CN112438253A - 一种唾液保存液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种唾液保存液及其制备方法,所述唾液保存液包括细胞稳定剂、核酸酶抑制剂、表面活性剂、蛋白质变性剂和防腐剂。本发明的唾液保存液具有良好的广谱抑菌性,可以抑制细菌、真菌等污染,使唾液样本在常温下保存一个月后仍能获得完整性、纯度均较好的基因组DNA,可应用于基因检测、流行病学调查等科研中保存受试者唾液。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域,尤其涉及一种唾液保存液及其制备方法。
背景技术
近些年来,科研和医药领域逐渐采用唾液取样的方式获取个体的DNA,对于常规科学研究,唾液样本相对于血液样本具有明显优势,不仅可以实现无痛、无创采集、操作简便,还可以获得足量的基因组DNA。唾液中主要含有水、口腔粘膜细胞、细菌、唾液淀粉酶、黏蛋白、糖蛋白以及无机物等成分,唾液中的DNA主要来源于口腔上皮粘膜细胞和唾液腺的白细胞,在唾液保存过程中,需要维持DNA的完整性,抑制核酸酶对DNA的降解作用,以及防止细菌、真菌等微生物对DNA纯度的污染。因此如何使唾液在长时间保存下还能获得纯度较高的DNA,成为唾液保存液的关键所在。
现有技术公开了一种人体唾液保存固定液及其制备与应用,该唾液保存固定液以蔗糖、Tris-HCl、氯化镁、异硫氰酸胍和水为主要成分。其中的蔗糖成分,虽能维持渗透压,但会引起细菌微生物的滋生;异硫氰酸胍成分,虽能使唾液中的蛋白质变性,但会裂解细胞,使DNA处于暴露游离状态,不利于维持DNA完整性。
本发明加入一种防腐剂,其具有良好的广谱抑菌性,可以抑制细菌、真菌等污染,价格低廉,在有效降低微生物污染的同时降低配制成本,简化配制过程,使唾液样本在常温下保存一个月后仍获得完整性、纯度均较好的基因组DNA,可应用于基因检测、流行病学调查等科研中保存受试者唾液。
发明内容
有鉴于此,本发明提出了一种抑菌性好、可长时间保存的一种唾液保存液及其制备方法。
本发明的技术方案是这样实现的:本发明提供了一种唾液保存液,包括细胞稳定剂、核酸酶抑制剂、表面活性剂、蛋白质变性剂和防腐剂。
在以上技术方案的基础上,优选的,所述防腐剂为2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮中的一种或两种组合。
在以上技术方案的基础上,优选的,所述防腐剂还包括稳定剂和水溶性基质。
在以上技术方案的基础上,优选的,所述稳定剂为烷基羧酸盐。
在以上技术方案的基础上,优选的,所述烷基羧酸盐为十二烷基琥珀酸、N-酰基氨基羧酸盐、十二烷基磺酸钠、4-乙基吡啶-2-羧酸盐、5-氨基吡啶-2-羧酸盐、1-丁基氨基-环己烷羧酸盐中的一种或多种组合。
在以上技术方案的基础上,优选的,所述水溶性基质为丙烯乙二醇、异丙醇、聚乙二醇、乙二醇单丁醚中的一种或多种组合。
在以上技术方案的基础上,优选的,按照重量份数计算,所述唾液保存液包括细胞稳定剂16-38份、核酸酶抑制剂5-15份,表面活性剂1-2份、蛋白质变性剂5-15份、防腐剂1-2份。
在以上技术方案的基础上,优选的,所述细胞稳定剂为PBS缓冲液,以PBS缓冲液1L计算,包括如下组分:100-150mmol/L的NaCl、1.5-2.5mmol/L的KCl、7-10mmol/L的Na2HPO4·12H2O和1-2mmol/L的KH2PO4,溶剂为去离子水。
在以上技术方案的基础上,优选的,所述核酸酶抑制剂为EDTA。
在以上技术方案的基础上,优选的,表面活性剂为Tween 20。
在以上技术方案的基础上,优选的,蛋白质变性剂为SDS。
更进一步优选的,还包括一种唾液保存液的制备方法,步骤如下:
S1,分别配制浓度为0.1-0.8mol/L的EDTA,质量体积分数为10%-15%的SDS,PH=7.4的PBS缓冲液,PBS缓冲液按照体积百分比配备:NaCl溶液65%-75%、KCl溶液1%-2%、Na2HPO4·12H2O溶液20%-28%和KH2PO4溶液2%-5%;
S2,将EDTA和PBS缓冲液在100-130℃条件下,灭菌10-30分钟;
S3,灭菌后的EDTA和PBS缓冲液冷却至20-30℃后,按照以下比例混合:EDTA5-15ml、SDS 5-15ml、Tween 200.5-1.5ml、防腐剂0.05-0.35ml,加入PBS缓冲液定容至50ml;
S4,将步骤S3混合液用0.20-0.30μm滤膜进行过滤,配制完成后在20-30℃条件下保存。
本发明的一种唾液保存液及其制备方法相对于现有技术具有以下有益效果:
(1)本发明唾液保存液中的EDTA作为螯合剂,Mg2+、Ca2+等是核酸酶激活剂,EDTA与这些金属离子螯合可保护DNA不会降解;SDS作为变性剂和抑菌剂,可将唾液中的黏蛋白等有机物质做变性处理,还可破坏核酸酶的活性,在降低液体粘性的同时可以减少微生物的污染,保护DNA的完整性;PBS在维持细胞渗透压的同时维持弱碱性环境,保护细胞稳定性;防腐剂具有良好的广谱抑菌性,可以抑制细菌(G+和G-)、真菌等污染,价格低廉,在有效降低微生物污染的同时降低配制成本,简化配制过程。
(2)本发明的唾液保存液可以抑制细菌、霉菌等微生物的繁殖和活性,无需冷冻,可以有效维持唾液样本在常温(20-30℃)下保存至少一个月不发生核酸污染和基因组DNA降解,可满足各种复杂的PCR实验。
(3)本发明的保存液不含叠氮钠、硫柳汞等传统防腐的有毒有害物质,可以保护操作人员和实验人员。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1-4唾液样本保存0天时的琼脂糖凝胶电泳图;
图2为实施例1-4唾液样本保存20天时的琼脂糖凝胶电泳图;
图3为实施例1-4唾液样本保持30天后琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式,对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式,而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式,都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)唾液保存液配备
S1,分别配制浓度为0.1mol/L的EDTA,质量体积分数为10%的SDS,PH=7.4的PBS缓冲液,PBS缓冲液按照体积百分比配备:NaCl溶液72%、KCl溶液1%、Na2HPO4·12H2O溶液25%和KH2PO4溶液2%;
S2,将EDTA和PBS缓冲液在100℃条件下灭菌10分钟;
S3,灭菌后的EDTA和PBS缓冲液冷却至20℃后,按照以下比例混合:EDTA5ml、SDS5ml、Tween 200.5ml、防腐剂0.05ml,加入PBS缓冲液定容至50ml;
S4,将步骤S3混合液用0.20μm滤膜进行过滤,配制完成后在20℃条件下保存。
其中PBS缓冲液,以PBS缓冲液1L计算,包括如下组分:100mmol/L的NaCl、1.5mmol/L的KCl、7mmol/L的Na2HPO4·12H2O和1mmol/L的KH2PO4,溶剂为去离子水。
防腐剂成分为2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、十二烷基琥珀酸、丙烯乙二醇。
(2)唾液保存液的使用方法:
采集前准备:被采集者在采集唾液半小时前,用清水漱口,若涂有口红或唇膏需先卸妆,之后半小时内勿进食、吸烟或嚼口香糖等。
采集:先在唾液收集保存管中加入2ml唾液保存液,采集唾液时,用牙齿轻轻刮蹭两颊口腔黏膜处,然后将唾液吐至唾液收集保存器中,当唾液收集保存管中唾液液体凹液面最低处达到4ml时停止收集。将唾液收集保存管的管盖拧紧,上下颠倒十次,使唾液与保存液混合均匀之后在20℃条件下保存。
实施例2
(1)唾液保存液配备
S1,分别配制浓度为0.8mol/L的EDTA,质量体积分数为15%的SDS,PH=7.4的PBS缓冲液,PBS缓冲液按照体积百分比配备:NaCl溶液75%、KCl溶液2%、Na2HPO4·12H2O溶液20%和KH2PO4溶液3%;
S2,将EDTA和PBS缓冲液在130℃条件下灭菌30分钟;
S3,灭菌后的EDTA和PBS缓冲液冷却至30℃后,按照以下比例混合:EDTA15ml、SDS15ml、Tween201.5ml、防腐剂0.35ml,加入PBS缓冲液定容至50ml;
S4,将步骤S3混合液用0.30μm滤膜进行过滤,配制完成后在30℃条件下保存。
其中PBS缓冲液,以PBS缓冲液1L计算,包括如下组分:110mmol/L的NaCl、1.8mmol/L的KCl、9mmol/L的Na2HPO4·12H2O和1.3mmol/L的KH2PO4,溶剂为去离子水。
防腐剂成分5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、5-氨基吡啶-2-羧酸盐、乙二醇单丁醚。
(2)唾液保存液的使用方法
采集前准备:被采集者在采集唾液半小时前,用清水漱口,若涂有口红或唇膏需先卸妆,之后半小时内勿进食、吸烟或嚼口香糖等。
采集:先在唾液收集保存管中加入2ml唾液保存液,采集唾液时,用牙齿轻轻刮蹭两颊口腔黏膜处,然后将唾液吐至唾液收集保存器中,当唾液收集保存管中唾液液体凹液面最低处达到4ml时停止收集。将唾液收集保存管的管盖拧紧,上下颠倒十次,使唾液与保存液混合均匀之后在30℃条件下保存。
实施例3
(1)唾液保存液配备
S1,分别配制浓度为0.3mol/L的EDTA,质量体积分数为13%的SDS,PH=7.4的PBS缓冲液,PBS缓冲液按照体积百分比配备:NaCl溶液69.5%、KCl溶液1.5%、Na2HPO4·12H2O溶液24%和KH2PO4溶液5%;
S2,将EDTA和PBS缓冲液在110℃条件下灭菌20分钟;
S3,灭菌后的EDTA和PBS缓冲液冷却至25℃后,按照以下比例混合:EDTA10ml、SDS12ml、Tween200.8ml、防腐剂0.12ml,加入PBS缓冲液定容至50ml;
S4,将步骤S3混合液用0.25μm滤膜进行过滤,配制完成后在25℃条件下保存。
其中PBS缓冲液,以PBS缓冲液1L计算,包括如下组分:150mmol/L的NaCl、2.5mmol/L的KCl、10mmol/L的Na2HPO4·12H2O和2mmol/L的KH2PO4,溶剂为去离子水。
防腐剂成分为2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、N-酰基氨基羧酸盐、十二烷基磺酸钠、4-乙基吡啶-2-羧酸盐,丙烯乙二醇、异丙醇和聚乙二醇。
(2)唾液保存液的使用方法:
采集前准备:被采集者在采集唾液半小时前,用清水漱口,若涂有口红或唇膏需先卸妆,之后半小时内勿进食、吸烟或嚼口香糖等。
采集:先在唾液收集保存管中加入2ml唾液保存液,采集唾液时,用牙齿轻轻刮蹭两颊口腔黏膜处,然后将唾液吐至唾液收集保存器中,当唾液收集保存管中唾液液体凹液面最低处达到4ml时停止收集。将唾液收集保存管的管盖拧紧,上下颠倒十次,使唾液与保存液混合均匀之后在25℃条件下保存。
实施例4
(1)唾液保存液配备
S1,分别配制浓度为0.6mol/L的EDTA,质量体积分数为14%的SDS,PH=7.4的PBS缓冲液,PBS缓冲液按照体积百分比配备:NaCl溶液65%、KCl溶液2%、Na2HPO4·12H2O溶液28%和KH2PO4溶液5%;
S2,将EDTA和PBS缓冲液在125℃条件下灭菌25分钟;
S3,灭菌后的EDTA和PBS缓冲液冷却至30℃后,按照以下比例混合:EDTA13ml、SDS10ml、Tween201.2ml、防腐剂0.25ml,加入PBS缓冲液定容至50ml;
S4,将步骤S3混合液用0.25μm滤膜进行过滤,配制完成后在30℃条件下保存。
其中PBS缓冲液,以PBS缓冲液1L计算,包括如下组分:120mmol/L的NaCl、2.0mmol/L的KCl、8mmol/L的Na2HPO4·12H2O和1.5mmol/L的KH2PO4,溶剂为去离子水。
防腐剂成分为2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、5-氨基吡啶-2-羧酸盐、1-丁基氨基-环己烷羧酸盐、丙烯乙二醇、异丙醇、乙二醇单丁醚。
(2)唾液保存液的使用方法:
采集前准备:被采集者在采集唾液半小时前,用清水漱口,若涂有口红或唇膏需先卸妆,之后半小时内勿进食、吸烟或嚼口香糖等。
采集:先在唾液收集保存管中加入2ml唾液保存液,采集唾液时,用牙齿轻轻刮蹭两颊口腔黏膜处,然后将唾液吐至唾液收集保存器中,当唾液收集保存管中唾液液体凹液面最低处达到4ml时停止收集。将唾液收集保存管的管盖拧紧,上下颠倒十次,使唾液与保存液混合均匀之后在30℃条件下保存。
实施例1-4分别采集1位受试者的唾液2ml,加入等体积唾液保存液,分别命名为1、2、3、4号唾液样本,每个样本做3个生物学平行对照,受试者编号+英文字母A-I命名后常温保存。常温保存0天、20天、30天后,取200μl混合液用QIAGEN试剂盒提取唾液DNA;取1μl唾液DNA用Qubit检测浓度;取0天、20天、30天的DNA进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,用DL2000Marker标记,结果见图1-3;取1μl唾液DNA用NanoDrop检测纯度,结果见表1-3。
表1实施例1-4样本保存0天时唾液DNA浓度与OD值
表2实施例1-4样本保存20天时唾液DNA浓度与OD值
表3实施例1-4样本保存30天时唾液DNA浓度与OD值
表1-3可知,保存30天后的唾液提取的DNA总量降低7%-14%,DNA总量仍足够;保存30天后的唾液提取的DNA纯度较好,OD值均在1.6-1.8之间,260/230均在1.5以上,表明提取的基因组DNA无蛋白质、离子或有机溶剂残留,且本发明的配方可以维持唾液在室温(20-30℃)下至少保存1个月不发生核酸污染。
图1-3电泳图条带清晰,说明本发明唾液保存液能够维持唾液样本在室温(20-30℃)下至少保存1个月,而且基因组DNA不发生降解。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种唾液保存液,其特征在于,包括细胞稳定剂、核酸酶抑制剂、表面活性剂、蛋白质变性剂和防腐剂;所述防腐剂为2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮中的一种或两种组合。
2.如权利要求1所述的一种唾液保存液,其特征在于,所述防腐剂还包括稳定剂和水溶性基质。
3.如权利要求2所述的一种唾液保存液,其特征在于,所述稳定剂为烷基羧酸盐。
4.如权利要求3所述的一种唾液保存液,其特征在于,所述烷基羧酸盐为十二烷基琥珀酸、N-酰基氨基羧酸盐、十二烷基磺酸钠、4-乙基吡啶-2-羧酸盐、5-氨基吡啶-2-羧酸盐、1-丁基氨基-环己烷羧酸盐中的一种或多种组合。
5.如权利要求2所述的一种唾液保存液,其特征在于,所述水溶性基质为丙烯乙二醇、异丙醇、聚乙二醇、乙二醇单丁醚中的一种或多种组合。
6.如权利要求1所述的一种唾液保存液,其特征在于,按照重量份数计算,所述唾液保存液包括细胞稳定剂16-38份、核酸酶抑制剂5-15份,表面活性剂1-2份、蛋白质变性剂5-15份、防腐剂1-2份。
7.如权利要求1所述的一种唾液保存液,其特征在于,所述细胞稳定剂为PBS缓冲液,以PBS缓冲液1L计算,包括如下组分:100-150mmol/L的NaCl、1.5-2.5mmol/L的KCl、7-10mmol/L的Na2HPO4·12H2O和1-2mmol/L的KH2PO4,溶剂为去离子水。
8.如权利要求1所述的一种唾液保存液,其特征在于,所述核酸酶抑制剂为EDTA,表面活性剂为Tween 20,蛋白质变性剂为SDS。
9.如权利要求1所述的一种唾液保存液的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1,分别配制浓度为0.1-0.8mol/L的EDTA,质量体积分数为10%-15%的SDS,PH=7.4的PBS缓冲液,PBS缓冲液按照体积百分比配备:NaCl溶液65%-75%、KCl溶液1%-2%、Na2HPO4·12H2O溶液20%-28%和KH2PO4溶液2%-5%;
S2,将EDTA和PBS缓冲液在100-130℃条件下灭菌10-30分钟;
S3,灭菌后的EDTA和PBS缓冲液冷却至20-30℃后,按照以下比例混合:EDTA5-15ml、SDS5-15ml、Tween 200.5-1.5ml、防腐剂0.05-0.35ml,加入PBS缓冲液定容至50ml;
S4,将步骤S3混合液用0.20-0.30μm滤膜进行过滤,配制完成后,在20-30℃条件下保存。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20210305 |