における「融解工程」は、上記凍結保存方法によって凍結状態にある胚を、４０～６０℃の範囲内に保持された融解用液と接触させて、急速融解することを特徴とする。上記「融解用液」の温度としては、４０～６０℃の範囲内であれば特に制限されないが、例えば、４２～６０℃、４５～６０℃、４７～６０℃、４２～５７℃、４５～５７℃、４７～５７℃、４２～５５℃、４５～５５℃、４７～５５℃、４２～５３℃、４５～５３℃、４７～５３℃、４８～５２℃、４８～５１℃、４９～５１℃等の範囲であることが好ましく、４７、４８、４９、５０、５１、５２、又は５３℃であることがより好ましく、５０℃であることがさらに好ましい。また、上記融解工程における融解速度としては、例えば、６，８００℃／分以上であることが好ましく、７，２００℃／分以上であることがより好ましく、７，５００℃／分以上であることがさらに好ましく、７，８００℃／分以上であることが特に好ましい。

上記融解用液としては、「凍結状態の哺乳動物初期胚を融解するため」という用途に特定された液であれば特に制限されず、哺乳動物初期胚の生存が可能な液（例えば、等張液、低張液、高張液）であればよく、等張液を好適に例示することができる。本明細書において「等張液」とは、体液や細胞液の浸透圧とほぼ同じ浸透圧を有する液を意味し、具体的には、２５０～３８０ｍＯｓｍ／Ｌの範囲内の浸透圧を有する液を意味する。また、本明細書において「低張液」とは、体液や細胞液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する液を意味し、具体的には、２５０ｍＯｓｍ／Ｌ未満の浸透圧を有する液を意味する。かかる低張液としては、細胞が破裂しない程度の低張液（具体的には、１００～２５０ｍＯｓｍ／Ｌ未満の範囲内の浸透圧を有する液）が好ましい。また、本明細書において「高張液」とは、体液や細胞液の浸透圧よりも高い浸透圧を有する液を意味し、具体的には、浸透圧が３８０ｍＯｓｍ／Ｌ超（好ましくは３８０ｍＯｓｍ／Ｌ超～１０００ｍＯｓｍ／Ｌの範囲内）を意味する。

上記等張液としては、体液や細胞液の浸透圧とほぼ同じになるようにナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン等によって塩濃度や糖濃度等を調整した等張液であれば特に制限されず、具体的には生理食塩水や、緩衝効果のある生理食塩水（例えば、ＰＢＳ、トリス緩衝生理食塩水［Tris BufferedSaline；ＴＢＳ］、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水）、リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液、５％グルコース水溶液、動物細胞培養液（例えば、ＰＢ１、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｆ－１０、Ｍ－１９９）、等張剤（例えば、ブドウ糖、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、ラクトース、塩化ナトリウム）等を挙げることができ、後述する本実施例において、その効果が実証されているため、ＰＢ１が好ましい。等張液は、市販のものであっても、自ら調製したものであってもよい。

上記融解用液としては、スクロース又はトレハロースを含むものが好ましく、かかるスクロースやトレハロースの濃度としては、例えば、０．２～０．７Ｍの範囲内、好ましくは、約０．５Ｍ（０．４～０．６Ｍの範囲内）である。

上記融解工程において「胚を４０～６０℃の融解用液と接触させる」方法としては、例えば、クライオチューブ内で凍結保存された胚を用いる場合には、該クライオチューブを液体窒素から取り出し、３０～６０秒、好ましくは約６０秒間室温に置き、次に、上記胚を含む凍結液（例えば、ガラス化液）の１０～３００倍量、好ましくは２００倍量の所定温度の融解用液を、上記クライオチューブに注入して胚を急速融解し、その後、３７℃以下の温度に保持した融解用液等で胚を洗浄すればよい。また、例えば、クライオトップ内で凍結保存された胚を用いる場合には、該クライオトップを液体窒素から取り出し、所定温度の融解用液中に直ちに浸漬することにより胚を急速融解し、その後、３７℃以下の温度に保持した融解用液等で胚を洗浄すればよい。かかる工程において、胚は一時的に４０～６０℃という高温に曝されるが、それにも関わらず、融解後の胚の生存率や機能は高いまま維持される（以下の実施例を参照のこと）。

さらに、本発明は、凍結保存された哺乳動物初期胚を含む胚移植用キットにも関する。かかるキットは、凍結状態の上記胚を４０～６０℃の融解用液と接触させる融解工程を行う旨が記載された説明書が共にパッケージされたものであれば特に制限されないが、上記融解用液をさらに備えるものであることが好ましい。本発明のキットに含まれる胚はガラス化されたものであることが好ましく、また、かかる胚はクライオチューブ内で凍結保存されていることが特に好ましい。具体的には、本発明のキットとしては、１～１００個、５０～１００個、２５～５０個、１０～５０個、５～２０個、７～１５個、又は５～１０個の胚、好ましくは、１００、７５、５０、３０、２０、１０、又は５個の胚が凍結保存されたクライオチューブを備えたものであって、かかる胚が３～１００μＬ、５～７５μＬ、５～５０μＬ、５～２５μＬ、又は１０～２０μＬのガラス化液、好ましくは、３、５、１０μＬのガラス化液に懸濁された状態で凍結保存されているキットを好適に挙げることができる。また、本発明のキットに使用される融解用液は、上記クライオチューブとは別の容器に保存されていることが好ましく、その量は、上記ガラス化液の１０～３００倍量であることが好ましく、２００倍量であることがより好ましい。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない

（１）ラット１細胞期胚の凍結融解
（１－１）１細胞期胚の採取
発情期後期の成熟雌ラット（９－１６週齢）に、１５０ ＩＵ／ｋｇのＰＭＳＧを腹腔内投与し、さらに４８時間後に、７５ ＩＵ／ｋｇのｈＣＧを腹腔内投与した。その後、雄ラットと自然交配させ、ｈＣＧ投与から２４時間後に、０．１％のヒアルロニダーゼを含むＭ２培地を用いた卵管灌流により、受精卵（１細胞期胚）を回収した。回収後の１細胞期胚は、Ｍ２培地で洗浄した後に、０．５ｍｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼを含むＭ２培地で懸濁することによって、卵丘細胞を除去した。以下、ここで得られたラット１細胞期胚を単に「ラット胚」と称する場合がある。

（１－２）ラット胚のガラス化保存
図１に示す方法に従って、上記（１－１）で得られたラット胚をガラス化保存した。具体的には、上記ラット胚を、７．５％又は１０％のエチレングリコール（ＥＧ）を含む耐凍剤液中（３０μＬのドロップ）に浸漬して、２３℃で５～１０分間インキュベートした。インキュベート後の胚を回収して、さらに、ガラス化保存液であるＥＦＳ４０溶液中［４０％（ｖ／ｖ）エチレングリコール、１８％（ｗ／ｖ）フィコール７０，及び０．３Ｍスクロースを含むＰＢ１液］（３０μＬのドロップ）中に浸漬した。そして、胚を含む５μＬのＥＦＳ４０溶液をクライオチューブ（凍結保存関連製品セラムチューブ、住友ベークライト株式会社製）に移してキャップをした。これらのラット胚とＥＦＳ４０溶液とを接触させる工程は、２３℃で合計１分となるように行った。キャップを閉めたクライオチューブを液体窒素に直接浸漬して、ガラス化したラット胚凍結し、以下の実験まで液体窒素中で保存した。

（１－３）ラット胚の融解
図２に示す方法に従って、上記（１－２）で凍結保存したラット胚を融解した。具体的には、０．５Ｍのスクロースを含むＰＢ１液（以下、「スクロース液」と称する場合がある）を調製して、２３℃、３７℃、及び５０℃の３つの温度のスクロース液を用意した。そして、上記クライオチューブを液体窒素から取り出してキャップを外し、チューブ内の液体窒素を捨てた後に、１ｍＬの上記スクロース液（２３℃、３７℃、又は５０℃）を各チューブに加えて、ラット胚を融解した。２３℃、３７℃、及び５０℃のスクロース液を用いた場合の融解速度、及び融解に要する時間（カッコ内に記載）はそれぞれ、４，６００℃／分（０．６秒）、６，６００℃／分（０．４秒）、７，８００℃／分（０．３秒）であった。融解したラット胚を、２３℃のスクロース液中（３０μＬのドロップ）に５分間浸した後に回収し、ＨＴＦ（１００μＬのドロップ）で培養した。１日間培養後のラット胚の生存率及び卵割率を測定した（ｎ＝３）。

（１－４）ラット胚の生存率及び卵割率に及ぼす融解速度の影響
上記（１－３）により得られた結果を図３に示す。図３に示されるように、融解に要する時間が０．６秒であった群（融解温度が２３℃）では、ラット胚の生存率は２０％以下であり、卵割率はほぼ０％であった。また、融解に要する時間が０．４秒であった群（融解温度が３７℃）では、ラット胚の生存率は５０％程度まで上昇したが、卵割率は５％程度と低い水準であった。一方、融解に要する時間が０．３秒であった群（融解温度が５０℃）では、ラット胚の生存率及び卵割率はともに１００％に近く、無処理群（凍結融解をしていない新鮮ラット１細胞期胚）と同程度の高いレベルであった。
以上の結果から、融解速度が凍結ラット胚の生存性や機能に大きな影響を及ぼすことが明らかとなった。また、５０℃のスクロース液を用いて凍結ラット胚を急速融解（７，８００℃／分）することによって、新鮮胚と同等の高い生存率及び卵割率を維持できることが明らかとなった。

（２）ウサギ１細胞期胚の凍結融解
（２－１）１細胞期胚の採取
発情期後期の成熟雌ウサギ（１６－２０週齢）に、１５０ ＩＵ／ｋｇのＰＭＳＧを腹腔内投与し、さらに７２時間後に、１００ ＩＵ／ｋｇのｈＣＧを腹腔内投与した。その後、採取したウサギ精子を用いて人工授精を施し、ｈＣＧ投与１６時間後に、１０％ＦＢＳを含む１９９培地（ＦＢＳ－１９９）を用いた卵管灌流により、受精卵（１細胞期胚）を回収した。回収後の１細胞期胚は、上記１９９培地で洗浄した後に、懸濁することによって、卵丘細胞を除去した。以下、ここで得られたウサギ１細胞期胚を単に「ウサギ胚」と称する場合がある。

（２－２）ウサギ胚のガラス化保存
図１に示す方法に従って、上記（２－１）で得られたウサギ胚をガラス化保存した。具体的には、上記ウサギ胚を、７．５％又は１０％のエチレングリコール（ＥＧ）を含む耐凍剤液中（３０μＬのドロップ）に浸漬して、２３℃で５～１０分間インキュベートした。インキュベート後の胚を回収して、さらに、ガラス化保存液であるＥＦＳ３０溶液中［３０％（ｖ／ｖ）エチレングリコール、２１％（ｗ／ｖ）フィコール７０、及び０．３５Ｍスクロースを含むＰＢ１液］（３０μＬのドロップ）中に浸漬した。そして、胚を含む５μＬのＥＦＳ３０溶液をクライオチューブ（凍結保存関連製品セラムチューブ、住友ベークライト株式会社製）に移してキャップをした。これらのウサギ胚とＥＦＳ３０溶液とを接触させる工程は、２３℃で合計１分となるように行った。キャップを閉めたクライオチューブを液体窒素に直接浸漬して、ガラス化したウサギ胚凍結し、以下の実験まで液体窒素中で保存した。

（２－３）ウサギ胚の融解
図２に示す方法に従って、上記（２－２）で凍結保存したウサギ胚を融解した。具体的には、０．５Ｍのスクロースを含むＰＢ１液（以下、「スクロース液」と称する場合がある）を調製して、２３℃、３７℃、及び５０℃の３つの温度のスクロース液を用意した。そして、上記クライオチューブを液体窒素から取り出してキャップを外し、チューブ内の液体窒素を捨てた後に、２３℃、３７℃、又は５０℃のスクロース液をチューブに加えて、ウサギ胚を融解した。２３℃、３７℃、及び５０℃のスクロース液を用いた場合の融解速度、及び融解に要する時間（カッコ内に記載）はそれぞれ、４，６００℃／分（０．６秒）、６，６００℃／分（０．４秒）、７，８００℃／分（０．３秒）であった。融解したウサギ胚を、２３℃のスクロース液中（３０μＬのドロップ）に５分間浸した後に回収し、１０％ＦＢＳを含むM１９９培地中（２００μＬのドロップ）で培養した。５日間培養後のウサギ胚の卵割率及び胚盤胞期までの発生率を測定した（ｎ＝２）。

（２－４）ウサギ胚の生存率及び発生率に及ぼす融解速度の影響
上記（２－３）により得られた結果を図４に示す。図４に示されるように、融解に要する時間が０．６秒であった群（融解温度が２３℃）では、ウサギ胚の卵割率は４０％程度であり、胚盤胞期までの発生率は２０％以下であった。また、融解に要する時間が０．４秒であった群（融解温度が３７℃）では、ウサギ胚の卵割率は７０％程度であり、胚盤胞期までの発生率は５０％程度であった。一方、融解に要する時間が０．３秒であった群（融解温度が５０℃）では、ウサギ胚の卵割率は１００％程度に、胚盤胞期までの発生率は８０％以上までそれぞれ上昇し、無処理群（凍結融解をしていない新鮮ウサギ１細胞期胚）と同程度の高いレベルであった。
以上の結果から、ラットと同様に、ウサギにおいても、融解速度が凍結胚の機能に大きな影響を及ぼすことが明らかとなった。また、５０℃のスクロース液を用いて凍結ウサギ胚を急速融解（７，８００℃／分）することによって、新鮮胚と同等の高い卵割率及び胚盤胞期までの発生率を維持できることが明らかとなった。

Claims (8)

1. 凍結状態の哺乳動物初期胚を４５～５０℃の融解用液と接触させる融解工程を含む、凍結保存後の前記哺乳動物初期胚を融解する方法であって、前記融解工程における融解速度が、７，５００℃／分以上である、前記方法。
2. 融解用液が、５０℃である、請求項１に記載の方法。
3. 融解用液が、スクロースを含む液である、請求項１又は２に記載の方法。
4. 哺乳動物初期胚が、ガラス化されたものである、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
5. 哺乳動物初期胚が、クライオチューブ内で凍結保存されている、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
6. 哺乳動物が、ラット又はウサギである、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
7. 初期胚が、１細胞期胚である、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
8. 凍結保存後の哺乳動物初期胚の生存率及び／又は発生率を改善するための、請求項１～７のいずれかに記載の方法。