CN101153263B - 一种血液dna保存卡及其制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及“一种血液DNA保存卡及其制作方法”，属于生物技术领域。一种血液DNA保存卡，包括具有吸附DNA能力的纤维状物的介质，其特征在于：所述介质内吸附有盐分，所述盐分包括细胞裂解剂、核酸酶抑制剂、使病原菌和病毒蛋白变性的物质和抗氧化抑制剂。这些盐分能够抑制病毒活性防止传染，同时能够防止核酸酶降解DNA，使血液DNA可在室温长期保存。本发明的卡片中保存的DNA，只要用水将卡片介质上的盐离子和血细胞残留物漂洗掉就得到纯净DNA，避免了提取过程，使得操作更为简便，便于批量操作，并且节约了DNA提取试剂的花费。

Description

一种血液DNA保存卡及其制作方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种血液DNA保存卡。

背景技术

随着基因组学研究的发展，DNA分析逐渐成为疾病诊断、遗传分析和个体识别等领域的基本手段。而人DNA最主要的来源是血液，对血液或血液中DNA样本的采集、运输和保存具有重要的实际意义。

目前常规的血液或血液DNA的保存和运输主要有这么几种：一，取静脉血，血液中加入抗凝剂，液体状态低温保存运输；二，采集指血，涂到滤纸上，由于滤纸有较好的吸附性，可以跟血细胞结合，便于保存；三，采集血液后现场分离血液中的DNA，并保存。

上述的三种方法在实际应用中，尤其是在现场采集或大规模采集的时候，有很大的局限性。方法一取静脉血，需要有比较好的洁净条件，并且后期储存和运输条件要求苛刻，成本较高，保存时间有限。方法二的优点是采集方便，保存和运输方便，缺点是防护较差，如果被采血液中有传染性强的病毒会对周围人群造成伤害，另一个缺陷就是保存时间有限，随时间延长核酸酶对样品DNA的降解很严重。方法三直接保存DNA可以最大限度延长保存时间，但是往往采集现场不具备DNA分离纯化条件。

近年来，对于基因资源的研究，大规模现场采集样本，因此，非常有必要开发一种血液DNA保存装置，既方便采集，安全性好，又便于长期保存。

发明内容

针对上述各种血液DNA保存、运输和提取中存在的问题，本发明提供了一种方便、可靠的血液DNA保存卡，既方便血液采集，安全性能又好，且便于长期保存。

一种血液DNA保存卡，包括具有吸附DNA能力的纤维状物的介质，其特征在于：所述介质内吸附有盐分，所述盐分包括细胞裂解剂、核酸酶抑制剂、使病原菌和病毒蛋白变性的物质和抗氧化抑制剂。

所述具有吸附DNA能力的纤维状物为滤纸、硝酸纤维素膜、尼龙膜或硅胶膜。

所述细胞裂解剂为(SDS)十二烷基磺酸钠或长链的脂肪酸钠。

所述核酸酶抑制剂为金属离子螯合剂，所述金属离子螯合剂为EDTA。

所述使病原菌和病毒蛋白变性的物质为异硫氰酸胍和SDS，异硫氰酸胍也可以用硫氰酸胍或盐酸胍来代替，SDS可以用长链的脂肪酸钠等其它离子型去污剂来代替。

所述抗氧化抑制剂为硫脲，也可以用尿酸或尿酸盐来代替。

所述盐分中细胞裂解剂为SDS(十二烷基磺酸钠)、核酸酶抑制剂为EDTA、使病原菌和病毒蛋白变性的物质为异硫氰酸胍和SDS(十二烷基磺酸钠)，抗氧化剂为硫脲，所述介质的规格是厚度为0.3-1mm卡片。

所述盐分来自pH8.0的Tris-HCl缓冲液，所述pH8.0的Tris-HCl缓冲液是将浓盐酸加入溶解有Tris碱、EDTA、SDS、异硫氰酸胍和硫脲的溶液中，调节pH到8.0所成。

上述卡片的制作方法，采用如下步骤：(1)配制-pH值为8.0，浓度为50mM-100mM的Tris-HCl缓冲液，该缓冲液中含有10mM-20mM的EDTA，2％-5％的SDS(十二烷基磺酸钠)，1M-2M的异硫氰酸胍和25-50μM的硫脲；(2)将介质放入水溶液中震荡，使溶液完全吸收；(3)取出卡片，干燥即可。

从吸附有血滴的血液DNA保存卡上获取DNA样本的方法，是从血液DNA保存卡上用打孔器打下或者剪刀剪下吸附有血滴的部位，放入去离子水中洗去吸附的盐分和血细胞残留物后，再将DNA洗脱下来即可。

本发明通过将能够吸附DNA的介质用某些化学试剂混合溶液浸泡，使介质中带有所需要的盐，这些盐分包括细胞裂解剂、核酸酶抑制剂、使病原菌和病毒蛋白变性的物质和抗氧化剂，它们能够抑制大多数病菌、病毒活性，防止传染，同时能够防止核酸酶降解DNA，使血液DNA可在室温长期保存。由于介质是厚度0.3-1mm的纤维状物制成的卡片，保存和运输都非常简便。另外，从介质上获取DNA也非常方便，只需要将带有血液的一小片介质在水中漂洗两遍除去盐分和血细胞残留物后，即可直接用作PCR扩增的模板。

血液DNA保存卡的介质必须是具有吸附DNA能力的纤维状物，经研究发现常用的滤纸、硝酸纤维素膜、尼龙膜、硅胶膜等均能满足要求。

配制一用于浸泡介质的Tris-HCl缓冲溶液，其中含有EDTA、SDS、异硫氰酸胍和硫脲。Tris-HCl缓冲液为pH8.0浓度为50mM-100mM的缓冲液，提供足够的缓冲能力，有利于DNA维持构象，减少脱氨基反应，延长保存时间。EDTA的浓度范围10mM-20mM，可以螯合二价金属离子，如镁离子，抑制核酸酶的活性，防止DNA被降解，EDTA还可以用其它金属螯合剂替代。SDS(十二烷基磺酸钠)浓度为2％-5％，用于裂解血液细胞将DNA释放出来被介质结合，还可以裂解病毒蛋白和细菌膜蛋白，使多数病原菌和病毒失去活性，保证了血液采集、收集、运输的安全性，SDS可以用长链的脂肪酸钠来替代。异硫氰酸胍的浓度范围可以是1M-2M，是较强的蛋白变性剂，能够裂解细胞同时抑制核酸酶和病原菌活性，可以用硫氰酸胍或盐酸胍来代替。硫脲的浓度范围是25-50μM，是一种抗氧化剂，能够结合细胞破裂时释放出来的羟自由基并将其还原，降低羟自由基对DNA链的破坏作用，该抗氧化剂还可以是尿酸或尿酸盐。

制备得到的血液DNA保存卡是经过浸泡后干燥处理的，使用时用采血针扎指后，将血挤到保存卡上涂匀，晾干；或者吸取5μl血液均匀滴加到上述血液保存卡上，形成一个直径约6mm的圆形，晾干，制得血液DNA样品卡，干燥后的血液DNA样品卡装于密封袋或其它保存袋中，室温干燥环境保存。

血液DNA保存在这种卡片上，能够在室温条件下保存3年以上，仍然可以经去离子水漂洗后直接作为PCR扩增的模板、DNA杂交，测序及其它分析。

本发明跟常规的血液DNA保存方法相比具有使用快捷方便，安全性好，保存时间长等优点。

本发明采用的介质是具有吸附能力的卡片，采集血液时非常方便，只需要将指血涂到卡片上或者滴到卡片上，干燥后就可以保存。适合于各种场合下操作，也适合于大规模样本采集工作。由于体积小，重量轻，便于运输。

由于本发明的卡片上有能够使病原菌和病毒蛋白变性的物质，因此能够使大多数病原菌和病毒丧失活力，避免带病血液污染环境和感染他人，具有更高的安全防护性，保证了血液采集、收集、运输的安全性。

本发明的卡片中含有细胞裂解剂，在血液接触介质后血细胞破裂，释放出DNA，由于有核酸酶抑制剂和抗氧化剂，DNA能够避免被降解。随即DNA跟介质结合，避免了跟外界物质的物理接触，得到进一步保护。这种卡片在室温保存就可以，避免了低温保存的高昂花费，并且保存时间更长。

本发明的卡片中保存的是DNA，只要用水将卡片介质上的盐离子和血细胞残留物漂洗掉就得到纯净DNA，避免了提取过程，使得操作更为简便，便于批量操作，并且节约了DNA提取试剂的花费。

附图说明

图1阴性对照(以去离子水为模板)

图2跟血液DNA样品卡同样处理的带有血样的1mm2普通滤纸为模板

图31mm2经过上述纯化步骤的血液DNA样品卡为模板

图4阳性对照(1ng A702022 DNA为模板)

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1血液DNA保存卡的制作：

1)用300ml去离子水溶解3克Tris碱、3.72克EDTANa₂·2H20，25克SDS，118克异硫氰酸胍和1.9毫克硫脲，用浓盐酸调节pH至8.0，加去离子水定容到500ml；

2)剪裁一定大小的硝酸纤维素膜，厚度约0.3mm，放入一定体积的上述溶液中(按照50μl溶液/cm²介质的比例)，置于密闭容器中防止外界DNA污染，100rpm/分钟震荡30分钟，直到溶液被吸收完全。

3)小心取出吸收了盐溶液的卡片，80℃烘烤1小时，充分干燥。

实施例2

1)用300ml去离子水溶解3克TrisBase、1.86克EDTANa₂·2H₂0，10克SDS，59克异硫氰酸胍和0.95毫克硫脲，用浓盐酸调节pH至8.0，加去离子水定容到500ml；

2)剪裁一定大小的滤纸介质，厚度约1mm，放入一定体积的上述溶液中(按照50μl溶液/cm2介质的比例)，置于密闭容器中防止外界DNA污染，100rpm/分钟震荡60分钟，直到溶液被吸收完全。

3)小心取出吸收了盐溶液的卡片，80℃烘烤1小时，充分干燥。

实施例3

1)用300ml去离子水溶解5克TrisBase、2.75克EDTANa2·2H20，15克SDS，80克异硫氰酸胍和1.29毫克硫脲，用浓盐酸调节pH至8.0，加去离子水定容到500ml；

2)剪裁一定大小的硅胶膜介质，厚度约0.5mm，放入一定体积的上述溶液中(按照50μl溶液/cm2介质的比例)，置于密闭容器中防止外界DNA污染，100rpm/分钟震荡40分钟，直到溶液被吸收完全。

3)小心取出吸收了盐溶液的卡片，80℃烘烤1小时，充分干燥。

实施例4血液DNA样品卡的制作

用采血针扎指后，将血挤到实施例1的血液DNA保存卡上涂匀，晾干。或者吸取5μl血液均匀滴加到上述血液保存卡上，形成一个直径约6mm的圆形，晾干。

干燥后的血液保存卡装于密封袋或其它保存袋中，室温干燥环境保存。

实施例5从血液DNA样品卡上获取纯化的DNA

DNA保存在这种卡片上，能够在室温条件下保存3年以上，仍然可以用于PCR扩增检测、DNA杂交，测序及其它分析。重新获取DNA方法如下：

1)用打孔器打下或剪刀剪取适当大小的带有血痕的卡片(实施例4)，置于0.2ml离心管中；

2)向管中加入100μl去离子水，在水平振荡器上振荡1分钟；

3)吸弃水分，短暂离心，吸去残留水分，重新加入100μl去离子水，重复上述操作一次。通过两次洗涤洗去了保存卡中所加入的各种盐，这些盐可能对后续的反应产生抑制作用；

(4)所得卡片上带有纯净的DNA，可以用作PCR反应的模板、核酸杂交等分子生物学实验。

实验例1：用纯化后的血液DNA样品卡作为模板进行PCR扩增

应用基点认知技术(北京)有限公司的Goldeneye16ADNA身份鉴定试剂盒，(市场有售)以纯化后的血液DNA样品卡(实施例5)作为模板进行PCR扩增，扩增结果用ABI 3100测序仪进行片段分析，数据用GeneMapper3.2进行分析。

按照Goldeneye16A试剂盒说明书的要求，在有纯化后血液DNA样品卡的0.2mlPCR管中加入去离子水7.5 1、10×buffer1 1、dNTP 0.8 1、引物混合物0.4 1，DS Taq酶0.3 1，按照说明书要求的PCR程序进行PCR扩增。结果如图1-图3：每个图谱的最下边一排为分子量内标ROX-500，上面三排是样品DNA经过PCR扩增后用ABI 3100测序仪进行片段分析的结果。

从结果可以看出，使用纯化后的血液样品DNA卡直接作为模板进行PCR扩增，可以得到很好的扩增结果，跟阳性对照接近，16个位点都得到很好的扩增，没有位点丢失和非特异性扩增现象。

Claims (4)

1.一种血液DNA保存卡，包括具有吸附DNA能力的纤维状物的介质，其特征在于：所述介质内吸附有盐分，所述盐分包括细胞裂解剂、核酸酶抑制剂、使病原菌和病毒蛋白变性的物质和抗氧化抑制剂；所述细胞裂解剂为SDS、核酸酶抑制剂为EDTA、使病原菌和病毒蛋白变性的物质为异硫氰酸胍和SDS，抗氧化剂为硫脲，所述介质的规格是厚度为0.3-1mm卡片；所述盐分来自pH8.0的Tris-HCl缓冲液，所述pH8.0的Tris-HCl缓冲液是将浓盐酸加入溶解有Tris碱、EDTA、SDS、异硫氰酸胍和硫脲的溶液中，调节pH到8.0所成，Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM-100mM，EDTA的浓度为10mM-20mM，SDS的浓度为2％-5％，异硫氰酸胍的浓度为1M-2M，硫脲的浓度为25-50μM。

2.根据权利要求1所述的血液DNA保存卡，所述具有吸附DNA能力的纤维状物为滤纸、硝酸纤维素膜、尼龙膜或硅胶膜。

3.根据权利要求1所述的血液DNA保存卡的制作方法，采用如下步骤：(1)配制一pH值为8.0，浓度为50mM-100mM的Tris-HCl缓冲液，该缓冲液中含有10mM-20mM的EDTA，2％-5％的SDS(十二烷基磺酸钠)，1M-2M的异硫氰酸胍和25-50μM的硫脲；(2)将介质放入水溶液中震荡，使溶液完全吸收；(3)取出卡片，干燥即可。

4.从吸附有血滴的血液DNA保存卡上获取DNA样本的方法，是从权利要求1或2所述血液DNA保存卡上用打孔器打下或者剪刀剪下吸附有血滴的部位，放入去离子水中洗去吸附的盐分和血细胞残留物后，再将DNA洗脱下来即可。

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