CN109673623A - 一种玻璃化冷冻试剂和玻璃化解冻试剂及其应用和使用方法 - Google Patents

一种玻璃化冷冻试剂和玻璃化解冻试剂及其应用和使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及冷冻及解冻技术领域，具体涉及一种玻璃化冷冻试剂和玻璃化解冻试剂及其应用和使用方法。本申请提供了一种冷冻时间和解冻时间短，便于操作和避免对胚胎损伤的玻璃化冷冻试剂和玻璃化解冻试剂。本专利冷冻和解冻方法较之目前的进口试剂比较，具有如下的优势:①冷冻时间和解冻时间均有缩短，提高了工作效率；②冷冻试剂溶质浓度合理，使得胚胎易于从冷冻载体上脱离下来，避免了对胚胎的过多操作和损伤；③解冻液的工作温度是37°，解冻过程中可以在一个工作台面连续进行，不必更换工作台，简化方便了操作流程，避免差错发生。

Description

一种玻璃化冷冻试剂和玻璃化解冻试剂及其应用和使用方法
技术领域
本发明涉及冷冻及解冻技术领域，具体涉及一种玻璃化冷冻试剂和玻璃化解冻试剂及其应用和使用方法。
背景技术
随着不孕人群的增加、二胎政策的开放和辅助生殖技术的发展，我国的试管婴儿治疗量(周期数)逐年增加。中国医师协会生殖医学专业委员会主任委员乔杰院士根据我国的辅助生殖技术发展，预测我国的试管婴儿治疗量(周期数)能达到每年40万例。
胚胎冷冻保存和解冻复苏技术是人类辅助生殖技术(体外受精和胚胎移植技术，俗称试管婴儿)领域中一项重要的技术。胚胎冷冻保存技术是指将人类胚胎通过一定的技术操作，包括转移至特制的系列溶液中，同时调节胚胎温度，最终将胚胎承载在特制的冷冻载体中转入-196°的液氮中。胚胎解冻技术是指将已经冻存在液氮中的人类胚胎，通过一定的技术操作，包括将胚胎从冷冻载体中转移至系列的溶液中，同时调节胚胎温度，最终将胚胎放入正常的培养液中，转入37°的二氧化碳培养箱中，等待移植使用。
目前的体外受精周期中约有60-70％的患者有胚胎需要冻存。冻存胚胎的目的：部分患者是因为有富裕的胚胎，这部分富裕的胚胎冷冻起来，以备患者本次治疗不成功或准备再生育时解冻再移植，提高了累积妊娠率；部分患者是出现了不能新鲜胚胎移植的病理情况，例如出现了卵巢过度刺激综合征、阴道异常出血或突发其他疾病等情况，可以将胚胎冷冻起来，以备患者病理情况消除后再行解冻移植；越来越多的研究表明，解冻胚胎移植有着较高的妊娠成功率和较好的妊娠结局，有的专家或有的助孕中心提倡不移植新鲜胚胎而将全部胚胎冷冻保存，后期做解冻胚胎移植。
综上所述，胚胎冷冻保存和解冻复苏技术的应用会越来越多，成为助孕技术中非常重要的治疗手段，其重要性会更加受到关注。
在胚胎冷冻和解冻过程中，伴随温度的变化，特制的化学试剂对胚胎的保护作用最为重要。胚胎冷冻试剂：在降温过程中，会形成冰晶损胚胎，冷冻保护剂会保护胚胎。胚胎解冻试剂：在复温过程中，也需要保护剂保护胚胎。
国内医疗行业使用的耗材试剂实行医疗注册证制度，目前国内助孕行业中“有证”的胚胎冷冻和胚胎解冻复苏的试剂只有进口的试剂(日本加藤的试剂)，没有国产试剂。
发明内容
为了解决以上问题，本申请提供了一种冷冻时间和解冻时间短，便于操作和避免对胚胎损伤的玻璃化冷冻试剂和玻璃化解冻试剂。
本发明提供了一种玻璃化冷冻试剂，包括冷冻前平衡液和冷冻液，
冷冻前平衡液组成：以磷酸盐缓冲液(DPBS)为基础溶液，所含成分为：乙二醇(EG)、二甲基亚砜(DMSO)、人血清白蛋白(HSA)、庆大霉素；
玻璃化冷冻液组成成分：以磷酸盐缓冲液为基础溶液，所含成分为：蔗糖(Sucrose)、乙二醇、二甲基亚砜、人血清白蛋白、庆大霉素。
其中，冷冻前平衡液的各组分浓度分别为：16-25％人血清白蛋白(体积百分比)、6-15％乙二醇(体积百分比)、6-15％二甲基亚砜(体积百分比)和6-15ug/ml庆大霉素(质量百分比)；冷冻液的各组分浓度分别为：16-25％人血清白蛋白(体积百分比)、16-25％乙二醇(体积百分比)、16-25％二甲基亚砜(体积百分比)、0.35-0.45M蔗糖(质量百分比)和6-15ug/ml庆大霉素(质量百分比)。
优选的，冷冻前平衡液的各组分浓度分别为20％人血清白蛋白、10％乙二醇、10％二甲基亚砜和10ug/ml庆大霉素；
优选的，冷冻液的各组分浓度分别为20％人血清白蛋白、20％乙二醇、20％二甲基亚砜和0.4M蔗糖和10ug/ml庆大霉素。
其中，每1000ml磷酸盐缓冲液配方包含以下组分：
氯化钠 8.0g
氯化钾 0.2g
磷酸氢二钠 1.15g
磷酸二氢钾 0.2g
氯化钙 0.1g
氯化镁 0.1g
葡萄糖 1.0g
丙酮酸钠 36mg。
本发明还提供了一种对上述玻璃化冷冻试剂冷冻产品进行解冻的玻璃化解冻试剂，包括解冻液I、解冻液II、解冻液III和解冻液Ⅳ；解冻液I、解冻液II、解冻液III以磷酸盐缓冲液为基础溶液，所含成分有：蔗糖、人血清白蛋白、庆大霉素；解冻液Ⅳ以磷酸盐缓冲液(DPBS)为基础溶液，所含成分人血清白蛋白、庆大霉素。
其中，解冻液I的各组分浓度分别为：0.8-1.2M的蔗糖、16-25％人血清白蛋白、6-15ug/ml庆大霉素；解冻液II的各组分浓度分别为：0.2-0.3的蔗糖、16-25％人血清白蛋白、6-15ug/ml庆大霉素：解冻液III的各组分浓度分别为：0.1-0.15M的蔗糖、16-25％人血清白蛋白、6-15ug/ml庆大霉素；解冻液Ⅳ冷冻液的各组分浓度分别为：16-25％人血清白蛋白和6-15ug/ml庆大霉素。
优选的，解冻液I的各组分浓度分别为：1M的蔗糖、20％人血清白蛋白、10ug/ml庆大霉素；
优选的，解冻液II的各组分浓度分别为：0.25M的蔗糖、20％人血清白蛋白、10ug/ml庆大霉素：
优选的，解冻液III的各组分浓度分别为：0.125M的蔗糖、20％人血清白蛋白、10ug/ml庆大霉素：
优选的，解冻液Ⅳ的各组分浓度分别为：20％人血清白蛋白和10ug/ml庆大霉素。每1000ml磷酸盐缓冲液配方包含以下组分：
氯化钠 8.0g
氯化钾 0.2g
磷酸氢二钠 1.15g
磷酸二氢钾 0.2g
氯化钙 0.1g
氯化镁 0.1g
葡萄糖 1.0g
丙酮酸钠 36mg。
另外，本发明还提供了玻璃化冷冻试剂和玻璃化解冻试剂用于冷冻或保藏人或动物卵裂期胚胎的方法。
玻璃化冷冻试剂的使用方法，将胚胎从正常的培养液中转移至冷冻前平衡液中，静置4～5分钟，然后转至冷冻液中，将带有少量冷冻液的胚胎转入冷冻载体中，并立即投入液氮中；从进入冷冻液到投入液氮中的时间在30～40秒内。操作均在常温下，在百级净化区内，在体式显微镜下操作。
玻璃化解冻试剂的使用方法，将胚胎迅速从液氮中取出，待观察到冷冻载体的胚胎和少量冻存液已经由固态融化为小液滴时，将带有胚胎的冷冻载体投入到解冻液I中，使胚胎从冷冻载体中分离下来，胚胎在解冻液I中停留5分钟，转入解冻液II中停留2～3分钟，转入解冻液III中停留1～2分钟，后转入解冻液Ⅳ中清洗后即可转入胚胎培养液中，放入37°的二氧化碳培养箱中培养等待移植。
本发明提供一种冷冻保存的试剂，包括玻璃化冷冻试剂和玻璃化解冻试剂。
本专利就是为填补国产冷冻解冻试剂空白，使之能国产化，不再依赖进口。并且本专利冷冻和解冻方法较之目前的进口试剂比较，具有如下的优势:①冷冻时间和解冻时间均有缩短，提高了工作效率；②冷冻试剂溶质浓度合理，使得胚胎易于从冷冻载体上脱离下来，避免了对胚胎的过多操作和损伤；③解冻液的工作温度是37°，解冻过程中可以在一个工作台面连续进行，不必更换工作台(日本加藤产品，在解冻过程需要更换不同的工作台，第一步37°，第二至第四步在室温，随后又需要回到37°，转移至胚胎培养液中)，简化方便了操作流程，避免差错发生。
具体实施方式
本专利产品包括两部分：玻璃化冷冻试剂和玻璃化解冻试剂。
玻璃化冷冻试剂配方：
D-PBS配方(1000ml)：
氯化钠 8.0g
氯化钾 0.2g
磷酸氢二钠 1.15g
磷酸二氢钾 0.2g
氯化钙 0.1g
氯化镁 0.1g
葡萄糖 1.0g
丙酮酸钠 36mg
玻璃化解冻试剂配方：
D-PBS配方(1000ml)：
氯化钠 8.0g
氯化钾 0.2g
磷酸氢二钠 1.15g
磷酸二氢钾 0.2g
氯化钙 0.1g
氯化镁 0.1g
葡萄糖 1.0g
丙酮酸钠 36mg
⑴人卵裂期胚胎玻璃化冷冻试剂和使用方法
结构及组成：该产品包括冷冻前平衡液和冷冻液，均为无菌、澄清液体。冷冻前平衡液组成成分为：乙二醇(EG)、二甲基亚砜(DMSO)、人血清白蛋白(HSA)、庆大霉素、磷酸盐缓冲液(DPBS)。玻璃化冷冻液组成成分：蔗糖(Sucrose)、乙二醇、二甲基亚砜、人血清白蛋白、庆大霉素、磷酸盐缓冲液
适用范围：用于人卵裂期胚胎(2细胞～10细胞阶段的人类胚胎)的玻璃化冷冻。
工作原理：使用蔗糖、乙二醇、二甲基亚砜、人血清白蛋白和葡萄糖作为冷冻保护剂，使胚胎在冷冻降温过程中，逐渐脱水，避免冰晶形成，最终安全进入液氮中长期储存。
使用方法(冷冻程序)：将胚胎从正常的培养液中转移至冷冻前平衡液中，静置4～5分钟，然后转至冷冻液中，随即将带有少量冷冻液的胚胎转入冷冻载体中，并立即投入液氮中。从进入冷冻液到投入液氮中，时间控制在30～40秒内。上述操作均在常温下，在百级净化区内，在体式显微镜下操作。
⑵人卵裂期胚胎玻璃化解冻试剂和使用方法
结构及组成：该产品包括玻璃化解冻液I、解冻液II、解冻液III和解冻液Ⅳ，均为无菌、澄清液体。玻璃化解冻液组成成分：蔗糖、人血清白蛋白、庆大霉素、磷酸盐缓冲液。玻璃化解冻液Ⅳ组成成分为：人血清白蛋白、庆大霉素、磷酸盐缓冲液。
适用范围：用于人卵裂期胚胎(2细胞～10细胞阶段的人类胚胎)的玻璃化解冻。
工作原理：使用蔗糖和人血清白蛋白等试剂，配合温度变化，使胚胎在脱离液氮后的升温过程中，逐渐吸水复苏还原，最终恢复活力和发育潜能。
使用方法(解冻程序)：将胚胎迅速从液氮中取出，待观察到冷冻载体的胚胎和少量冻存液已经由固态融化为小液滴时，将带有胚胎的冷冻载体投入到解冻液I中，使胚胎从冷冻载体中分离下来，胚胎在解冻液I中停留5分钟，转入解冻液II中停留2～3分钟，转入解冻液III中停留1～2分钟，后转入解冻液Ⅳ中清洗后即可转入胚胎培养液中，放入37°的二氧化碳培养箱中培养等待移植。上述操作均在百级净化区内，在37°恒温工作台上，在体式显微镜下进行。
本发明试剂与背景技术中进口日本加藤试剂的对比

Claims (10)

1.一种玻璃化冷冻试剂，包括冷冻前平衡液和冷冻液，
冷冻前平衡液组成成分为：乙二醇、二甲基亚砜、人血清白蛋白、庆大霉素、磷酸盐缓冲液；
玻璃化冷冻液组成成分：蔗糖、乙二醇、二甲基亚砜、人血清白蛋白、庆大霉素、磷酸盐缓冲液。
2.根据权利要求1所述的玻璃化冷冻试剂，其特征在于：
冷冻前平衡液以磷酸盐缓冲液为基础溶液，所含成分为：体积百分比浓度为16-25％的人血清白蛋白、体积百分比浓度为6-15％乙二醇、体积百分比浓度为6-15％二甲基亚砜和6-15ug/ml庆大霉素；
冷冻液以磷酸盐缓冲液为基础溶液，所含成分为：体积百分比浓度为16-25％人血清白蛋白、体积百分比浓度为16-25％乙二醇、体积百分比浓度为16-25％二甲基亚、质量百分比为0.35-0.45M蔗糖和6-15ug/ml庆大霉素。
3.权利要求1所述玻璃化冷冻试剂用于冷冻人或动物卵裂期胚胎的应用。
4.权利要求1所述玻璃化冷冻试剂的使用方法，将胚胎从正常的培养液中转移至冷冻前平衡液中，静置4～5分钟，然后转至冷冻液中，将带有少量冷冻液的胚胎转入冷冻载体中，并立即投入液氮中；从进入冷冻液到投入液氮中的时间在30～40秒内。
5.一种对权利要求1或2所述玻璃化冷冻试剂冷冻产品进行解冻的玻璃化解冻试剂，其特征在于：包括解冻液I、解冻液II、解冻液III和解冻液Ⅳ；解冻液I、解冻液II、解冻液III组成成分：蔗糖、人血清白蛋白、庆大霉素、磷酸盐缓冲液；解冻液Ⅳ组成成分为：人血清白蛋白、庆大霉素、磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求5所述的玻璃化解冻试剂，其特征在于：
解冻液I以磷酸盐缓冲液为基础溶液，各组分浓度分别为：0.8-1.2M的蔗糖、16-25％人血清白蛋白、6-15ug/ml庆大霉素；
解冻液II以磷酸盐缓冲液为基础溶液，各组分浓度分别为：0.2-0.3的蔗糖、16-25％人血清白蛋白、6-15ug/ml庆大霉素：
解冻液III以磷酸盐缓冲液为基础溶液，各组分浓度分别为0.1-0.15M的蔗糖、16-25％人血清白蛋白、6-15ug/ml庆大霉素；
解冻液Ⅳ以磷酸盐缓冲液为基础溶液，各组分浓度分别为16-25％人血清白蛋白和6-15ug/ml庆大霉素。
7.根据权利要求1所述的玻璃化冷冻试剂或权利要求5所述的玻璃化解冻试剂，其特征在于：每1000ml磷酸盐缓冲液配方包含以下组分：
氯化钠 8.0g
氯化钾 0.2g
磷酸氢二钠 1.15g
磷酸二氢钾 0.2g
氯化钙 0.1g
氯化镁 0.1g
葡萄糖 1.0g
丙酮酸钠 36mg。
8.权利要求6所述玻璃化解冻试剂用于冷冻人或动物卵裂期胚胎解冻的应用。
9.权利要求6所述玻璃化解冻试剂的使用方法，将胚胎迅速从液氮中取出，待观察到冷冻载体的胚胎和少量冻存液已经由固态融化为小液滴时，将带有胚胎的冷冻载体投入到解冻液I中，使胚胎从冷冻载体中分离下来，胚胎在解冻液I中停留5分钟，转入解冻液II中停留2～3分钟，转入解冻液III中停留1～2分钟，后转入解冻液Ⅳ中清洗后即可转入胚胎培养液中，放入37°的二氧化碳培养箱中培养等待移植。
10.根据权利要求9所述的使用方法，其特征在于：操作均在37°下，在百级净化区内，在体式显微镜下操作。
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