ES2938394A1

ES2938394A1 - Composición para el muestreo, inactivación de microorganismos y preservación de ácidos nucleicos de muestras ambientales

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Publication number: ES2938394A1
Application number: ES202130937A
Authority: ES
Inventors: Rodriguez Lucas José Dominguez; Rodriguez Mercedes Dominguez; Iruela Inmaculada Moreno; Schmidt Christian Gortazar; Rodriguez José Manuel Sanchez-Vizcaino; Sancho Marta Perez; La Fuente Garcia José De Jesús De; Guerrier Alberto A Diez; Romero Teresa Garcia-Seco; Garcia-Arevalo José Angel Barasona; Fernandez De Mera María Isabel Garcia; Martinez Beatriz Romero; Aleksandra Kosowska; Sanchez Sandra Diaz; Arevalo Sandra Barroso; Juan Ferre Lucía De; Andres Aránzazu Buendia; Lorenzo José Antonio Infantes
Original assignee: Maeva Servet S L
Current assignee: Maeva Servet S L
Priority date: 2021-10-06
Filing date: 2021-10-06
Publication date: 2023-04-10

Abstract

Composición para el muestreo, inactivación de microorganismos y preservación de ácidos nucleicos de muestras ambientales. La invención se relaciona con una composición que permite inactivar microorganismos y detectar su presencia en las muestras y con los usos de la misma para la realización de muestreos ambientales. La invención también se refiere a kits que comprenden dicha composición y a sus usos.

Description

DESCRIPCIÓN

Composición para el muestreo, inactivación de microorganismos y preservación de ácidos nucleicos de muestras ambientales

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención está relacionada con el campo de los muéstreos ambientales. En concreto, la invención se relaciona con una composición para la realización de muestreos ambientales que permite inactivar microorganismos y detectar su presencia en las muestras.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los análisis epidemiológicos han demostrado que muchos microorganismos se introducen por vías de transmisión indirecta, tales como fómites contaminados (vehículos, personas, herramientas). Por ejemplo, uno de los riesgos más ampliamente reconocidos para la introducción del virus de la peste porcina Africana son los vehículos de transporte de ganado contaminados. La posible contaminación de estos vehículos puede proceder de las excreciones de animales infectados (heces, orina, fluidos orales/nasales) y una limpieza y desinfección adecuada puede ser crucial para prevenir la reinfección de las fuentes ambientales. Por este motivo es prioritario disponer de métodos de muestreo de superficies que permitan detectar la presencia de contaminación ambiental por microorganismos y contribuyan a la prevención y al control de las enfermedades infecciosas.

El muestreo ambiental se ha mostrado especialmente relevante durante la pandemia de COVID-19. El agente causante de COVID-19 es un coronavirus potencialmente zoonótico emergente oficialmente denominado coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo 2 (SARS-CoV-2). Este virus se transmite no solo mediante aerosoles, sino también indirectamente mediante objetos y superficies contaminadas, incluyendo la piel humana, sobre la que puede sobrevivir durante horas o días. La vigilancia ambiental de ARN puede contribuir a mejorar la evaluación espacio-temporal del riesgo de COVID-19 mediante la monitorización de entornos sospechosos de estar contaminados como centros comerciales, centros de salud, residencias de ancianos o domicilios de personas que han pasado la enfermedad. Así, la detección de ARN de SARS-CoV-2 en superficies de carritos de supermercados, pomos de puertas o asas de contenedores de basura, así como en superficies corporales o ropa de personas infectada indica la presencia de partículas virales potencialmente infectivas. Además, el ARN de SARS-CoV-2 puede detectarse en aguas residuales.

El muestreo ambiental tiene también relevancia en el control de la tuberculosis animal. La tuberculosis animal es una infección multihuésped causada por Mycobacterium bovis y otros miembros relacionados del complejo Mycobacterium tuberculosis (MTBC). Se considera que un país está oficialmente libre de tuberculosis cuando menos del 0,2% de su ganado bovino está infectado. Según el Reglamento Delegado (UE) 2020/689 por el que se completa el Reglamento (UE) 2016/429 del Parlamento Europeo y del Consejo en lo referente a las normas de vigilancia, los programas de erradicación y el estatus de libre de enfermedad (capítulo 2, sección 1), para que un país o región se considere oficialmente libre de tuberculosis al menos el 99,8% de los establecimientos que tienen bovinos, y que representen como mínimo el 99,9% dela población de bovinos, tiene que haberse mantenido oficialmente libre de tuberculosis durante los últimos 3 años, así como no haber superado una tasa de incidencia del 0,1% de los establecimientos en los que se ha confirmado la infección durante el año. Mantener un estatus libre de tuberculosis animal o conseguir su erradicación es un reto cuando muchos huéspedes salvajes y domésticos contribuyen al mantenimiento de bacterias del complejo Mycobacterium tuberculosis (MTBC). El muestreo de ADN ambiental en animales puede ayudar a la hora de evaluar el riesgo de contacto con respecto al MTBC en el ganado a nivel de rebaño.

El muestreo de superficies se realiza tradicionalmente con esponjas, hisopos de algodón u otros soportes impregnados con tampón salino fosfato, así como otras soluciones isotónicas estériles, que no permiten la inactivación de los microorganismos presentes en el medio, por lo que no se puede descartar que los microorganismos patógenos viables puedan diseminarse desde la muestra al ambiente o infectar al analista.

Existe la necesidad de desarrollar métodos para la realización de muestreos ambientales para el control de microorganismos que sean capaces de asegurar la completa inactivación del microorganismo en la muestra y al mismo tiempo preserven el material genético de éste de modo que permitan la detección posterior del material genético de dicho microorganismo en la muestra por técnicas de biología molecular.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han desarrollado una composición para la realización de muestreos ambientales que, sorprendentemente, permite inactivar los microorganismos ambientales para garantizar la seguridad del manejo de la muestra en el transporte y en su procesamiento posterior sin detrimento de la sensibilidad diagnóstica. Esta composición permite detectar la presencia del material genético de los microorganismos ambientales de interés recogidos en la toma de muestra mediante técnicas de biología molecular con suficiente sensibilidad. Los inventores han evaluado mediante ensayos la capacidad de la composición de la invención para inactivar microorganismos, conservar ácidos nucleicos y ser usado como vehículo para la realización de muestreos ambientales mediante esponjas impregnadas o prehidratadas con dicha composición.

Los métodos de muestreo realizados con esponjas impregnadas o prehidratadas con la composición de la invención han demostrado la misma sensibilidad para la detección del material genético de microorganismos en muestras de superficies ambientales que los métodos tradicionales que emplean hisopos de algodón impregnados en solución salina, con la ventaja de que los métodos de la invención logran simultáneamente la inactivación de dichos microorganismos.

Por lo tanto, cuando los microorganismos implicados son microorganismos patógenos de nivel 3, el método de la invención, que inactiva el microorganismo en la muestra original, tiene la ventaja de que no requiere el uso de un laboratorio de bioseguridad de nivel 3 para procesar la muestra, lo que permite acelerar sustancialmente la detección temprana del patógeno.

Además, los métodos de la invención que emplean esponjas impregnadas o prehidratadas con la composición de la invención permiten muestrear superficies mucho más amplias en comparación con las que se pueden cubrir con los hisopos tradicionales, aumentando así la posibilidad de detección de microorganismos en entornos contaminados. Esto puede resultar de particular interés en el caso de los vehículos de transporte para ganado y los animales transportados, que se consideran un peligro importante para la introducción de microorganismos como el virus de la peste porcina Africana.

Otra ventaja adicional de emplear esponjas impregnadas o prehidratadas con la composición de la invención es que permiten detectar el material genético del microorganismo sobre la piel animal, demostrando su utilidad para la monitorización de patógenos en ganado. Se trata de una técnica no invasiva de utilidad en el transporte de animales potencialmente contaminados, que pueden muestrearse simplemente frotando la esponja en sus flancos u otras regiones sin la necesidad de un manejo más complejo, permitiendo así la detección temprana de una posible infección entre los animales transportados y mejorando el bienestar de estos animales.

En resumen, los métodos de la invención son seguros, sencillos, rápidos y económicos, y pueden ser potencialmente útiles para el control de la contaminación de superficies y la vigilancia efectiva de microorganismos tales como los microorganismos causantes de COVID-19 o los causantes de la tuberculosis animal y la peste porcina Africana, entre otros, reduciendo su riesgo de transmisión entre granjas, mejorando el bienestar animal y evitando pérdidas económicas.

Por tanto, en un primer aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende:

a) de 315 a 350 g de alcohol isopropílico por cada litro de composición,

b) de 40 a 60 g de un alcohol seleccionado del grupo que consiste en etanol, metanol y mezclas de los mismos por cada litro de composición,

c) de 6 a 8,4 g de glicerol por cada litro de composición,

d) de 0,0500 a 0,0920 g de Na²HPO⁴por cada litro de composición,

e) de 0,4 a 0,6 g de SDS por cada litro de composición, y

f) de 470 a 550 g de agua por cada litro de composición.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de la composición de la invención para la inactivación de microorganismos.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de la composición de la invención para la inactivación de un hongo miceliar.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de la composición de la invención como vehículo para la realización de muestreos de muestras que contienen microorganismos.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de la composición de la invención como vehículo para la realización de muestreos de muestras que contienen hongos miceliares.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de la composición de la invención para preservar la integridad de los ácidos nucleicos de una muestra de microorganismos.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de la composición de la invención para preservar la integridad de los ácidos nucleicos de una muestra de hongos miceliares.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para detectar la presencia de un microorganismo en una muestra que comprende:

(a) incubar la muestra con la composición de la invención y, opcionalmente, con el soporte o dispositivo de recolección, y

(b) someter la muestra incubada con la composición de la etapa (a) a una técnica de biología molecular capaz de detectar los ácidos nucleicos del microorganismo, donde la detección de los ácidos nucleicos del microorganismo es indicativa de la presencia del microorganismo en la muestra.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para detectar la presencia de un hongo miceliar en una muestra que comprende:

(b) someter la muestra incubada con la composición de la etapa (a) a una técnica de biología molecular capaz de detectar los ácidos nucleicos del hongo miceliar, donde la detección de los ácidos nucleicos del hongo miceliar es indicativa de la presencia del hongo miceliar en la muestra.

En otro aspecto, la invención se refiere a un soporte que comprende la composición de la invención.

En otro aspecto, la invención se refiere a un kit que comprende:

a) un soporte o un dispositivo de recolección, preferiblemente capaz de ser impregnado por la composición de la invención y

b) la composición de la invención.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un kit de la invención para la inactivación de microorganismos u hongos miceliares, para la realización de muestreos de muestras que contienen microorganismos u hongos miceliares, para preservar la integridad de los ácidos nucleicos de una muestra de microorganismos u hongos miceliares o para detectar la presencia de un microorganismo o de un hongo miceliar en una muestra.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Composición de la invención

En un primer aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende:

a) de 315 a 350 g de alcohol isopropílico por cada litro de composición, b) de 40 a 60 g de un alcohol seleccionado del grupo que consiste en etanol, metanol y mezclas de los mismos por cada litro de composición,

c) de 6 a 8,4 g de glicerol por cada litro de composición,

d) de 0,0500 a 0,0920 g de Na²HPO⁴por cada litro de composición,

e) de 0,4 a 0,6 g de SDS por cada litro de composición, y

f) agua, preferiblemente de 470 a 550 g de agua por cada litro de composición.

El término “composición”, en el contexto de la presente invención, se refiere a una composición química que puede contener únicamente los componentes (a) a (f) listados anteriormente, o también otros componentes adicionales.

En una realización, la composición de la invención es para la realización de muestreos ambientales, preferiblemente para la realización de muestreos de superficie. En otra realización, la composición es para la inactivación y detección de microorganismos en muestras ambientales. En otra realización, la composición es para la inactivación y detección de hongos miceliares en muestras ambientales.

En otra realización, la composición es para la toma de muestras clínicas o matrices biológicas. En otra realización, la composición es para la inactivación y detección de microorganismos en muestras clínicas o matrices biológicas. En otra realización, la composición es para la inactivación y detección de hongos miceliares en muestras clínicas o matrices biológicas.

En una realización la composición comprende de 315 a 350 g, preferiblemente de 320 a 345 g, más preferiblemente de 325 a 345 g, aún más preferiblemente de 330 a 340 g, todavía más preferiblemente 336 g de alcohol isopropílico por cada litro de composición.

El componente (b) puede ser etanol, metanol o una mezcla de ambos. En otra realización la composición comprende de 40 a 60 g, preferiblemente de 45 a 55 g, más preferiblemente de 50 a 55 g, aún más preferiblemente 50 g de etanol y/o metanol por cada litro de composición, donde los gramos se refieren a la suma total de los gramos de etanol y metanol presente en la composición. En una realización particular, el 50% del componente (b) es metanol y el otro 50% es etanol. En una realización aún más particular la composición comprende de 20 a 30 g de etanol por cada litro de composición y de 20 a 30 g de metanol por cada litro de composición. En otra realización la composición comprende 25 g de etanol por cada litro de composición y 25 g de metanol por cada litro de composición.

En otra realización la composición comprende de 6 a 8,4 g, preferiblemente de 6,5 a 8 g, más preferiblemente de 7 a 7,5 g, aún más preferiblemente 7,2 g de glicerol por cada litro de composición.

En otra realización la composición comprende de 0,0500 a 0,0920 g, preferiblemente de 0,0600 a 0,0900 g, más preferiblemente de 0,0700 a 0,0800 g, aún más preferiblemente de 0,0700 a 0,0750 g, todavía más preferiblemente 0,0709 g de Na²HPO⁴por cada litro de composición.

El término "SDS”, según se usa en el presente documento, se refiere a dodecilsulfato de sodio (NaC¹²H²⁵SO⁴). En una realización la composición comprende de 0,4 a 0,6 g, preferiblemente de 0,45 a 0,55 g, más preferiblemente de 0,48 a 0,52 g, aún más preferiblemente 0,5 g de SDS por cada litro de composición.

En otra realización la composición comprende de 470 a 550 g, preferiblemente de 470 a 542 g, preferiblemente de 495 a 509 g, preferiblemente de 500 a 507 g, más preferiblemente de 500 a 505 g, aún más preferiblemente de 500 a 503 g, todavía más preferiblemente 501,9 g de agua por cada litro de composición. En una realización la composición comprende de 501,5 a 504 g de agua por cada litro de composición. En otra realización la composición comprende de 509 a 511 g de agua por cada litro de composición. Cuando se prepara un litro de composición, la cantidad de agua es la cantidad suficiente para obtener un litro de composición una vez añadidos el resto de componentes.

En una realización, el agua de la composición es preferiblemente agua libre de nucleasas. El término "libre de nucleasas” significa que el agua utilizada para la preparación de la composición está sustancialmente libre de enzimas que degradan ácidos nucleicos, preferiblemente libre de ribonucleasas y desoxirribonucleasas, es decir, que contiene menos del 10%, menos del 5%, menos del 1%, menos del 0,5%, menos del 0,1%, menos del 0,01% en peso de nucleasas, más preferiblemente no contiene nucleasas.

En otra realización, el agua es estéril. Los procedimientos para esterilizar agua son ampliamente conocidos por el experto en la técnica. Se trata de procesos de descontaminación que destruyen todas aquellas formas de microorganismos (bacterias, mohos, virus y/o parásitos) presentes en el material a esterilizar.

En otra realización, el agua es agua destilada, preferiblemente agua destilada estéril.

En una realización particular, la composición de la invención comprende:

a) 336 g de alcohol isopropílico por cada litro de composición,

b) 50 g de un alcohol seleccionado del grupo que consiste en etanol, metanol y mezclas de los mismos por cada litro de composición,

c) 7,2 g de glicerol por cada litro de composición,

d) 0,0709 g de Na²HPO⁴por cada litro de composición,

e) 0,5 g de SDS por cada litro de composición, y

f) agua, preferiblemente de 509 a 511 g de agua por cada litro de composición.

En otra realización, la composición de la invención comprende:

a) de 315 a 350 g de alcohol isopropílico por cada litro de composición, b) de 20 a 30 g de etanol por cada litro de composición,

c) de 20 a 30 g de metanol por cada litro de composición,

d) de 6 a 8,4 g de glicerol por cada litro de composición,

e) de 0,0500 a 0,0920 g de Na²HPO⁴por cada litro de composición,

f) de 0,4 a 0,6 g de SDS por cada litro de composición, y

g) agua, preferiblemente de 470 a 550 g de agua por cada litro de composición.

En una realización más preferida, la composición de la invención comprende:

a) 336 g de alcohol isopropílico por cada litro de composición,

b) 25 g de etanol por cada litro de composición,

c) 25 g de metanol por cada litro de composición,

d) 7,2 g de glicerol por cada litro de composición,

e) 0,0709 g de Na²HPO⁴por cada litro de composición,

f) 0,5 g de SDS por cada litro de composición, y

g) agua, preferiblemente de 509 a 511 g de agua por cada litro de composición.

En otra realización, la composición de la invención consiste en:

c) de 6 a 8,4 g de glicerol por cada litro de composición,

d) de 0,0500 a 0,0920 g de Na²HPO⁴por cada litro de composición,

e) de 0,4 a 0,6 g de SDS por cada litro de composición, y

f) agua, preferiblemente la cantidad suficiente para obtener un litro de composición, más preferiblemente de 470 a 550 g de agua por cada litro de composición, aún más preferiblemente de 509 a 511 g de agua por cada litro de composición.

En una realización más preferida, la composición de la invención consiste en:

a) 336 g de alcohol isopropílico por cada litro de composición,

c) 7,2 g de glicerol por cada litro de composición,

d) 0,0709 g de Na²HPO⁴por cada litro de composición,

e) 0,5 g de SDS por cada litro de composición, y

f) agua, preferiblemente la cantidad suficiente para obtener un litro de composición, más preferiblemente de 509 a 511 g de agua por cada litro de composición.

En otra realización, la composición consiste en:

c) de 20 a 30 g de metanol por cada litro de composición,

d) de 6 a 8,4 g de glicerol por cada litro de composición,

e) de 0,0500 a 0,0920 g de Na²HPO⁴por cada litro de composición,

f) de 0,4 a 0,6 g de SDS por cada litro de composición, y

g) agua, preferiblemente la cantidad suficiente para obtener un litro de composición, más preferiblemente de 470 a 550 g de agua por cada litro de composición, aún más preferiblemente de 509 a 511 g de agua por cada litro de composición.

En otra realización más preferida, la composición de la invención consiste en:

a) 336 g de alcohol isopropílico por cada litro de composición,

b) 25 g de etanol por cada litro de composición,

c) 25 g de metanol por cada litro de composición,

d) 7,2 g de glicerol por cada litro de composición,

e) 0,0709 g de Na²HPO⁴por cada litro de composición,

f) 0,5 g de SDS por cada litro de composición, y

g) agua, preferiblemente la cantidad suficiente para obtener un litro de composición, más preferiblemente de 509 a 511 g de agua por cada litro de composición.

En una realización de la invención la composición no comprende un agente caotrópico, preferiblemente la composición no comprende un agente caotrópico seleccionado del grupo que consiste en tiocianato de potasio, yoduro sódico, perclorato sódico, urea y guanidinio, más preferiblemente no comprende un agente caotrópico seleccionado de tiocianato de guanidinio, isotiocianato de guanidinio y clorhidrato de guanidinio.

El término "agente caotrópico”, en el contexto de la invención, se refiere a sustancias que causan el desordenamiento de una proteína o ácido nucleico, por ejemplo, alterando su estructura secundaria, terciaria o cuaternaria pero dejando la estructura primaria intacta.

En otra realización, la composición no comprende un agente quelante, preferiblemente la composición no comprende un agente quelante seleccionado del grupo que consiste en ácido etilenglicol tetraacético (EGTA), ácido hidroxietiletilendiaminotriacético (HEDTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), W,W-Bis(carboximetil)glicina (NTA), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), citrato anhidro, citrato de sodio, citrato de calcio, citrato de amonio, bicitrato de amonio, ácido cítrico, citrato de diamonio, citrato potásico, citrato magnésico, citrato de amonio férrico y citrato de litio.

El término "agente quelante”, según se usa en este documento, se refiere a una sustancia que forma complejos con iones de metales pesados, también conocido como secuestrante o antagonista de metales pesados.

En otra realización la composición no comprende un agente reductor, preferiblemente no comprende un agente reductor seleccionado del grupo que consiste en 2-mercaptoetanol, tris(2-carboxietil) fosfina (TCEP), ditiotreitol (DTT), dimetilsulfóxido (DMSO) y formamida.

El término "agente reductor” , según se usa en este documento, se refiere a aquel que cede electrones a un agente oxidante.

En otra realización la composición no comprende un polímero de silicona o un polisorbato.

En otra realización la composición no comprende un detergente seleccionado del grupo que consiste en dodecil sulfato de litio (LDS), taurodesoxicolato sódico (NaTDC), taurocolato sódico (NaTC), glicocolato sódico (NaGC), desoxicolato sódico (NaDC), colato sódico, alquilbencenosulfonato sódico (NaABS), N-lauroilsarcosina (NLS), sales de ácidos carboxílicos, sales de ácidos sulfónicos, sales de ácido sulfúrico, ésteres de ácido fosfórico y polifosfórico, alquilfosfatos, monoalquil fosfatos (MAP) y sales de ácidos perfluorocarboxílicos.

El término "detergente”, según se usa en este documento, se refiere a una sustancia que preferiblemente es capaz de producir la lisis celular.

En otra realización la composición no comprende un agente antiespumante, preferiblemente no comprende un agente antiespumante seleccionado del grupo que consiste en cocamidopropil hidroxisultaína, ácidos alquilaminopropiónicos, carboxilatos de imidazollina, betaínas, sulfobetaínas, sultaínas, etoxilatos de alquilfenol, etoxilatos de alcohol, polioxipropilenglicoles polioxietilenados, mercaptanos polioxietilenados, ésteres de ácidos carboxílicos de cadena larga, alcanolamidas, glicoles acetilénicos terciarios, siliconas polioxietilenadas, N-alquilpirrolidonas, alquilpoliglucosidasas, polímeros de silicona como Antifoam A® y polisorbatos como Tween®.

En la presente invención se entiende por "agente antiespumante” a una sustancia que evita la formación de espuma que resulta de la presencia de detergentes.

En otra realización la composición no comprende un alcanol de cadena corta seleccionado del grupo que consiste en butanol, pentanol y hexanol.

En otra realización la composición no comprende ningún compuesto seleccionado del grupo que consiste en betaína, albúmina sérica bovina y osmolitos como trehalosa o sorbitol.

En otra realización la composición de la invención no comprende ácidos nucleicos (ARN y/o ADN).

En otra realización la composición no comprende un agente antimicrobiano, antiviral o antifúngico.

En otra realización la composición no comprende un tampón seleccionado del grupo que consiste en tris(hidroximetil)aminometano (Tris), citrato, ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico (MES), ácido N,N-Bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfónico (BES), 1,3-bis(tris(hidroximetil)metilamino)propano (Bis-Tris), ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinoetanosulfónico (HEPES), ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS), N,N-bis(2-hidroxietil)glicina (Bicina), N-[tris(hidroximetil)metil]glicina (Tricina), ácido N-2-acetamido-2-iminodiacético (ADA), ácido N-(2-acetamido)-2-aminoetanosulfónico (ACES), ácido piperazina-1,4-bis (2-etanosulfónico) (PIPES) y bicarbonato.

El término "tampón”, según se usa en el presente documento, se refiere a una composición o solución acuosa de la misma que resiste las fluctuaciones de pH cuando se añade un ácido o álcali a la solución o composición que contiene el tampón. Esta resistencia al cambio de pH es debida a las propiedades tamponantes de tales soluciones y puede ser debida a uno o más compuestos específicos incluidos en la composición. Las soluciones o composiciones con capacidad tamponante se denominan tampones o soluciones tamponantes. Los tampones generalmente no tienen una capacidad ilimitada de mantener el pH de una solución o composición, sino que habitualmente son capaces de mantener el pH entre ciertos intervalos, por ejemplo, desde 5 a 8.

La inclusión de un tampón, como el Na²HPO⁴contenido en la composición, es deseable para controlar el pH de la composición. Preferiblemente, el tampón o tampones de la composición se eligen para mantener una capacidad tamponante en un intervalo de pH de 5 a 8, más preferiblemente de 5 a 7, más preferiblemente de 6 a 7, aún más preferiblemente de 6,2 a 6,9, todavía más preferiblemente de 6,4 a 6,9. Las composiciones de la invención tienen suficiente capacidad tamponante para estabilizar los ácidos nucleicos obtenidos de una muestra y para mantenerlos en un intervalo de pH similar cuando la muestra se pone en contacto con la composición.

En otra realización, el pH de la composición se ajusta a un valor comprendido entre 5 y 8, más preferiblemente entre 5 y 7, aún más preferiblemente entre 6 y 7, aún más preferiblemente entre 6,2 y 6,9, todavía más preferiblemente entre 6,4 y 6,9. El ajuste del pH puede realizarse con un ácido o base según sea necesario, preferiblemente con un ácido o base tal como ácido clorhídrico o hidróxido sódico, que puede añadirse a la composición final para ajustar el pH. En otra realización la composición comprende la cantidad necesaria de ácido o base para ajustar el pH de la composición a un valor comprendido entre 5 y 8, más preferiblemente entre 5 y 7, aún más preferiblemente entre 6 y 7, aún más preferiblemente entre 6,2 y 6,9, todavía más preferiblemente entre 6,4 y 6,9. La medida y el ajuste del pH se realiza por métodos conocidos por el experto en la técnica con la ayuda de un pHmetro o medidor de pH. En una realización el pH se mide a temperatura ambiente, preferiblemente a una temperatura entre 18°C y 25°C, más preferiblemente entre 20°C y 22°C, aún más preferiblemente a 20°C.

En otra realización, la composición es adecuada para su aplicación tópica sobre la superficie del cuerpo animal o humano. Esto incluye, por ejemplo, la aplicación sobre piel o uñas. En una realización preferida, la composición no se aplica sobre mucosas. Preferiblemente, la composición debe ser aceptable desde el punto de vista tópico y no debe contener sustancias tóxicas para la piel animal o humana.

En otra realización, la composición comprende una muestra susceptible de contener un microorganismo, preferiblemente una muestra ambiental que comprende microorganismos. En otra realización, la composición comprende una muestra susceptible de contener un hongo miceliar, preferiblemente duna muestra ambiental que comprende un hongo miceliar.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método de preparación de la composición de la invención que comprende mezclar a partes iguales una solución que comprende el alcohol isopropílico, el etanol y/o metanol y el glicerol (solución A) con otra solución que comprende Na²HPO⁴, SDS y agua (solución B). Métodos para preparar estas soluciones son conocidos por el experto en la técnica.

Alternativamente, en otro aspecto la invención se refiere a un método de preparación de la composición que comprende mezclar todos los componentes (a) a (f) o (a) a (g) y, opcionalmente, otros componentes adicionales, hasta su completa disolución, preferiblemente mediante agitación, más preferiblemente hasta que la composición sea homogénea mediante evaluación macroscópica.

Usos de la composición de la invención

La composición de la invención permite conseguir simultáneamente en una única etapa la inactivación del microorganismo u hongo miceliar contenido en la muestra y la preservación de la integridad de sus ácidos nucleicos para su posterior aislamiento y purificación.

Uso para la inactivación de microorganismos y hongos miceliares

En un aspecto, la invención se refiere al uso de la composición de la invención para la inactivación de microorganismos, preferiblemente para la inactivación de microorganismos ambientales, más preferiblemente para la inactivación de microorganismos de muestras ambientales.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de la composición de la invención para la inactivación de hongos miceliares, preferiblemente para la inactivación de hongos miceliares ambientales, más preferiblemente para la inactivación de hongos miceliares de muestras ambientales.

En otra realización, la composición de la invención se usa para la inactivación de microorganismos de muestras clínicas o de matrices biológicas.

En otra realización, la composición de la invención se usa para la inactivación de hongos miceliares de muestras clínicas o de matrices biológicas.

El método de inactivación de la invención comprende poner en contacto la composición de la invención con la muestra que contiene los microorganismos u hongos miceliares que se quieren inactivar. En una realización de la invención, la muestra se mezcla a partes iguales con la composición de la invención. En una realización aún más preferida, la relación muestra: composición de la invención es 1:10, es decir, se mezcla una parte de muestra con 9 partes de la composición de la invención.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método de inactivación de microorganismos, preferiblemente microorganismos ambientales, más preferiblemente microorganismos de muestras ambientales, que comprende poner en contacto la composición de la invención con la muestra que contiene los microorganismos, preferiblemente durante el tiempo necesario para inactivarlos. En otra realización, el método de la invención es un método de inactivación de microorganismos de muestras clínicas o de matrices biológicas.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método de inactivación de hongos miceliares, preferiblemente hongos miceliares ambientales, más preferiblemente hongos miceliares de muestras ambientales, que comprende poner en contacto la composición de la invención con la muestra que contiene los hongos miceliares, preferiblemente durante el tiempo necesario para inactivarlos. En otra realización, el método de la invención es un método de inactivación de hongos miceliares de muestras clínicas o de matrices biológicas.

El término “inactivación”, en el contexto de la presente invención, se refiere a que las composiciones de la invención son capaces de inactivar a los microorganismos u hongos miceliares presentes en la muestra, transformando una muestra infecciosa o potencialmente infecciosa en una muestra no infecciosa, donde los microorganismos u hongos miceliares ya no son viables, de modo que se facilita el manejo de dicha muestra. La inactivación implica que el microorganismo deja de ser capaz de multiplicarse en condiciones de laboratorio, por ejemplo, en el caso de las bacterias deja de ser capaz de formar colonias aisladas sobre placas de cultivo que contienen un medio específico para dicho microorganismo. Una definición alternativa de inactivación es el proceso por el que una célula viable del microorganismo u hongo miceliar es transformada en una célula no viable. El término “viable” o “viabilidad”, según se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de una célula de mantenerse a sí misma o recuperar su potencialidad y sobrevivir hasta que sea capaz de dividirse. Así, una célula viable es una célula capaz de sobrevivir y dividirse. Por el contrario, una célula no viable no es capaz de sobrevivir y dividirse. Una célula no viable incluye a células muertas. La viabilidad se puede determinar por ensayos convencionales del estado de la técnica como los descritos en los ejemplos del apartado 2.1 de la presente invención. Ensayos apropiados para medir la viabilidad de un microorganismo pueden ser ensayos de citolisis como el ensayo de lactato deshidrogenasa, el ensayo de yoduro de propidio, el ensayo de azul tripano y el ensayo de 7-aminoactinomicina D, así como ensayos proteómicos y genómicos que estudian la activación de vías de estrés usando microarrays de ADN. La viabilidad de un microorganismo o de un hongo miceliar se determina habitualmente comprobando la ausencia de células tras su cultivo en un medio apropiado. Cuando el microorganismo es un virus, su viabilidad puede determinarse, por ejemplo, mediante una prueba de hemadsorción (HAD) o mediante ensayos in vivo en animales como los descritos en los ejemplos del apartado 2.3.4 de la presente invención.

Las composiciones de la invención inactivan al menos sustancialmente y, preferiblemente, completamente, los patógenos potencialmente infecciosos de una muestra, es decir, que los matan o neutralizan para facilitar el manejo y transporte de la muestra, de modo que la mezcla resultante resulta en una mezcla sustancialmente no patogénica. El término “sustancialmente no patogénico” cuando se refiere a la actividad patogénica significa que la composición de la invención deja, preferiblemente, menos del 10%, menos del 5%, menos del 3%, menos del 1% de la actividad patogénica de la muestra inicial, preferiblemente la actividad patogénica es cero. La actividad patogénica se mide por los mismos métodos utilizados para medir la viabilidad.

El término “microorganismo” se refiere a un organismo microscópico, que puede ser un organismo unicelular o pluricelular, procariota o eucariota, e incluye, sin limitación, procariotas como arqueobacterias y eubacterias, cianobacterias, hongos, levaduras, mohos, actinomicetos, espiroquetas y micoplasmas; virus incluyendo, sin limitación, Ortohepadnavirus (por ejemplo, los virus de la hepatitis A, B y C), papilomavirus humano, Flavivirus (por ejemplo, el virus del Dengue), Lyssavirus (por ejemplo el virus de la rabia), Morbillivirus (por ejemplo, el virus del sarampión), Simplexvirus (por ejemplo el virus del herpes simple), Poliomavirus, Rubulavirus (por ejemplo el virus de las paperas), Rubivirus (por ejemplo, el virus de la rubéola), Varicellovirus (por ejemplo el virus de la varicela), rotavirus, coronavirus, citomegalovirus, adenovirus, virus adenoasociados, baculovirus, parvovirus, retrovirus, vaccinia virus, poxvirus y semejantes; algas; protozoos; protistas; plantas; briófitos y semejantes. En general, cualquier microorganismo que pueda estar presente en una muestra ambiental.

El término "hongo miceliar” se refiere a un organismo eucariota del reino Fungi que tiene micelio, también conocido como moho u hongo filamentoso.

En una realización preferida, el microorganismo u hongo miceliar es causante de enfermedades en animales, tanto mamíferos como no mamíferos, particularmente enfermedades de mamíferos, como animales de granja, incluyendo ganado, caballos, cabras, ovejas, cerdos y animales domésticos como gatos y perros, así como animales salvajes como monos, ratas, ratones, conejos y otros.

En una realización preferida el microorganismo se selecciona de una bacteria Grampositiva, una bacteria Gram-negativa, una micobacteria, un virus, un hongo o mezclas de los mismos.

En una realización el microorganismo es una bacteria. El término "bacteria” se refiere a una célula bacteriana Gram-positivo o Gram-negativo capaz de infectar y causar enfermedades en un huésped, produciendo síntomas relacionados con la infección en dicho huésped, tales como fiebre u otros signos de inflamación, síntomas intestinales, respiratorios, deshidratación, etc. Métodos para determinar si una bacteria es Gramnegativo o Gram-positivo son conocidos por el experto en la técnica.

En una realización, el microorganismo es una bacteria de un filo seleccionado del grupo que consiste en Acidobacteria, Actinobacteria, Aquificae, Armatimonadetes, Bacteroidetes, Caldiserica, Chlamydiae, Chlorobi, Chloroflexi, Chrysiogenetes, Cyanobacteria, Deferribacteres, Dictyoglomi, Elusimicrobia, Fibrobacteres, Firmicutes, Fusobacteria, Gemmatimonadetes, Gracilicutes, Lentisphaerae, Nitrospira, Planctomycetes, Proteobacteria, Spirochaetes, Synergistetes, Tenericutes, Thermodesulfobacteria, Thermotogae y Verrucomicrobia.

Particularmente, en una realización el microorganismo es una bacteria de un género seleccionado del grupo que consiste en Acinetobacter, Actinobacillus, Aeromonas, Aggregatibacter, Agrobacterium, Anaplasma, Bacillus, Bordetella, Borrelia, Brucella, Burkholderia, Campylobacter, Chlamydia, Chromobacterium, Clostridium, Corynebacterium, Cyanobacteria, Enterobacter, Enterococcus, Erwinia, Escherichia, Francisella, Fusobacterium, Haemophilus, Helicobacter, Klebsiella, Lactobacillus, Lactococcus, Legionella, Listeria, Micrococcus, Moraxella, Mycoplasma, Mycobacterium, Neisseria, Nitrosomas, Nocardia, Obesumbacterium, Pantoea, Pasteurella, Pediococcus, Porphyromonas, Prevotella, Proteus, Pseudomonas, Ralstonia, Rickettsia, Rhisobium, Rhodobacter, Salmonella, Serratia, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Tannerella, Treponema, Tsukamurella, Vibrio, Xenorhabdus, Yersinia, entre otras, así como combinaciones de los mismos.

En otra realización, el microorganismo es una bacteria seleccionada del grupo que consiste en Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Acinetobacter baumannii, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Agrobacterium tumefaciens, Anaplasma spp., Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Borrelia burgdorferi, Bordetella pertussis, Brucella abortus, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Chlamydia trachomatis, Chromobacterium violaceum, Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheria, Enterobacter agglomeran, Enterococcus faecalis, Erwinia carotovora, Erwinia chrysanthemi, Escherichia coli, Francisella tularensis, Fusobacterium nucleatum, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Lactobacillus plantarum, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes, Klebsiella pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Micrococcus luteus, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Nitrosomas europaea, Nocardia carnea, Obesumbacterium proteus, Pantoea stewartii, Pediococcus acidilactici, Prevotella intermedia, Porphyromonas gingivalis, Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas Phosphoreum, Pseudomonas syringae, Ralstonia solanacearum, Rhisobium etli, Rhisobium leguminosarum, Rhodobacter sphaeroides, Rickettsia spp., Salmonella enterica, Salmonella typhimurium, Serratia liguefaciens, Serratia marcescens, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus enteritis, Streptococcus pneumoniae, Tannerella forsythensis, Treponema denticola, Treponema pallidum, Tsukamurella pulmonis, Vibrio anguillarum, Vibrio fischeri, Vibrio cholerae, Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, Vibrio vulnificus, Xenorhabdus nematophilus, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia medievalis, Yersinia ruckeri y combinaciones de las mismas.

En una realización el microorganismo se selecciona de firmicutes, gracilicutes, proteobacterias, mendosicutes, actinobacterias, tenericutes, virus, hongos y mezclas de los mismos; preferiblemente se selecciona de firmicutes, gracilicutes, proteobacterias, actinobacterias, virus, hongos y mezclas de los mismos.

En una realización la bacteria es una bacteria Gram-negativa, preferiblemente es una proteobacteria, más preferiblemente es una bacteria seleccionada del grupo que consiste en Brucella suis (más preferiblemente Brucella suis Biovar 2), Salmonella enteritidis, Pasteurella multocida y E.coli, preferiblemente una cepa no verotoxigénica.

En otra realización la bacteria es una bacteria Gram-positiva, preferiblemente es una bacteria del filo firmicutes, más preferiblemente es una bacteria seleccionada del grupo que consiste en Enterococcus faecalis, Staphilococcus aureus, Streptococcus suis, Listeria monocytogenes, Listeria innocua y Lactococcus garvieae.

En una realización preferida, el microorganismo es una micobacteria. El término “Mycobacterium", se refiere a un género de bacterias de la familia Mycobacteriaceae que no se pueden teñir mediante tinción de Gram. El género Mycobacterium se identifica en la base de datos NCBI por su número de identificación taxonómica Taxonomy ID: 1763.

En otra realización el microorganismo es una actinobacteria.

En una realización aún más preferida, Mycobacterium se selecciona del grupo que consiste en M. africanum, M. bovis, M. canetti, M. caprae, M. microti, M. mungi, M. orygis, M. pinnipedii, M. suricattae, M. tuberculosis, M. avium, M. avium paratuberculosis, M. avium silvaticum, M. avium "hominissuis", M. colombiense, M. indicus pranii, M. intacellulare, M. smegmatis, M. phlei, M. fortuitum, M. lufu, M. paratuberculosis, M. habana, M. scrofulaceiu, M. gordonae, M. ulcerans. M. asiaticum, M. gastri, M. kansasii, M. hiberniae, M. icosiumassiliensis, M. nonchromogenicum, M. terrae, M. triviale, M. ulcerans, M. pseudoshottsii, M. shottsii, M. triplex, M. genavense, M. florentinum, M. lentiflavum, M. palustre, M. kubicae, M. parascrofulaceum, M. heidelbergense, M. interjectum, M. simiae, M. arabiense, M. aromaticivorans, M. aquaticum, M. bacteremicum, M. bohemicum, M. botniense, M. branderi, M. celatum, M. chimaera, M. conspicuum, M. cookie, M. doricum, M. farcinogenes, M. haemophilum, M. heckeshornense, M. lacus, M. leprae, M. lepraemurium, M. lepromatosis, M. liflandii, M. llatzerense, M. malmoense M. marinum, M. neoaurum, M. monacense, M. montefiorense, M. murale, M. nebraskense, M. saskatchewanense, M. sediminis, M.

scmfulaceum, M. shimoidei, M. szulgai, M. talmoniae, M. tusciae, M. xenopi, M. yongonense, M. intermedium, M. abscessus, M. bolletii, M. chelonae, M. immunogenum, M. stephanolepidis, M. boenickei, M. brisbanense, M. cosmeticum, M. fortuitum subsp. Acetamidolyticum, M. houstonense, M. mageritense, M. neworleansense, M. peregrinum, M. porcinum, M. senegalense, M. septicum, M. aubagnese, M. mucogenicum, M. phocaicum, M. austroafricanum, M. diernhoferi, M. frederiksbergense, M. hodleri, M. neoaurum, M. parafortuitum, M. aurum, M. vaccae, M. chitae, M. fallax, M. agri, M. aichiense, M. alvei, M. arupense, M. barrassiae, M. brumae, M. canariasense, M. chubuense, M. conceptionense, M. confluentis, M. duvalii, M. elephantis, M. flavescens, M. gadium, M. gilvum, M. hassiacum, M. holsaticum, M. iranicum, M. komossense, M. madagascariense, M. massiliense, M. massilipolynesiensis, M. moriokaense, M. obuense, M. psychrotolerans, M. pulveris, M. pyrenivorans, M. goodie, M. wolinskyi, M. sphagni, M. thermoresistibile, M. vanbaalenii, M. arosiense, M. aubagnense, M. chlorophenolicum, M. fluoroanthenivorans, M. kumamotonense, M. novocastrense, M. parmense, M. poriferae, M. rhodesiae, M. seoulense M. tokaiense, y combinaciones de los mismos.

En una realización aún más preferida, el Mycobacterium se selecciona de miembros del complejo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) y combinaciones de los mismos. En el contexto de la presente invención, el "complejo Mycobacterium tuberculosis (MTBC)” es un grupo genéticamente relacionado de especies de Mycobacterium que pueden causar tuberculosis en un sujeto, y que incluye, sin limitación: M. tuberculosis, M. africanum, M. orygis, M. bovis (Incluyendo la cepa del bacilo de Calmette-Guérin (BCG) de M. bovis), M. microti, M. canetti, M. caprae, M. pinnipedii, M. suricattae y M. mungi.

En otra realización, el Mycobacterium se selecciona de los miembros del complejo Mycobacterium avium tales como M. avium subsp. avium, M. avium subsp. paratuberculosis, M. avium subsp. silvaticum, M. avium subsp. hominissuis, M. colombiense, M. indicus pranii, M. intacellulare y combinaciones de los mismos.

En otra realización, el Mycobacterium se selecciona del grupo que consiste en M. smegmatis, M. phlei, M. fortuitum, M. lufu, M. avium subsp. paratuberculosis, M. habana, M. scrofulaceiu, M. gordonae, M. ulcerans. M. asiaticum, M. gastri, M. kansasii, M. hiberniae, M. icosiumassiliensis, M. nonchromogenicum, M. terrae, M. triviale, M. ulcerans, M. pseudoshottsii, M. shottsii, M. triplex, M. genavense, M. florentinum, M. lentiflavum, M. palustre, M. kubicae, M. parascrofulaceum, M. heidelbergense, M.

interjectum, M. simiae, M. arabiense, M. aromaticivorans, M. aquaticum, M. bacteremicum, M. bohemicum, M. botniense, M. branderi, M. celatum, M. chimaera, M. conspicuum, M. cookie, M. doricum, M. farcinogenes, M. haemophilum, M. heckeshornense, M. lacus, M. leprae, M. lepraemurium, M. lepromatosis, M. liflandii, M. llatzerense, M. malmoense M. marinum, M. neoaurum, M. monacense, M. montefiorense, M. murale, M. nebraskense, M. saskatchewanense, M. sediminis, M. scrofulaceum, M. shimoidei, M. szulgai, M. talmoniae, M. tusciae, M. xenopi, M. yongonense, M. intermedium, M. abscessus, M. bolletii, M. chelonae, M. immunogenum, M. stephanolepidis, M. boenickei, M. brisbanense, M. cosmeticum, M. fortuitum subsp. Acetamidolyticum, M. houstonense, M. mageritense, M. neworleansense, M. peregrinum, M. porcinum, M. senegalense, M. septicum, M. aubagnese, M. mucogenicum, M. phocaicum, M. austroafricanum, M. diernhoferi, M. frederiksbergense, M. hodleri, M. neoaurum, M. parafortuitum, M. aurum, M. vaccae, M. chitae, M. fallax, M. agri, M. aichiense, M. alvei, M. arupense, M. barrassiae, M. brumae, M. canariasense, M. chubuense, M. conceptionense, M. confluentis, M. duvalii, M. elephantis, M. flavescens, M. gadium, M. gilvum, M. hassiacum, M. holsaticum, M. iranicum, M. komossense, M. madagascariense, M. massiliense, M. massilipolynesiensis, M. moriokaense, M. obuense, M. psychrotolerans, M. pulveris, M. pyrenivorans, M. goodie, M. wolinskyi, M. sphagni, M. thermoresistibile, M. vanbaalenii, M. arosiense, M. aubagnense, M. chlorophenolicum, M. fluoroanthenivorans, M. kumamotonense, M. novocastrense, M. parmense, M. poriferae, M. rhodesiae, M. seoulense M. tokaiense, y combinaciones de los mismos.

En una realización aún más preferida el microorganismo es M. bovis. M.bovis se identifica en la base de datos taxonómica del NCBI por su número de identificación taxonómico Taxonomy ID: 1765.

En una realización todavía más preferida, el microorganismo es M. bovis BCG.

En otra realización, el microorganismo es un protozoo. El término “protozoo” se refiere a un organismo eucariota unicelular, ya sean de vida libre o parásitos, que se alimentan por heterotrofia de materia orgánica como otros microorganismos o tejidos y desechos orgánicos. Los protozoos parásitos son capaces de invadir, colonizar y causar enfermedades.

En una realización de la invención el microorganismo es un protozoo de un género seleccionado del grupo que consiste en: Acanthamoeba, Babesia, Balamuthia, Balantidium, Blastocystis, Cryptosporidium, Cyclospora, Dientamoeba, Entamoeba, Giardia, Isospora, Leishmania, Naegleria, Plasmodium, Rhinosporidium, Sarcocystis, Toxoplasma, Trichomonas, Trypanosoma y combinaciones de los mismos. Más preferiblemente, el microorganismo es un protozoo seleccionado del grupo que consiste en Acanthamoeba spp., Balamuthia mandrillaris, Babesia divergens, Balantidium coli, Blastocystis spp., Cryptosporidium spp., Cyclospora cayetanensis, Dientamoeba fragilis, Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Isospora belli, Leishmania spp., Naegleria fowleri, Plasmodium berghei, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, Plasmodium knowlesi, Rhinosporidium seeberi, Sarcocystis bovihominis, Sarcocystis suihominis, Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis, Trypanosoma brucei y Trypanosoma cruzi.

En otra realización el microorganismo es un hongo unicelular del subreino Eumycota. Preferiblemente es un hongo seleccionado del grupo que consiste en Género Candida. Género Cryptococcus. Género Malassezia. Hongos dimórficos. Género Histoplasma. Género Coccidioides. Género Blastomyces. Género Talaromyces. Género Sporothrix.

En una realización el microorganismo es un virus. El término "virus” se refiere a un agente infeccioso microscópico acelular que solo puede replicarse dentro de las células de otros organismos. Los virus están constituidos por genes que contienen ácidos nucleicos que forman moléculas largas de ADN o ARN, monocatenarias o bicatenarias, y rodeadas de proteínas. De esta forma, se define como virus a cualquier tipo de elemento genético móvil que codifica al menos una proteína que es un componente principal del virión que encierra el ácido nucleico del elemento genético móvil respectivo y, por lo tanto, el gen que codifica la proteína del virión principal en sí; o elemento genético móvil que se pueda demostrar claramente que son miembros de una línea de ascendencia evolutiva de las principales entidades que codifican la proteína del virión.

En una realización el microorganismo es un virus de una familia seleccionada del grupo que consiste en Abyssoviridae, Ackermannviridae, Adenoviridae, Adintoviridae, Aliusviridae, Alloherpesviridae, Alphaflexiviridae, Alphasatellitidae, Alphatetraviridae, Alvernaviridae, Amalgaviridae, Amnoonviridae, Ampullaviridae, Anelloviridae, Arenaviridae, Arteriviridae, Artoviridae, Ascoviridae, Asfarviridae, Aspiriviridae, Astroviridae, Atkinsviridae, Autographiviridae, Autolykiviridae, Avsunviroidae, Bacilladnaviridae, Baculoviridae, Barnaviridae, Belpaoviridae, Benyviridae, Betaflexiviridae, Bicaudaviridae, Bidnaviridae, Birnaviridae, Blumeviridae, Bornaviridae, Botourmiaviridae, Bromoviridae, Caliciviridae, Carmotetraviridae, Caulimoviridae, Chaseviridae, Chrysoviridae, Chuviridae, Chuviridae, Circoviridae, Clavaviridae, Closteroviridae, Coronaviridae, Corticoviridae, Cremegaviridae, Crepuscuviridae, Cruliviridae, Curvulaviridae, Cystoviridae, Deltaflexiviridae, Demerecviridae, Dicistroviridae, Drexlerviridae, Duinviridae, Endornaviridae, Euroniviridae, Fiersviridae, Filoviridae, Fimoviridae, Finnlakeviridae, Flaviviridae, Fuselloviridae, Gammaflexiviridae, Geminiviridae, Genomoviridae, Globuloviridae, Gresnaviridae, Guelinviridae, Guttaviridae, Halspiviridae, Hantaviridae, Hepadnaviridae, Hepeviridae, Herelleviridae, Herpesviridae, Hypoviridae, Hytrosaviridae, Iflaviridae, Inoviridae, Iridoviridae, Kitaviridae, Kolmioviridae, Lavidaviridae, Leishbuviridae, Lipothrixviridae, Lispiviridae, Malacoherpesviridae, Marnaviridae, Marseilleviridae, Matonaviridae, Matshushitaviridae, Mayoraviridae, Medioniviridae, Megabirnaviridae, Mesoniviridae, Metaviridae, Metaxyviridae, Microviridae, Mimiviridae, Mininudeoviridae, Mitoviridae, Mononiviridae, Mymonaviridae, Myoviridae, Mypoviridae, Myriaviridae, Nairoviridae, Nanghosviridae, Nanhypoviridae, Nanoviridae, Narnaviridae, Nataviridae, Nimaviridae, Nodaviridae, Nudiviridae, Nyamiviridae, Olfoviridae, Orthomyxoviridae, Ovaliviridae, Papillomaviridae, Paramyxoviridae, Partitiviridae, Parvoviridae, Paulinoviridae, Peribunyaviridae, Permutotetraviridae, Phasmaviridae, Phenuiviridae, Phycodnaviridae, Picobirnaviridae, Picornaviridae, Pithoviridae, Plasmaviridae, Plectroviridae, Pleolipoviridae, Pneumoviridae, Podoviridae, Polycipiviridae, Polydnaviridae, Polymycoviridae, Polyomaviridae, Portogloboviridae, Pospiviroidae, Potyviridae, Poxviridae, Pseudoviridae, Qinviridae, Quadriviridae, Redondoviridae, Reoviridae, Retroviridae, Rhabdoviridae, Roniviridae, Rountreeviridae, Rudiviridae, Salasmaviridae, Saltoviridae, Sarthroviridae, Schitoviridae, Secoviridae, Simuloviridae, Sinhaliviridae, Siphoviridae, Smacoviridae, Solemoviridae, Solinviviridae, Solspiviridae, Sphaerolipoviridae, Spiraviridae, Steitzviridae, Sunviridae, Tectiviridae, Thaspiviridae, Tobaniviridae, Togaviridae, Tolecusatellitidae, Tombusviridae, Tospoviridae, Totiviridae, Tristromaviridae, Turriviridae, Tymoviridae, Virgaviridae, Wupedeviridae, Xinmoviridae, Yueviridae y Zobellviridae

En una realización preferida el microorganismo de la invención es un virus de la familia Coronaviridae. Incluida dentro del dominio Riboviria, que contiene los virus que codifican ARN polimerasas dependientes de ARN y transcriptasas inversas. Incluye viriones pleomórficos, redondeados en el caso de los coronavirus (60-220 nm), y en forma de rodillo, en el caso de los torovirus (120-140 nm). En la envoltura se encuentran dos estructuras glicoproteícas virales S y M. La glicoproteína S es ampliamente glicosilada, de alto peso molecular y se ubica en la parte externa de la membrana de la envoltura y es responsable de las proyecciones abultadas (peplómeros) que caracterizan a los coronavirus, los cuales usan como ligandos en la fusión de membrana. La glicoproteína M (proteína matricial) es una molécula transmembrana y se localiza en la parte interna de la envoltura. Otra importante estructura proteica es la proteína de la nucleocápside (N), con un peso molecular de 50 a 60 kDa, responsable de la simetría helicoidal de la cápside en cuyo interior se aloja el ARN genómico. Se incluyen los géneros Alphacoronavirus, Betacoronavirus, Deltacoronavirus, Gammacoronavirus y Alphaletovirus.

En una realización aún más preferida el microorganismo es un Betacoronavirus causante de clínica humana. Incluyendo OC43 y HKU1 para el linaje A, SARS-CoV y SARS-CoV-2 (causante de la COVID-19) para el linaje B y MERS-CoV para el linaje C. En una realización aún más preferida el microorganismo es el virus SARS-CoV-2.

En una realización preferida el microorganismo de la invención es un Asfivirus, único género de la familia Asfarviridae que infecta animales, responsable de la peste porcina Africana. Incluido dentro del dominio Varidnaviria, que contiene virus de ADN bicatenario de gran tamaño (200nm de diámetro) que se caracterizan por tener una proteína en rollo de gelatina vertical dentro una cápside de forma hexagonal y simetría icosaédrica. En una realización aún más preferida, el microorganismo es el virus de la peste porcina africana, más preferiblemente una cepa seleccionada de Armenia 2007, Kenya 2006 y NH/P68, aún más preferiblemente seleccionada de Armenia 2007 y Kenya 2006.

En otra realización, el hongo miceliar es un hongo seleccionado del subreino Eumycota que consiste en División Oomycota. Género Saprolegnia. Subdivisión Mucoromycotina. Género Mucor. Género Rhizopus. Género Lichtheimia (Absidia). Género Mortierella, División Ascomycota. Género Ascosphaera. División Deuteromycota. Género Microsporum. Género Nannizia. Género Lophophyton. Género Trichophyton. Género Aspergillus. Género Penicillium y Hongos dimórficos. Género Histoplasma. Género Coccidioides. Género Blastomyces. Género Talaromyces. Género Sporothrix.

En una realización preferida el hongo miceliar es un hongo seleccionado del grupo que consiste en un hongo del género Microsporum, un hongo del género Trichophyton, un hongo del género Aspergillus y mezclas de los mismos.

En otra realización, el microorganismo u hongo miceliar de la invención es causante de enfermedades humanas.

En una realización preferida los microorganismos y hongos miceliares son patógenos de los grupos de riesgo 1, 2 y 3, más preferiblemente de los grupos 2 y 3 del nivel de contención biológica según el Real Decreto 664/1997, de 12 de mayo, sobre la protección de los trabajadores contra los riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos durante el trabajo.

En una realización más preferida el microorganismo es un microorganismo ambiental. Se entiende por “microorganismo ambiental” cualquier microorganismo que pueda estar presente en una muestra ambiental.

En otra realización preferida el hongo miceliares un hongo miceliar ambiental, es decir, que puede estar presente en una muestra ambiental.

El término “muestra” se refiere a todo aquello que contenga o supuestamente contenga una sustancia de interés. Puede ser un producto que contenga ácidos nucleicos, proteínas y cualquier otra biomolécula de interés. El término “muestra” incluye una solución, célula, tejido o población de uno o más de los mismos que incluye una población de ácidos nucleicos (ADN genómico, ADNc, ARN, etc.). Los términos “muestra” y “espécimen” se utilizan aquí de manera intercambiable en un amplio sentido e incluyen una variedad de fuentes biológicas que contienen ácidos nucleicos. En el contexto de esta invención las muestras contienen microorganismos u hongos miceliares.

El término “muestra ambiental” , tal y como aquí se utiliza, se refiere, sin limitación, a una muestra tomada del aire, el agua, el suelo, los sedimentos, la vegetación, las superficies y los alimentos. El término “muestra ambiental” incluye también muestras recogidas de la superficie de animales (muestreo no invasivo), que son representativas de lo que hay en el ambiente, por ejemplo, en el ambiente de una granja. Este término incluye también el muestreo de un objeto inanimado como un comedero o un bebedero. Las muestras se pueden usar en los métodos de la invención frescas o tras haber sido almacenadas durante un periodo de tiempo con la composición incluyendo, por ejemplo, muestras criopreservadas, e incluye muestras ambientales recogidas sobre animales, alimentos, bebida, fuentes de agua potable, aguas residuales, residuos industriales, fuentes de agua natural, suelos, fuentes aerotransportadas, poblaciones pandémicas o epidémicas, muestras epidemiológicas, materiales de investigación, especímenes patológicos, agentes sospechosos de bioterrorismo, y similares.

En otra realización, la muestra es una matriz biológica. El término "matriz biológica” se refiere a una muestra obtenida mediante un procedimiento invasivo procedente de un animal, humano o planta. Ejemplos de matrices biológicas son, sin limitación, linfonodos de bovinos naturalmente infectados, muestras de tejido sólido obtenidas mediante un procedimiento quirúrgico o muestras de biopsia, muestras de tejido líquido, fluidos biológicos, aspirados, células y fragmentos celulares. Ejemplos de matrices biológicas son, sin limitación, sangre, líquido cefalorraquídeo, suero, plasma, hígado, riñones, huesos, médula ósea, testículos, cerebro, ovario, pulmón, próstata, glándula tiroides, páncreas, estómago, intestino, vejiga, colon, fluido sinovial, fluido espinal, fluido amniótico, fluido peritoneal, fluido pleural, líquido pericárdico, fluido linfático, fluido intersticial, entre otros. Estas muestras se pueden obtener por métodos convencionales, utilizando procedimientos conocidos por el experto en la técnica, tal como extracción de sangre, punción pleural o toracocentesis, punción percutánea sinovial, punción abdominal, amniocentesis, punción percutánea peritoneal, punción percutánea pericárdica, etc.

El término "incubar” en este contexto, es sinónimo de "poner en contacto” , y se refiere a poner en contacto la composición de la invención con la muestra, ya sea a temperatura ambiente o inferior, durante un tiempo determinado.

En una realización preferida la inactivación se produce a los 10 minutos del contacto del microorganismo con la composición, preferiblemente a los 9 minutos, más preferiblemente a los 8 minutos, a los 7 minutos, a los 6 minutos, a los 5 minutos, a los 4 minutos, a los 3 minutos, a los 2 minutos, al minuto o es inmediata. Por lo tanto, en una realización la muestra que contiene el microorganismo se mantiene en contacto con la composición de la invención durante al menos 1 minuto, al menos 2 minutos, al menos 3 minutos, al menos 4 minutos, al menos 5 minutos, al menos 6 minutos, al menos 7 minutos, al menos 8 minutos, al menos 9 minutos, al menos 10 minutos. En una realización preferida la composición se pone en contacto con la muestra durante al menos 10 minutos. Estos mismos tiempos son aplicables cuando la muestra contiene un hongo miceliar.

En una realización preferida, preferiblemente cuando el microorganismo es una bacteria Gram-positiva o Gram-negativa, preferiblemente una bacteria de un género seleccionado de Brucella, Salmonella, Pasteurella, Escherichia, Enterococcus, Staphilococcus, Streptococcus, Listeria y Lactococcus, más preferiblemente una bacteria seleccionada del grupo que consiste en Brucella suis, Salmonella enteritidis, Pasteurella multocida, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Staphilococcus aureus, Streptococcus suis, Listeria monocytogenes, Listeria innocua y Lactococcus garvieae, el tiempo de contacto entre la muestra que contiene el microorganismo y la composición es de al menos 10 minutos.

En otra realización preferida, la inactivación se produce a las 72 horas del contacto del microorganismo con la composición, preferiblemente a las 70 horas, más preferiblemente a las 60 horas, a las 50 horas, a las 48 horas, a las 40 horas, a las 30 horas, a las 24, a las 20 horas, a las 15 horas, a las 12 horas, a las 10 horas, a las 5 horas, a las 3 horas, a las 2 horas, a la hora, a los 30 minutos, a los 20 minutos o es inmediata. Por lo tanto, en una realización la muestra que contiene el microorganismo se mantiene en contacto con la composición de la invención durante al menos 20 minutos, al menos 1 hora, al menos 2 horas, al menos 3 horas, al menos 5 horas, al menos 10 horas, al menos 12 horas, al menos 15 horas, al menos 20 horas, al menos 24 horas, al menos 30 horas, al menos 40 horas, al menos 48 horas, al menos 50 horas, al menos 60 horas, al menos 70 horas, al menos 72 horas. En una realización preferida el tiempo de contacto es de al menos 1 hora. En otra realización preferida el tiempo de contacto es de al menos 24 horas. En otra realización preferida el tiempo de contacto es de al menos 72 horas. Estos mismos tiempos son aplicables cuando la muestra contiene un hongo miceliar.

En una realización preferida, preferiblemente cuando el microorganismo es una micobacteria, preferiblemente una bacteria del género Mycobacterium, más preferiblemente Mycobacterium bovis, aún más preferiblemente Mycobacterium bovis BCG, el tiempo de contacto entre la muestra que contiene el microorganismo (preferiblemente una muestra ambiental) y la composición es de al menos 24 horas. En otra realización preferida, cuando el microorganismo es una micobacteria, preferiblemente una bacteria del género Mycobacterium, más preferiblemente Mycobacterium bovis, aún más preferiblemente Mycobacterium bovis BCG, más preferiblemente cuando el microorganismo procede de una matriz biológica tal como la superficie de un animal, el tiempo de contacto entre la muestra que contiene el microorganismo y la composición es de al menos 72 horas.

En una realización, la composición de la invención es capaz de inactivar una concentración de bacterias de 105-108 UFC/ml en función de la especie. En una realización preferida, la composición de la invención es capaz de inactivar bacterias, preferiblemente micobacterias, a una concentración de 105-106 UFC/ml. En otra realización preferida, la composición de la invención es capaz de inactivar bacterias, preferiblemente bacterias Gram positivas o Gram negativas, a una concentración de 107-108 UFC/ml.

En una realización preferida, preferiblemente cuando el microorganismo es un hongo, preferiblemente un hongo del género Microsporum, Trichophyton o Aspergillus, el tiempo de contacto entre la muestra que contiene el microorganismo y la composición es de al menos 10 minutos, al menos 1 hora, al menos 24 horas.

Preferiblemente, la muestra se pone en contacto con una cantidad de la composición de la invención a una temperatura de desde -80°C a 40°C, preferiblemente desde -20°C a 40°C, más preferiblemente de 0°C a 40°C, aún más preferiblemente a una temperatura de 4°C a 37°C, todavía más preferiblemente a una temperatura de 4°C a 35°C, todavía más preferiblemente a una temperatura de 4°C a 30°C, más preferiblemente a una temperatura de 10°C a 30°C, aún más preferiblemente a una temperatura de 10°C a 25°C, aún más preferiblemente a una temperatura de 15°C a 25°C. En una realización preferida, la muestra se pone en contacto con la composición a una temperatura de desde 0°C a 40°C.

Preferiblemente, la muestra se pone en contacto con una cantidad de la composición de la invención a una temperatura de desde -80°C a 40°C, preferiblemente desde -20°C a 40°C, más preferiblemente de 0°C a 40°C, aún más preferiblemente a una temperatura de 4°C a 37°C, todavía más preferiblemente a una temperatura de 4°C a 35°C, todavía más preferiblemente a una temperatura de 4°C a 30°C, más preferiblemente a una temperatura de 10°C a 30°C, aún más preferiblemente a una temperatura de 10°C a 25°C, aún más preferiblemente a una temperatura de 15°C a 25°C durante un periodo de tiempo de al menos 10 minutos, al menos 1 hora, al menos 24 horas, más preferiblemente de al menos 48 horas, al menos 72 horas, al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 4 semanas o más sin causar un deterioro o degradación sustancial de los ácidos nucleicos contenidos en la muestra.

En una realización, el método de inactivación de la invención no se lleva a cabo sobre el cuerpo humano o animal, preferiblemente no se lleva a cabo sobre un cuerpo humano o animal vivo. En otra realización, el método de inactivación de la invención no es un método diagnóstico o terapéutico llevado a cabo sobre el cuerpo humano o animal.

Todas las realizaciones y definiciones de la composición de la invención son aplicables al método de inactivación de microorganismos y hongos miceliares de la invención.

Uso como vehículo para la realización de muéstreos

Otro aspecto de la invención es el uso de la composición de la invención como vehículo para la realización de muestreos, preferiblemente de muestras que contienen microorganismos.

Alternativamente, otro aspecto de la invención es un método para la realización de muestreos, preferiblemente de muestras que contienen microorganismos, que comprende usar la composición de la invención como vehículo.

En otra realización las muestras contienen hongos miceliares.

En una realización preferida de la invención los muestreos son muestreos ambientales.

En otra realización de la invención los muestreos son muestreos de matrices biológicas.

Estos métodos comprenden poner en contacto la muestra con la composición de la invención.

En una realización preferida, el método de la invención comprende tomar una muestra, preferiblemente una muestra ambiental o de una matriz biológica, más preferiblemente una muestra de superficie, con un soporte que comprende la composición de la invención. Opcionalmente, esta muestra puede almacenarse en la composición de la invención, preferiblemente puede almacenarse durante un tiempo comprendido entre 24 horas y 4 semanas, más preferiblemente entre 72 horas y 4 semanas, aún más preferiblemente entre 1 semana y 4 semanas, todavía más preferiblemente entre 2 semanas y 4 semanas. En una realización más preferida de la invención la muestra puede almacenarse al menos 4 semanas.

En el contexto de la presente invención el término "vehículo” se refiere al medio (solución, suspensión, coloide, etc.) inerte que sirve para recolectar la muestra y que al mismo tiempo permite inactivar el microorganismo u hongo miceliar y preservar sus ácidos nucleicos para el análisis posterior. Preferiblemente, este vehículo debe ser aceptable para entrar en contacto con la superficie de animales o personas.

El término "muestreo ambiental” se refiere a la toma de muestras en cualquier localización ambiental de las mencionadas anteriormente en el contexto del método de inactivación, su almacenamiento y conservación para su análisis posterior. Preferiblemente, el muestreo ambiental es un muestreo de superficie. El muestreo ambiental se realiza por métodos comúnmente conocidos por el experto en la técnica del muestreo.

En una realización el muestreo ambiental se realiza sobre una superficie seleccionada de ropa y calzado de personas infectadas o que trabajan con animales, guantes, superficies de picaportes de puertas, sillas, teclados, mesas, suelos, tierra, botas, boxes, comida animal o cebo, vehículos de transporte de animales, comida, carcasas, comederos y paredes.

En otra realización el muestreo ambiental se realiza sobre la superficie de un animal. Más preferiblemente, la muestra de superficie del animal se obtiene de cabeza, dorso o pecho del animal.

En otra realización el muestreo ambiental se realiza sobre la superficie de un ser humano.

En otra realización el muestreo ambiental se realiza sobre una muestra de agua, preferiblemente agua residual.

En una realización, el muestreo ambiental no incluye el muestreo sobre un cuerpo animal o humano.

En otra realización, la composición de la invención se usa como vehículo para la realización de muestreos de matrices biológicas que contienen microorganismos. En otra realización, la composición de la invención se usa como vehículo para la realización de muestreos de matrices biológicas que contienen hongos miceliares.

El término "matriz biológica” se ha definido en el contexto del uso para la inactivación de microorganismos. En una realización preferida, la matriz biológica es piel animal o humana, preferiblemente piel de un animal o humano infectado. En una realización preferida los animales son cerdos, jabalíes y bovinos. En otra realización preferida, la matriz biológica son linfonodos.

En una realización, el microorganismo contenido en la muestra que se somete a muestreo se selecciona del grupo que consiste en Brucella suis, preferiblemente es Brucella suis biovar 2, Mycobacterium bovis, SARS-CoV-2 y el virus de la peste porcina Africana. Preferiblemente, el microorganismo contenido en la muestra es SARS-CoV-2.

En otra realización, el microorganismo contenido en la muestra que se somete a muestreo se selecciona del grupo que consiste en Brncella suis, Escherichia coli, Streptococcus suis, Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Coxiella burnetii, Pasteurella multocida y Lactococcus garvieae; preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en Brucella suis, Escherichia coli, Streptococcus suis, Listeria innocua y Coxiella burnetii.

En una realización preferida, la muestra se pone en contacto con la composición de la invención a una temperatura de desde -80°C a 40°C, preferiblemente desde -20°C a 40°C, más preferiblemente de 0°C a 40°C, aún más preferiblemente a una temperatura de 4°C a 37°C, todavía más preferiblemente a una temperatura de 4°C a 35°C, todavía más preferiblemente a una temperatura de 4°C a 30°C, más preferiblemente a una temperatura de 10°C a 30°C, aún más preferiblemente a una temperatura de 10°C a 25°C, aún más preferiblemente a una temperatura de 15°C a 25°C. En una realización preferida, la muestra se pone en contacto con la composición a una temperatura de desde 0°C a 40°C. En otra realización de la invención la muestra se pone en contacto con la composición a una temperatura de desde -80°C a 10°C, preferiblemente desde -80°C a 4°C.

En una realización, el muestreo se realiza mediante un soporte que comprende la composición de la invención. Más preferiblemente, el soporte está impregnado con la composición de la invención. El término "soporte prehidratado o impregnado” se refiere a cualquier objeto que pueda ser hidratado, impregnado o embebido con la composición de la invención y que permita la recolección de una muestra. Por "impregnado” o "prehidratado” se entiende que la composición está presente en la superficie del soporte, más preferiblemente está adherida a la superficie del soporte.

En una realización preferida, el soporte que comprende la composición es una esponja, preferiblemente una esponja impregnada con la composición de la invención.

En una realización, el método de muestreo de la invención no se lleva a cabo sobre el cuerpo humano o animal, preferiblemente no se lleva a cabo sobre un cuerpo humano o animal vivo. En otra realización, el método de muestreo no es un método diagnóstico o terapéutico llevado a cabo sobre el cuerpo humano o animal.

Todas las realizaciones y definiciones de la composición de la invención y del uso para la inactivación de microorganismos de la invención son aplicables al uso como vehículo para la realización de muestreos.

Uso para preservar la integridad de los ácidos nucleicos

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para preservar la integridad de los ácidos nucleicos de una muestra de microorganismos que comprende poner en contacto la muestra con la composición de la invención.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para preservar la integridad de los ácidos nucleicos de una muestra de hongos miceliares que comprende poner en contacto la muestra con la composición de la invención.

Preferiblemente, es un método para mantener la integridad de los ácidos nucleicos de una muestra durante un periodo de desde 24 horas a 4 semanas cuando la composición que comprende la muestra se almacena a una temperatura de desde -80°C hasta 40°C; más preferiblemente durante un periodo de al menos 72 horas cuando se almacena a una temperatura desde 0°C hasta 40°C, más preferiblemente desde 10°C hasta 25°C; aún más preferiblemente desde 18°C hasta 25°C; todavía más preferiblemente durante un periodo de al menos 4 semanas cuando se almacena a una temperatura desde 0°C hasta 40°C, más preferiblemente desde 0°C hasta 8°C, preferiblemente desde 10°C hasta 25°C, preferiblemente desde 18°C hasta 25°C.

La expresión "preservar la integridad de los ácidos nucleicos” se refiere a mantener la integridad de los ácidos nucleicos presentes en la muestra en su forma no degradada, preferiblemente durante periodos de varias semanas, meses o más, incluso cuando la composición que contiene la muestra se almacena a una temperatura entre -80°C y 40°C hasta que las muestras puedan ser procesadas en un laboratorio. Las composiciones de la invención preferiblemente no degradan los ácidos nucleicos o pierden su integridad durante la recolección, almacenamiento y transporte de la muestra, de modo que pueden utilizarse para análisis in vivo o in vitro con posterioridad.

Métodos para detectar la preservación de la integridad de los ácidos nucleicos son, por ejemplo, la determinación del ciclo umbral (C ^t ) de la PCR según se describe en el apartado 2.2 de los ejemplos de la presente invención. En una realización de la presente invención se dice que la composición preserva la integridad de los ácidos nucleicos cuando se puede detectar la secuencia del ácido nucleico mediante amplificación. El nivel de fluorescencia basal que indica una lectura positiva y, por lo tanto, la detección, se denomina valor C ^t . El ciclo umbral (C ^t ) se define como el número de ciclos en el que la señal fluorescente cruza este umbral, es decir, el ciclo de la PCR en el que comienza a detectarse el ácido nucleico del microorganismo. En particular, la preservación se indica por la detección de la secuencia del ácido nucleico hasta 30-38 ciclos de PCR, preferiblemente 30-35. Así, en una realización preferida, la composición de la invención preserva los ácidos nucleicos si tras la amplificación, C ^t se alcanza a 38 ciclos o menos.

Otros métodos para detectar la preservación de la integridad de los ácidos nucleicos son, sin limitación, métodos de secuenciación de ADN o ARN convencionales, incluyendo métodos de secuenciación química como Maxam-Gilbert, el método de terminación de la cadena didesoxi de Sanger, métodos basados en fluoróforos o técnicas de pirosecuenciación.

El experto entenderá que las composiciones de la invención estabilizan los ácidos nucleicos de modo que permanecen totalmente o al menos sustancialmente sin degradación, incluso durante tiempos de almacenamiento prolongados a temperatura ambiente, refrigerados o a temperaturas bajo cero. El término “sustancial” con respecto a la degradación o deterioro de los ácidos nucleicos, se refiere a que al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o el 100% de los ácidos nucleicos contenidos en la muestra no se degraden tras el almacenamiento prolongado de la misma. La degradación se mide por los mismos métodos utilizados para medir la integridad de los ácidos nucleicos.

En una realización, al menos el 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% o 100% de los ácidos nucleicos están presentes tras el almacenamiento cuando se comparan con la cantidad presente en la muestra cuando esta se recogió. En otra realización, al menos el 75% de los ácidos nucleicos mantienen su longitud total.

El término “ácido nucleico” se refiere a uno o más tipos de polidesoxiribonucleótidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa), poliribonucleótidos (que contienen D-ribosa), y cualquier otro tipo de polinucleótidos tales como N-glicósidos de una base púrica o pirimidínica, o bases púricas o pirimidínicas modificadas (inclyuyendo sitios abásicos). El término “ácido nucleico” también incluye polímeros de ribonucleósidos o desoxiribonucleósidos que están covalentemente unidos, típicamente por enlaces fosfodiéster entre subunidades, pero en algunos casos por fosforotioatos, metilfosfonatos y similares. “Ácido nucleico” incluye ADN de cadena doble y simple, así como ARN de cadena doble y simple. Ejemplos de ácidos nucleicos incluyen, sin limitación, ADNg, ARNhn, ARNm, ARNr, ARNt, micro-ARN, ARN pequeño de interferencia (ARNip). ARN nuclear pequeño (ARNnp), ARN nucleolar pequeño (ARNnop), y ARN temporal pequeño, entre otros. En una realización preferida el ácido nucleico es ADN. En otra realización preferida el ácido nucleico es ARN.

En una realización preferida, la composición de la invención preserva la integridad del material genético presente en una muestra ambiental. En otra realización preferida, la composición de la invención preserva la integridad del material genético presente en una matriz biológica.

El método para preservar la integridad de los ácidos nucleicos de una muestra comprende poner en contacto o incubar la muestra con la composición de la invención durante un tiempo determinado.

Preferiblemente, la composición de la invención que contiene la muestra es lo suficientemente estable como para permitir el almacenamiento de la muestra en la composición a temperatura ambiente o a temperaturas más bajas desde el momento de la recolección de la muestra hasta el momento del análisis de los ácidos nucleicos presentes en la muestra. La expresión “temperatura ambiente”, en el presente documento, se refiere a temperaturas desde 18°C a 25°C, preferiblemente de 20°C a 22°C. En una realización preferida, la composición de la invención es capaz de preservar los ácidos nucleicos de la muestra cuando esta se almacena a una temperatura entre -80°C y 40°C, preferiblemente entre -80°C a 25°C, más preferiblemente entre -20°C y 10°C, más preferiblemente entre 0°C y 8°C, aún más preferiblemente entre 0°C y 4°C. En una realización preferida, la composición de la invención es capaz de preservar los ácidos nucleicos cuando la muestra está refrigerada, es decir, a una temperatura entre 0 y 8°C, más preferiblemente entre 0°C y 4°C.

En una realización preferida, la composición de la invención es capaz de preservar los ácidos nucleicos de la muestra cuando esta se almacena a una temperatura entre -80°C y 40°C, preferiblemente entre -80°C a 25°C, más preferiblemente entre -20°C y 10°C, más preferiblemente entre 0°C y 8°C, aún más preferiblemente entre 0°C y 4°C, durante un periodo de tiempo de al menos 24 horas, al menos 72 horas, al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 4 semanas.

En una realización los ácidos nucleicos se conservan en la muestra durante al menos 24 horas, al menos 72 horas, al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 4 semanas. Preferiblemente, los ácidos nucleicos se conservan durante un tiempo comprendido entre 24 horas y 4 semanas. En una realización más preferida de la invención los ácidos nucleicos se conservan al menos 4 semanas.

En una realización el microorganismo se selecciona del grupo que consiste en Brucella suis, Pasteurella multocida, Escherichia coli, Streptococcus suis, Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Coxiella bumetii y Lactococcus garvieae; preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en Brucella suis, Escherichia coli, Streptococcus suis, Listeria innocua y Coxiella burnetii. En una realización más particular, el microorganismo es Brucella suis, preferiblemente Brucella suis biovar 2. En otra realización particular el microorganismo es Coxiella burnetii.

En una realización preferida, preferiblemente cuando el microorganismo es una bacteria Gram-positiva o Gram-negativa, más preferiblemente Brucella suis, aún más preferiblemente Brucella suis biovar 2, los ácidos nucleicos se conservan en la muestra durante al menos 24 horas.

En una realización preferida, preferiblemente cuando el microorganismo es una bacteria Gram-positiva o Gram-negativa, más preferiblemente una bacteria seleccionada del grupo que consiste en Brucella suis, Pasteurella multocida, Escherichia coli, Streptococcus suis, Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Coxiella burnetii y Lactococcus garvieae; todavía más preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en Brucella suis, Escherichia coli, Streptococcus suis, Listeria innocua y Coxiella burnetii, los ácidos nucleicos se conservan en la muestra durante al menos 24 horas, preferiblemente durante al menos 4 semanas.

En otra realización preferida el microorganismo es una micobacteria del complejo Mycobacterium tuberculosis.

En una realización preferida, cuando el microorganismo es una micobacteria del complejo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) los ácidos nucleicos se conservan en la muestra durante al menos 24 horas, preferiblemente durante al menos 72 horas.

En otra realización preferida, el microorganismo es un virus seleccionado del virus de la peste porcina Africana y el virus SARS-CoV-2.

Todas las realizaciones y definiciones de la composición de la invención, del uso para la inactivación de microorganismos u hongos miceliares y del uso como vehículo para la realización de muestreos son también aplicables al uso para preservar la integridad de los ácidos nucleicos.

Métodos de la invención

En un aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para detectar la presencia de un microorganismo en una muestra, preferiblemente en una muestra ambiental o en una matriz biológica, que comprende:

En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para detectar la presencia de un hongo miceliar en una muestra, preferiblemente en una muestra ambiental o en una matriz biológica, que comprende:

El término "muestra”, cuando se refiere a este aspecto de la invención, incluye cualquier tipo de muestra que contenga o sea susceptible de contener ácidos nucleicos de microorganismos u hongos miceliares. En una realización preferida la muestra es una muestra ambiental. En otra realización preferida es una matriz biológica.

El método de la invención es un método “in vitro”, es decir, que se lleva a cabo sobre una muestra previamente aislada y no sobre un animal vivo. En una realización de la invención, el método no se lleva a cabo sobre el cuerpo humano o animal, preferiblemente no se lleva a cabo sobre un cuerpo humano o animal vivo. En otra realización, el método no es un método diagnóstico o terapéutico llevado a cabo sobre el cuerpo humano o animal.

La expresión "detectar la presencia de un microorganismo o de un hongo miceliar” se refiere al proceso de determinar y/o identificar dicho organismo en la muestra. Como el experto en la técnica entenderá, esta detección puede que no sea correcta para el 100% de las muestras, aunque preferiblemente es correcta para el 100%. No obstante, este término requiere ser capaz de detectar la presencia de microorganismos u hongos miceliares en una parte estadísticamente significativa de las muestras. Un experto en la técnica puede determinar si una parte es estadísticamente significativa usando varias herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, la determinación de intervalos de confianza, la determinación del valor p, t de Student, etc., usando la especificidad y la sensibilidad para clasificar una muestra en el grupo correcto. Intervalos de confianza preferidos son al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%. Los valores p son, preferiblemente, 0.05, 0.01, 0.005 o menores.

El método de la invención permite detectar un ácido nucleico que es indicativo de la presencia de un microorganismo u hongo miceliar en una muestra y comprende contactar la muestra a temperatura ambiente con la composición de la invención formando una composición que inactiva el microorganismo u hongo miceliar sin degradar los ácidos nucleicos de la muestra, de manera que los ácidos nucleicos del microorganismo u hongo miceliar son detectables por amplificación mediante PCR.

El método de la invención comprende una primera etapa de incubación de la muestra con la composición de la invención. Preferiblemente, la muestra se incuba con una cantidad efectiva de la composición de la invención durante un tiempo suficiente para inactivar el microorganismo u hongo miceliar sin degradar los ácidos nucleicos. Preferiblemente, la muestra se incuba a una temperatura comprendida entre -80°C y 40°C por el tiempo requerido, más preferiblemente por el tiempo requerido para inactivar el microorganismo u hongo miceliar. En una realización la muestra se incuba durante un tiempo comprendido entre 10 minutos y 4 meses.

El soporte o dispositivo de recolección puede utilizarse para recolectar la muestra y después desecharse, o también puede incubarse junto con la muestra. En una realización preferida, se incuba con la muestra.

El término "soporte”, "soporte de toma de muestra” o "dispositivo de recolección” , según se usa en el presente documento, se refiere a cualquier objeto que permita la recolección de una muestra, tal como un hisopo, una cureta, un asa de cultivo, una esponja, un cubrebotas, un rodillo, una toallita, un paño, una gasa, etc. Preferiblemente, el soporte o dispositivo de recolección debe poder ser impregnado, hidratado o embebido en la composición de invención. En una realización más preferida el soporte o dispositivo de recolección es poroso, más preferiblemente es una esponja. El dispositivo de recolección preferiblemente es apto para el muestreo de superficie.

El soporte o dispositivo de recolección puede comprender o no la composición de la invención, preferiblemente comprende la composición de la invención. El soporte puede estar previamente impregnado o prehidratado con la composición, o bien puede impregnarse o hidratarse in situ en el lugar de la toma de muestra. En una realización el método de la invención comprende una etapa previa de muestreo de superficie mediante un soporte que comprende la composición de la invención, preferiblemente que está impregnado, más preferiblemente hidratado, aún más preferiblemente prehidratado con la composición. En una realización aún más preferida, el método comprende una etapa previa donde el soporte se impregna o hidrata con la composición de la invención.

El método de la invención comprende una segunda etapa donde se somete la muestra incubada con la composición de la etapa (a) a una técnica de biología molecular capaz de detectar los ácidos nucleicos del microorganismo u hongo miceliar, preferiblemente se someten los ácidos nucleicos de la muestra a esta técnica. En una realización preferida, el ácido nucleico de la muestra sigue siendo detectable mediante PCR después de que la mezcla que contiene la muestra con la composición se haya almacenado a una temperatura entre -80°C y 40°C durante un periodo comprendido entre 24 horas y 4 semanas, preferiblemente a una temperatura entre 0°C y 8°C durante al menos 4 semanas.

Adicionalmente, tras la toma de muestra, el soporte puede impregnarse o rehidratarse de nuevo con la composición de la invención. Por lo tanto, en otra realización, el método comprende una etapa adicional entre la etapa (a) y (b) donde se impregna o rehidrata el soporte con la composición de la invención.

En una realización preferida el soporte es una esponja. Cuando el soporte es una esponja, antes del inicio de la etapa (b) se recoge el fluido retenido en la esponja.

En una realización preferida de la invención, tras la recogida del fluido se realiza una centrifugación durante 10 minutos a 12000-14000 rpm.

En una realización preferida de la invención la muestra se conserva refrigerada y se procesa en un intervalo de tiempo comprendido entre 24 horas y 4 semanas después de la recogida.

Las técnicas de biología molecular que permiten detectar ácidos nucleicos son conocidas por el experto en la técnica.

Las composiciones de la invención son compatibles con una variedad de métodos de extracción, purificación y amplificación de ácidos nucleicos convencionales. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos aislados por los métodos de la presente invención pueden servir como molde en una o más de las siguientes aplicaciones o técnicas de biología molecular, incluyendo, sin limitarse a, técnicas de amplificación de ácidos nucleicos como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), análisis de microsatélites, técnicas de hibridación con sondas como Southern-blot o Northern-blot, PCR convencional, PCR a tiempo real (RT-PCR), PCR cuantitativa en tiempo real, multiplex PCR, PCR anidada, PCR de transcripción inversa, PCR específica de metilación (MPCR), amplificación dependiente de helicasa (HDA), amplificación del genoma completo (WGA), amplificación mediada por transcripción (MTA), reacción en cadena de la ligasa (LCR), aislamiento de plásmidos, amplificación alélica, microarrays o similar. En una realización la técnica utilizada es una técnica de hibridación, donde el ácido nucleico se hibrida con una sonda por métodos conocidos por el experto en la técnica. En otra realización la técnica utilizada es una técnica de amplificación de ácidos nucleicos, preferiblemente es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), preferiblemente PCR a tiempo real. En otra realización, la técnica es una PCR convencional. En otra realización, la técnica es multiplex PCR.

En una realización preferida de la invención, la técnica de biología molecular permite detectar la presencia de un ácido nucleico específico, preferiblemente mediante una reacción de hibridación o de amplificación con reactivos específicos para ese ácido nucleico, más preferiblemente con sondas o cebadores específicos para ese ácido nucleico.

Una sonda o cebador es específico cuando híbrida con sus secuencias diana y no comparte una homología significativa o no se une sustancialmente a otras dianas distintas de la que se quiere detectar, es decir, que no tiene reacción cruzada o no hibrida con otros ácidos nucleicos presentes en la muestra. La selección de sondas y cebadores es un proceso bien conocido por el experto en la técnica.

Las técnicas de biología molecular para la detección de ácidos nucleicos de la presente invención también pueden ser técnicas de secuenciación, como métodos de secuenciación química de Maxam-Gilbert, el método de terminación de la cadena didesoxi de Sanger, métodos basados en fluoróforos o técnicas de pirosecuenciación.

Las muestras recolectadas incluirán ácidos nucleicos, preferiblemente ácidos nucleicos aislados de muestras ambientales, incluyendo ARN y ADN.

En una realización preferida, los métodos de la invención detectan ARN de SARS-CoV-2 y ADN de Mycobacterium y virus de la peste porcina Africana. En una realización preferida el microorganismo detectado se selecciona de SARS-CoV-2, Mycobacterium y virus de la peste porcina Africana.

En una realización el microorganismo se selecciona del grupo que consiste en Brucella suis, Pasteurella multocida, Escherichia coli, Streptococcus suis, Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Coxiella burnetii, Lactococcus garvieae, un microorganismo del complejo Mycobacterium tuberculosis, el virus de la peste porcina Africana o el virus SARS-CoV-2.

En otra realización, previamente a la etapa (b) se purifican o extraen los ácidos nucleicos de la muestra. Los métodos para aislar ácidos nucleicos a partir de una muestra son bien conocidos por el experto en la técnica e incluyen, por ejemplo, la lisis de las células y extracción de ácidos nucleicos usando fenol:cloroformo según protocolos estándar, o bien el uso de otros tampones de lisis como Trizol o RIPA. Algunos métodos utilizan una columna que une ácidos nucleicos para capturar los ácidos nucleicos contenidos en la muestra. Una vez se unen a la columna, los ácidos nucleicos se eluyen utilizando un tampón o solución adecuada para eliminar la interacción entre los ácidos nucleicos y la columna, eluyendo de este modo los ácidos nucleicos. Se pueden añadir también inhibidores de RNAsas o proteasas.

Las composiciones de la invención son particularmente útiles para estudios de campo, muestreo epidemiológico, y para la monitorización, etiología y control de enfermedades epidémicas o pandémicas tanto en humanos como en poblaciones de animales domésticos y salvajes.

Los métodos de la invención también permiten detectar el microorganismo u hongo miceliar en una matriz biológica, preferentemente en un huésped o sujeto. El término "huésped” o "sujeto” se refiere aquí a un individuo que puede servir como fuente de una o más de las muestras o especímenes mencionados. En algunas realizaciones, el sujeto es un animal vertebrado, preferiblemente un mamífero, incluyendo un ser humano. En una realización el sujeto no es un ser humano. En otras realizaciones el sujeto puede ser cualquier animal, incluyendo pero sin limitarse a, primates humanos y no humanos, aves, reptiles, anfibios, bovinos, perros, cabras, ovejas, cuervos, cerdos, caballos, gatos, conejos, ratas, ratones, zorros, jabalíes, entre otros, incluyendo, sin limitación, ganado domesticado, animales de pastoreo o migratorios o aves, especímenes exóticos o zoológicos, así como animales de compañía, mascotas, y cualquier animal bajo el cuidado médico veterinario. La invención también puede utilizarse para monitorizar un brote o progresión de una enfermedad en una población como por ejemplo la tuberculosis, la peste porcina Africana, el SARS-CoV-2 o la gripe aviar. En algunas realizaciones las muestras son preferiblemente de origen mamífero y más preferiblemente de origen humano. En una realización preferida las muestras son muestras veterinarias, preferiblemente obtenidas de la superficie de un animal.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para detectar la presencia de un microorganismo en una muestra, preferiblemente en una muestra ambiental o en una matriz biológica, que comprende:

a) tomar una muestra de la superficie o material que se desea ensayar,

b) incubar la muestra con la composición de la invención y, opcionalmente, con el soporte o dispositivo de recolección, y

c) someter la muestra incubada con la composición de la etapa (a) a una técnica de biología molecular capaz de detectar los ácidos nucleicos del microorganismo, donde la detección de los ácidos nucleicos del microorganismo es indicativa de la presencia del microorganismo en la muestra.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para detectar la presencia de un hongo miceliar en una muestra, preferiblemente en una muestra ambiental o en una matriz biológica, que comprende:

a) tomar una muestra de la superficie o material que se desea ensayar,

c) someter la muestra incubada con la composición de la etapa (a) a una técnica de biología molecular capaz de detectar los ácidos nucleicos del hongo miceliar, donde la detección de los ácidos nucleicos del hongo miceliar es indicativa de la presencia del hongo miceliar en la muestra.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para detectar la presencia de un ácido nucleico de un microorganismo en una muestra, preferiblemente en una muestra ambiental o en una matriz biológica, que comprende:

a) incubar la muestra con la composición de la invención, y, opcionalmente con el soporte o dispositivo de recolección, y

b) someter la muestra incubada con la composición de la etapa (a) a una técnica de biología molecular capaz de detectar los ácidos nucleicos del microorganismo.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para detectar la presencia de un ácido nucleico de un hongo miceliar en una muestra, preferiblemente en una muestra ambiental o en una matriz biológica, que comprende:

b) someter la muestra incubada con la composición de la etapa (a) a una técnica de biología molecular capaz de detectar los ácidos nucleicos del hongo miceliar.

En una realización preferida, la técnica de biología molecular es una reacción de hibridación, y la detección de la presencia del producto de hibridación es indicativa de la presencia del ácido nucleico en la muestra. En otra realización preferida, la técnica de biología molecular es una reacción de amplificación, más preferiblemente una PCR, y la detección de la presencia del producto de amplificación es indicativa de la presencia del ácido nucleico en la muestra.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para detectar la presencia de un microorganismo, de un hongo miceliar o de un ácido nucleico en una muestra, preferiblemente en una muestra ambiental o en una matriz biológica, que comprende: a) incubar la muestra con la composición de la invención y, opcionalmente, con el soporte o dispositivo de recolección;

b) extraer los ácidos nucleicos de la muestra;

c) amplificar los ácidos nucleicos por PCR usando dos cebadores específicos para el ácido nucleico del microorganismo u hongo miceliar que se quiere detectar;

d) opcionalmente, hibridar una o más sondas marcadas específicas para el ácido nucleico del microorganismo u hongo miceliar, con el producto de la PCR de la etapa (c); y

e) detectar la presencia del producto de amplificación o de la sonda marcada en la muestra, que es indicativa de la presencia del microorganismo, del hongo miceliar o del ácido nucleico en la muestra.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para extraer ácidos nucleicos de una muestra que comprende: a) incubar la muestra con la composición de la invención y, opcionalmente, con el soporte o dispositivo de recolección; y b) extraer los ácidos nucleicos de la muestra.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso del método de la invención para detectar la presencia de un microorganismo para diagnosticar una infección.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para diagnosticar una infección que comprende detectar la presencia de un microorganismo según el método de la invención.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso del método de la invención para detectar la presencia de un microorganismo para determinar el pronóstico o para monitorizar la progresión de una infección en un sujeto.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso del método de la invención para detectar la presencia de un hongo miceliar para diagnosticar una infección.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para diagnosticar una infección que comprende detectar la presencia de un hongo miceliar según el método de la invención.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso del método de la invención para detectar la presencia de un hongo miceliar para determinar el pronóstico o para monitorizar la progresión de una infección en un sujeto.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso del método de la invención para monitorizar el efecto de una terapia para el tratamiento de una infección.

Todas las realizaciones y definiciones de la composición de la invención, del uso para la inactivación de microorganismos u hongos miceliares, del uso como vehículo para la realización de muestreos y del uso para preservar la integridad de los ácidos nucleicos, son también aplicables a los métodos de la invención.

Kits de la invención

En un aspecto la invención se refiere a un soporte que comprende la composición de la invención. En una realización preferida el soporte está impregnado con la composición de la invención, más preferiblemente está hidratado con la composición de la invención.

Ejemplos de soportes que pueden estar impregnados o prehidratados con la composición de la invención son, sin limitación, un hisopo, una esponja, un cubrebotas, un rodillo, una toallita, un paño, una gasa. En una realización preferida el soporte es una esponja.

En una realización preferida, el soporte, preferiblemente la esponja, se presenta en una bolsa plástica de cierre metálico.

En otro aspecto, la invención se refiere a un kit que comprende:

a) Un soporte o un dispositivo de recolección, preferiblemente capaz de ser impregnado por una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y

b) Una composición según las reivindicaciones 1 a 10.

Preferiblemente, la composición de la invención permite mantener la integridad de los ácidos nucleicos de la muestra cuando la muestra se almacena a una temperatura entre -80°C y 40°C durante un periodo comprendido entre 24 horas y 4 semanas.

La expresión "capaz de ser impregnado” se refiere a que el soporte o dispositivo de recolección debe poder incorporar una mayor o menor cantidad de la composición de la invención. En una realización aún más preferida el soporte es un soporte capaz de ser hidratado con la composición de la invención. En una realización preferida el soporte es una esponja.

La composición de la invención debe almacenarse en un contenedor resistente, hermético, que proteja al producto de la luz.

En una realización preferida, el kit de la invención además comprende un recipiente de recogida o recipiente de recolección. Preferiblemente, el recipiente de recolección debe poder abrirse fácilmente para añadir la composición de la invención, cerrarlo y empaquetarlo. También debe poder abrirse fácilmente para depositar la muestra y, opcionalmente, parte del dispositivo de recolección, y cerrarse para su almacenamiento o transporte. El recipiente de recogida puede utilizar cualquier mecanismo que permita su apertura, entre otros, un tapón de rosca, tapa a presión, tapón que requiera presionar y girar, etc. Este recipiente puede ser un tubo de ensayo, un vial o una bolsa, preferiblemente una bolsa de plástico, que puede o no contener la composición de la invención. En una realización preferida contiene la composición de la invención. En una realización, el recipiente es impermeable o resiste la penetración del agua. En algunas realizaciones, puede incluir un asa o correa para facilitar la portabilidad. En otras realizaciones incluye un cierre que se puede abrir y volver a sellar, por ejemplo, una cremallera o pestillo. Preferiblemente, el recipiente de recolección está hecho de cualquier material de embalaje que no sea de vidrio, por ejemplo, papel de aluminio o plástico, blísteres, cartón, un componente polimérico u otro plástico como una poliolefina termoplástica. En una realización preferida el recipiente de recogida es una bolsa plástica, preferiblemente una bolsa plástica de cierre metálico. En una realización aún más preferida el recipiente de recolección, preferiblemente la bolsa, contiene la composición de la invención.

Preferiblemente, el soporte o dispositivo de recolección y el recipiente de recolección son estériles.

En una forma de realización la composición de la invención ya está contenida en el recipiente de recolección y/o en el dispositivo de recolección.

El kit de la invención también puede incluir, opcionalmente, uno o más reactivos, dispositivos de almacenamiento, dispositivos de transporte, manipulación o procesamiento y/o instrucciones para obtener, recolectar, almacenar o transportar la muestra.

Adicionalmente, el kit puede contener uno o más dispositivos o reactivos de extracción de ácidos nucleicos para obtener ADN o ARN sustancialmente puro para su análisis.

En otra realización, el kit contiene una o más sondas y/o cebadores específicos para la hibridación del ácido nucleico o ácidos nucleicos que se quieren detectar. En otra realización, el kit contiene al menos dos cebadores específicos para la amplificación del ácido nucleico o ácidos nucleicos que se quieren detectar. En otra realización, el kit comprende un enzima polimerasa. En otra realización el kit comprende dNTPs. En otra realización, el kit comprende magnesio. En otra realización el kit contiene un marcador detectable, preferiblemente un marcador seleccionado de un marcador radioactivo, luminiscente, quimioluminiscente, fluorescente, enzimático o magnético. En otra realización, el kit comprende uno o más tampones, DNAsas, RNAsas y otros reactivos para aislar o purificar los ácidos nucleicos.

Un "cebador” es una secuencia de ácido nucleico que se hibrida selectivamente a una cadena de ácido nucleico molde complementaria ("secuencia diana”) y actúa como el lugar de inicio para la adición de nucleótidos para replicar la cadena molde. Estos cebadores pueden estar marcados o contener otras modificaciones que permitan la detección de los productos de amplificación.

Una sonda es un oligonucleótido con una secuencia capaz de hibridarse específicamente con una secuencia complementaria de ácido nucleico que puede usarse para detectar e identificar secuencias complementarias en ácidos nucleicos. La longitud de la sonda puede variar.

En otra realización, el kit comprende un ácido nucleico como control interno positivo.

En otra realización, el kit incluye maquinaria para llevar a cabo la PCR, tal como un termociclador, y/o una fuente de alimentación. Ejemplos de maquinaria para llevar a cabo la PCR que puede utilizarse son el R.A.P.I.D ® PCR, comercializado por Idaho Technology, el LightCycler® o el ABI 7500 (7000). Preferiblemente, una fuente de alimentación incluye una batería, un generador eléctrico, un panel solar o una combinación de los mismos, junto con sus dispositivos asociados como cables de alimentación o adaptadores para facilitar la conexión de la fuente de alimentación a cualquier equipo de campo.

En una realización, el kit incluye un procesador, por ejemplo, un equipo informático o asistente personal digital (PDA) con el software necesario para llevar a cabo el análisis.

Los kits se pueden empaquetar para su distribución comercial. Los contenedores para estos kits pueden incluir, típicamente, al menos un vial, tubo de ensayo, matraz, botella u otro recipiente en el que se puede colocar la composición, preferiblemente en alícuotas para la recolección de muestras individuales, transporte y almacenamiento. El kit también puede incluir un recipiente más grande, como un estuche, que incluye los contenedores indicados anteriormente junto con otros equipos, instrucciones y similares, de manera que se puede utilizar para recolectar múltiples muestras de la misma fuente o de fuentes diferentes.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un kit de la invención para la inactivación de microorganismos.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un kit de la invención para la inactivación de hongos miceliares.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un kit de la invención para la realización de muestreos de muestras que contienen microorganismos.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un kit de la invención para la realización de muestreos de muestras que contienen hongos miceliares.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un kit de la invención para preservar la integridad de los ácidos nucleicos de una muestra de microorganismos.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un kit de la invención para preservar la integridad de los ácidos nucleicos de una muestra de hongos miceliares.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un kit de la invención para detectar la

presencia de un microorganismo en una muestra. En otro aspecto, la invención se

refiere al uso de un kit de la invención para detectar la presencia de un hongo miceliar

en una muestra. Preferiblemente, el kit se utiliza en un método según la invención.

Todas las realizaciones y definiciones de la composición de la invención, del uso para

la inactivación de microorganismos y hongos miceliares, del uso como vehículo para la

realización de muestreos, del uso para preservar la integridad de los ácidos nucleicos y

de los métodos de la invención, son también aplicables a los kits de la invención.

La invención se describe a continuación mediante los siguientes ejemplos, que deben

ser considerados como meramente ilustrativos y en ningún caso limitativos del ámbito

de la presente invención.

Ejemplos

1. Composición y modo de preparación

La composición de la invención se prepara mezclando a partes iguales la solución A y

la solución B, que se preparan de forma independiente.

• Composición de la solución A (1 litro):

-861,43 mL Alcohol Isopropílico (densidad 786 g/L) (comercial al 99,8 %)

859,70 mL 1,72 mL H ² O (675,72 g 1,72 g)

-63,74 mL Etanol (densidad 790 g/litro) 99,8%

63,61 mL 0,127 mL de H ² O (50,35 g 0,127 g)

-63,74 mL de Metanol (densidad 791,8 g/litro) 99,9%

63,67 mL 0,067 de H ² O (50,41 g 0,067 g)

-14,38 gr de Glicerol (densidad 1260 g/litro)

14,38 g

• Composición de la solución B (1 litro):

- Na2HPO4 PM =141,944

0,1419 g

-0.1% SDS

¹ g

-1000 mL Agua

1000 g

Receta para la producción de un litro de composición del producto final, indicando la cantidad de los distintos componentes en gramos:

336g/L Alcohol Isopropílico

25g/L Etanol

25g/L Metanol

7,2 g de Glicerol

0,0709 g Na2HPO4

0,5 g SDS

509-511 g Agua

Nota: la cantidad de etanol en el producto final puede ser total o parcialmente sustituida por metanol, y viceversa.

2. Ensayos de evaluación de la utilidad de la composición de la invención para la realización de muéstreos ambientales

Se llevaron a cabo ensayos para determinar la adecuación del empleo de la composición de la invención en la toma de muestras ambientales con el doble objetivo de:

a) Permitir la inactivación de los microorganismos ambientales para garantizar la seguridad en el manejo posterior de la muestra, tanto en el transporte como en el procesamiento posterior de la misma, sin detrimento de la sensibilidad diagnóstica. b) Detectar, mediante distintos abordajes de laboratorio y técnicas diagnósticas, la presencia de los microorganismos ambientales de interés recogidos en la toma de muestra.

Así, se han empleado tres abordajes:

• Ensayos de evaluación de la capacidad de inactivación de microorganismos. • Ensayos de evaluación de la capacidad de conservación de ácidos nucleicos. • Aplicación del producto como vehículo para la realización de muestreos ambientales mediante esponjas.

2.1. Ensayos de evaluación de la capacidad de inactivación de microorganismos El objetivo de estas pruebas fue la evaluación de la capacidad de inactivación de diferentes tipos de microorganismos por parte de la composición de la invención, cuando esta entra en contacto con los mismos. Para llevar a cabo estos ensayos se realizó una selección representativa de microorganismos, escogidos en función de:

- Su naturaleza (bacterias Gram-positivas, Gram-negativas, micobacterias, virus y hongos).

- Su papel patógeno, escogiéndose preferentemente microorganismos relevantes en sanidad animal y/o salud pública.

- Su clasificación de acuerdo al nivel de contención biológica requerido para su manejo de acuerdo al Real Decreto 664/1997, seleccionando preferiblemente patógenos del grupo 2 y 3.

Asimismo, para la realización de las pruebas se atendió a dos variables fundamentales: concentración de partida del microorganismo vivo y tiempo de contacto con el producto.

A continuación, se describen los ensayos realizados en cada grupo de microorganismos.

2.1.1. Bacterias Gram-negativas

Todas las cepas seleccionadas, indicadas en la Tabla 1, pertenecían al cepario del Centro VISAVET.

Tabla 1. Relación de especies de bacterias Gram-negativas incluidas en las pruebas realizadas.

GRUPO Y NIVEL DE CONTENCIÓN

ESPECIE BIOLÓGICA REQUERIDO PARA SU MANEJO

DE ACUERDO AL RD 664/1997

B rú ce la suis Biovar 2 Grupo 3 - nivel de contención biológica 3 Salmonella enteritidis Grupo 2 - nivel de contención biológica 2 Pasteurella multocida Grupo 2 - nivel de contención biológica 2 Escherichia coli

Grupo 2 - nivel de contención biológica 2 (cepa no verotoxigénica)

Metodología

Por cada especie bacteriana a evaluar se empleó la siguiente metodología:

- Se realizó una suspensión 0,5 McFarland en 5 mL de una solución salina estéril al 0,85% a partir de colonias en pureza crecidas en medio sólido Agar Columbia incubadas a 37°C durante 24 horas.

- Se dispensó 1 mL de esta suspensión en:

^o A: Un tubo con 9 mL de solución salina estéril al 0,85% (control de viabilidad y pureza).

^o B: Un tubo con 9 mL de la composición de la invención (réplica de inactivación 1).

^o C: Un tubo con 9 mL de la composición de la invención (réplica de inactivación 2).

- Se homogeneizaron las suspensiones con vórtex.

- Se realizó una incubación a tres tiempos (conservando los tubos en refrigeración entre tiempos) para valorar cómo afecta el paso del tiempo en la inactivación. Dichos tiempos fueron:

^o 10 minutos.

^o 1 hora.

^o 24 horas.

- Tras cada uno de los tiempos, por cada tubo se realizó la siembra de 100 ^L de la suspensión en masa en medio sólido. La siembra de cada tubo y cada tiempo se realizó por duplicado. Además, en el caso del tubo A (solución salina) se realizaron diluciones seriadas en solución salina en base 1:10 para estimar la concentración del inóculo.

- La incubación de las placas se realizó en las condiciones requeridas para la bacteria en estudio (en este caso, en aerobiosis, 37°C, 24 horas de incubación). Tras la incubación, se realizó la lectura de las placas para comprobar si existía o no crecimiento bacteriano.

- Para que el resultado de inactivación a un determinado tiempo se considerase válido, fue necesario que se diesen las siguientes condiciones:

^o Ausencia total de crecimiento en las placas provenientes de los tubos B y C (los realizados con la composición de la invención).

^o Crecimiento en pureza de la cepa bacteriana en estudio en las dos placas del tubo A (solución salina), con una concentración estimada de entre 107 - 108 UFC/mL, dependiendo de la especie.

Resultados

En todas las especies evaluadas se observó una inactivación total del microorganismo a los 10 minutos de contacto con la composición de la invención.

2.1.2. Bacterias Gram-positivas

Todas las cepas seleccionadas, indicadas a continuación en la Tabla 2, pertenecían al cepario del Centro VISAVET.

Tabla 2. Relación de especies de bacterias Gram-positivas incluidas en las pruebas realizadas.

GRUPO Y NIVEL DE CONTENCIÓN

ESPECIE BIOLÓGICA REQUERIDO PARA SU MANEJO

DE ACUERDO AL RD 664/1997 Enterococcus faecalis Grupo 2 - nivel de contención biológica 2 Staphylococcus aureus Grupo 2 - nivel de contención biológica 2 Streptococcus suis Grupo 2 - nivel de contención biológica 2 Listeria m onocytogenes Grupo 2 - nivel de contención biológica 2 Listeria innocua Grupo 1 - nivel de contención biológica 1 Lactococcus garvieae Grupo 1 - nivel de contención biológica 1

Metodología

Se empleó la misma metodología indicada en el apartado 2.2.1, con la salvedad de que la incubación de las placas de Lactococcus garvieae se realizó a 22°C.

Resultados

2.1.3. Micobacterias

La especie seleccionada para hacer los ensayos fue Mycobacterium bovis, agente causal de la tuberculosis bovina, enfermedad de declaración obligatoria de gran relevancia en salud pública y sanidad animal. Las peculiaridades de su pared celular confieren a los microorganismos de este género bacteriano una gran resistencia ambiental y a los agentes desinfectantes, siendo por tanto de gran interés la evaluación de la capacidad inactivante de la composición en estudio frente a este género bacteriano.

En este caso no solo se evaluó la capacidad inactivante de la composición de la invención sobre la bacteria en suspensión, sino también sobre linfonodos de animales naturalmente infectados en los que la bacteria estaba presente y donde había lesiones macroscópicas asociadas a la colonización del tejido por parte de la bacteria. El objeto de este segundo abordaje fue evaluar la capacidad de inactivación del producto en dicha matriz biológica, ampliamente empleada para el diagnóstico directo de esta enfermedad en animales sospechosos en campañas de erradicación de la enfermedad así como en estudios de investigación.

2.1.3.1. Ensayos de inactivación de BCG en PBS (tampón fosfato salino) Los ensayos se llevaron a cabo con una cepa de Mycobacterium bovis BCG (Bacilo de Calmette-Guérin) perteneciente al cepario del Centro VISAVET.

Metodología

- Se partió de 400 mL de un cultivo líquido de BCG en medio Middlebrook enriquecido con suplemento OADC, incubado 4 semanas a 37°C en aerobiosis. - Se llevó a cabo la concentración del cultivo y mediante recogida de las colonias crecidas en superficie, centrifugación (2500g 10 minutos), lavado de los pellets obtenidos en PBS estéril y resuspensión de los mismos en dicho tampón junto con esferas de vidrio estéril de 2 mm de diámetro, sometiendo los tubos a agitación mediante vórtex para disgregar los agregados bacterianos, recogiendo el sobrenadante.

- A partir de dicho sobrenadante se preparó una suspensión bacteriana de BCG diluyendo la misma en tampón PBS estéril hasta alcanzar un 1 en la escala McFarland.

- Se dispensó 1 mL de esta suspensión en:

^o A: Un tubo con 15 mL de tampón PBS estéril (control de viabilidad y pureza).

^o B: Un tubo con 15 mL de la composición de la invención para evaluar la capacidad de inactivación tras 24 horas de contacto.

^o C: Un tubo con 15 mL de la composición de la invención para evaluar la capacidad de inactivación tras 48 horas de contacto.

^o D: Un tubo con 15 mL de la composición de la invención para evaluar la capacidad de inactivación tras 72 horas de contacto.

- Se homogeneizaron las suspensiones con vórtex.

- Se mantuvo cada tubo en refrigeración durante el tiempo de contacto correspondiente para cada uno.

- Tras cada uno de los tiempos, para cada tubo B-D se realizó la siembra de 100 ^L de la suspensión en masa en medio sólido (agar Middlebrook 7H11), realizando diluciones seriadas en base 1:10 en tampón PBS para estimar la concentración del inóculo. La siembra de cada tubo y cada tiempo se realizó por duplicado. En paralelo a las siembras de los tubos B-D se sembró el tubo A (control de viabilidad y pureza) para cada uno de los tiempos.

- La incubación de las placas se realizó en aerobiosis, a 37°C durante un máximo de 3 meses (tiempo requerido para considerar como negativo un cultivo de M. bovis), realizando semanalmente una inspección visual de las placas para determinar la presencia de crecimiento de la micobacteria y, en su caso, el número de unidades formadoras de colonias observadas.

^o Ausencia total de crecimiento en las placas provenientes de los tubos B, C y D (los realizados con la composición de la invención).

^o Crecimiento en pureza de la cepa BCG en las dos placas del tubo A (solución salina).

Resultados

Se observó una inactivación total de la cepa BCG a las 24 horas de contacto con la composición de la invención, esto es, el tiempo de contacto mínimo que se evaluó.

2.I.3.2. Ensayos de inactivación de Mycobacterium bovis en matriz biológica: linfonodos de bovinos naturalmente infectados

Metodología

- Se seleccionaron tres muestras de linfonodos bovinos que previamente habían presentado un resultado positivo para el cultivo y aislamiento de M. bovis, que a su vez presentaban lesiones macroscópicas asociadas a la multiplicación de dicha micobacteria.

- De cada muestra de linfonodo se tomaron 4 secciones de 2 g de peso, cada una de las cuales se utilizó para evaluar la capacidad inactivante de la composición de la invención tras un tiempo de contacto. Así, los tiempos de contacto evaluados fueron:

^o Ausencia de contacto con la composición de la invención: control positivo de aislamiento y pureza.

^o 24 horas.

^o 72 horas.

- Tras la incubación del tejido con la composición de la invención durante el tiempo correspondiente, se realizó el procesado de la muestra para su cultivo, de acuerdo con el protocolo establecido en el Laboratorio Europeo de Referencia de Tuberculosis Bovina, ubicado en el Centro VISAVET (Gomez-Buendía et al.

2021; BMC Veterinary Research, 17:148).

- El cultivo de cada muestra se realizó en paralelo tanto en medio líquido (MGIT) como en medio sólido (Lowenstein Jensen, LJ) con 1% de piruvato sódico. - Los cultivos se realizaron en areobiosis a 37°C durante un máximo de 3 meses, realizando una revisión semanal de la presencia de crecimiento.

Resultados

A continuación, en la Tabla 3 se resumen los resultados obtenidos con cada una de las muestras.

Tabla 3. Resultados de las pruebas de inactivación de Mycobacterium bovis con la composición de la invención.

De acuerdo a los resultados preliminares observados, se considera necesario que el tiempo de contacto entre el tejido y la composición de la invención sea al menos de 72 horas para garantizar la inactivación completa de las micobacterias presentes en el mismo.

*Entre paréntesis aparece el día en el que se observó/detectó el crecimiento.

2.1.4. Hongos

Por cada hongo (Microsporum, Trichophyton, Aspergilus) a evaluar se empleó la siguiente metodología:

- Se realizó una suspensión a una concentración previamente establecida en 5 mL de una solución salina estéril al 0,85% a partir de una placa crecida en medio sólido/líquido en temperatura y tiempo requeridos para cada especie.

- Se dispensó 1 mL de esta suspensión en:

- Se homogeneizaron las suspensiones con vórtex.

^o 10 minutos.

^o 1 hora.

^o 24 horas.

- Tras cada una de los tiempos, por cada tubo se realizó la siembra de 100 ^L de la suspensión en medio sólido. La siembra de cada tubo y cada tiempo se realizó por duplicado. Además, en el caso del tubo A (solución salina) se realizaron diluciones seriadas en solución salina en base 1:10 para estimar la concentración del inóculo.

- La incubación de las placas se realizó en las condiciones requeridas para cada hongo en estudio. Tras la incubación, se realizó la lectura de las placas para comprobar si existía o no crecimiento.

^o Ausencia total de crecimiento en las placas provenientes de los tubos B y C (los realizados con la composición de la invención). Crecimiento en pureza del hongo en estudio en las dos placas del tubo A (solución salina), con una concentración estimada, dependiendo de la especie.

2.2. Ensayos de evaluación de la capacidad de conservación de ácidos nucleicos El objetivo de estas pruebas fue demostrar la capacidad de conservación de los ácidos nucleicos presentes en la muestra por parte de la composición de la invención a lo largo del tiempo, con objeto de garantizar la correcta detección de estos mediante el empleo de técnicas de biología molecular basadas en la técnica PCR.

2.2.1. Ensayos basados en la conservación de bacterias Gram-positivas y Gramnegativas por parte de la composición de la invención

Metodología

Para cada una de las especies bacterianas reflejadas en la Tabla 5 se realizó el siguiente protocolo:

- Muestras de partida:

^o Tubos B y C del protocolo descrito en el apartado 2.1.1: 1 mL de suspensión 0,5 McFarland en solución salina del microorganismo 9 mL de la composición de la invención.

■ Cada muestra se analizó a diferentes tiempos, conservándose en refrigeración. Los tiempos evaluados fueron:

• 24 h, 72 h, 1 semana, 2 semanas, 4 semanas.

^o Control positivo de extracción: tubo A del protocolo descrito en el apartado 2.2.1: 1 mL de suspensión 0,5 McFarland en solución salina del microorganismo 9 mL de solución salina estéril.

^o Control negativo de extracción: composición de la invención.

- Protocolo de extracción y purificación del material genético: se llevó a cabo mediante el kit comercial MagMax Core Nucleid Acid Purification kit (ref. A32702, ThermoFisher Scientific) y el equipo de extracción automatizada KingFisher Flex, de ThermoFisher Scientific, según las instrucciones del fabricante, empleando el protocolo simple de extracción. Cada uno de los tubos se extrajo por duplicado. Se determinó la concentración del ADN extraído de cada muestra mediante el equipo NanoDropTM 2000/2000c (ThermoFisher Scientific).

- Análisis de los productos extraídos empleando una PCR específica para cada microorganismo en estudio, referenciadas a continuación, en la Tabla 5.

Tabla 5. Relación de PCR empleadas para la detección del ADN de las distintas bacterias incluidas en el estudio de conservación del material genético por parte de la composición de la invención.

Resultados

En la siguiente tabla (Tabla 6) se recogen los principales resultados obtenidos. Como puede observarse, en todos los microorganismos evaluados se observó un resultado de PCR positivo en todos los puntos temporales evaluados. Estos resultados son indicativos de la capacidad de conservación del ADN de la muestra por parte de la composición de la invención, al menos hasta 4 semanas desde la toma de muestra, conservada en refrigeración.

2.2.2. Ensayos de detección de B rú ce la suis en un ambiente naturalmente contaminado mediante el empleo de la composición de la invención en muestreos realizados mediante esponjas

Además de las anteriores pruebas, en el caso de Brucella suis, se llevó a cabo un estudio en una granja de porcino que presentaba un brote activo por dicho patógeno.

Metodología

El estudio se basó en toma de muestras ambientales de distintas zonas de la explotación mediante el empleo de esponjas empleadas en los muestreos oficiales de los programas de verificación microbiológica en canales de mataderos y líneas de producción de alimentos listos para consumo.

Así, se emplearon las esponjas Dry-Sponge envirosponge (ref. 009068100X 3M), presentadas en una bolsa plástica de cierre metálico para preservar el medio líquido en el que se hidrata dicha esponja antes de la toma de muestra de superficies, y que sirve como vehículo para la muestra que se emplea para el posterior análisis en laboratorio. En este estudio se comparó el empleo del medio de cultivo agua de peptona (utilizado para el aislamiento de bacterias como Salmonella spp. en los citados muestreos oficiales) con el empleo de la composición de la invención. Para ambos productos se añadieron 15 mL de medio por cada esponja.

Se realizó una toma de muestras de 24 puntos de la explotación, tomando por cada punto una muestra con esponja en agua de peptona y otra en la composición de la invención. Los puntos muestreados incluyeron salas de parto, lechoneras, pasillos, pediluvios, botas del personal, salas de destete, salas de cebo y oficinas.

Las muestras se conservaron en refrigeración hasta su procesamiento, que se realizó de acuerdo al siguiente protocolo:

- Recogida de la máxima cantidad posible del líquido presente en la esponja y la bolsa. - Transferencia de 2 mL a un tubo de rosca apto para minifuga y centrifugación 10 minutos a 12000-14000 rpm.

- Recogida del fondo del tubo del volumen necesario para realizar una extracción y purificación del material genético presente seguido de la detección del ADN de Brucella spp mediante PCR, empleando la misma metodología indicada en la sección 2.2.1.

Resultados

En la siguiente tabla (Tabla 7) se recogen los resultados obtenidos.

Tabla 7. Resultados de detección de ADN de Brncella spp mediante PCR en esponjas ambientales tomadas en distintas localizaciones de una explotación porcina positiva a dicho patógeno.

Ct de la PCR frente a Ct de la PCR frente a B rúce la spp Localización B rúce la spp en muestras tomadas en la muestra en muestras tomadas en composición de la invención agua de peptona

1 37,47 34,11

2 36,56 34,17

3 21,54 20,66

4 36,17 34,68

5 26,91 34,33

6 33,18 34,03

7 36,02 36,75

8 34,69 34,65

9 36,09 37,88

10 31,1 31,15

11 36,81 35,42

12 37,24 33,3

13 35,13 32,41

14 35,22 37,17

15 41,89 33,19

16 39,65 35,97

17 42,42 37,45

18 39,12 37,43

19 NA NA

20 NA NA

21 NA 38,13

22 40,17 NA

23 40,29 40,78

24 38,63 38,2

El resultado de la PCR de Brucella spp (referenciada en la Tabla 4) se presenta como valor de Ct, Cycle threshold o ciclo umbral, es decir, el ciclo de la PCR en el que comienza a detectarse ADN del patógeno. El punto de corte de la PCR estaba establecido en 38 ciclos, es decir, las muestras con Ct iguales o menores a 38 eran consideradas positivas (indicadas en cursiva en la tabla) y las que presentaban un Ct superior a 38 (o en ausencia de amplificación) eran consideradas negativas. NA = no amplifica.

Del total de las 18 muestras positivas con alguno de los dos productos (agua de peptona o la composición de la invención):

^o 14 muestras fueron positivas con ambos productos.

^o 4 muestras fueron positivas solo con la composición de la invención.

En las 14 muestras positivas con ambos productos:

^o En 8 muestras los Ct obtenidos en la PCR de muestras tomadas con la composición de la invención fueron más tempranos que en agua de peptona, mientras que en las 6 muestras restantes, los Ct fueron más tempranos en las réplicas tomadas en agua de peptona.

^o La diferencia de ciclos media en los Ct observados en réplicas de muestras tomadas con ambos productos fue de 2 ciclos.

Estos resultados sugieren que, en las condiciones del estudio presentado, la capacidad de detección de ADN de Brucella en muestras ambientales recogidas con esponjas es equivalente si el medio de transporte utilizado es la composición de la invención o si se emplea agua de peptona, con la ventaja demostrada en el apartado 2.2.1 de que la composición de la invención es capaz de inactivar Brucella suis biovar 2.

2.2.3. Ensayos de detección de Coxiella burnetti en un ambiente naturalmente contaminado mediante el empleo de la composición de la invención en muestreos realizados mediante esponjas

De forma equivalente a lo descrito en el apartado anterior, se llevó a cabo un estudio basado en muestreos ambientales en dos granjas de pequeños rumiantes (una de ovino y otra de caprino), positivas a fiebre Q, enfermedad causada por la bacteria Coxiella burnetii.

Metodología

La metodología llevada a cabo fue equivalente a la descrita en el anterior apartado para los muestreos de Brucella suis, si bien en este caso, además de la toma de muestras de superficies de la granja (en las que se incluyeron comederos, teleras, superficies de la sala de ordeño y de la nave, y botas, entre otras), también se llevó a cabo la toma de muestras sobre la superficie de los animales, en este caso concreto sobre el corvejón derecho de cada animal muestreado.

Las muestras extraídas se analizaron mediante una PCR específica para la detección de ADN de Coxiella burnetii (Silke R. Klee et al. Highly sensitive real-time PCR for specific detection and quantification of Coxiella burnetii. 2006. BMC Microbiology, 6, Article number: 2).

Resultados

En la siguiente tabla (Tabla 8) se recogen los resultados obtenidos. Como puede observarse, la composición de la invención empleada en muestreos ambientales mediante esponjas permitió la detección del material genético de C. burnetii, demostrando así su utilidad en la realización de muestreos ambientales para la monitorización de la fiebre Q en granjas de rumiantes.

Tabla 8. Resultados de detección de ADN de Coxiella burnetii mediante PCR en esponjas ambientales tomadas en distintas localizaciones de dos explotaciones de pequeños rumiantes positiva a dicho patógeno.

EXPLOTACIÓN EXPLOTACIÓN OVINO CAPRINO

Muestras positivas/ Muestras positivas/ muestras tomadas muestras tomadas Superficies instalaciones 8+/10 6+/9

granja

Superficies de animales 2+/10 9+/10

Los resultados obtenidos ponen de manifiesto la adecuación y utilidad de los muestreos ambientales mediante esponjas y la composición de la invención para la detección de C. burnetii en ambientes contaminados.

2.2.4. Ensayos de conservación y detección de ADN de micobacterias del complejo Mycobacterium tuberculosis a partir de muestras ambientales tomadas de bovinos de una explotación positiva a tuberculosis bovina, y estudio comparativo de diferentes zonas de muestreo.

Metodología

Se llevó a cabo un estudio sobre 15 bovinos de una explotación confirmada como positiva a tuberculosis bovina.

De cada animal se tomaron dos muestras de cada una de las siguientes localizaciones: cabeza, dorso y pecho:

^o una de ellas para su conservación a temperatura ambiente y procesamiento en las siguientes 24 horas tras su recogida

^o otra para su conservación en refrigeración hasta su procesamiento 72 horas tras su recogida.

La toma de muestras se realizó empleando las esponjas Dry-Sponge envirosponge (ref.

009068100X 3M) prehidratadas con 15 mL de la composición de la invención, pasando 10 veces la esponja por la superficie del animal a muestrear.

El proceso de extracción y purificación del material genético para la detección de ADN de bacterias del complejo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) fue realizado en el laboratorio de nivel 3 de contención biológica del centro VISAVET donde el pellet fue sometido a varios pasos de lisis y disrupción mediante esferas empleando un equipo Fast-prep para garantizar la lisis completa de las micobacterias. La purificación del ADN se realizó con el kit comercial DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN), de acuerdo a protocolos previamente probados (Lorente-Leal V. et al. 2019. Validation of a Real-Time PCR for the Detection of Mycobacterium tuberculosis Complex Members in Bovine Tissue Samples. Front Vet Sci, 6:61).

Para la detección de ADN de MTBC en las muestras, se realizó la PCR en tiempo real dirigida a la secuencia IS6110 (Lorente-Leal V, Liandris E, Pacciarini M, Botelho A, Kenny K, Loyo B, Fernández R, Bezos J, Domínguez L, de Juan L, Romero B. 2021. Direct PCR on Tissue Samples To Detect Mycobacterium tuberculosis Complex: an Alternative to the Bacteriological Culture. J Clin Microbiol. 59: e01404-20).

Resultados

1) La refrigeración ofrece resultados ligeramente mejores que la conservación a temperatura ambiente.

Así, se obtuvieron 17 positivos en temperatura ambiente y 19 en refrigeración. Además, no se observó variación respecto al número de ciclos de PCR en muestras positivas:

Temperatura ambiente: media 38,71, mediana 37,11

Refrigeración: media 38,70, mediana 37,46

2) No existe total coincidencia de resultados entre muestras de esponjas tomadas del mismo animal y localización pero procesadas a distintos tiempos.

Así, se observaron 10 casos en los que una esponja del mismo animal y localización fue positiva tanto en temperatura ambiente como en refrigeración, 7 casos en los que la esponja fue positiva a temperatura ambiente pero no en refrigeración y 8 casos en los que fue positiva en refrigeración pero no a temperatura ambiente.

3) Analizando los resultados de las tres localizaciones estudiadas (cabeza, dorso y pecho), por cada uno de los 15 animales incluidos en el estudio, con las muestras de temperatura ambiente se observaron 7 animales negativos a las tres localizaciones, mientras que con las muestras refrigeradas observamos solo 2 animales negativos a las tres localizaciones.

4) Las localizaciones de cabeza y lomo presentaron mayor proporción de positivos que el pecho, independientemente si las muestras se conservaron a temperatura ambiente o refrigeradas (Tabla 9).

Tabla 9. Resultados comparativos del número de muestras ambientales positivas a la PCR de detección de micobacterias del complejo Mycobacterium tuberculosis en función de la zona de toma de muestra y del modo de conservación de la misma.

TEMPERATURA REFRIGERACIÓN

AMBIENTE

CABEZA 8/16 9/15

DORSO 6/15 9/15

PECHO 3/15 1/15

Todos estos resultados ponen de manifiesto la utilidad de la realización de muéstreos ambientales en la superficie de los bovinos empleando la composición de la invención para la monitorización ambiental (como se confirma con los datos presentados en la sección 2.3.2), que puede presentar utilidad como medida complementaria de vigilancia de la presencia y circulación de dicho patógeno en explotaciones, extrapolable a otros microorganismos de interés.

2.2.5. Evaluación de la conservación y detección de ADN del virus de la peste porcina Africana en las muestras ambientales y de matriz biológica

El estudio se basó en la toma de muestras ambientales de distintas zonas de las instalaciones donde se desarrolló un ensayo de vacunación para evaluar la eficacia y seguridad de una cepa atenuada (candidato vacunal) del virus de la peste porcina africana tras un desafío con una cepa virulenta.

Metodología

Para el muestreo ambiental se emplearon las esponjas Dry-Sponge envirosponge (ref. 009068100X 3M), presentadas en una bolsa plástica de cierre metálico para preservar el medio líquido en el que se hidrata dicha esponja antes de la toma de muestra de superficies, y que sirve como vehículo para la muestra que se emplea para el posterior análisis en laboratorio. Las esponjas Dry-Sponge han sido pre hidratadas con 15 mL de la composición de la invención.

Otros dos tipos de materiales para recogida de muestras han sido evaluados en este estudio, el hisopo de algodón (Deltalab, Barcelona, España) pre-hidratado con 1X PBS y Danaswab Viral Sample Collection Kit (Danagen-Bioted, Barcelona, España).

Se realizó una toma de muestras en 4 puntos de las instalaciones donde han sido alojados los animales que participaron en el estudio de vacunación. Los puntos muestreados incluyeron suelo, comedero, bebedero (contacto directo con los animales) y las paredes de la instalación (no contacto directo con los animales).

Posteriormente a la recogida de las muestras, estas fueron procesadas en el laboratorio. De cada muestra se almacenó 800 |jl-1000 jl y se conservó en congelación (-80°C) hasta su procesamiento.

La extracción del ADN se realizó mediante el kit comercial High Pure Template Preparation Mix (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania), siguiendo las instrucciones de uso del fabricante. La detección del genoma viral del virus de la PPA se realizó mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR) con sonda comercial UPL (Universal Probe Library). Referencia: Fernández-Pinero, J.; Gallardo, C.; Elizalde, M.; Robles, A.; Gómez, C.; Bishop, R.; Heath, L.; Couacy-Hymann, E.; Fasina, F.O.; Pelayo, V.; et al. Molecular Diagnosis of African Swine Fever by a New Real-Time PCR Using Universal Probe Library. Transbound. Emerg. Dis. 2013, 60, 48-58.

Resultados

En total se analizaron 48 muestras, 14 de ellas fueron positivas y 34 negativas.

Tabla 10. Resultados de detección de ADN del virus de la peste porcina Africana mediante PCR en muestras ambientales tomadas en distintas localizaciones.

Los resultados están expresados en el valor numérico perteneciente al ciclo umbral (cycle threshold, Ct) de la qPCR, que equivale al número de ciclos necesarios para que cada curva alcance un umbral en la señal de fluorescencia. El Ct es un valor definido de forma matemática, que se caracteriza por ser inversamente proporcional a la carga vírica.

Del total de 14 muestras positivas con alguno de los tres productos:

- 6 muestras fueron positivas con la composición de la invención

- 5 muestras fueron positivas con el hisopo de algodón con PBS

- 3 muestras fueron positivas con el sistema Danaswab Viral Sample Collection kit

En otra ocasión, se realizó un muestreo ambiental y de matriz biológica del ambiente contaminado y los animales infectados con cepa virulenta del virus de la PPA. Los resultados se muestran a continuación.

Tabla 11. Resultados de detección de ADN del virus de la peste porcina Africana mediante PCR en muestras ambientales y de matriz biológica tomadas de ambiente contaminado y los animales (jabalíes) infectados con la cepa virulenta.

Bebedero B 32,89

Los resultados presentados demuestran, que el método de muestreo con la composición de la invención conserva el genoma viral, permitiendo la detección de ADN del virus de la peste porcina Africana en muestras ambientales y en la matriz biológica procedentes de ambientes previamente contaminados.

2.3. Aplicación de la composición de la invención como vehículo para la realización de muestreos ambientales mediante esponjas

2.3.1. Detección del ARN de SARS-CoV-2 ambiental en puntos de alta prevalencia en España

Objetivos del estudio en relación con los muestreos ambientales

Evaluar la utilidad de los muestreos ambientales para la detección del virus SARS-CoV-2 para incrementar el conocimiento de la epidemiología de la enfermedad a través de la evaluación de dinámicas de excreción y grado de contaminación ambiental, para mejorar la estimación del riesgo espacio temporal de COVID-19 y, en última instancia, como medida de vigilancia complementaria de la enfermedad.

Metodología

Este estudio se realizó en la localidad de Horcajo de los Montes (Ciudad Real, Castilla-La Mancha), con una población de 883 habitantes y un 53% de casos sintomáticos de COVID-19 acumulados desde el inicio de la pandemia en el momento del inicio de los muestreos. Cabe citar que, en dicha localidad, además de las medidas de confinamiento e higiene generales, se realizaron desinfecciones periódicas con hipoclorito al 2%, de determinados espacios públicos.

La cronología de muestreos y localizaciones muestreadas se indica a continuación:

Muestreo 1 (13 de mayo de 2020):

- 10 domicilios de personas infectadas por el SARS-CoV-2, en diferentes estadíos de la enfermedad: se tomaron muestras ambientales y de la ropa de las personas infectadas.

- 7 lugares públicos (centro de salud, farmacia, oficina de correos, gasolinera, supermercado, comisaría de policía y bar).

- Aguas residuales del sistema de alcantarillado.

Muestreo 2 (5 de junio de 2020):

- 7 domicilios de personas infectadas (tres incluidas en el primer muestreo y cuatro nuevas).

- 7 lugares públicos (centro de salud, farmacia, oficina de correos, gasolinera, supermercado, todos ellos previamente muestreados, y dos nuevos: ayuntamiento y tienda).

La metodología de la toma de muestras fue la siguiente:

^o Muestras ambientales: Por cada sitio muestreado se usaron un total de 4 esponjas prehidratadas con 15 mL, frotando en superficies en contacto con las manos o guantes (como picaportes de puertas, sillas, teclados, mesas, etc) o directamente o sobre los guantes y ropa de las personas.

^o Aguas residuales: se mezclaron 5 mL del agua con 5 mL de la composición de la invención.

- Recogida de la máxima cantidad posible del líquido presente en la esponja y la bolsa.

- Transferencia 2 mL a un tubo de rosca apto para minifuga y centrifugación 10 minutos a 12000-14000 rpm.

- Recogida del fondo del tubo de 200 ^L para realizar una extracción y purificación del material genético presente mediante el kit NucleoSpin RNAVirus (ref. 740956.50 Macherey-Nagel), siguiendo las instrucciones del fabricante. - La detección del ARN de SARS-CoV-2 se realizó mediante PCR en tiempo real para la detección de tres dianas de acuerdo a las recomendaciones de la OMS: gen codificante de la proteína de membrana E (E-Sarbeco), y dos dianas del gen de la RNA polimerasa (RdRp); IP2 e IP4 (Corman V.M. et al. 2020. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time qPCR. Eurosurveillance, 25(3):2000045; Grenga L et al. 2020. Shotgun proteomics of SARS-CoV-2 infected cells and its application to the optimization of whole viral particle antigen production for vaccines. Emerging Microbes & Infections, 9:1712-1721). Se consideró que una muestra era positiva cuando presentaba amplificación en al menos dos de las tres dianas.

Resultados

En el primer muestreo se detectó ARN de SARS-CoV-2 en la ropa de dos de los 10 domicilios de pacientes con infección activa, en superficies de un domicilio de un paciente en recuperación y en superficies de dos de los siete espacios públicos evaluados (gasolinera y farmacia).

En el segundo muestreo se detectó ARN de SARS-CoV-2 en la ropa de uno de los siete domicilios muestreados, que había mostrado un resultado positivo en el primer muestreo y perteneciente a un paciente en recuperación de la infección, y en superficies de un sitio público (ayuntamiento).

Conclusiones

Estos resultados ponen de manifiesto la capacidad de detección de ARN de SARS-CoV-2 en muestras ambientales y su posible utilidad en la aplicación de medidas de vigilancia y control de la enfermedad.

2.3.2. ADN ambiental como factor prometedor para la evaluación del riesgo de tuberculosis en entornos con múltiples hospedadores

Objetivos del estudio en relación con los muestreos ambientales

El objetivo de este estudio consistió en la evaluación de la utilidad de los muestreos ambientales basados en esponjas para la detección de ADN de bacterias del complejo Mycobacterium tuberculosis como herramienta para la evaluación del riesgo de exposición a dicho patógeno en granjas de rumiantes domésticos donde, por distintos factores epidemiológicos, la enfermedad sigue estando presente a pesar de la aplicación de los planes de erradicación en vigor.

Metodología

El área de estudio se localiza en la zona noroeste de Pamplona, consistente en un área pre-Pirenaica de 100 km2 dividida en tres categorías según el tipo de propiedad en terreno privado, municipal y regional, cuyas normas de acceso condicionan el movimiento de ganado entre terrenos.

Dentro de dicho área, se incluyeron en el estudio para la toma de muestras ambientales 24 rebaños de ganado bovino, de los 36 presentes en la zona. En dichos rebaños:

- Se recabaron, entre otros datos epidemiológicos [por ejemplo, el uso de pastos, y la densidad, presencia de reservorios salvajes (jabalíes y tejones), estatus sanitario frente a tuberculosis bovina de pequeños rumiantes de la zona, etc], los resultados anuales de la prueba de la tuberculina para diagnóstico oficial de tuberculosis bovina de los bovinos de cada explotación entre los años 2012 y 2016.

- Se realizaron muestreos ambientales en enero de 2017, como se describe a continuación:

^o En cada granja se seleccionaron dos animales al azar.

^o De cada uno de ellos se tomó una muestra con la anteriormente citada esponja Dry-Sponge envirosponge (ref. 009068100X, 3M) rehidratada con 15 mL de la composición de la invención, frotando la esponja 10 veces en la región de la escápula. Se eligió esta región porque es un área fácilmente accesible durante el manejo de los animales. Además, es una gran área casi horizontal, por lo que las partículas de polvo y los contaminantes se pueden depositar fácilmente, aumentando así el riesgo de detección de patógenos.

^o Una vez en el laboratorio la esponja fue hidratada con 10 mL adicionales de la composición de la invención y centrifugada a 3500g durante 10 minutos.

^o El proceso de extracción y purificación del material genético para la detección de ADN de bacterias del complejo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) fue realizado en el laboratorio de nivel 3 de contención biológica donde el pellet fue sometido a varios pasos de lisis y disrupción mediante esferas empleando un equipo Fast-prep para garantizar la lisis completa de las micobacterias, de acuerdo a protocolos previamente probados (Lorente-Leal V. et al. 2019. Validation of a Real-Time PCR for the detection of Mycobacterium tuberculosis complex members in bovine tissue samples. Front Vet Sci, 6:61).

^o Para la detección de ADN de MTBC en las muestras, se realizó la PCR en tiempo real dirigida a la secuencia IS6110 (Lorente-Leal et al. 2021. Direct PCR on Tissue Samples To Detect Mycobacterium tuberculosis Complex: an Alternative to the Bacteriological Culture. J Clin Microbiol.

59: e01404-20). Asimismo, se realizó una PCR convencional para descartar la presencia de subespecies de Mycobacterium avium (Wilton S and Cousins D. Detection and identification of multiple mycobacterial pathogens by DNA amplification in a single tube. Genome Res. 1992. 1:269-273).

Resultados

Se detectó ADN ambiental del MTBC en ganado de 12 de las 24 explotaciones muestreadas (50% de granjas positivas; 15 muestras positivas de 48 tomadas: 31,3% de muestras positivas).

En lo que respecta a los datos de la prueba de la tuberculina, de las 24 explotaciones muestreadas, 8 fueron negativas al test dérmico en el periodo de 2012 a 2016. En las otras 16 explotaciones se obtuvieron resultados positivos al test dérmico con una media de 28,6 animales positivos al año, no siendo ninguna de estas granjas positiva los 5 años seguidos. Con base a esta información, 10 explotaciones se clasificaron como de alto riesgo (positivas durante al menos dos años seguidos) y 14 explotaciones de bajo riesgo (positivas un año o negativas) en el periodo estudiado.

La detección ambiental de ADN de MTBC mostró diferencias significativas con respecto a las variables "uso de pastos regionales" y "proximidad al bosque" (test U de Mann-Whitney, P = 0,014 y P = 0,006, respectivamente), observándose un mayor riesgo de detectar ADN de MTBC en granjas situadas a mayor altitud y que están más próximas a los hábitats de reservorios silvestres, como jabalíes y tejones.

Conclusiones

La herramienta de monitorización ambiental dirigida a detectar ADN de MTBC a nivel de rebaño basada en el empleo de esponjas rehidratas con la composición de la invención, abre nuevas vías de la investigación epidemiológica, esperándose de ella que pueda proporcionar información adicional en el conocimiento sobre los factores de riesgo a nivel de rebaño respecto al contacto con MTBC y otros patógenos en una amplia variedad de entornos y situaciones epidemiológicas.

2.3.3. Control de Brucella suis biovar 2 en explotaciones porcinas: nuevo papel de muestras ambientales de los animales de cebo

Objetivos del estudio en relación con los muéstreos ambientales

En este estudio se evaluó el papel de la realización de muéstreos ambientales como forma complementaria de monitorización de la evolución de un brote clínico de brucelosis porcina en una granja de madres, empleando dicha técnica en distintas localizaciones, fases de la producción y momentos temporales respecto al inicio de la aplicación de medidas de control.

Metodología

El programa de erradicación de la enfermedad de la granja se llevó a cabo durante 24 meses, durante los cuales se aplicaron diferentes medidas para eliminar la enfermedad de la explotación, basadas principalmente en la identificación de animales infectados mediante diferentes pruebas diagnósticas y su consiguiente eliminación de la granja, así como aplicación de protocolos de limpieza y desinfección de instalaciones.

Durante los citados 24 meses se llevó a cabo la toma de muestras ambientales en los meses 1,2, 3, 6, 913 y 24.

Para dicha toma de muestras se emplearon esponjas Dry-Sponge envirosponge (ref.

009068100X 3M), rehidratando cada una con 15 mL de la composición de la invención para tomar muestras ambientales, de las localizaciones indicadas en la Tabla 10.

El procesamiento y análisis de dichas muestras mediante extracción del material genético y detección del ADN de Brncella spp mediante PCR en tiempo real se llevó a cabo empleando la misma metodología recogida en la sección 2.2.2.

Resultados

En la siguiente tabla (Tabla 12) se resumen los resultados obtenidos en el estudio respecto a las muestras ambientales:

Tabla 12. Resultados de detección de ADN de Brncella spp en muestras ambientales recogidas en una explotación porcina con un brote de brucelosis porcina, tomadas en distintos tiempos dentro de un programa de control y erradicación de la enfermedad en granja.

t1 t2 t3 t6 t9 t13 t24 Total

18/64 Boxes 3/7 6/9 5/7 0/11 4/11 0/8 0/11

(28,1%)

22/64 Maternidad 6/6 4/11 7/9 0/11 1/7 4/13 0/7

(34,4%)

4/39 Cebo 2/3 0/2 2/6 0/2 0/7 0/12 0/7

(10,3%) 2/8 Botas 0/0 1/1 1/1 0/2 0/2 0/2 0/0

(25,0%)

Muestras

11/16 11/23 15/23 0/26 5/27 4/35 0/25

positivas

(68,8%) (47,8%) (65,2%) (0,0%) (18,5%) (11,4%) (0,0%)

(%)

Cada t hace referencia al mes de programa de control (desde el 1 hasta el 24) en el cual se recogió la muestra.

Como puede observarse, los muestreos ambientales permitieron la detección de ADN de B. suis en el ambiente, detectándose un descenso en el porcentaje de muestras positivas de acuerdo al avance del programa de control aplicado en la granja, hasta obtener un 100% de muestras negativas, momento en el cual se dio por finalizado el brote de brucelosis porcina, cuando ya se habían eliminado todos los animales presentes en la granja en el momento del inicio del brote (tanto positivos a pruebas diagnósticas como negativos a estas).

Conclusiones

La realización de muestreos ambientales con la metodología aquí descrita demostró su utilidad como medida de vigilancia complementaria para monitorizar la evolución de las medidas dirigidas al control de un brote de brucelosis porcina, incluyendo la valoración de la eficacia de programas de limpieza y desinfección. Este mismo enfoque podría ser de utilizad para la monitorización de otras enfermedades infecciosas de importancia en sanidad animal.

2.3.4. Nuevo método de detección e inactivación del virus de la peste porcina Africana en muestras ambientales

Objetivos del estudio en relación con los muestreos ambientales

Evaluar la capacidad de inactivación del virus de la peste porcina Africana (vPPA) en muestras ambientales así como la capacidad de detección de material genético en las mismas, como medida de monitorización de la presencia del virus en el ambiente, en comparación con el método tradicional de toma de muestras mediante hisopos de algodón.

Metodología

Todos los estudios se llevaron a cabo en el BSL3 del Centro VISAVET, en la Universidad Complutense de Madrid. Los animales fueron identificados mediante crotal, proporcionándoles agua y alimento ad libitum y dejándoles un periodo de aclimatación. Durante el estudio, las instalaciones se trataron tres veces a la semana utilizando Virkon™ (Lanxess, Suffolk, UK), mientras que los instrumentos y equipos en contacto con los animales fueron limpiadas sólo con agua.

Se llevaron a cabo dos muestreos diferentes con las esponjas Dry-Sponge Envirosponge (ref. 009068100X 3M) prehidratadas con 15 mL de la composición de la invención, para 1) evaluar la eficacia para preservar el genoma del virus y 2) evaluar la capacidad de inactivación del virus.

1) Evaluación de la eficacia para preservar el genoma. Para esta parte del estudio, se utilizaron 5 jabalíes hembra infectadas experimentalmente con el aislado del virus PPA Armenia07. Se recogieron diversas muestras a lo largo del estudio:

^o Muestras recogidas al final del estudio de la piel de 4 animales, frotando la esponja sobre la región escapular izquierda. Todas las muestras fueron inmediatamente congeladas a -80°C hasta su análisis.

^o Al final del estudio, de forma previa a la descontaminación, se realizaron muestreos pareados mediante esponjas e hisopos de 6 puntos en contacto directo con los animales y 2 puntos sin contacto con los animales para comparar la sensibilidad de ambos métodos. Los hisopos se pre hidrataron con 1 mL de tampón fosfato salino al 1% (PBS), y las esponjas fueron prehidratadas con 15 mL de la composición de la invención.

En el laboratorio se tomaron 1,5 mL de líquido de cada esponja y los hisopos fueron sumergidos en 1 mL de PBS, disponiendo todas las muestras en tubos. El ADN viral fue extraído a partir de 200 ^L de cada muestra, utilizando el kit High Pure Template Preparation Mix (Roche Diagnostics GmbH), según las instrucciones del fabricante. Para la detección del ADN del virus de la PPA se llevó a cabo la qPCR descrita por Fernández-Pinero y colaboradores (Fernández-Pinero J. et al. Molecular Diagnosis of African Swine Fever by a New Real-Time PCR Using Universal Probe Library. Transbound Emerg Dis. 2013.

60(1):48-58).

La carga viral en las muestras positivas fue determinada mediante una curva patrón de cantidades conocidas del plásmido PGemT® TA (Promega) que contiene un fragmento de ADN del virus PPA, expresando la carga viral en copias de genoma/^L.

2) Evaluación de la capacidad de inactivación del virus (experimento in vivo). Para esta parte se utilizaron 10 cerdos castrados machos de 3 meses de edad, divididos en 4 grupos, los cuales fueron inoculados intramuscularmente con los siguientes inóculos:

a. Ambiental, n=2: se inocularon con 1 mL de un pool de esponjas ambientales del estudio 1. La concentración del número de copias de genoma del virus de PPA en dicho inóculo se calculó en 1,12 x 105 copias genoma/^L.

b . Armenia07, n=2: se inocularon con 1 mL del aislado del virus altamente virulento de PPA Armenia07 diluido con el líquido de las esponjas para conseguir un título (cantidad de virus que causa hemadsorción en el 50% de los cultivos infectados) de virus vivo inicial de 105 HAD⁵o/mL.

La concentración del número de copias de genoma del virus de PPA en dicho inóculo se calculó en 5,77 x 105 copias genoma/^L.

c. Control, n=2: se inocularon con el líquido de esponjas estéril.

d. Naive, n=4: se dejaron sin inocular, la exposición al virus tuvo lugar por contacto con el resto de animales.

A lo largo del estudio se realizó examen clínico diario de los animales. Al final del estudio se procedió al sacrificio humanitario y necropsia de todos los animales, tomando muestras de linfonodos, bazo, hígado, pulmón, corazón, riñón y médula ósea.

El muestreo de sangre de los animales se realizó en los días 0, 4, 7, 12, 17, 19, 24 y 28 postinoculación en tubos con EDTA y sin aditivo. La sangre en EDTA se procesó inmediatamente tras muestreo y el suero fue alicuotado y almacenado a -80°C hasta su uso. La extracción y detección de ADN se realizó siguiendo los mismos procedimientos que en el estudio 1).

El suero fue utilizado para la realización de un ELISA comercial para la detección del antígeno VP72 del virus PPA (®Ingenasa-Ingezim PPA Compac K3; Ingenasa), siguiendo las instrucciones del fabricante.

El análisis estadístico se realizó utilizando el programa SPSS 25 (IBM, Somar, USA). El test de Fisher se utilizó para comparar los resultados de PCR de los dos métodos de muestreo ambiental. Un p valor < 0,05 se consideró significativo.

Resultados

1) Evaluación de la eficacia para preservar el genoma.

Todos los animales inoculados mostraron signos de infección compatible con PPA. En el momento del sacrificio, todos los animales mostraron una viremia consistente. Los hallazgos patológicos encontrados en todos los animales fueron compatibles con PPA.

Las muestras ambientales (superficies y piel), confirmaron la presencia de ADN procedente del virus PPA, mostrando una cantidad de copias de genoma similar entre ambos métodos de muestreo (esponjas e hisopos).

Las muestras de superficies en contacto con los animales presentaron un menor número de copias que las superficies sin contacto directo con los animales.

Las muestras de la piel mostraron un menor número de copias que las muestras de superficies.

Tabla 13. Resultados de PCR cuantitativa en las zonas muestreadas Resultados de PCR cuantitativa

Zona muestreada (copias de genoma /^L)

Esponja Hisopo

Comedero A 1.55 x 105 2.40 x 106 Comedero B 1.21 x 106 3.27 x 106 Comedero C 9.99 x 104 6.10 x 102 Comedero D 2.13 x 105 2.25 x 106

Suelo A 6.47 x 105 6.43 x 105

Suelo B 1.87 x 103 1.73 x 103 Superficies A 2.17 x 103 1.48 x 105 Superficies B 4.86 x 103 3.31 x 106

2) Evaluación de la capacidad de inactivación del virus (experimento in vivo).

Ninguno de los animales inoculados mostró signos de enfermedad a lo largo del experimento, ni se detectó ADN en las muestras de sangre recogidas. El examen clínico realizado fue normal. La necropsia no reveló ningún hallazgo compatible con infección por virus PPA.

Conclusiones

El empleo de la composición de la invención ha demostrado:

- Su capacidad de inactivación del virus de PPA, como se ha podido observar tras el desafío de cerdos con una dosis elevada de una cepa virulenta del virus diluida en la composición de la invención.

- Su utilidad como vehículo para la toma de muestras ambientales mediante esponjas para detección de virus de PPA en ambientes potencialmente contaminados con dicho virus.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende:

c) de 6 a 8,4 g de glicerol por cada litro de composición,

d) de 0,0500 a 0,0920 g de Na²HPO⁴por cada litro de composición,

e) de 0,4 a 0,6 g de SDS por cada litro de composición, y

f) de 470 a 550 g de agua por cada litro de composición.

2. Composición según la reivindicación 1 que comprende:

a) 336 g de alcohol isopropílico por cada litro de composición,

c) 7,2 g de glicerol por cada litro de composición,

d) 0,0709 g de Na²HPO⁴por cada litro de composición,

e) 0,5 g de SDS por cada litro de composición, y

f) de 509 a 511 g de agua por cada litro de composición.

3. Composición según la reivindicación 1 que comprende:

c) de 20 a 30 g de metanol por cada litro de composición,

d) de 6 a 8,4 g de glicerol por cada litro de composición,

e) de 0,0500 a 0,0920 g de Na²HPO⁴por cada litro de composición,

f) de 0,4 a 0,6 g de SDS por cada litro de composición, y

g) de 470 a 550 g de agua por cada litro de composición.

4. Composición según la reivindicación 3 que comprende:

a) 336 g de alcohol isopropílico por cada litro de composición,

b) 25 g de etanol por cada litro de composición,

c) 25 g de metanol por cada litro de composición,

d) 7,2 g de glicerol por cada litro de composición,

e) 0,0709 g de Na²HPO⁴por cada litro de composición,

f) 0,5 g de SDS por cada litro de composición, y

g) de 509 a 511 g de agua por cada litro de composición.

5. Composición según la reivindicación 1 que consiste en:

c) de 6 a 8,4 g de glicerol por cada litro de composición,

d) de 0,0500 a 0,0920 g de Na²HPO⁴por cada litro de composición,

e) de 0,4 a 0,6 g de SDS por cada litro de composición, y

f) agua.

6. Composición según la reivindicación 2 que consiste en:

a) 336 g de alcohol isopropílico por cada litro de composición,

c) 7,2 g de glicerol por cada litro de composición,

d) 0,0709 g de Na²HPO⁴por cada litro de composición,

e) 0,5 g de SDS por cada litro de composición, y

f) agua.

7. Composición según la reivindicación 3 que consiste en:

c) de 20 a 30 g de metanol por cada litro de composición,

d) de 6 a 8,4 g de glicerol por cada litro de composición,

e) de 0,0500 a 0,0920 g de Na²HPO⁴por cada litro de composición,

f) de 0,4 a 0,6 g de SDS por cada litro de composición, y

g) agua.

8. Composición según la reivindicación 4 que consiste en:

a) 336 g de alcohol isopropílico por cada litro de composición,

b) 25 g de etanol por cada litro de composición,

c) 25 g de metanol por cada litro de composición,

d) 7,2 g de glicerol por cada litro de composición,

e) 0,0709 g de Na²HPO⁴por cada litro de composición,

f) 0,5 g de SDS por cada litro de composición, y

g) agua.

9. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 5 o 7, donde la composición contiene de 470 a 550 g de agua por cada litro de composición.

10. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 6 u 8, donde la composición contiene de 509 a 511 g de agua por cada litro de composición.

11. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para la inactivación de microorganismos.

12. Uso según la reivindicación 11, donde los microorganismos se seleccionan de bacterias gracilicutes, actinobacterias, firmicutes, proteobacterias, virus, hongos y mezclas de los mismos.

13. Uso según la reivindicación 12, donde las proteobacterias se seleccionan del grupo que consiste en Brucella suis Biovar 2, Salmonella enteritidis, Pasteurella multocida y E.coli.

14. Uso según la reivindicación 12, donde las bacterias firmicutes se seleccionan del grupo que consiste en Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Streptococcus suis, Listeria monocytogenes, Listeria innocua y Lactococcus garvieae.

15. Uso según la reivindicación 12, donde las actinobacterias son Mycobacterium bovis.

16. Uso según la reivindicación 12, donde los virus se seleccionan del grupo que consiste en el virus de la peste porcina Africana y el virus SARS-CoV-2.

17. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para la inactivación de hongos miceliares.

18. Uso según la reivindicación 17, donde los hongos se seleccionan del grupo que consiste en hongos de los géneros Microsporum, Trichophyton y Aspergillus.

19. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18, donde la composición se pone en contacto con la muestra que contiene el microorganismo durante al menos 10 minutos.

20. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18, donde la composición se pone en contacto con la muestra que contiene el microorganismo durante al menos 72 horas.

21. Uso de la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 como vehículo para la realización de muestreos de muestras que contienen microorganismos.

22. Uso de la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 como vehículo para la realización de muestreos de muestras que contienen hongos miceliares.

23. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 21 o 22 para la realización de muestreos ambientales.

24. Uso según la reivindicación 23, donde el muestreo ambiental se realiza sobre una superficie seleccionada de ropa y calzado de personas infectadas o que trabajan con animales, guantes, superficies de picaportes de puertas, sillas, teclados, mesas, suelos, tierra, botas, boxes, comida animal o cebo, vehículos de transporte de animales, comida, carcasas, comederos y paredes.

25. Uso según la reivindicación 23, donde el muestreo ambiental se realiza sobre una muestra de agua, preferiblemente agua residual.

26. Uso según la reivindicación 23, donde el muestreo ambiental se realiza sobre la superficie de un animal o humano.

27. Uso según la reivindicación 21 para la realización de muestreos de matrices biológicas que contienen microorganismos.

28. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 21 o 23 a 27, donde los microorganismos se seleccionan del grupo que consiste en Brucella suis, Mycobacterium tuberculosis, SARS-CoV-2 y el virus de la peste porcina Africana.

29. Uso según la reivindicación 21 para la realización de muestreos de matrices biológicas que contienen hongos miceliares.

30. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 29, donde el muestreo se realiza mediante un soporte que comprende la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

31. Uso según la reivindicación 30 donde el soporte es una esponja.

32. Uso de la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para preservar la integridad de los ácidos nucleicos de una muestra de microorganismos.

33. Uso de la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para preservar la integridad de los ácidos nucleicos de una muestra de hongos miceliares.

34. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 32 o 33 donde los ácidos nucleicos preservan su integridad durante al menos 24 horas.

35. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 32 o 33 donde los ácidos nucleicos preservan su integridad durante al menos 4 semanas.

36. Un método in vitro para detectar la presencia de un microorganismo en una muestra que comprende:

(a) incubar la muestra con la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y, opcionalmente, con el soporte o dispositivo de recolección, y

37. Un método in vitro para detectar la presencia de un hongo miceliar en una muestra que comprende:

38. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 36 o 37, donde la muestra es una muestra ambiental.

39. Método según la reivindicación 38, donde el método comprende una etapa previa de muestreo de superficie mediante un soporte que comprende la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

40. Método según la reivindicación 39, donde el método comprende una etapa previa donde el soporte se impregna con la composición de la invención.

41. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 39 o 40, donde el método comprende una etapa adicional entre la etapa (a) y (b) donde el soporte se vuelve a impregnar con la composición de la invención.

42. Método según cualquiera de las reivindicaciones 39 a 41, donde el soporte es una esponja.

43. Método según la reivindicación 42, donde previamente a la etapa (b) se recoge el fluido retenido en la esponja.

44. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 36 a 43 donde previamente a la etapa (b) se purifican o extraen los ácidos nucleicos de la muestra.

45. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 36 a 44, donde la técnica de biología molecular que permite detectar los ácidos nucleicos es la reacción en cadena de la polimerasa.

46. Método según cualquiera de las reivindicaciones 36 o 37 donde la muestra es una matriz biológica.

47. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 32, 34 o 35 o método según cualquiera de las reivindicaciones 36 o 38-46 donde el microorganismo se selecciona del grupo que consiste en Brucella suis, Escherichia coli, Streptococcus suis, Listeria innocua, Coxiella burnetii, un microorganismo del complejo Mycobacterium tuberculosis, el virus de la peste porcina Africana o el virus SARS-CoV-2.

48. Un soporte que comprende la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

49. Soporte según la reivindicación 48, donde dicho soporte es una esponja.

50. Soporte según cualquiera de las reivindicaciones 48 o 49 donde el soporte se presenta en una bolsa plástica de cierre metálico.

51. Un kit que comprende:

a) Un soporte o un dispositivo de recolección, preferiblemente capaz de ser impregnado por una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y b) Una composición según las reivindicaciones 1 a 10.

52. Kit según la reivindicación 51 que además comprende un recipiente de recogida.

53. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 51 o 52 donde el soporte o dispositivo de recolección es una esponja.

54. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 52 o 53 donde el recipiente de recogida es una bolsa plástica de cierre metálico.

55. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 52 a 54 donde el recipiente de recogida contiene la composición de la invención según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

56. Uso de un kit según cualquiera de las reivindicaciones 51 a 55 para la inactivación de microorganismos.

57. Uso de un kit según cualquiera de las reivindicaciones 51 a 55 para la realización de muestreos de muestras que contienen microorganismos.

58. Uso de un kit según cualquiera de las reivindicaciones 51 a 55 para preservar la integridad de los ácidos nucleicos de una muestra de microorganismos.

59. Uso de un kit según cualquiera de las reivindicaciones 51 a 55 para detectar la presencia de un microorganismo en una muestra.

60. Uso de un kit según cualquiera de las reivindicaciones 51 a 55 para la inactivación de hongos miceliares, para la realización de muestreos de muestras que contienen hongos miceliares, para preservar la integridad de los ácidos nucleicos de una muestra de hongos miceliares o para detectar la presencia de un hongo miceliar en una muestra.

61. Uso según la reivindicación 59 o 60, donde el kit se utiliza en un método según una cualquiera de las reivindicaciones 36 a 47.