CN105586336B - 一种生物dna和rna室温保存卡及其制作方法 - Google Patents

一种生物dna和rna室温保存卡及其制作方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体来说，涉及到一种生物DNA和RNA室温保存卡及其制作方法。所述保存卡的储样介质为吸水性或具有DNA结合能力的材料，所述储样介质中含有核酸酶抑制剂和核酸稳定剂，且经去除DNA酶和RNA酶处理。与现有技术相比，本发明所述的生物DNA和RNA室温保存卡的有益效果在于：采用吸水性材料将DNA干燥保存于膜上，同时膜经过无酶化处理和经核酸稳定剂处理，可长期保存DNA和RNA不会降解；无有毒有害物质，对人和环境均安全，所使用的试剂和材料均无PCR等酶促反应抑制成分，适用于所有分子生物学下游实验的开展；运输或邮寄过程中无需干冰，常温运输即可，且卡片信息详细便于分类储存和查找。

Description

一种生物DNA和RNA室温保存卡及其制作方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体来说，涉及到一种生物DNA和RNA室温保存卡及其制作方法。
背景技术
生物的遗传性状主要由核酸来决定，核酸包括DNA和RNA。近年来，随着分子生物学和各种组学技术的发展，对核酸序列的比较研究逐渐成为疾病诊断、遗传变异、调控机理和病害流行规律分析的基本手段。针对大量DNA和RNA资源的保存，开发一种简便的方法对重要样本核酸进行归类整理、长期保存和运输具有十分重要的意义。
目前常见的核酸保存方法主要是将核酸溶液冷冻于-20℃短期保存，置于-80℃或液氮中进行长期保存。面对庞大数量样本的保存，尤其是RNA样品需要占用大量的超低温冰箱空间，消耗大量能源维持低温储存，且在核酸的运输过程中通常需要使用干冰进行低温运输，以防止在运输过程中核酸解冻导致其降解。常规保存过程除能耗高成本高，运输过程中需要干冰保护导致运输费用也很高。因此非常有必要开发一种简便易行的方法，实现室温保存，方便整理取用和运输，对人和环境安全，且适合各种下游分子生物学实验的保存方法。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种生物DNA和RNA室温保存卡及其制作方法。该保存卡无需使用超低温冰箱和液氮，又可以长期保存和运输，既方便又简单。
本发明所述的一种生物DNA和RNA室温保存卡，所述保存卡的储样介质为吸水性或具有DNA结合能力的材料，所述储样介质中含有核酸酶抑制剂和核酸稳定剂，且经去除DNA酶和RNA酶处理。
本发明所述的一种生物DNA和RNA室温保存卡，所述储样介质为滤纸、硝酸纤维素膜、尼龙膜、玻璃纤维素膜或硅胶膜中的一种。
本发明所述的一种生物DNA和RNA室温保存卡，所述核酸酶抑制剂为金属离子螯合剂Na2EDTA或EDTA。
本发明所述的一种生物DNA和RNA室温保存卡，所述核酸稳定剂为pH 8.0的Tris-HCl缓冲液，是将浓盐酸加入Tris base和Na2EDTA，调节pH至8.0制成。
本发明所述的生物DNA和RNA室温保存卡的制作方法，所述制作方法的具体步骤为：
1)配制核酸稳定剂：用除去DNA酶和RNA酶的超纯水配制终浓度为含50-100mMTris-HCl和10-20mM Na2EDTA的溶液，pH 8.0；该溶液可以使核酸在水环境中保持稳定，不易降解；
2)处理保存卡储样介质：将H2O2加入核酸稳定剂中，使H2O2最终质量浓度达到3％-5％，混合均匀后放入裁切好的储样介质，浸泡8-16h，使储样介质充分吸收混合液；该步处理储样介质后会去除介质中的所有DNA酶和RNA酶，所有需要使用到的器具(包括干燥盒、镊子、压痕管和过塑膜)均涉及此处理步骤；
3)干燥：取出储样介质放于干燥盒中，烘箱80℃烘烤干燥；高温干燥可促进H2O2分解，达到去除H2O2的目的；
4)压痕和组装：用压痕装置在储样介质中间压出多个直径5-6mm的圆形环，压痕个数视需要而定，用镊子将干燥的储样介质粘至信息卡片左端；
5)点样：将需要保存的DNA或RNA样品5-10μL用移液枪点于圆形环中间，放于干燥盒中，采用干燥剂或冷冻干燥机快速脱水干燥；
6)信息填写与卡片封装：填写样品信息后将储样介质一端过塑封装，室温保存；
7)保存卡上DNA或RNA的使用：用打孔器、剪刀或一次性刀片取含有DNA或RNA的一小片储样介质置于2mL离心管底部，加30-100μL无RNA酶DNA酶超纯水，50-65℃溶解2-5min后混匀取上清使用。
本发明所述的生物DNA和RNA室温保存卡的制作方法，所述步骤5)中的干燥剂为变色硅胶、无水硫酸钙、无水硫酸镁、蒙脱石、氧化铝、千层塔型香豆酸酯或分子筛干燥剂中的一种。
用于浸泡储样介质的Tris-HCl缓冲溶液pH在8.0左右浓度在50-100mM可使核酸保持稳定，避免脱氨基的发生，该缓冲液也可以用同样浓度和pH的Tris-HBO3代替。缓冲液中含有EDTA，该物质可以螯合金属离子，而常见的二价金属离子均是核酸酶(DNA酶和RNA酶)发挥活性所必不可缺少的催化剂，10-20mM的浓度可以防止外界引入的金属离子催化核酸酶导致核酸降解的可能。缓冲液中的过氧化氢可以破坏核酸酶结构，进而除去核酸酶，烘干时80℃的高温可以使过氧化氢全部分解为无害的水和氧气，避免过氧化氢破坏DNA或RNA。同时核酸储样区的过塑使样品温度达到130℃，进一步去除了核酸酶，而干燥的核酸不会受到短时间130℃高温的破坏，保证样品储存的稳定性。
本发明干燥卡片上的核酸样品时采用常温或低温干燥，用吸水能力快的干燥剂进行干燥，减少了在干燥过程中核酸降解的可能行。本发明的卡片核酸储存区经无酶化处理，不含DNA酶和RNA酶，且储样介质上含有核酸稳定成分和核酸酶抑制成分，取用时仅需用超纯水溶解介质上的核酸即可使用。介质上的核酸一经溶解需要置于-20℃或-80℃保存。DNA或RNA保存在这种卡片上，能够与外界隔离，常规温湿度的变化不会影响其储存时间。在室温下至少稳定保存2年以上，经超纯水溶解后仍可进行PCR反应，酶切，分子杂交，文库构建，测序及其它序列分析。
与现有技术相比，本发明所述的生物DNA和RNA室温保存卡的有益效果在于：采用吸水性材料将DNA干燥保存于膜上，同时膜经过无酶化处理和经核酸稳定剂处理，可长期保存DNA和RNA不会降解；无有毒有害物质，对人和环境均安全，所使用的试剂和材料均无PCR等酶促反应抑制成分，适用于所有分子生物学下游实验的开展；运输或邮寄过程中无需干冰，常温运输即可，且卡片信息详细便于分类储存和查找。
附图说明
图1是生物DNA和RNA室温保存卡示意图。图2是实施例1-3柑橘DNA、RNA和pEasy-colicin质粒DNA保存两年后效果对照。图3是实施例1和2保存样品检测黄龙病和黄化脉明病结果。M为100bp DNA ladder；1为柑橘黄龙病特异引物检测已保存2年的感病样品DNA；2为柑橘黄龙病特异引物检测新提取的感病样品的DNA；3为PCR检测健康柑橘样品的DNA；4为柑橘黄化脉明病检测保存2年的RNA样品；5为柑橘黄化脉明病检测新提取的RNA样品；6为柑橘黄化脉明病检测时保存3年的RNA样品；7为柑橘黄化脉明病检测时保存3年的RNA样品(但干燥剂替换为等量的无水硫酸钙)；8为柑橘黄化脉明病检测时健康柑橘的RNA样品。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述的生物DNA和RNA室温保存卡及其制作方法做进一步说明，但是本发明的保护范围并不限于此。
实施例1
(1)取1M Tris-HCl(pH 8.0)10mL，0.5M EDTA(pH 8.0)2mL，加超纯水定容至1L，高压灭菌后冷却至室温，加35mL双氧水混匀，放入裁切好的滤纸、干燥盒、镊子和压痕管浸泡过夜；
(2)将浸泡的材料沥干溶液，放于干燥盒中，烘箱80℃烘烤干燥；
(3)用压痕管在滤纸中间压出6个直径5mm的圆形环，用镊子将干燥的滤纸粘至已填好样品信息的卡片左端；
(4)将提取的柑橘黄龙病病叶样品DNA(浓度1500-5000ng/μL)10μL用移液枪点于圆形压痕中间，将每张卡片分别垂直插入干燥盒的卡槽中，置于放有变色硅胶的干燥器中常温快速脱水干燥；
(5)将有滤纸一端过塑封装，室温保存；
(6)取用时，用打孔器打下含有核酸的一小片滤纸，去除塑封膜后置于2mL离心管底部，加30μL超纯水，65℃溶解5min后混匀取上清作为PCR模板；
(7)用2μL上清液作为模板，按照标准PCR体系，采用柑橘黄龙病特异性引物OI1(5’-GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA-3’)和OI2c(5’-GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3’)进行PCR检测，退火温度64℃。PCR产物经电泳可得到1160bp的DNA特异性条带。
实施例2
(1)取1.21g Tris Base和0.564g Na2EDTA，加超纯水溶解，用1M HCl调节pH至8.0，加超纯水定容至1L，高压灭菌后冷却至室温，加40mL双氧水混匀，放入裁切好的硝酸纤维素膜、干燥盒、镊子、压痕管和塑封膜浸泡过夜；
(2)将浸泡的材料沥干溶液，放于干燥盒中，烘箱80℃烘烤干燥；
(3)用压痕管在硝酸纤维素膜中间压出6个直径5mm的圆形环，用镊子将干燥的硝酸纤维素膜粘至已填好样品信息卡片的左端透明区域；
(4)将提取的柑橘脉明黄化病嫩叶样品RNA(浓度1500-2500ng/μL)10μL用移液枪点于圆形压痕中间，将卡片一张张垂直插入干燥盒的卡槽中，置于放有千层塔型香豆酸酯(即千层塔烯二醇-21β-对二氢香豆酸酯，前期研究表明：与同质量的变色硅胶、无水硫酸钙相比，其吸水量要高出27％，而且还可以吸除空气中的氧气，减少氧化，延长保存时间)的干燥器中常温快速脱水干燥；
(5)将有硝酸纤维素膜一端过塑封装，室温保存；
(6)取用时，用一次性刀片切下含有核酸的一小片硝酸纤维素膜置于2mL离心管底部，加100μL无RNA酶DNA酶超纯水，55℃溶解5min后混匀取上清作为PCR模板。；
(7)按照标准PCR体系，采用柑橘黄化脉明病特异性引物CYV-627F(5’-CAAACAACCAAGCCGCTA-3’)和CYV-1254R(5’-GCCGAACTCTTTCTTTCCG-3’)进行一步法RT-PCR检测，退火温度52℃。PCR产物经电泳可得到600bp的DNA特异性条带。
实施例3
(1)取1M Tris-HCl(pH 8.0)10mL，0.5M EDTA(pH 8.0)2mL，加超纯水定容至1L，高压灭菌后冷却至室温，加30mL双氧水混匀，放入裁切好的硅胶膜、干燥盒、镊子和压痕管浸泡过夜；
(2)将浸泡的材料沥干溶液，放于干燥盒中，烘箱80℃烘烤干燥；
(3)用压痕管在硅胶膜中间压出6个直径5mm的圆形环，用镊子将干燥的硅胶膜粘至已填好样品信息卡片的左端透明区域；
(4)将提取的pEasy-colicin质粒DNA(浓度600-2000ng/μL)10μL用移液枪点于圆形压痕中间，将卡片一张张垂直插入干燥盒的卡槽中，置于放有无水硫酸钙的干燥器中常温快速脱水干燥；
(5)将有硅胶膜一端过塑封装，室温保存；
(6)取用时，用剪刀剪下含有核酸的一小片硅胶膜置于2mL离心管底部，加50μL超纯水，60℃溶解5min后混匀取上清作为PCR模板；
(7)取3μL上清按照标准热击转化程序转化大肠杆菌Top10。

Claims (4)

1.一种生物DNA和RNA室温保存卡，其特征在于，所述保存卡的储样介质为吸水性或具有DNA结合能力的材料，所述储样介质中含有核酸酶抑制剂和核酸稳定剂，且经去除DNA酶和RNA酶处理；
制作方法的具体步骤为：
1)配制核酸稳定剂：用除去DNA酶和RNA酶的超纯水配制终浓度为含50-100mM Tris-HCl和10-20mM Na2EDTA的溶液，pH 8.0；
2)处理保存卡储样介质：将H2O2加入核酸稳定剂中，使H2O2最终质量浓度达到3％-5％，混合均匀后放入裁切好的储样介质，浸泡8-16h，使储样介质充分吸收混合液；
3)干燥：取出储样介质放于干燥盒中，烘箱80℃烘烤干燥；
4)压痕和组装：用压痕装置在储样介质中间压出多个直径5-6mm的圆形环，用镊子将干燥的储样介质粘至信息卡片左端；
5)点样：将需要保存的DNA或RNA样品5-10μL用移液枪点于圆形环中间，放于干燥盒中，采用干燥剂或冷冻干燥机快速脱水干燥；
6)信息填写与卡片封装：填写样品信息后将储样介质一端过塑封装，室温保存，所述过塑封装的温度为130摄氏度；
7)保存卡上DNA或RNA的使用：用打孔器、剪刀或一次性刀片取含有DNA或RNA的一小片储样介质置于2mL离心管底部，加30-100μL无RNA酶DNA酶超纯水，50-65℃溶解2-5min后混匀取上清使用，所述储样介质为滤纸、硝酸纤维素膜、尼龙膜、玻璃纤维素膜或硅胶膜中的一种。
2.根据权利要求1所述的生物DNA和RNA室温保存卡，其特征在于，所述核酸酶抑制剂为金属离子螯合剂Na2EDTA或EDTA。
3.根据权利要求2所述的生物DNA和RNA室温保存卡，其特征在于，所述核酸稳定剂为pH8.0的Tris-HCl缓冲液，是将浓盐酸加入Tris base和Na2EDTA，调节pH至8.0制成。
4.根据权利要求1所述的生物DNA和RNA室温保存卡，其特征在于，所述步骤5)中的干燥剂为变色硅胶、无水硫酸钙、无水硫酸镁、蒙脱石、氧化铝、千层塔型香豆酸酯或分子筛干燥剂中的一种。
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