CN104673717A - 一种生物组织rna保护试剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种RNA保护试剂，它含有以下组分：15～20mM柠檬酸钠、5～10mM乙二胺四乙酸、40～55％W/V硫酸铵、10～20mM二硫苏糖醇、8～15μM1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖和0.001～0.010％V/V甘油。本发明所述的RNA保护试剂无需液氮或干冰就可以让离体生物组织的RNA方便安全地在室温下保存一段时间，低温可长期保存，并且该试剂没有毒性，使用方便，用后可直接倒入水槽中；与液氮和干冰相比，成本低廉，更易于广泛应用。本发明还提供了所述的RNA保护试剂的制备方法和应用。

Description

一种生物组织RNA保护试剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物化学和分子生物学领域，具体涉及保护离体生物组织中RNA稳定性的一种化学试剂。
背景技术
细胞中的信息分子RNA是比较脆弱的分子物质，很容易在多种不同的机理作用下降解。由于RNA酶(Ribonuclease，RNase)的广泛存在与难以灭活的顽固特性，使得RNA的提取纯化和后续工作变得非常困难。涉及RNA的操作包含两个方面：一个是实验操作(RNA提取、RNA反转录和RNA电泳等)，一个是RNA的保存。
RNA实验操作的主要问题是防止RNase的污染。RNase无处不在，在实验操作的任何一步，任何偶然的疏忽或不当操作都有可能造成RNase污染，从而导致整个实验失败。因此，严格控制实验条件，避免任何可能的污染是保证实验成功的关键，目前常在试剂中添加焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)和核糖核酸酶抑制剂(Ribonuclease Inhibitor，RNaseInhibitor)，DEPC对RNase的作用是特异性的，它能够与很多酶的-NH，-SH或-OH等基团发生反应，而破坏酶的活性位点。一般常用浓度为0.1％(1L水中加入1mL DEPC)的DEPC来作为RNase的抑制剂。比如，进行RNA实验时，要用DEPC处理实验所用的水和各种溶液以及容器；RNase Inhibitor对RNase的作用也是特异性的，它与RNase A形成1:1复合体，对RNase A表现高度的非竞争性抑制(Ki＝3×10-10M)。该反应是可逆的，通过尿素及疏基类试剂能够解离复合体，使RNase复活而抑制剂不可逆失活。RNase Inhibitor不能抑制反转录酶的RNase H的活性。
以上是RNA实验操作方面存在的问题，更多的时候是生物样品RNA离体后由于场地或时间等因素的限制，不能马上进行RNA实验操作，需要暂时保存RNA样品，保持RNA样品的稳定性就显得尤为重要。样品一旦从生物体中分离，细胞内的RNA就变得非常不稳定，容易降解。因此取样后，如何保证取样前后基因的表达模式不变，就变得非常重要。
现有技术中，传统方法是用液氮将离体的生物样品RNA速冻，再放到超低温冰箱中保存，操作非常不便。王华等(王华，李华，保存动物组织内RNA的方法改进，生物技术通报，2010年第6期，152～155)曾经尝试改进了动物组织RNA的保存方法，是使用含有柠檬酸钠、EDTA、硫酸铵和异硫氰酸胍的溶液保存动物组织，经Trizol法提取后发现，该溶液保存的动物组织中的RNA比冷藏、速冻等常规方法保存后质量更高，完整性更好。但是研究人员同时发现该溶液只对保护动物组织的RNA有一定效果，而对植物组织的RNA不能起到保护效果，而且对于离体动物组织DNA的保护效果也还不够理想。
本发明在上述背景下开发出一种新的RNA保护试剂，以期有效解决包括植物组织在内的生物组织RNA实验操作中的RNase污染问题和稳定性，并进一步提高离体组织DNA的稳定性。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种RNA保护试剂，具有抑制RNase和稳定RNA作用，能够对动物组织和植物组织的离体样品RNA起到显著的保护和稳定作用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
提供一种RNA保护试剂，它含有以下组分：15～20mM柠檬酸钠、5～10mM乙二胺四乙酸(EDTA)、40～55％(W/V)硫酸铵、10～20mM二硫苏糖醇(DTT)、8～15μM 1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖(1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose，PGG)和0.001～0.010％(V/V)甘油(glycerol)。
本发明一种优选的RNA保护试剂中含有以下组分：15～18mM柠檬酸钠、6～8mM乙二胺四乙酸(EDTA)、45～50％(W/V)硫酸铵、12～18mM二硫苏糖醇(DTT)、8～12μM1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖(1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose，PGG)和0.004～0.006％(V/V)甘油(glycerol)。
本发明一种更优选的RNA保护试剂中含有以下组分：17mM柠檬酸钠、7mM乙二胺四乙酸(EDTA)、48％(W/V)硫酸铵、14mM二硫苏糖醇(DTT)、10μM 1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖(1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose，PGG)和0.005％(V/V)甘油(glycerol)。
所述的硫酸铵在本发明保护试剂中的含量单位中的“W/V”表示重量/体积的比例，其中，当W代表的重量以千克计时，对应的V代表的体积以升计。
本发明优选的方案中，所述的PGG提取自白芍，纯度(HPLC)≥98％。
本发明优选的方案中，所述的RNA保护试剂pH值在4.3～5.3之间，更优选4.8～5.2，进一步优选5.0～5.2，最优选5.2。
本发明所述的RNA保护试剂是无色无毒的透明溶液，能够迅速渗入到新鲜组织细胞的胞浆中，组分以特定的比例、在特定的pH值环境下发挥协同作用，快速有效地灭活生物样品中的RNase，使保护试剂在整体上对离体生物组织RNA具有显著的保护作用，使样品中的RNA在一定时间内于室温或4℃保存仍不会被降解。本试剂可以免去使用液氮或超低温冰箱的不便，同时也可以有效解决组织、细胞样品的保存及运输问题。本发明的RNA保护试剂具体的有益效果体现在以下几个方面：
组织细胞内含有包裹RNase的溶酶体，用来降解不需要的mRNA。当细胞或组织死亡时，这些溶酶体会破裂，释放其中的RNase到细胞质空间，最终降解RNA。环境RNase很可能污染实验人员的手套、试剂、移液器、甚至是手，并导致研究者最不愿看到的结果，RNA被惊人地降解了。此外，当RNA暴露在二价阳离子比如钙离子或镁离子时，加热会催化羟基群提供电子对磷酸骨架发起亲核性攻击，进而导致RNA降解，另外，RNA既不耐酸，也不耐碱，但在偏酸性溶液中较稳定。本发明所述的RNA保护试剂在保存过程中能够保护RNA不被氧化，同时又不会对RNase提供保护，反而会使RNase迅速灭活，这种效果主要来自于本发明保护试剂中的DTT和EDTA。DTT是一种还原性很强的小分子有机还原剂，化学式为C4H10O2S2，其还原状态下为线性分子，被氧化后变为包含二硫键的六元环状结构，其还原性很大程度上是由于其氧化状态六元环(含二硫键)的构象稳定性。DTT的还原力受pH值的影响，只在pH值大于7的情况下能够发挥还原作用。这是因为只有脱去质子的硫醇盐负离子(-S–)才具有反应活性，硫醇(-SH)则没有；而巯基的pKa一般为～8.3。本发明巧妙地利用了这一点，将本发明的RNA保护试剂pH调节为弱酸性，这种环境下添加DTT能够保护RNA不被氧化，同时又不能保护RNase(RNA酶是蛋白质)。试验证明，在其他组分及含量都不变的情况下，加了DTT的保护试剂比不加DTT的保护试剂对生物组织RNA的保护效果有非常显著的提高。EDTA是强络合剂，可起到去除RNase活性的作用。核酸酶(包括RNase和DNase等)发挥活性靠的是多聚体结构(二聚体或四聚体等)，单体通过镁离子(Mg2+)或钙离子(Ca2+)等二价阳离子络合聚在一起维持多聚体结构，从而维持了核酸酶活性，一旦二价阳离子被EDTA络合，多聚体结构就解体，核酸酶就失去了活性。
从新鲜组织、细胞中提取RNA时，往往由于种种原因不能立即处理样品，此时即使将样品保存于-80℃，样品中的RNA也会不同程度地降解，而液氮保存又极不方便。本发明的RNA保护试剂可以免去使用液氮或超低温冰箱的不便，同时也可以有效解决组织、细胞样品的保存及运输问题。此外，如果将不同时期收集的样品都预先存放于本试剂中，可以做到立即终止并固定RNA表达的时序变化，减少实验组间的误差。本发明的RNA保护试剂之所以能够迅速渗入到新鲜组织细胞的胞浆中，主要是其中的PGG和甘油协同作用的结果。PGG通常用于抗病毒、抗氧化，并具有诱导癌细胞凋亡的功效。已有研究发现PGG能增强细胞的吞噬作用，使DNA疫苗在细胞转染时增加转染效率，导致外源DNA等物质高效快速进入细胞，增加了外源物质对细胞的渗透效果。本发明人经过大量试验发现，将PGG与甘油以特定比例加入本发明的RNA保护试剂后，保护试剂向细胞内渗透的速度得到了意料不到的成倍提升，其中PGG增强了细胞的吞噬作用，甘油则增加了细胞的渗透压，两者相辅相成，协同增效，共同使本发明RNA保护试剂以理想的速度渗透进入细胞内。在此基础上，本发明优选的方案中采用提取自中药白芍的PGG，与化学合成的PGG相比，同样来自天然物质的PGG能够很好的保护生物组织的天然属性。
内源RNase量在不同种类组织中差异极大。脑组织和心组织拥有相对最低的内源RNase，胸腺组织和胰腺组织拥有比脑组织多100,000倍内源RNase。着手样品破裂匀浆时，考虑以上因素，在获得样品的最初时间将富含RNase的样品放入本发明所述的RNA保护试剂中，进行后续破裂匀浆。组织切割后浸没入本发明所述的RNA保护试剂中贮藏，不会损害后续RNA分离步骤所获得的RNA质量和数量。只需将样品(组织、细胞、土壤、昆虫、植物等等)浸入5倍体积的本发明的RNA保护试剂中保存，就可保护样品内RNA免于内源RNase降解。大多数组织经本发明的RNA保护试剂处理后可以在室温或低温保存很长时间，在-20℃/-80℃甚至更长。
本发明所述的RNA保护试剂是一种非特异性的蛋白变性剂。在它的作用下不仅RNase被变性抑制从而保护RNA，大多数蛋白酶同时也被变性抑制，因而同样可以保护样品中的DNA、表达谱和蛋白质完整性。
实践中如果使用本发明的保护试剂，无需液氮或干冰就可以让离体组织的RNA方便安全地在室温下保存一段时间，低温可长期保存，并且该试剂没有毒性，使用方便，用后可直接倒入水槽中。与液氮和干冰相比，成本低廉，约为市场上相关试剂的1/5-1/10，更不及品牌产品的1/20，而且对RNA的稳定作用更佳。本发明RNA保护试剂4℃保存有效期大于6个月，非常有利于推广普及。
本发明还提供所述的RNA保护试剂的制备方法，包括以下步骤：
在水中加入(NH4)2SO4，搅拌使其完全溶解，然后依次加入柠檬酸钠水溶液、EDTA水溶液、DTT水溶液、PGG水溶液和甘油，搅拌均匀后调pH至4.3～5.3，用水定容，最终使各组分达到所述的比例，得到本发明所述的RNA保护试剂。
本发明所述的制备方法中，所述的水优选超纯水。
本发明所述的制备方法中，优选使用硫酸调pH。
本发明还提供所述的RNA保护试剂在细菌培养、酵母培养、植物组织保存、动物组织保存、细胞培养或悬浮细胞(白细胞、流式细胞仪收集的细胞)保存等过程中的应用。
附图说明
图1是分别保存于本发明RNA保护试剂与RNA保护试剂中的HL60细胞RNA提取后的电泳结果对比图。
图2是分别保存于本发明RNA保护试剂与RNA保护试剂中的小鼠脾脏RNA提取后的电泳结果对比图。
图3A是分别保存于本发明RNA保护试剂与RNA保护试剂中的烟草叶片RNA提取后的电泳结果对比图；图3B是β-actin(500bp)电泳结果图。
图4A是分别保存于本发明RNA保护试剂与RNA保护试剂中的大鼠脾脏RNA提取后的电泳结果对比图；图4B是β-actin(750bp)电泳结果。
具体实施方式
本发明的技术方案中，所述的柠檬酸钠、乙二胺四乙酸(EDTA)、硫酸铵、二硫苏糖醇(DTT)、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖(1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose，PGG)、甘油、硫酸、超纯水等原料或组分均为现有试剂，或可以通过现有产品通过现有方法制备的试剂，各试剂的来源如下表1：
表1
药品名称 生产厂家 Code
柠檬酸钠 SIGMA W302600
乙二胺四乙酸二钠 上海生工 E0105
二硫苏糖醇(DTT) SIGMA D9779
1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖 同田生物 14937-32-7
甘油 上海生工 56-81-5
硫酸铵 SIGMA A4418
硫酸 沈阳化工 分析纯
本发明所述的制备方法中，所述的柠檬酸钠水溶液、EDTA水溶液、DTT水溶液、PGG水溶液制备方法分别如下：
配制1M柠檬酸钠水溶液：柠檬酸钠分子量为294.1，称取柠檬酸钠44.1g于100mlMilli-Q水中搅拌溶解，用Milli-Q水定容至150ml，4℃保存。
配制0.5M EDTA水溶液：EDTA·2Na·2H2O分子量为372.24，称取EDTA·2Na·2H2O 22.4g于75ml Milli-Q水中搅拌溶解，用5N和1N NaOH调pH至8.0，用Milli-Q水定容至120ml，4℃保存。
配制1M DTT水溶液：DTT分子量为154.2，称取DTT 7.66g于40ml Milli-Q水中，用Milli-Q水定容至50ml，现用现配。
配制10mM PGG水溶液：PGG分子量940.68，称取提取自白芍、纯度(HPLC)≥98％的PGG 94mg于8ml Milli-Q水中，用Milli-Q水定容至10ml，4℃保存。
以下通过实施例的方式对本发明的技术方案作出进一步的说明，并通过相关实验证明本发明RNA保护试剂的有益效果。
实施例1
一种RNA保护试剂，按照以下方法配制：
在5L灭菌玻璃瓶中加入2.2L Milli-Q水，加入1.74kg(NH4)2SO4，搅拌使其完全溶解，然后依次加入按照上述方法配制好的试剂：62.1ml 1M柠檬酸钠水溶液，50ml 0.5M EDTA水溶液，50ml 1M DTT水溶液，3.6ml 10mM PGG水溶液，最后再加入18ml甘油，搅拌均匀，用1M H2SO4室温精调pH至5.2，用Milli-Q水定容至3.6L，用1L(0.22um)过滤器过滤配制好的溶液，于4℃保存。
制得的RNA保护试剂A中含有：17mM柠檬酸钠、7mM EDTA、48％(W/V)硫酸铵、14mM DTT、10μM PGG和0.005％(V/V)甘油。
实施例2
一种RNA保护试剂，按照以下方法配制：
在5L灭菌玻璃瓶中加入2.2L Milli-Q水，加入1.44kg(NH4)2SO4，搅拌使其完全溶解，然后依次加入按照上述方法配制好的试剂：54ml 1M柠檬酸钠水溶液，72ml 0.5M EDTA水溶液，72ml 1M DTT水溶液，2.9ml 10mM PGG水溶液，最后再加入3.6ml甘油，搅拌均匀，用1M H2SO4室温精调pH至5.3，用Milli-Q水定容至3.6L，用1L(0.22um)过滤器过滤配制好的溶液，于4℃保存。
制得的RNA保护试剂B中含有：15mM柠檬酸钠、10mM EDTA、40％(W/V)硫酸铵、20mM DTT、8μM PGG和0.001％(V/V)甘油。
实施例3
一种RNA保护试剂，按照以下方法配制：
在5L灭菌玻璃瓶中加入2.2L Milli-Q水，加入1.98kg(NH4)2SO4，搅拌使其完全溶解，然后依次加入按照上述方法配制好的试剂：72ml 1M柠檬酸钠水溶液，25ml 0.5M EDTA水溶液，25ml 1M DTT水溶液，5.4ml 10mM PGG水溶液，最后再加入36ml甘油，搅拌均匀，用1M H2SO4室温精调pH至4.8，用Milli-Q水定容至3.6L，用1L(0.22um)过滤器过滤配制好的溶液，于4℃保存。
制得的RNA保护试剂C中含有：20mM柠檬酸钠、5mM EDTA、55％(W/V)硫酸铵、10mM DTT、15μM PGG和0.010％(V/V)甘油。
质量控制(QC)：
1、收集生长状态良好的HL60细胞平均分成4管(约106cell/tube)，用PBS清洗后离心，弃去PBS，其中两管分别加入500μl本实施例新制造的RNA保护试剂和Control RNA保护试剂充分悬浮细胞，于37℃条件下保存2天。剩余两管中，一管于-80℃保存两天，作为正对照(P)，一管不加任何保护试剂，于37℃保存两天，作为负对照(N)。
2、保存的样品利用RNA提取试剂(RNAiso Reagent)提取Total RNA。
①保存的样品12000×g离心1分钟，弃去RNA保护试剂，加入1ml RNAiso Reagent振荡5分钟。P和N直接加入1ml RNAiso Reagent振荡5分钟。
②加入1/5体积氯仿混匀，静置10分钟，12000×g离心10分钟，取上清于另一个tube中。
③加入等体积异丙醇混匀，静置5分钟，12000×g离心15分钟，弃上清，保留沉淀。
④加入70％用DEPC水溶解的冷乙醇，12000×g离心5分钟，保留沉淀。
⑤沉淀自然风干，至乙醇完全挥发(约5分钟)，加入50μl的DEPC水溶解所得沉淀。
3、将上述操作提取的RNA样品，取1μl使用1％琼脂糖凝胶，在180V电压下，在0.5×TAEbuffer中(RNA专用)电泳15分钟，观察电泳结果。
[QC结果判定标准]
与control相比，本实施例试剂的RNA条带无明显变化，28s、18s、5s条带清晰，其中28s为18s的1-1.5倍，没有明显的降解现象。
[注意事项]
RNA与DNA相比非常不稳定，容易分解，手指的汗液，和空气中尘埃等容易混入RNase，操作时空气进入tube内，或是用手接触tube盖的内侧，都会使其中的RNA降解。而蛋白质则非常稳定，即使在100℃10分钟，也能在室温下恢复活性，因此，RNA相关实验，重要的试剂往往用RNase Inhibitor和DEPC处理，实验仪器使用RNA专用的仪器，使其完全不含有RNase。
应用实施例
一、RNA保护试剂的使用方法
操作步骤：
1.样品的取得：
1.1动物组织、植物组织：把组织切成0.5cm左右的组织块，加入5倍体积的本发明的RNA保护试剂，于适当条件下保存。
1.2培养细胞、白细胞：按标准实验操作方法收集细胞，弃上清，用PBS清洗后加入5倍体积本发明的RNA保护试剂，于适当条件下保存。
1.3酵母：收集大约108个细胞(12,000g，2min)，弃上清，加入0.5-1ml本发明的RNA保护试剂保存，在25℃可以保存8小时以上，4℃可以保存一周，长期保存应把酵母细胞置于本发明的RNA保护试剂中放置1小时，然后离心收集细胞(12,000g，5min)，弃上清后于-80℃冻存。
2.保存：一般来说，本发明的RNA保护试剂保存的样品在37℃可以保存1天以上；25℃可以保存1周；4℃可以保存一个月；-20℃和-80℃可以长期保存。
3.RNA提取：
3.1去除本发明的RNA保护试剂，组织块可以直接用灭菌镊子从RNA保护试剂中取出，细胞应先离心(＞5,000g，5min)，收集细胞沉淀。(因为RNA保护试剂密度较大，需要使用大于普通介质的离心力。)
3.2采用各种常见的RNA抽提试剂盒提取样品RNA。
二、对比试验
1.对HL60细胞RNA的保护
本对比试验使用不同的RNA保护试剂保存HL60细胞，不同时间后使用Trizol reagent进行RNA提取，所述的保护试剂及保持条件见表2：
表2
RNA保护试剂 保存温度 保存时间
正对照(P) - 培养细胞立即进行RNA提取
A 本发明实施例1 37℃ 1day
B Ambion 37℃ 1day
负对照1(N1) - 37℃ 不加保护试剂，1day
C 本发明实施例1 25℃ 1week
D Ambion 25℃ 1week
负对照2(N2) - 25℃ 不加保护试剂，1week
提取后各组HL60细胞的RNA电泳结果显示，本发明的RNA保护试剂能够很好地抑制HL60细胞RNA的降解，尤其是在25℃下保存1周时，保存效果明显优于Ambion公司的RNA保护试剂，具体电泳结果见图1。
2.对小鼠脾脏RNA的保护
使用不同RNA保护试剂保存，不同时间后使用Trizol reagent进行RNA提取，所述的保护试剂及保持条件见表3：
表3
RNA保护试剂 保存温度 保存时间
C 本发明实施例2 25℃ 1week
D Ambion 25℃ 1week
负对照 - 25℃ 不加保护试剂，1week
提取后各组小鼠脾脏RNA电泳结果显示，本发明的RNA保护试剂能够很好地抑制RNA降解，对于脾脏25℃下一周的保存效果明显优于Ambion公司的RNA保护试剂，具体电泳结果见图2。
3.对烟草叶片RNA的保护
使用不同RNA保存试剂保存，不同时间后使用Trizol reagent进行RNA提取，所述的保护试剂及保持条件见表4：
表4
RNA保护试剂 保存温度 保存时间
正对照(P) - 烟草叶片立即进行RNA提取
A Ambion 37℃ 1day
B 本发明实施例1 37℃ 1day
负对照1(N1) - 37℃ 不加保护试剂，1day
C 本发明实施例1 25℃ 1week
D Ambion 25℃ 1week
负对照2(N2) - 25℃ 不加保护试剂，1week
对C组提取后的烟草RNA进行β-actin(500bp)的RT－PCR扩增检测，参数如下：
检测结果显示，本发明RNA保护试剂能够明显抑制植物RNA降解。在保存过程中发现：本发明保护试剂中的烟草叶片始终是绿色，Ambion RNA保护液中的叶片2-3days后开始发黄。研究发现这是由于PGG和甘油等的协同作用，使本发明的RNA保护试剂高效快速渗透到烟草叶片中，很好的保护了植物组织的天然属性。总之上述实验结果说明本发明RNA保护试剂对植物叶子的保鲜效果优于Ambion RNA保护液，提取RNA后电泳结果见图3A，C组β-actin(500bp)电泳结果见图3B。
4.对大鼠脾脏RNA的保护
使用不同RNA保护试剂保存，不同时间后使用Trizol reagent进行RNA提取，所述的保护试剂及保持条件见表5：
表5
RNA保护试剂 保存温度 保存时间
正对照(P) - 大鼠脾脏立即进行RNA提取
A Ambion 37℃ 1day
B 本发明实施例3 37℃ 1day
负对照1(N1) - 37℃ 不加保护试剂，1day
C Ambion 25℃ 1week
D 本发明实施例3 25℃ 1week
负对照2(N2) - 25℃ 不加保护试剂，1week
对D组提取后的大鼠脾脏RNA进行β-actin(750bp)的RT－PCR扩增检测，参数如下：
结果显示，本发明RNA保护试剂能很好的抑制大鼠脾脏RNA的降解，并且对后续的RT-PCR反应无影响，提取RNA后电泳结果见图4A，D组β-actin(750bp)电泳结果见图4B。
结论：本发明RNA保护试剂可以有效保护新鲜动植物组织RNA的完整性，不影响RNA的提取及随后的RT-PCR反应。

Claims (9)

1.一种RNA保护试剂，其特征在于，它含有以下组分：15～20mM柠檬酸钠、5～10mM乙二胺四乙酸、40～55％W/V硫酸铵、10～20mM二硫苏糖醇、8～15μM 1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖和0.001～0.010％V/V甘油。
2.权利要求1所述的RNA保护试剂，其特征在于，它含有以下组分：15～18mM柠檬酸钠、6～8mM乙二胺四乙酸、45～50％W/V硫酸铵、12～18mM二硫苏糖醇、8～12μM1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖和0.004～0.006％V/V甘油。
3.权利要求1所述的RNA保护试剂，其特征在于，它含有以下组分：17mM柠檬酸钠、7mM乙二胺四乙酸、48％W/V硫酸铵、14mM二硫苏糖醇、10μM 1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖和0.005％V/V甘油。
4.权利要求1-3任意一项所述的RNA保护试剂，其特征在于，所述的1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖提取自白芍，纯度(HPLC)≥98％。
5.权利要求1所述的RNA保护试剂，其特征在于，所述的RNA保护试剂pH值在4.3～5.3之间，优选5.0～5.3，最优选5.2。
6.制备权利要求1所述的RNA保护试剂的方法，包括以下步骤：
在水中加入(NH4)2SO4，搅拌使其完全溶解，然后依次加入柠檬酸钠水溶液、EDTA水溶液、DTT水溶液、PGG水溶液和甘油，搅拌均匀后调pH至4.3～5.3，用水定容，最终使各组分达到所述的比例，得到所述的RNA保护试剂。
7.权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的水为超纯水。
8.权利要求6所述的方法，其特征在于，使用硫酸调pH。
9.权利要求1所述的RNA保护试剂在细菌培养、酵母培养、植物组织保存、动物组织保存、细胞培养或悬浮细胞保存过程中的应用。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105145545A (zh) * 2015-07-27 2015-12-16 北京泛生子生物科技有限公司 用于常温条件下长期保存和运输组织样本的核酸保护液
CN105506129A (zh) * 2016-01-01 2016-04-20 广州邦德盛生物科技有限公司 一种rna类样本保存稀释液及其制备
WO2018040849A1 (zh) * 2016-08-30 2018-03-08 成都瑞琦科技实业股份有限公司 孕妇外周血中胎儿游离dna的保存剂及其构成的真空采血管
CN108094407A (zh) * 2017-12-29 2018-06-01 浙江今复康生物科技有限公司 一种细胞保存液及痰液细胞参考品的制备方法
CN108669070A (zh) * 2018-05-26 2018-10-19 温州医科大学 一种植物组织和细胞的低温保存溶液及其使用方法
CN109576262A (zh) * 2017-09-28 2019-04-05 东北林业大学 一种广泛适用于植物野外取样的保存液配方及其使用方法
CN109609498A (zh) * 2019-01-28 2019-04-12 温州医科大学附属第医院 一种动物组织rna的样品保存液及其保存方法
CN112251489A (zh) * 2019-07-22 2021-01-22 北京华颉基因医疗技术有限公司 一种血液rna保护剂及其制备方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101778673A (zh) * 2007-08-02 2010-07-14 普瑞阿那利提克斯有限公司 用于固定/稳定化样品的方法和装置
CN101999344A (zh) * 2010-12-27 2011-04-06 协和干细胞基因工程有限公司 一种保存离体组织的保存液及其制备方法
CN103230405A (zh) * 2013-04-16 2013-08-07 暨南大学 五没食子酰葡萄糖在杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物的应用
US20140295411A1 (en) * 1998-07-31 2014-10-02 Applied Biosystems, Llc Methods and reagents for preserving rna in cell and tissue samples
CN104263721A (zh) * 2014-09-19 2015-01-07 宁波有成生物医药科技有限公司 一种保护痰液中核酸(dna和rna)的痰纸及核酸提取方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140295411A1 (en) * 1998-07-31 2014-10-02 Applied Biosystems, Llc Methods and reagents for preserving rna in cell and tissue samples
CN101778673A (zh) * 2007-08-02 2010-07-14 普瑞阿那利提克斯有限公司 用于固定/稳定化样品的方法和装置
CN101999344A (zh) * 2010-12-27 2011-04-06 协和干细胞基因工程有限公司 一种保存离体组织的保存液及其制备方法
CN103230405A (zh) * 2013-04-16 2013-08-07 暨南大学 五没食子酰葡萄糖在杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物的应用
CN104263721A (zh) * 2014-09-19 2015-01-07 宁波有成生物医药科技有限公司 一种保护痰液中核酸(dna和rna)的痰纸及核酸提取方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YANYAN CAO ET AL.: "Biological and biomedical functions of Penta-O-galloyl-D-glucose and its derivatives", 《J NAT MED》 *
凌沛学: "《眼科药物与制剂学》", 31 January 2010, 中国轻工业出版社 *
时维静等: "《中药分析与检测》", 30 September 2010, 化学工业出版社 *
杜迎彬等: "对虾组织样品中RNA的铵盐常温保存法及其效果", 《渔业科学进展》 *
王华等: "保存动物组织内RNA的方法改进", 《生物技术通报》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105145545A (zh) * 2015-07-27 2015-12-16 北京泛生子生物科技有限公司 用于常温条件下长期保存和运输组织样本的核酸保护液
CN105506129A (zh) * 2016-01-01 2016-04-20 广州邦德盛生物科技有限公司 一种rna类样本保存稀释液及其制备
WO2018040849A1 (zh) * 2016-08-30 2018-03-08 成都瑞琦科技实业股份有限公司 孕妇外周血中胎儿游离dna的保存剂及其构成的真空采血管
CN109576262A (zh) * 2017-09-28 2019-04-05 东北林业大学 一种广泛适用于植物野外取样的保存液配方及其使用方法
CN108094407A (zh) * 2017-12-29 2018-06-01 浙江今复康生物科技有限公司 一种细胞保存液及痰液细胞参考品的制备方法
CN108669070A (zh) * 2018-05-26 2018-10-19 温州医科大学 一种植物组织和细胞的低温保存溶液及其使用方法
CN108669070B (zh) * 2018-05-26 2021-05-25 温州医科大学 一种植物组织和细胞的低温保存溶液及其使用方法
CN109609498A (zh) * 2019-01-28 2019-04-12 温州医科大学附属第医院 一种动物组织rna的样品保存液及其保存方法
CN112251489A (zh) * 2019-07-22 2021-01-22 北京华颉基因医疗技术有限公司 一种血液rna保护剂及其制备方法

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