JPH056983B2 - - Google Patents
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- JPH056983B2 JPH056983B2 JP3033290A JP3033290A JPH056983B2 JP H056983 B2 JPH056983 B2 JP H056983B2 JP 3033290 A JP3033290 A JP 3033290A JP 3033290 A JP3033290 A JP 3033290A JP H056983 B2 JPH056983 B2 JP H056983B2
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Description
［産業上の利用分野］
本発明は受胎率を上げた凍結受精卵及びその調
製法に関する。また本発明はこのように保存され
た牛の受精卵を融解し、効率的に移植する方法に
関する。 ［従来の技術］ 畜産界ことに牛の繁殖の分野において、受精卵
移植はすでに実用技術として採用され実施機関お
よび受精卵移植による産子も急増している。本明
細書では牛について説明するが、実施法は他の家
畜においても同じように適用することができる。 牛の受精卵移植において、供卵牛から採取した
受精卵を凍結保存後融解して移植する凍結受精卵
移植は受卵牛（借腹牛）の発情に合わせて移植で
きるので非常に効率的である。 牛受精卵の凍結は、すでに幾つかの方法が確立
されているが、その主な工程は受精卵の選別、凍
結保護物質の添加、保存用ストローへの封入、冷
却、植氷、液体窒素への浸漬などである。また凍
結受精卵を移植する場合は、融解、凍結保護物質
除去、及び受卵牛への移植の工程が必要である。 牛受精卵の凍結・融解・移植法について最もオ
ーソドツクスな方法はステツプワイズ法とよばれ
凍結保護物質として添加したグリセリンを段階的
に稀釈して除去し、受精卵の生存性を確認したう
えで移植ストローに吸入して移植する方法であ
る。 この方法のうち武田 （Survival of cryopreserved bovine embryos
cooled at 0.5℃ or １℃／minute：Takeda，
T.R.P.Elsden and C.E.Seidel Jr. Theriogenology 23：232（1985） Cryopreservation of mouse morulae in propylene glycol or glycerol：Takeda，T. Theriogenology 27：282（1986） Deep freezing of split and intact bovine embryos：Takeda，T.W.B.Henderson and
J.F.Hasler Theriogenology 27：285（1987））の方法は、
10％（1.4モル）グリセリンを用い、−4.5℃で植
氷し、その後−32℃まで冷却したのち液体窒素へ
投入する。移植時のグリセリン除去は、6.7％、
3.3％および０％グリセリンの0.3モル蔗糖溶液に
順次、各５分間保持する。この凍結・融解法によ
る牛凍結受精卵の移植後の受胎率は50〜70％と極
めて高いことが実証されている。しかしながら、
この方法は受精卵を移植しようとする施術者に対
し、受精卵の凍結・融解の理論の熟知と卵の生存
性判定技術等を必要とし、操作が繁雑で人手も必
要とする。 一方、凍結精液のような融解後ストローから直
接移植できる方法として凍結受精卵の直接融解移
植法（鈴木達行、特公昭63−33867号）が試みら
れている。この方法は、省力的ではあるが、凍
結・融解後の受精卵の生存性が確認できず、また
グリセリン除去時に受精卵の紛失のおそれがあ
り、実際この方法による移植後の受胎率は30数％
で武田の方法の半分にも達しない。 日本における牛凍結受精卵移植の平均受胎率は
ここ数年30％前後と低迷し、実用化および普及化
の妨げとなつている。日本では家畜改良増殖法に
より受精卵移植技術者の範囲が限定されている
が、受精卵の形態も知らず、さらに凍結・融解の
理論を理解せずともこの資格を得ることができ、
このことが移植成績に多大な影響を及ぼしてい
る。今後、受精卵移植の普及を円滑に進めるため
には、移植知識と技術の向上を図つていくより
も、凍結受精卵の在存性が移植技術者により左右
されない方法の開発と移植技術の標準化が急務で
ある。 ［発明が解決しようとする課題］ 武田の方法による受胎率が極めて高いのは、植
氷温度と冷却速度および脱グリセリンの方法が受
精卵の特性に照らして極めて適切であることによ
る。一方、前述の直接融解移植法では、グリセリ
ン除去に用いる蔗糖溶液を予めストロー内に封入
しグリセリンと混合しないよう空気の層を設けて
隔離してあり、融解後グリセリンは蔗糖溶液の中
で受精卵内から脱出するが、その速度は温度によ
り左右される。このことは、受精卵の生存性に大
きく影響を及ぼす。さらに融解後に受精卵を蔗糖
の層と混合させるため施術者がストローを体温計
のごとく振つたり、あるいはストローを強くはじ
いて衝撃を与える必要がある。この際に受精卵の
位置が確認できず、ストロー先端の綿栓に付着し
たり紛失することがある。 本発明者は、融解の際の凍結保護物質の除去を
ステツプワイズ法のように自然に行わせしめる条
件について鋭意研究の結果、凍結保護物質溶液と
除去のための糖溶液をストロー内で直接重層させ
る方法を見い出し、本発明を完成させたのであ
る。 本発明によれば、融解の際、凍結保護物質除去
まで何の操作も必要としなくなるので移植者は融
解卵の移植業務にのみ専念でき、卵操作の補助者
も不要である。また、移植卵をストロー外に取り
出す必要もないので、受精卵の形態や凍結・融解
の理論について移植技術者を強制的に教育する必
要性がなくなる。このことは、凍結受精卵の移植
技術者の拡大と受胎率向上に大きく貢献する。 ［課題を解決するための手段］ 上記した課題を解決する本発明は、受精卵を凍
結の損傷から保護するために添加した凍結保護物
質溶液の除去をストロー内で自然に行わせること
により受精卵の生存性を損なわず、また融解操作
が簡易になり、さらに受精卵を紛失することなく
確実に受卵牛に移植して受胎させることができ
る。 凍結保護物質溶液除去をストロー内で行うには
予めストロー内に除去のための糖溶液を挿入し、
受精卵を含む凍結保護物質溶液との混和を防止す
るため空気の層を設けて隔離しておく必要があ
る。融解後、ストローに衝撃を与えて空気層を除
去するのが直接融解法であるが、その問題点は上
記のとおりである。したがつて、この空気層は受
精卵の凍結前には必要であるが、融解時には全く
不要のものである。 本発明者は研究の結果、意外にも凍結過程にお
いて空気層を除去することにより、受精卵の耐凍
性を損なわず、凍結保護物質の除去を自然に行わ
せしめることを発見して本発明を完成させたので
ある。 すなわち本発明は、受精卵の凍結保護物質溶液
とその除去のための糖溶液を混和することなく予
めストローに封入して、凍結保護物質の除去を自
然かつ確実に行わせしめることを特徴とする凍結
受精卵の調製方法に関する。 さらに本発明は、ストロー内で凍結保護物質を
自然かつ確実に除去して得た凍結融解受精卵を受
卵牛に直接移植することによる牛の繁殖方法にも
関する。 以下、本発明について具体的に説明する。 供卵牛より採卵した受精卵および体外受精卵あ
るいは核移植卵を実体顕微鏡を用いて正常な発育
段階、形態の卵を選別し、凍結に供する。 凍結用容器として0.25mlもしくは0.5ml容プラ
スチツク製ストロー管を用いる。 凍結保護物質としてグリセリン、DMSO（ジメ
チルスルホキシド）、エチレングリコール、プロ
パンジオールのように細胞内浸透性を示す物質を
用い、それらを燐酸緩衝液（PBS）に添加した
溶液と、融解後の凍結保護物質除去用として蔗
糖、トレハロースのような二糖類、三糖類の糖を
PBSに溶解した溶液を予め用意する。凍結保護
物質の濃度は0.5モルから2.0モルの範囲が望まし
く、糖類は0.2モルから1.1モルの範囲が最も望ま
しい。 選別した受精卵をPBSを用いて数回洗浄後、
凍結保護物質溶液に浮遊させ、室温で15分以上静
置する。ストロー管の綿栓側から順に、 PBS、空気、凍結保護物質溶液、空
気、受精卵の入つた凍結保護物質溶液、空
気、糖溶液、を挿入し、最後に綿栓とは反対側
のストロー管の先端を加熱して封入する（第１図
参照）。 このストロー管をアルコールバス付きのプログ
ラムフリーザーに綿栓部を下にし上記の液層が
アルコール槽に浸るように立てて入れる。ストロ
ー管がマイナス10℃以下に冷却された時点で一旦
外へ取り出し、軽く振る。この操作で上記の空
気層はストローの先端部に移動し、受精卵を含む
凍結保護物質溶液と糖溶液とは接触し、混和する
ことなく重層される。ストロー管をアルコール槽
に戻しマイナス25℃以下まで冷却したのち液体窒
素（マイナス196℃）に投入して保存する。 融解は、液体窒素から取り出したストロー管を
水平に保ち、空気中あるいは微温湯に浸漬して行
う。本発明によれば、上記の空気層が凍結時に
おいて予め除去されているので融解開始と同時に
凍結保護物質の除去が緩やかに行われ受精卵の生
存性は損なわれず、従来の技術で必要とした各液
層混和のための衝撃が不要であるため受精卵を紛
失する恐れは全くない。 移植は、融解したストローの先端を切除し、受
精卵の入つたストロー管をそのまま受精卵移植器
あるいは人工受精器に挿入して受卵牛に移植す
る。従来のステツプワイイズ法ではストロー管か
ら受精卵を取り出し実体顕微鏡下で段階的に凍結
保護物質除去を行い新たなストローに受精卵を吸
入したのち移植に供するが、本発明ではそのよう
な繁雑な操作が不要で、短時間で省力的に移植す
ることができる。 ［実施例］ 実施例１ （凍結融解後の生存性） １ 実験方法 (1) 受精卵：７日齢のホルスタイン種受精卵、
桑実胚および胚盤胞（品質ランク；１および
２） (2) 凍結保護物質：８％および10％グリセリン
（PBS＋0.4％BSA） (3) 糖溶液：0.4モルおよび0.8モル蔗糖（PBS
＋0.4％BSA） (4) 凍結用容器：0.25ml容プラスチツクストロ
ー (5) ストロー内への挿入方法：ストローの綿栓
側より PBS＋10％CS 空気 グリセリン（８％又は10％）溶液 空気 グリセリン溶液と受精卵 空気 蔗糖（0.4又は0.8モル）溶液 (6) プログラムフリーザー：東京理化製プロク
ールバス (7) 冷却速度：0.5℃／分 (8) 液体窒素投入温度：−32.5℃ (9) 融解方法：ストローを水平にし、 空気中（室温）で５分(A) 37℃温湯内で２分、その後３分間室温(B) (10) ストロー内容物の回収方法：PBS＋10％
CS（約３ml、Ｐ液）を満たしたシヤーレ内に
全内容物を押し出した。 (11) 回収卵の洗浄・培養：Ｐ液内で２度洗浄、
発育ステージ・品質ランクを記録し、Ｐ液内
で60分培養し発育ステージ・ランクを記録し
た。60分後、CMRL＋10％FCS内に移し炭
酸ガス培養器内で24時間培養して発育卵数を
調査した。
製法に関する。また本発明はこのように保存され
た牛の受精卵を融解し、効率的に移植する方法に
関する。 ［従来の技術］ 畜産界ことに牛の繁殖の分野において、受精卵
移植はすでに実用技術として採用され実施機関お
よび受精卵移植による産子も急増している。本明
細書では牛について説明するが、実施法は他の家
畜においても同じように適用することができる。 牛の受精卵移植において、供卵牛から採取した
受精卵を凍結保存後融解して移植する凍結受精卵
移植は受卵牛（借腹牛）の発情に合わせて移植で
きるので非常に効率的である。 牛受精卵の凍結は、すでに幾つかの方法が確立
されているが、その主な工程は受精卵の選別、凍
結保護物質の添加、保存用ストローへの封入、冷
却、植氷、液体窒素への浸漬などである。また凍
結受精卵を移植する場合は、融解、凍結保護物質
除去、及び受卵牛への移植の工程が必要である。 牛受精卵の凍結・融解・移植法について最もオ
ーソドツクスな方法はステツプワイズ法とよばれ
凍結保護物質として添加したグリセリンを段階的
に稀釈して除去し、受精卵の生存性を確認したう
えで移植ストローに吸入して移植する方法であ
る。 この方法のうち武田 （Survival of cryopreserved bovine embryos
cooled at 0.5℃ or １℃／minute：Takeda，
T.R.P.Elsden and C.E.Seidel Jr. Theriogenology 23：232（1985） Cryopreservation of mouse morulae in propylene glycol or glycerol：Takeda，T. Theriogenology 27：282（1986） Deep freezing of split and intact bovine embryos：Takeda，T.W.B.Henderson and
J.F.Hasler Theriogenology 27：285（1987））の方法は、
10％（1.4モル）グリセリンを用い、−4.5℃で植
氷し、その後−32℃まで冷却したのち液体窒素へ
投入する。移植時のグリセリン除去は、6.7％、
3.3％および０％グリセリンの0.3モル蔗糖溶液に
順次、各５分間保持する。この凍結・融解法によ
る牛凍結受精卵の移植後の受胎率は50〜70％と極
めて高いことが実証されている。しかしながら、
この方法は受精卵を移植しようとする施術者に対
し、受精卵の凍結・融解の理論の熟知と卵の生存
性判定技術等を必要とし、操作が繁雑で人手も必
要とする。 一方、凍結精液のような融解後ストローから直
接移植できる方法として凍結受精卵の直接融解移
植法（鈴木達行、特公昭63−33867号）が試みら
れている。この方法は、省力的ではあるが、凍
結・融解後の受精卵の生存性が確認できず、また
グリセリン除去時に受精卵の紛失のおそれがあ
り、実際この方法による移植後の受胎率は30数％
で武田の方法の半分にも達しない。 日本における牛凍結受精卵移植の平均受胎率は
ここ数年30％前後と低迷し、実用化および普及化
の妨げとなつている。日本では家畜改良増殖法に
より受精卵移植技術者の範囲が限定されている
が、受精卵の形態も知らず、さらに凍結・融解の
理論を理解せずともこの資格を得ることができ、
このことが移植成績に多大な影響を及ぼしてい
る。今後、受精卵移植の普及を円滑に進めるため
には、移植知識と技術の向上を図つていくより
も、凍結受精卵の在存性が移植技術者により左右
されない方法の開発と移植技術の標準化が急務で
ある。 ［発明が解決しようとする課題］ 武田の方法による受胎率が極めて高いのは、植
氷温度と冷却速度および脱グリセリンの方法が受
精卵の特性に照らして極めて適切であることによ
る。一方、前述の直接融解移植法では、グリセリ
ン除去に用いる蔗糖溶液を予めストロー内に封入
しグリセリンと混合しないよう空気の層を設けて
隔離してあり、融解後グリセリンは蔗糖溶液の中
で受精卵内から脱出するが、その速度は温度によ
り左右される。このことは、受精卵の生存性に大
きく影響を及ぼす。さらに融解後に受精卵を蔗糖
の層と混合させるため施術者がストローを体温計
のごとく振つたり、あるいはストローを強くはじ
いて衝撃を与える必要がある。この際に受精卵の
位置が確認できず、ストロー先端の綿栓に付着し
たり紛失することがある。 本発明者は、融解の際の凍結保護物質の除去を
ステツプワイズ法のように自然に行わせしめる条
件について鋭意研究の結果、凍結保護物質溶液と
除去のための糖溶液をストロー内で直接重層させ
る方法を見い出し、本発明を完成させたのであ
る。 本発明によれば、融解の際、凍結保護物質除去
まで何の操作も必要としなくなるので移植者は融
解卵の移植業務にのみ専念でき、卵操作の補助者
も不要である。また、移植卵をストロー外に取り
出す必要もないので、受精卵の形態や凍結・融解
の理論について移植技術者を強制的に教育する必
要性がなくなる。このことは、凍結受精卵の移植
技術者の拡大と受胎率向上に大きく貢献する。 ［課題を解決するための手段］ 上記した課題を解決する本発明は、受精卵を凍
結の損傷から保護するために添加した凍結保護物
質溶液の除去をストロー内で自然に行わせること
により受精卵の生存性を損なわず、また融解操作
が簡易になり、さらに受精卵を紛失することなく
確実に受卵牛に移植して受胎させることができ
る。 凍結保護物質溶液除去をストロー内で行うには
予めストロー内に除去のための糖溶液を挿入し、
受精卵を含む凍結保護物質溶液との混和を防止す
るため空気の層を設けて隔離しておく必要があ
る。融解後、ストローに衝撃を与えて空気層を除
去するのが直接融解法であるが、その問題点は上
記のとおりである。したがつて、この空気層は受
精卵の凍結前には必要であるが、融解時には全く
不要のものである。 本発明者は研究の結果、意外にも凍結過程にお
いて空気層を除去することにより、受精卵の耐凍
性を損なわず、凍結保護物質の除去を自然に行わ
せしめることを発見して本発明を完成させたので
ある。 すなわち本発明は、受精卵の凍結保護物質溶液
とその除去のための糖溶液を混和することなく予
めストローに封入して、凍結保護物質の除去を自
然かつ確実に行わせしめることを特徴とする凍結
受精卵の調製方法に関する。 さらに本発明は、ストロー内で凍結保護物質を
自然かつ確実に除去して得た凍結融解受精卵を受
卵牛に直接移植することによる牛の繁殖方法にも
関する。 以下、本発明について具体的に説明する。 供卵牛より採卵した受精卵および体外受精卵あ
るいは核移植卵を実体顕微鏡を用いて正常な発育
段階、形態の卵を選別し、凍結に供する。 凍結用容器として0.25mlもしくは0.5ml容プラ
スチツク製ストロー管を用いる。 凍結保護物質としてグリセリン、DMSO（ジメ
チルスルホキシド）、エチレングリコール、プロ
パンジオールのように細胞内浸透性を示す物質を
用い、それらを燐酸緩衝液（PBS）に添加した
溶液と、融解後の凍結保護物質除去用として蔗
糖、トレハロースのような二糖類、三糖類の糖を
PBSに溶解した溶液を予め用意する。凍結保護
物質の濃度は0.5モルから2.0モルの範囲が望まし
く、糖類は0.2モルから1.1モルの範囲が最も望ま
しい。 選別した受精卵をPBSを用いて数回洗浄後、
凍結保護物質溶液に浮遊させ、室温で15分以上静
置する。ストロー管の綿栓側から順に、 PBS、空気、凍結保護物質溶液、空
気、受精卵の入つた凍結保護物質溶液、空
気、糖溶液、を挿入し、最後に綿栓とは反対側
のストロー管の先端を加熱して封入する（第１図
参照）。 このストロー管をアルコールバス付きのプログ
ラムフリーザーに綿栓部を下にし上記の液層が
アルコール槽に浸るように立てて入れる。ストロ
ー管がマイナス10℃以下に冷却された時点で一旦
外へ取り出し、軽く振る。この操作で上記の空
気層はストローの先端部に移動し、受精卵を含む
凍結保護物質溶液と糖溶液とは接触し、混和する
ことなく重層される。ストロー管をアルコール槽
に戻しマイナス25℃以下まで冷却したのち液体窒
素（マイナス196℃）に投入して保存する。 融解は、液体窒素から取り出したストロー管を
水平に保ち、空気中あるいは微温湯に浸漬して行
う。本発明によれば、上記の空気層が凍結時に
おいて予め除去されているので融解開始と同時に
凍結保護物質の除去が緩やかに行われ受精卵の生
存性は損なわれず、従来の技術で必要とした各液
層混和のための衝撃が不要であるため受精卵を紛
失する恐れは全くない。 移植は、融解したストローの先端を切除し、受
精卵の入つたストロー管をそのまま受精卵移植器
あるいは人工受精器に挿入して受卵牛に移植す
る。従来のステツプワイイズ法ではストロー管か
ら受精卵を取り出し実体顕微鏡下で段階的に凍結
保護物質除去を行い新たなストローに受精卵を吸
入したのち移植に供するが、本発明ではそのよう
な繁雑な操作が不要で、短時間で省力的に移植す
ることができる。 ［実施例］ 実施例１ （凍結融解後の生存性） １ 実験方法 (1) 受精卵：７日齢のホルスタイン種受精卵、
桑実胚および胚盤胞（品質ランク；１および
２） (2) 凍結保護物質：８％および10％グリセリン
（PBS＋0.4％BSA） (3) 糖溶液：0.4モルおよび0.8モル蔗糖（PBS
＋0.4％BSA） (4) 凍結用容器：0.25ml容プラスチツクストロ
ー (5) ストロー内への挿入方法：ストローの綿栓
側より PBS＋10％CS 空気 グリセリン（８％又は10％）溶液 空気 グリセリン溶液と受精卵 空気 蔗糖（0.4又は0.8モル）溶液 (6) プログラムフリーザー：東京理化製プロク
ールバス (7) 冷却速度：0.5℃／分 (8) 液体窒素投入温度：−32.5℃ (9) 融解方法：ストローを水平にし、 空気中（室温）で５分(A) 37℃温湯内で２分、その後３分間室温(B) (10) ストロー内容物の回収方法：PBS＋10％
CS（約３ml、Ｐ液）を満たしたシヤーレ内に
全内容物を押し出した。 (11) 回収卵の洗浄・培養：Ｐ液内で２度洗浄、
発育ステージ・品質ランクを記録し、Ｐ液内
で60分培養し発育ステージ・ランクを記録し
た。60分後、CMRL＋10％FCS内に移し炭
酸ガス培養器内で24時間培養して発育卵数を
調査した。
【表】
３ コメント：凍結融解後の生存率、発育率はス
テツプワイズ法と差がなかつた。 実施例２ （移植試験その１） １ 実験方法 (1) 受精卵：７日齢の黒毛和種受精卵、桑実胚お
よび胚盤胞（品質ランク；１および２） (2) 凍結保護物質：10％グリセリン（PBS＋0.4
％BSA） (3) 糖溶液：0.4モル蔗糖（PBS＋0.4％BSA） (4) 凍結用容器：0.25ml容プラスチツクストロー (5) ストロー内への挿入方法：実施例１と同じ (6) プログラムフリーザー：実施例１と同じ (7) 冷却速度：実施例１と同じ (8) 液体窒素投入温度：実施例１と同じ (9) 融解方法：ストローを水平に保ち、空気中
（室温）で８秒間保持したのち37℃の温湯内で
２分間浸漬 (10) 移植方法：発情周期を受精卵と同期化させた
ホルスタイン種未経産牛に非手術的に移植（１
卵移植）。
テツプワイズ法と差がなかつた。 実施例２ （移植試験その１） １ 実験方法 (1) 受精卵：７日齢の黒毛和種受精卵、桑実胚お
よび胚盤胞（品質ランク；１および２） (2) 凍結保護物質：10％グリセリン（PBS＋0.4
％BSA） (3) 糖溶液：0.4モル蔗糖（PBS＋0.4％BSA） (4) 凍結用容器：0.25ml容プラスチツクストロー (5) ストロー内への挿入方法：実施例１と同じ (6) プログラムフリーザー：実施例１と同じ (7) 冷却速度：実施例１と同じ (8) 液体窒素投入温度：実施例１と同じ (9) 融解方法：ストローを水平に保ち、空気中
（室温）で８秒間保持したのち37℃の温湯内で
２分間浸漬 (10) 移植方法：発情周期を受精卵と同期化させた
ホルスタイン種未経産牛に非手術的に移植（１
卵移植）。
【表】
３ コメント
本法は、ワンステツプ法より高く、ステツプワ
イズ法と同等以上の受胎率を示した。凍結卵の融
解開始から受精卵移植器にストローを挿入するま
での所要時間はステツプワイズ法のおよそ５分の
１に短縮され、実体顕微鏡等の特別な機器は不要
であつた。 実施例３ （移植試験その２） １ 実験方法 (1) 受精卵：７日齢のアンガス、ヘレホード種等
受精卵、桑実胚および胚盤胞（品質ランク；１
および２） (2) 護物質：７％および10％グリセリン（PBS
＋0.4％BSA） (3) 糖溶液：0.4モルおよび0.8モル蔗糖（PBS＋
0.4％BSA） (4) 凍結用容器：0.25mlプラスチツクストロー (5) ストロー内への挿入方法：実施例１と同じ (6) プログラムフリーザー：FTS社製バイオク
ール (7) 冷却速度：0.6℃／分 (8) 液体窒素投入温度：−32.0℃ (9) 融解方法：ストローを水平に保ち、空気中
（室温）で８秒間保持したのち37℃の温湯内で
２分間浸漬。 (10) 移植方法：発情周期を受精卵と同期化させた
アンガス、ヘレホード種等未経産牛に融解後５
〜10分以内に非手術的に移植（１〜２卵移植）。
イズ法と同等以上の受胎率を示した。凍結卵の融
解開始から受精卵移植器にストローを挿入するま
での所要時間はステツプワイズ法のおよそ５分の
１に短縮され、実体顕微鏡等の特別な機器は不要
であつた。 実施例３ （移植試験その２） １ 実験方法 (1) 受精卵：７日齢のアンガス、ヘレホード種等
受精卵、桑実胚および胚盤胞（品質ランク；１
および２） (2) 護物質：７％および10％グリセリン（PBS
＋0.4％BSA） (3) 糖溶液：0.4モルおよび0.8モル蔗糖（PBS＋
0.4％BSA） (4) 凍結用容器：0.25mlプラスチツクストロー (5) ストロー内への挿入方法：実施例１と同じ (6) プログラムフリーザー：FTS社製バイオク
ール (7) 冷却速度：0.6℃／分 (8) 液体窒素投入温度：−32.0℃ (9) 融解方法：ストローを水平に保ち、空気中
（室温）で８秒間保持したのち37℃の温湯内で
２分間浸漬。 (10) 移植方法：発情周期を受精卵と同期化させた
アンガス、ヘレホード種等未経産牛に融解後５
〜10分以内に非手術的に移植（１〜２卵移植）。
【表】
３ コメント
本法はステツプワイズ法と同等以上の受胎率を
示した。さらに２卵移植は１卵移植より高い受胎
率を得た。 実施例４ （移植試験その３、体外受精卵） １ 実験方法 (1) 受精卵：黒毛和種の屠場卵巣から抽出した卵
胞卵子を体外成熟後、体外受精を施し培養後家
兎卵管に仮移植して回収した桑実胚または胚盤
胞。ならびに体外受精後、卵丘細胞、卵管上皮
細胞、子宮上皮細胞または栄養胚葉小腔と共培
養して得た桑実胚および胚盤胞。 (2) 凍結保護物質：10％グリセリン（PBS＋0.4
％BSA） (3) 糖溶液：0.8モル蔗糖（PBS＋0.4％BSA） (4) 凍結用容器：0.25mlプラスチツクストロー (5) ストロー内への挿入方法：実施例１と同じ (6) プログラムフリーザー：実施例１と同じ (7) 冷却速度：0.6℃／分 (8) 液体窒素投入温度：−32.5℃ (9) 融解方法：ストローを水平に保ち、空気中
（室温）で８秒間保持したのち37℃の温湯内で
２分間浸漬。 (10) 移植方法：発情育周期を受精卵と同期化させ
たホルスタイン種未経産牛に融解後５〜10分以
内に非手術的に移植（２卵移植）。
示した。さらに２卵移植は１卵移植より高い受胎
率を得た。 実施例４ （移植試験その３、体外受精卵） １ 実験方法 (1) 受精卵：黒毛和種の屠場卵巣から抽出した卵
胞卵子を体外成熟後、体外受精を施し培養後家
兎卵管に仮移植して回収した桑実胚または胚盤
胞。ならびに体外受精後、卵丘細胞、卵管上皮
細胞、子宮上皮細胞または栄養胚葉小腔と共培
養して得た桑実胚および胚盤胞。 (2) 凍結保護物質：10％グリセリン（PBS＋0.4
％BSA） (3) 糖溶液：0.8モル蔗糖（PBS＋0.4％BSA） (4) 凍結用容器：0.25mlプラスチツクストロー (5) ストロー内への挿入方法：実施例１と同じ (6) プログラムフリーザー：実施例１と同じ (7) 冷却速度：0.6℃／分 (8) 液体窒素投入温度：−32.5℃ (9) 融解方法：ストローを水平に保ち、空気中
（室温）で８秒間保持したのち37℃の温湯内で
２分間浸漬。 (10) 移植方法：発情育周期を受精卵と同期化させ
たホルスタイン種未経産牛に融解後５〜10分以
内に非手術的に移植（２卵移植）。
【表】
３ コメント
家兎卵管仮移植した体外受精卵および共培養に
よる体外受精卵のいづれもステツプワイズ法と同
等以上の受胎率を得た。
よる体外受精卵のいづれもステツプワイズ法と同
等以上の受胎率を得た。
第１図に本発明方法による態様を示し、第２図
〜第４図は従来法を示す。
〜第４図は従来法を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ストローの中央部に受精卵と凍結保護物質溶
液の混合液が位置し、その綿栓方向に１つまたは
それ以上の空気層を有し、空気層の間には凍結保
護物質溶液が介在し、かつ綿栓方向と反対の受精
卵放出口方向には空気層はなく、凍結保護物質除
去用物質のみが存在する。受胎率を上げた凍結受
精卵。 ２ 受精卵は牛、馬または羊の受精卵である、請
求項１記載の凍結受精卵。 ３ 受精卵は妊娠家畜から採取したものである、
請求項１または２記載の凍結卵。 ４ 体外受精卵を使用する、請求項１記載の凍結
受精卵。 ５ 受精卵は細胞融合法により作出した核移植卵
である、請求項１記載の凍結受精卵。 ６ 凍結保護物質除去用物質は糖溶液である、請
求項１記載の凍結受精卵。 ７ 片側に綿栓をしたストロー管に順に燐酸緩衝
液、空気、凍結保護物質溶液、空気、受精卵と凍
結保護物質の混合液、空気および凍結保護物質除
去用物質溶液を注入し、ストロー管の末端を密封
した後、綿栓側を下にして、受精卵を含む混合液
までを先ず凍結し、ついでその管を振つて未凍結
側の空気層を凍結保護物質除去用物質に溶かし込
み、そして全体のストロー管を凍結することを特
徴とする、凍結受精卵の調製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3033290A JPH03232441A (ja) | 1990-02-09 | 1990-02-09 | 受胎率を上げた凍結受精卵およびその調製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3033290A JPH03232441A (ja) | 1990-02-09 | 1990-02-09 | 受胎率を上げた凍結受精卵およびその調製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03232441A JPH03232441A (ja) | 1991-10-16 |
| JPH056983B2 true JPH056983B2 (ja) | 1993-01-27 |
Family
ID=12300859
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3033290A Granted JPH03232441A (ja) | 1990-02-09 | 1990-02-09 | 受胎率を上げた凍結受精卵およびその調製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03232441A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2582327B2 (ja) * | 1992-10-29 | 1997-02-19 | 宮崎県 | 哺乳動物胚の凍結保護物質の簡易除去法 |
| EP2471359B1 (en) * | 2010-12-30 | 2016-03-30 | Cellulis S.L. | Method of freezing cells |
| JP2021114962A (ja) * | 2020-01-28 | 2021-08-10 | 三菱製紙株式会社 | 被包部材 |
-
1990
- 1990-02-09 JP JP3033290A patent/JPH03232441A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03232441A (ja) | 1991-10-16 |
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