CN111926059A - 一种痰液中微生物核酸新型保存液 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种痰液中微生物核酸新型保存液，所述保存液包括如下按质量份计算的组份：15～30％核酸酶抑制剂；1.5～5％pH值稳定剂；0.8～1.5％螯合剂；0.05～0.15％粘液溶解剂；0.1～0.5％十二烷基肌氨酸钠；10～20％异丙醇；2～15％丙三醇；余量为灭菌水。本发明所述痰液中微生物核酸新型保存液能够快速溶解以及稳定痰液样本，还能够有效抑制核酸酶的活性并防止细胞裂解，且样品抗菌性好，保存时间久，此外所述的核酸新型保存液成分相对简单且成本低，同时能够在室温条件下保持核酸，非常适合在临床广泛使用。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及一种痰液中微生物核酸新型保存液。
背景技术
痰是呼吸道受到刺激分泌的液体，也叫痰液，成分包含粘液、异物、病原微生物，各种炎症细胞、坏死脱落的粘膜上皮细胞等。目前在临床上，痰液样本主要用于痰液细胞学检测以及呼吸道病原体检测，其中，通过检测痰液样本中病原体的核酸来鉴定病原体的种类是目前最精准且最快速的呼吸道病原体诊断方法。然而在实际操作中，痰液样本中的核酸(尤其是RNA)极不稳定，通常在温室条件下数小时就被降解。造成核酸降解的外界物理因素如温度、湿度、紫外线等；化学因素如强酸或强碱环境、水解反应等；生物因素如酶解及微生物侵染等。其中，生物因素是造成核酸不稳定的最主要原因，痰液中细胞破裂释放的核酸酶以及操作过程中因污染引入的核酸酶会造成核酸降解；痰液通常被一种或多种微生物污染，这些微生物含有可以与痰液样品来源的核酸一起被检测的核酸。
目前已有部分专利公开了用于保护核酸的方法，然而，现有的专利涉及的技术对于痰液样本的实用性较差，大多还存在以下问题：现有的保存液难以同时兼顾抑制核酸酶的活性和防止细胞裂解；抑菌效果差，微生物易滋生；保存时间不够长等。
发明内容
本发明旨在克服上述现有技术的至少一种缺陷，提供一种痰液中微生物核酸新型保存液，所述痰液中微生物核酸新型保存液能够快速溶解以及稳定痰液样本，还能够有效抑制核酸酶的活性并防止细胞裂解，且样品抗菌性好，保存时间久。
本发明采取的技术方案如下：
一种痰液中微生物核酸新型保存液，包括如下按质量份计算的组份：
核酸酶抑制剂15～30％；
pH值稳定剂1.5～5％；
螯合剂0.8～1.5％；
粘液溶解剂0.05～0.15％；
十二烷基肌氨酸钠0.1～0.5％；
异丙醇10～20％；
丙三醇2～15％；
余量为灭菌水。
本发明所述的微生物核酸新型保存液使用核酸酶抑制剂能够抑制体系中的核酸酶活性，防止痰液样本中的核酸被降解；pH值稳定剂能够保持痰液样本为中性或弱碱性，为痰液样本中的核酸提供相对稳定的pH值环境；螯合剂能够进一步抑制核酸酶的活性；粘液溶解剂通过分解粘蛋白复合物、核酸，能够将痰中的脓性成分及其它粘液和粘液分泌物从粘稠变为稀薄而发挥强烈的粘液溶解作用，能够使痰液中微生物核酸新型保存液充分溶解痰液；十二烷基肌氨酸钠作为表面活性剂，具有良好的生物溶解性和杀菌抑菌性，还能抑制DNA转录；异丙醇能够沉淀核酸，减少气泡现象，丙三醇可以使保存液更加稳定。本发明通过合理配制各组份，使得所制备的痰液中微生物核酸新型保存液能够快速溶解以及稳定痰液样本，还能够有效抑制核酸酶的活性并防止细胞裂解，且样品抗菌性好，保存时间久。
优选地，所述的痰液中微生物核酸新型保存液，包括如下按质量份计算的组份：
核酸酶抑制剂22～30％；
pH值稳定剂2～5％；
螯合剂0.8～1.2％；
粘液溶解剂0.1～0.15％；
十二烷基肌氨酸钠0.3～0.4％；
异丙醇10～20％；
丙三醇3～15％；
余量为灭菌水。
优选地，所述核酸酶抑制剂为盐酸胍/异硫氰酸胍与8-羟基喹啉的混合物。
盐酸胍或异硫氰酸胍能变性裂解细胞，提取RNA和DNA，并抑制细胞释放出的核酸酶，8-羟基喹啉为RNAse抑制剂，其与盐酸胍或异硫氰酸胍联合使用可以增强抑制核糖核酸酶的功效。
优选地，所述核酸酶抑制剂中盐酸胍/异硫氰酸胍与8-羟基喹啉的质量比为(6～10)：1。
优选地，所述pH值稳定剂为三羟甲基氨基甲烷或双(2-(羟甲基)氨基-三(羟甲基)甲烷。
优选地，所述鳌合剂为乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二钠(盐)。
优选地，所述粘液溶解剂为N-乙酰基-L-半胱氨酸。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明所述的痰液中微生物核酸新型保存液能够快速溶解痰液样本，使痰液样本可以与本保存液充分混合均匀，能快速自动提取痰液的核酸，有效抑制核酸酶的活性并防止细胞裂解，稳定核酸，避免核酸被降解；本发明所述的核酸新型保存液成分相对简单且成本低，同时能够在室温条件下保持核酸，非常适合在临床广泛使用；本发明所述的核酸新型保存液抗菌性好，保存时间久，能够提供充足的送检、受检时间。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
下述实施例中所用的实验原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为普通市售产品。
以下实施例所述的灭菌水均为不含核酸酶的灭菌水。
实施例
将210g异硫氰酸胍溶于等质量的灭菌水中，配制质量浓度为50％的异硫氰酸胍水溶液，将30g 8-羟基喹啉溶于90g异丙醇配制质量浓度为25％的8-羟基喹啉-异丙醇溶液，将异硫氰酸胍水溶液和8-羟基喹啉-异丙醇溶液混合得到核酸酶抑制剂。
35g将三羟甲基氨基甲烷溶于105g灭菌水中，配制质量浓度为25％的三羟甲基氨基甲烷溶液，作为pH稳定剂。
10g乙二胺乙二胺四乙酸二钠溶于30g灭菌水中，配制质量浓度为25％的乙二胺乙二胺四乙酸二钠溶液，作为螯合剂。
将配制的核酸酶抑制剂、pH稳定剂、螯合剂混合均匀，然后加入1g粘液溶解剂N-乙酰基-L-半胱氨酸和4g十二烷基肌氨酸钠，搅拌均匀，再加入100g丙三醇和60g异丙醇，最后加入115g灭菌水，搅拌均匀得到痰液中微生物核酸新型保存液，所得的微生物核酸新型保存液各组分的最终质量分数如下：
核酸酶抑制剂24％；
pH值稳定剂3.5％；
螯合剂1％；
粘液溶解剂0.1％；
十二烷基肌氨酸钠0.4％；
异丙醇15％；
丙三醇10％；
余量为灭菌水。
保存液性能测试
1、健康志愿者样品实验：
样品：选5名健康志愿者的痰液，在收集唾液样本前30min，受试者用清水漱口，并保持口腔清洁，清洁口腔后勿进食、吸烟、嚼口香糖、饮水等，用加温45℃左右的10％的盐水雾化吸入喉咙，痰咳出后立即放入干净消毒的痰盒内。取每名志愿者的痰液2mL，均分为2份，每个志愿者的两组痰液记为A组、B组，每份约1mL。
处理方法：
(1)实验组
将其中一份A组痰液与上述痰液中微生物核酸新型保存液按照积比1：1的比例混合，然后将混合后的混合液再分为两份，记为样品1和样品2，其中样品1在在4℃条件下保存，样品2在25℃保存。将B组样品也分为两份，记为样品3和样品4，样品3在4℃条件下保存，样品4在25℃保存。将样品1再分为4份，记为样品A1、样品A2、样品A3、样品A4。保存1h后取200μL样品A1，用市售痰液试剂盒核酸提取或纯化试剂提取得到痰液样本的基因组DNA，DNA总体积50μL；保存3天后取200μL样品A2，采用同样的方法提取痰液样本的基因组DNA；保存5天后取200μL样品A3，采用同样的方法提取痰液样本的基因组DNA；保存7天后取200μL样品A4，采用同样的方法提取痰液样本的基因组DNA。用NanoDrop one检测其浓度(单位为ng/μL)。
采用同样的方式，将样品2分为4份，记为样品A5、样品A6、样品A7、样品A8，分别对应保存时间为1h、3天、5天、7天，分别测定提取的基因组浓度。实验结果见表1、表2所示。
(2)对照组
将样品3分为4份，记为样品B1、样品B2、样品B3、样品B4，分别在4℃保存1h、3天、5天、7天后，然后分别取200μL样品B1、样品B2、样品B3、样品B4，用市售痰液试剂盒核酸提取或纯化试剂提取得到痰液样本的基因组DNA，DNA总体积50μL，再进行直接采用NanoDropone法进行基因组DNA浓度测定。采用同样的方式，将样品4分为4份，记为样品B5、样品B6、样品B7、样品B8，分别对应保存时间为1h、3天、5天、7天，保存温度为25℃，分别测定提取的基因组DNA浓度。实验结果见表1、表2所示。
表1 4℃保存条件下实验组和对照组的DNA浓度测定(健康志愿者)(浓度单位：ng/μL)
从表1的结果可知，经过所述痰液中微生物核酸新型保存液处理的实验组样品1中，在4℃条件下保存1h、3天、5天和7天，所得的核酸其浓度基本维持稳定，没有出现明显的降解，5天后的降解率大为维持8％，7天后的降解率大约维持在13％左右；而未做任何处理的对照组样样品3，保存7天后核酸其浓度差不多减半。可见本发明所述的痰液中微生物核酸新型保存液能够较好的维持痰液中核酸的稳定性。
表2 25℃保存条件下实验组和对照组的DNA浓度测定(浓度单位：ng/μL)
从表2的结果可知，经过所述痰液中微生物核酸新型保存液处理的实验组样品2中，在25℃条件下保存1h、3天、5天和7天，所得的核酸其浓度也较为稳定，没有出现明显的降解，7天后的降解率大约维持在15％左右；而未做任何处理的对照组样样品4，保存7天后核酸其浓度差不多降低了54％。可见本发明所述的痰液中微生物核酸新型保存液在常温保持条件下也能能够较好的维持痰液中核酸的稳定性。
2、肺结核患者样品实验：
样品：选5名肺结核患者痰液，在收集唾液样本前30min，受试者用清水漱口，并保持口腔清洁，清洁口腔后勿进食、吸烟、嚼口香糖、饮水等，用加温45℃左右的10％的盐水雾化吸入喉咙，痰咳出后立即放入干净消毒的痰盒内。取每名患者的痰液2mL，均分为2份，每个志愿者的两组痰液记为C组、D组，每份约1mL。
处理方法：
(1)实验组
将其中一份C组痰液与上述痰液中微生物核酸新型保存液按照积比1：1的比例混合，然后将混合后的混合液再分为两份，记为样品5和样品6，其中样品5在在4℃条件下保存，样品6在25℃保存。将D组样品也分为两份，记为样品7和样品8，样品7在4℃条件下保存，样品8在25℃保存。将样品5再分为4份，记为样品C1、样品C2、样品C3、样品C4。保存1h后取200μL样品C1，用市售痰液试剂盒核酸提取或纯化试剂提取得到痰液样本的基因组DNA，DNA总体积50μL；保存3天后取200μL样品C2，采用同样的方法提取痰液样本的基因组DNA；保存5天后取200μL样品C3，采用同样的方法提取痰液样本的基因组DNA；保存7天后取200μL样品C4，采用同样的方法提取痰液样本的基因组DNA。用NanoDrop one检测其浓度(单位为ng/μL)。
采用同样的方式，将样品6分为4份，记为样品C5、样品C6、样品C7、样品C8，分别对应保存时间为1h、3天、5天、7天，分别测定提取的基因组浓度。实验结果见表3、表4所示。
(2)对照组
将样品7为4份，记为样品D1、样品D2、样品D3、样品D4，在4℃保存条件下分别对应保存时间为1h、3天、5天、7天，分别测定提取的基因组DNA浓度。采用同样的方式，将样品8分为4份，记为样品D5、样品D6、样品D7、样品D8，分别对应保存时间为1h、3天、5天、7天，保存温度是25℃，分别测定提取的基因组DNA浓度。实验结果见表3、表4所示。
表3 4℃保存条件下实验组和对照组的DNA浓度测定(肺结核患者)(浓度单位：ng/μL)
表4 25℃保存条件下实验组和对照组的DNA浓度测定(肺结核患者)(浓度单位：ng/μL)
通过表3、表4可知，经过所述痰液中微生物核酸新型保存液处理的肺结核患者的痰液样品，在4℃、25℃条件下保存1h、3天、5天和7天，所得的DNA浓度也较为稳定，样品的稳定性明显优于而未做任何处理的对照组样品，可见本发明所述的痰液中微生物核酸新型保存液能够较好的维持痰液中核酸的稳定性。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种痰液中微生物核酸新型保存液，其特征在于，包括如下按质量份计算的组份：
核酸酶抑制剂15～30％；
pH值稳定剂1.5～5％；
螯合剂0.8～1.5％；
粘液溶解剂0.05～0.15％；
十二烷基肌氨酸钠0.1～0.5％；
异丙醇10～20％；
丙三醇2～15％；
余量为灭菌水。
2.根据权利要求1所述的痰液中微生物核酸新型保存液，其特征在于，包括如下按质量份计算的组份：
核酸酶抑制剂22～30％；
pH值稳定剂2～5％；
螯合剂0.8～1.2％；
粘液溶解剂0.1～0.15％；
十二烷基肌氨酸钠0.3～0.4％；
异丙醇10～20％；
丙三醇3～15％；
余量为灭菌水。
3.根据权利要求1或2所述痰液中微生物核酸新型保存液，其特征在于，所述核酸酶抑制剂为盐酸胍/异硫氰酸胍与8-羟基喹啉的混合物。
4.根据权利要求3所述的痰液中微生物核酸新型保存液，其特征在于，所述核酸酶抑制剂中盐酸胍/异硫氰酸胍与8-羟基喹啉的质量比为(6～10)：1。
5.根据权利要求1或2所述的痰液中微生物核酸新型保存液，其特征在于，所述pH值稳定剂为三羟甲基氨基甲烷或双(2-(羟甲基)氨基-三(羟甲基)甲烷。
6.根据权利要求1或2所述的痰液中微生物核酸新型保存液，其特征在于，所述鳌合剂为乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二钠(盐)。
7.根据权利要求1或2所述的痰液中微生物核酸新型保存液，其特征在于，所述粘液溶解剂为N-乙酰基-L-半胱氨酸。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114134140A (zh) * | 2021-11-30 | 2022-03-04 | 上海康黎医学检验所有限公司 | 一种痰液保存裂解液及其试剂盒以及应用 |
| CN114875020A (zh) * | 2022-05-20 | 2022-08-09 | 上海前瞻创新研究院有限公司 | 一种稳定化核酸的溶液及其用途和方法 |
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| ES2938394A1 (es) * | 2021-10-06 | 2023-04-10 | Maeva Servet S L | Composición para el muestreo, inactivación de microorganismos y preservación de ácidos nucleicos de muestras ambientales |
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