CN103798227B - 一种锦紫苏类病毒离体常温保存方法 - Google Patents
一种锦紫苏类病毒离体常温保存方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种锦紫苏类病毒离体常温保存方法，主要包括以下步骤：样品采集：采摘带有锦紫苏类病毒毒源的鲜活锦紫苏植株叶片或茎干样品；变色硅胶干燥：将离体后12小时内的样品，与等重的变色硅胶密封于塑料保存袋中；室温放置2-3天，观察变色硅胶颜色变化，若硅胶变成浅红色可继续补加硅胶，直至硅胶保持蓝色后无需补加，并将保存袋密封后常温放置。本发明使用的离体常温保存方法，毒源生物活性的常温保存时间可达1年，保存毒源可用于检测阳性对照、分子克隆以及生物学接种实验等科研工作。成功地解决了锦紫苏类病毒离体后，常温下容易发生降解的问题，极大地方便了锦紫苏类病毒的异地采样、远距离常温运输以及保存工作，节省了人力物力，节约了科研成本。
Description
技术领域
本发明属于生物学领域，主要是涉及一种锦紫苏类病毒的离体常温保存方法。
背景技术
类病毒是一类无外壳蛋白包裹的能在寄主植物中自我复制的环状闭合单链RNA 分子，是迄今为止发现的最小病原物（Hataya, 1999; 李世访等, 2000）。其侵染性强，多侵染果树、花草及其它多年生植物，侵染后引起类似病毒感染的矮化、斑驳、叶变形、坏死、裂皮等症状，影响了果实及花色品质，且植株一旦被类病毒侵染将终生带毒，造成了严重的经济损伤。锦紫苏类病毒（Coleus
blumei viroid）属于马铃薯纺锤类病毒（Pospiviroidae）科锦紫苏类病毒属，主要侵染锦紫苏（一种在世界广泛种植的观叶性园艺植物）（Fonseca
et al,1989；苏前富，2006，植物保护；）。
在类病毒研究中，类病毒毒源是一种重要的生物资源，是科学研究和实际应用的基础。毒源的保存工作不仅要维持类病毒的侵染活性，还要使类病毒不产生变异和污染，对后续科研工作至关重要。目前锦紫苏类病毒毒源的保存主要采用活体保存和离体低温保存的方法。活体保存是指通过人工种植带有锦紫苏类病毒毒源的植株进行保存，但由于锦紫苏的耐寒力较弱，冬季越冬温度为15℃，越冬保存需培养温室等条件，耗费人力物力，增加了科研经费。离体保存解决了活体保存费时费力，成本较高的问题，目前锦紫苏类病毒的离体保存主要是将带有毒源的锦紫苏植株叶片置于低温冰箱（-20度或-70度）中冷冻保存，或者通过提取带毒植株叶片中的低分子量RNA，将RNA抽提液放置于低温冰箱中冷冻保存，该方法保存效果较好，但需要低温保藏设备，保存成本较高，且存在冷冻后，常温放置或远距离运输时极易发生降解的问题。
发明内容
本发明使用的离体常温保存方法，毒源生物活性的常温保存时间可达1年，保存毒源可用于检测阳性对照、分子克隆以及生物学接种实验等科研工作。成功地解决了锦紫苏类病毒离体后，常温下降解的问题，极大地方便了锦紫苏类病毒的异地采样、远距离常温运输以及保存工作，节省了人力物力，节约了科研成本。
本发明为达到上述目的主要包括以下步骤：
（1）样品采集：采摘带有锦紫苏类病毒毒源的鲜活锦紫苏植株叶片或茎干样品；
（2）变色硅胶干燥：将离体后12小时内的样品，与等重的变色硅胶密封于塑料保存袋中；
（3）室温放置2-3天，观察变色硅胶颜色变化，若硅胶变成浅红色可继续补加硅胶，直至硅胶保持蓝色后无需补加，并将保存袋密封后常温放置。
所述的变色硅胶为蓝色变色硅胶，含有微量氯化钴，为玻璃状颗粒，具有硅胶吸附防潮的作用，并可随吸湿量的增加，自身颜色由蓝色变紫色，最后变成浅红色，既起到吸附水分的作用，同时指示环境的湿度，也直观显示是否仍有防潮作用。
经过以上方法处理的锦紫苏类病毒毒源可常温存放1年，仍具有类病毒的生物学活性。
附图说明
图1：锦紫苏类病毒（CbVd1）侵染的锦紫苏叶片RNA抽提样Northren杂交检测图
图中：NC，健康锦紫苏叶片RNA抽提样；PC， CbVd1侵染的锦紫苏植株RNA抽提样；1，从CbVd1侵染的锦紫苏植株上采摘的新鲜叶片RNA抽提样；2，用本发明方法保存1个月的CbVd1侵染叶片RNA抽提样；3，用本发明方法保存3个月的CbVd1侵染叶片RNA抽提样；4，用本发明方法保存1年的CbVd1侵染叶片RNA抽提样；5，用本发明方法保存1年的CbVd1接种植株的RNA抽提样；6，从CbVd1侵染锦紫苏植株上采摘的叶片，常温放置24小时后的RNA抽提样；7，从CbVd1侵染锦紫苏植株上采摘的叶片，常温放置7天后的RNA抽提样；8，CbVd1环状RNA分子杂交信号；9，CbVd1线状RNA分子杂交信号。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步描述。
1. 实验前处理
（1）锦紫苏类病毒侵染的锦紫苏叶片300g，采自温室种植的侵染了锦紫苏类病毒1（CbVd1）的感病锦紫苏植株；
（2）将带毒叶片分成两份，一份100g常温放置，另一份200g按本发明保存方法处理。
2．供试材料
（1）锦紫苏类病毒侵染的锦紫苏叶片，采自感染锦紫苏类病毒1（CbVd1）的感病锦紫苏植株；
（2）常温放置24小时后叶片：采自CbVd1侵染锦紫苏植株，常温放置24小时；
（3）常温放置7天后的叶片：采自CbVd1侵染锦紫苏植株，常温放置7天；
（4）健康锦紫苏叶片：采自健康的锦紫苏植株；
（5）用本发明方法保存1个月、3个月、1年的CbVd1毒源：通过本发明方法处理后的CbVd1侵染植株叶片，分别常温放置1个月、3个月、1年；
（6）用本发明方法保存1年的CbVd1毒源，接种的锦紫苏植株。
3．低分子RNA的提取
（1）称取锦紫苏叶片样品2 g，液氮充分研磨后转入离心管，加入2倍体积重量比的1 mol/L K2HPO4和0.1%
2-巯基乙醇，再加入2倍体积重量比的水饱和酚/氯仿（1:1），充分搅拌，8000 r/min离心20
min；
（2）取上层液，加入等体积的水饱和酚/氯仿（1:1），充分搅拌，8000 r/min离心20
min；
（3）取上层液，加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀，-20度，放置至少1 h，8000 r/min离心20
min；
（4）取沉淀，加入5 mL的ddH2O充分溶解后，再加入5 mL的2.5 mol/L K2HPO4和5 mL的2-甲氧-乙醇，充分搅拌10 min，8000 r/min离心20 min；
（5）取上层液，加ddH2O至62.5mL，加入0.625mL 的2%的CTAB，放入冰中至少1h，8000r/min离心20min；
（6）取沉淀，加5 mL的ddH2O充分溶解后，再加12.5 mL的无水乙醇，0.5 mL的pH 5.2, 3 mol/L
NaAc，摇匀，-20度，至少1 h，8000 r/min离心20
min；
（7）取沉淀，干燥后，加ddH2O
100 μL，洗涤沉淀并转移到 1.5
mL EP管中，然后加入等体积的4 mol/L的LiCl，混匀置冰上4 h，8000 r/min离心20 min；
（8）取上清，加入2.5倍体积的乙醇，-20度，1 h，10000 r/min离心20
min；
（9）取沉淀用70％乙醇500 μL洗两次。干燥后，溶于100 μL TE，-20度保存备用。
4． Northern杂交检测
（1）DIG-RNA探针标记
酶切
用于标记 RNA 探针的质粒克隆载体为pGEM®-T，在使用之前必须线性化
10×OPA Buffer* 的配制：
酶切体系
酶切产物回收
按照 Qiagen PCR 产物回收试剂盒使用说明书回收如下操作：
1）加入5倍体积的PBI缓冲液，混合均匀
2）检查混合液颜色是否变黄色
3）将 Qiagen 离心柱放置在2mL 收集管中
4）离心60s 结合 DNA
5）倒掉废液，将 Qiagen 离心柱放回收集管中
6）加入0.75 mL 缓冲液 PE 洗涤离心柱
7）倒掉废液，将离心柱重新放回收集管中，并离心1min
8）将离心柱柱置于一个新的离心管中，加入30uLddH2O，温室放置1min，离心1min洗脱DNA
体外转录
以回收的线性化质粒为模板进行体外转录反应，反应体系如下：
37度温浴2h，反应结束后，加入2uL 0.2M pH0.8 EDTA 终止反应，取0.5uL
标记产物进行3％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果表明：体外转录产物量比较大，而模板只有很少，标记产物的大小在480bp
左右，分装10管，置-20度 保存。
（2）膜制备
变性丙烯酰胺凝胶电泳：5%的聚丙烯酰胺变性胶，1×TBE 缓冲液，恒压500V ，当染料二甲苯腈距离底部约2-3cm处，停止电泳，约50min。聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后，将Hybond-N+尼龙膜放在凝胶上，Hybond-N+尼龙膜上放三张3MM
Whatman 滤纸，用玻璃板夹紧过夜。小心取下转移膜，将其自然凉干后，于120度烤膜30 min或者80度烤膜2 h。
（3）杂交
试剂：
马来酸缓冲液：
冲洗缓冲液：
检测缓冲液：
| 0.1 mol/L | Tris·HCl |
| 0.1 mol/L | NaCl |
| 调pH 到9.5 |
1％封闭液：
马来酸缓冲液 100 mL
封闭剂
1 g
抗体溶液：
抗地高辛碱性磷酸酶标记抗体 1uL
封闭液
10 mL
定影液及显影液按照说明书配制
操作步骤：
1）将处理好的尼龙膜装入杂交瓶，按照10 mL/100 cm2的比例加入杂交缓冲液（ DIG Easy Hyb）预杂交，将杂交瓶放置于杂交炉中，68度预杂交30 min ；
2）将标记的 RNA 探针沸水煮10
min，迅速置于冰上冷却5 min，然后将变性的探针加入预热的 DIG
Easy Hyb 中（10mL /100 cm2 ，10mL 杂交液中加入1uL 探针），弃掉预杂交液，加入杂交液，将杂交瓶置于杂交炉中，68度杂交过夜；
3）2×SSC，0.1%SDS，室温洗膜2次，各5 min
；
4）0.5×SSC，0.1%SDS， 68度洗膜2次，各15 min ；
5）洗涤后用冲洗缓冲液洗膜1-5
min；
6）室温下，用封闭液100mL 孵育30
min；
7）室温下，用抗体溶液20mL孵育30
min；
8）室温下，用充足的冲洗缓冲液洗2次，各15
min；
9）室温下，在检测缓冲液中平衡2-5 min；
10）滴加 CSPD，使 CSPD
在膜上扩散均匀，将多余的 CSPD 液体挤干净，封口，37度处理10min；
11）在暗室取出 X 光片，放在膜上暴光，然后取出胶片显影、定影。
Claims (2)
1.一种锦紫苏类病毒离体常温保存方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）样品采集：采摘带有锦紫苏类病毒毒源的鲜活锦紫苏植株叶片或茎干样品；
（2）变色硅胶干燥：将离体后12小时内的样品，与等重的变色硅胶密封于塑料保存袋中；
（3）室温放置2-3天，观察变色硅胶颜色变化，若硅胶变成浅红色可继续补加硅胶，直至硅胶保持蓝色后无需补加，并将保存袋密封后常温放置。
2.如权利要求1所述的锦紫苏类病毒离体常温保存方法，其特征在于：所述的变色硅胶为蓝色变色硅胶，含有微量氯化钴，为玻璃状颗粒，具有硅胶吸附防潮的作用，并可随吸湿量的增加，自身颜色由蓝色变紫色，最后变成浅红色。
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