CN101423822A - 猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒rAd-HS35 - Google Patents

Abstract

本发明猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SY0608株重组腺病毒，属于高新生物技术领域。把克隆的副猪嗜血杆菌的热休克蛋白HSP70基因克隆入穿梭载体中pShuttle－CMV－GP3－GP5中，与骨架载体pAdEasy－1共转化大肠杆菌BJ5183菌株，转染HEK293－A细胞获得了重组腺病毒rAd－HS35。重组腺病毒能够对外源蛋白进行大量表达的翻译后修饰，能更有效的刺激机体的免疫保护反应，表达出来的HSP在充当免疫佐剂的同时可以促进对表达出来的GP3和GP5蛋白的抗原递呈作用。这种重组腺病毒疫苗具有亚单位疫苗的安全性和弱毒疫苗诱导细胞免疫反应的能力，从而具有广泛的开发和应用前景。

Description

猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒rAd-HS35

一、技术领域

本发明猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组腺病毒rAd-HS35及疫苗属于生物技术高科技领域，专用于加强猪对猪繁殖与呼吸综合征病毒的免疫保护作用及减少猪场的经济损失。

二、背景技术

重组腺病毒基因工程技术在人类的基因治疗方面已经得到了较为广泛的应用，很多应用于人类基因治疗的重组腺病毒已经进入临床实验三期阶段。因为重组腺病毒具有宿主范围广，感染细胞种类多，可以表达人源和非人源蛋白，而且不会插入宿主染色体，回复突变率低，可以复制到很高的滴度等特点。

目前应用的PRRS弱毒苗和灭活苗对变异的PRRSV感染不能提供有效的保护作用，证明了变异的PRRSV在抗原性、致病特性上和传统的北美型毒株发生了很大的变化；具有中和活性的GP3、GP4和GP5蛋白在病毒粒子中产生少，难以诱导产生有效的中和抗体；本实验室(W.Jiang等，Enhanced immune responses of mice inoculated recombinant adenovirusesexpressing GP5 by fusion with GP3 and/or GP4 of PRRS virus，Virus Research 136(2008)50-57)的研究结果表明GP3和GP5基因串联后所构建的重组腺病毒能够有效刺激机体产生中和抗体。

研究证明细菌的HSP70(Brahm H.Segal等，Drug Discovery Today，volume 11，numbers11/12 June 2006)，除了作为分子伴侣，还具有很高的免疫原性，且在机体抗微生物感染过程中发挥重要作用。细菌热休克蛋白与抗原基因融合表达后免疫机体，能够诱导抗原特异性的体液及细胞免疫，尤其是可以诱导快速持久的抗原特异性CTL反应。这一特点已经得到了广泛的证明与应用。针对PRRSV的抗原特异性CTL免疫应答对PRRSV的清除起着重要作用。目前还没有构建成副猪嗜血杆菌与猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV的重组腺病毒报道。

三、发明内容

技术问题 本发明的目的是研制一种能够有效控制猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的重组腺病毒rAd-HS35及疫苗，使在当前PRRS难以防治的情况下有新的突破。

技术方案 本发明的实施方案如下：

猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒，其特征在于，重组腺病毒rAd-HS35在分类上属于：腺病毒科(Adenoviridae)，哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)，人腺病毒种(Humanadenovirus)，分类命名：腺病毒(重组)，该重组腺病毒可以对目的蛋白进行有效的表达，用该重组腺病毒感染动物后不出现临床症状，因此可以用来表达抗原蛋白。该重组腺病毒已在中国中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期为2008年3月4日，保藏号为：CGMCC No.2392。

上述猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒，是通过以下方法构建而成的：

(1)猪繁殖与呼吸综合征GP3、GP5基因的扩增、克隆

参照PRRSVS Y0608株基因序列(GenBank登录号：EU144079)设计引物：

SY-GP3.1 5-GACCTCGAGATGGCTAATAGCTGTACATT-3

SY-GP3.2 5-ACAAAGCTTTCGCCGTGCGGCACT-3

SY-GP5.1 5-ACGAAGCTTATGTTGGGGAAGTGCT-3

SYGP5.2 5-CAGATATCCTAGAGACGACCCCATTG-3

提取PRRS病毒SY0608毒株感染后的猴肾细胞MARC-145细胞的总RNA，以反转录后的cDNA产物为模板，得到不含终止密码子的GP3及含终止密码子的GP5基因。通过基因两端引入的酶切位点，将GP3、GP5串联克隆入穿梭载体pShuttle-CMV中，得到重组穿梭质粒pShuttle-CMV-GP3-GP5。

(2)副猪嗜血杆菌热休克蛋白基因的扩增与克隆

根据副猪嗜血杆菌HSP70基因序列(Genbank登录号：EU693116)，设计了一对特异性引物，序列如下：

HSP70KpnI：5-TATGGTACCATGGGGAAGATCATCGG-3

QS HSP70 XhoI：5-TTACTCGAGACCGCCACCGCCACCGAGATTTTTGTTGT-3

以副猪嗜血杆菌的基因组DNA产物为模板，应用PCR技术扩增出了不含终止密码子的HSP70基因，在引物的5’端分别含有两个不同的限制性内切酶酶切位点，通过这两个酶切位点，把HSP70基因克隆入已经含有PRRSV SY0608株GP3和GP5蛋白基因的穿梭载体pShuttle-CMV-GP3-GP5中，然后通过酶切和PCR鉴定，获得含有HSP基因的穿梭载体pShuttle-CMV-HS35，简称pSh-HS35；

(3)含有HSP基因的穿梭载体pSh-HS35与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组鉴定好的含有GP5基因的穿梭载体pSh-HS35经酶切线性化后与腺病毒骨架载体pAdEasy-1通过电转化方法转化入大肠杆菌菌株BJ5183中，在大肠杆菌重组酶的作用下，在穿梭载体和骨架载体之间发生同源重组，实现了把外源基因转入腺病毒骨架载体，经卡那霉素和酶切鉴定筛选获得了含有外源基因的重组腺病毒质粒rAd-HS35；

(4)重组腺病毒rAd-HS35的获得鉴定好的重组腺病毒质粒通过阳离子脂质体法转染HEK293-A细胞，重组腺病毒质粒在293细胞内包装成完整的病毒rAd-HS35。

用上述猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒制成的疫苗：

将纯化的重组腺病毒rAd-HS35在HEK293-A细胞上连续传代30次，检测其猪繁殖与呼吸综合征GP3、GP5基因以及副猪嗜血杆菌HSP70的转录与表达情况，证明PRRSVGP3、GP5蛋白及副猪嗜血杆菌HSP70蛋白表达稳定。重组腺病毒的毒价稳定在10^-9.77TCID₅₀/1.0ml。

在扩大培养过程中取用保存纯化的重组PRRSV腺病毒rAd-HS35按10⁴TCID₅₀接种长成单层的HEK293-A细胞。当细胞病变达70-90％时收毒，经反复冻融一次即可获得PRRSV重组腺病毒rAd-HS35疫苗。

有益效果

本发明首次提出了用腺病毒载体构建表达PRRSV SY0608株GP3、GP5和副猪嗜血杆菌HSP的重组腺病毒，该重组腺病毒突破了PRRSV常规灭活疫苗和弱毒疫苗的局限性。该重组疫苗具有弱毒疫苗的复制特性和灭活疫苗的安全性，而且使PRRSV GP3，GP5蛋白获得了大量表达，改变了PRRSV感染猪后中和抗体产生量少而且慢的特点，同时HSP的表达增强了GP3，GP5基因的抗原提呈，因而有效改善了机体对重组病毒的免疫应答。因为该重组腺病毒疫苗采用的是人腺病毒血清5型载体，对人、猪等动物没有致病性，容易通过安全性评价。

与现在应用的PRRSV的弱毒疫苗和灭活疫苗相比，该病毒能在猪体内呈一过性复制增殖并且不断表达外源蛋白的时间比较长，使机体持续受到该蛋白的刺激，不断产生针对GP5蛋白的中和抗体，同时表达的热休克蛋白能够增强机体产生GP3-GP5特异性的CTL反应，并这样就能对猪体提供持久的保护力，因此在PRRS的防治方面具有广阔的应用前景。

四、附图说明

图1副猪嗜血杆菌HSP70基因克隆入穿梭载体p-Shuttle-CMV-GP3-GP5示意图

图2含HS35基因的穿梭载体与腺病毒的骨架载体的同源重组和获得重组腺病毒的示意图

图3副猪嗜血杆菌HSP70基因PCR扩增结果

1：DL2000Ladder        2：HSP70基因PCR产物

图4猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3、GP5基因PCR扩增结果

1：DL15000 Marker 2：GP3 PCR扩增产物约780bp 3：GP5 PCR扩增产物约620bp

图5pShuttle-CMV-GP3-GP5的Xho I/EcoR V双酶切鉴定结果

1：1kb DNA Ladder Marker 2：pShuttle-CMV-GP3-GP5质粒双酶切结果

图6 HSP70基因重组pAd-HS35质粒KpnI/XhoI酶切鉴定结果

1：DL2000Marker     2-4：三个阳性重组质粒的酶切结果

图7重组质粒的PacI酶切鉴定

1：1kb plus DNA Marker；2，3，4：pAd-HS35阳性质粒酶切结果.

图8重组腺病毒感染HEK-293A细胞后，用针对HSP、GP3和GP5蛋白的抗体进行间接免疫荧光试验，鉴定目的蛋白的表达，右侧为阴性对照

图9Western blot鉴定重组腺病毒rAd-HS35

1.野生型重组腺病毒对照2，3，4，分别为GP3，GP5，HSP阳性血清反应条带

五、具体实施方式：

1PCR引物的设计

1.1副猪嗜血杆菌HSP70引物的设计

参照GenBank巴氏杆菌科其它细菌HSP70蛋白序列(GenBank登录号：NP_872793，ZP_00154968，ZP_00134922)，设计了一对针对HSP70全基因序列简并引物。引物序列如下：

Uhsp1-11     5-MGNATHGGNATHAAYATGGGNAARATHATHGG-3

Dhsp625-634  5-YTTRTTNTCYTTNACYTCYTCRAAYTCNGC-3

利用上述简并引物，以副猪嗜血杆菌SH051201分离株(GenBank Accession Number：EU693116)基因组DNA为模板(Redondo V A等，Typing of Haemophilus parasuis strainsby PCR-RFLP analysis of the tbpA gene[J].Vet Microbiol，2003，92：253-262)，通过常规PCR技术，扩增得到HSP70基因；将得到的HSP70基因克隆至pMD18-T载体，得pMD18-T-HSP70进行基因测序。

2 PCR扩增副猪嗜血杆菌HSP70基因以及猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3、GP5基因

2.1 PCR扩增副猪嗜血杆菌HSP70基因

设计合成针对HSP70的特异性引物，如下

HSP70KpnI 5-TATGGTACCATGGGGAAGATCATCGG-3

QS HSP70XhoI 5-TTACTCGAGACCGCCACCGCCACCGAGATTTTTGTTGT-3

以pMD18-T-HSP70为模板进行PCR扩增目的基因HSP70。

以HSP70KpnI为上游引物，QS HSP70 XhoI为下游引物扩增出扩增片段大小1908bp的HSP70基因片段(图3)

。PCR反应体系如下：取0.5μL质粒模板，加入PCR混合液24.5μL，包括2.5μL10×PCR-Buffer，1.5μL 25mmol/L MgCl2，2.0μL 2.5mmol/L dNTPs，1.0μL 10mmol/L上下游引物，1.0U Taq polymerase，加双蒸水至24.5μL。

PCR反应参数如下：94℃预变性3min，再进行35个PCR循环(94℃ 45s，62℃ 45s，72℃ 60s)，最后72℃延伸10min。

2.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3、GP5基因的扩增

1.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3、GP5引物设计

参照PRRSV SY0608株基因序列(GenBank Accession Number EU144079)设计引物：

提取PRRS病毒SY0608毒株感染后的猴肾细胞MARC-145细胞的总RNA，以反转录后的cDNA产物为模板，以SY-GP3.1和SY-GP3.2为上下游引物扩增不含终止密码子的GP3基因，目的基因大小约780bp(GP3)；以上下游引物SY-GP5.1和SYGP5.2扩增含终止密码子的GP5基因，扩增目的基因大小约620bp(GP5)。

PCR反应体系如下：取0.5μL质粒模板，加入PCR混合液24.5μL，包括2.5μL10×PCR-Buffer，1.5μL 25mmoL/L MgCL₂，2.0μL 2.5mmoL/L dNTPs，1.0μL 10mmoL/L上下游引物，1.0U Taq poLymerase，加双蒸水至24.5μL。

PCR反应参数如下：94℃预变性3min，再进行35个PCR循环(94℃ 45s，62℃ 45s，72℃ 60s)，最后72℃延伸10min。

2.3 目的基因HSP70，GP3及GP5的回收与纯化

用DNA胶回收试剂盒回收目的基因片段，具体操作按TaKaRa凝胶回收试剂盒的说明书进行。得到纯化的HSP70，GP3及GP5基因。

3 重组穿梭载体质粒pShuttle-CMV-GP3-GP5的构建

3.1 目的基因GP3与GP5的酶切与回收纯化

纯化的GP3基因用XhoI、HindIII双酶切，纯化的GP5基因用HindIII、EcoRV双酶切。酶切反应体系为30.0μL。体系如下：3.0μL Buffer，20.0μL基因PCR回收片段，限制性内切酶各10.0U，用无菌双蒸水补至总体积30.0μL。

37℃作用1.0～3.0h。酶切完毕后，用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切后的产物进行回收，方法同上。得到双酶切处理的GP3及GP5基因。

3.2 穿梭载体pShuttle-CMV酶切，回收

穿梭载体pShuttle-CMV(STRATAGENE公司)用Xho I、EcoR V双酶切。酶切反应体系为30.0μL。体系如下：3.0μL 10×H Buffer，5.0μL载体pShuttle-CMV质粒，限制性内切酶Xho I、EcoR V各10U，用无菌双蒸水补至总体积30.0μL。

37℃作用1.0～3.0h，然后进行琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切后的产物进行回收，方法同上。得到双酶切处理的穿梭载体pShuttle-CMV。

3.3 目的基因片段与载体的连接

连接反应体积为10.0μL。体系如下：1.0μL 10×Ligase Buffer，1.0μL双酶切处理的pShuttle-CMV，4.0μL双酶切处理的GP3基因，3.5μL双酶切处理的GP5基因，0.5μLT4 DNALigase。混匀后4℃连接8～10h，同时设定载体自身连接对照。获得重组穿梭载体pShuttle-CMV-GP3-GP5。

3.4 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备与转化

用CaCl₂法制备感受态大肠杆菌DH5a，将连接产物转化感受态DH5a，获得重组穿梭载体质粒pShuttle-CMV-GP3-GP5。

3.5 重组穿梭载体质粒pShuttle-CMV-GP3-GP5的小量提取与鉴定

碱裂解法小量提取质粒后采用Xho I、EcoR V双酶切鉴定方法进行鉴定。酶切反应体系为30.0μL。体系如下：3.0μL 10×H Buffer，10μL载体质粒pShuttle-CMV-GP3-GP5，10UXho I、EcoR V，用无菌双蒸水补至总体积30.0μL。

37℃作用1.0～3.0h，然后进行琼脂糖凝胶电泳。结果切出约1.4kb的目的条带(图五)。

4 重组穿梭载体质粒pShuttle-CMV-HS35(pSh-HS35)的构建

4.1目的基因HSP70的酶切与回收纯化

HSP70基因用Kpn I、Xho I双酶切。酶切反应体系为30.0μL。体系如下：3.0μL Buffer，20.0μL基因PCR回收片段，限制性内切酶各10.0U，用无菌双蒸水补至总体积30.0μL。

37℃作用1.0～3.0h。酶切完毕后，用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切后的产物进行回收，方法同上。得到双酶切处理的HSP70基因。

4.2 穿梭载体pShuttle-CMV-GP3-GP5酶切，回收

穿梭载体pShuttle-CMV-GP3-GP5酶切反应体系为30.0μL。体系如下：3.0μL 10×MBuffer，5.0μL载体pShuttle-CMV-GP3-GP5质粒，限制性内切酶Kpn I、Xho I各10U，用无菌双蒸水补至总体积30.0μL。

37℃作用1.0～3.0h，然后进行琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切后的产物进行回收，方法同上。得到双酶切处理的穿梭载体pShuttle-CMV-GP3-GP5。

4.3 目的基因片段与载体的连接

连接反应体积为10.0μL。体系如下：1.0μL 10×Ligase Buffer，1.0μL双酶切处理的pShuttle-CMV-GP3-GP5，2.0μL双酶切处理的HSP70基因，100U T4 DNA Ligase，用无菌双蒸水补至总体积10.0μL。混匀后4℃连接8～10h。同时设定载体自身连接对照。获得重组穿梭载体pShuttle-CMV-HS35。

4.4 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备与转化

用CaCl₂法制备感受态大肠杆菌DH5a，将连接产物转化感受态DH5a，获得重组穿梭载体质粒pShuttle-CMV-HS35。

4.5 重组穿梭载体质粒pShuttle-CMV-HS35的小量提取与鉴定

碱裂解法小量提取质粒后采用Kpn I、Xho I双酶切鉴定方法进行鉴定。酶切反应体系为30.0μL。体系如下：3.0μL 10×M Buffer，10μL载体质粒pShuttle-CMV-HS35，10U KpnI、Xho I，用无菌双蒸水补至总体积30.0μL。

37℃作用1.0～3.0h，然后进行琼脂糖凝胶电泳。

酶切鉴定证明外源基因已经成功的克隆如穿梭载体中，基因测序结果表明克隆入的基因完全正确。得到阳性重组穿梭载体pShuttle-CMV-HS35。

5 重组穿梭载体pShuttle-CMV-HS35与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在BJ5183大肠杆菌中同源重组

5.1 重组穿梭载体质粒pShuttle-CMV-HS35的线性化

酶切反应体系为30.0μL。体系如下：3.0μL 10×NE Buffer 4，0.3μL 100×BSA，5μgpShuttle-CMV-HS35，0.5μL Pme I，用无菌双蒸水补至总体积30.0μL。

37℃作用1.0～3.0h，然后进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，确定是否酶切完全。得到完全线性化的穿梭载体。

5.2 线性载体的去磷酸化

反应体系为30.0μL。体系如下：3.0μL 10×Buffer，26.0μL完全线性化的穿梭载体，10.0U CIAP，用无菌双蒸水补至总体积30.0μL。

50℃作用1.0h，用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切后的产物进行回收，方法同上。得到去磷酸化的重组穿梭载体质粒pShuttle-CMV-HS35。

5.3 BJ5183电转化感受态细胞的制备与电转化

用CaCl₂法制备感受态大肠杆菌BJ5183，将腺病毒骨架载体pAdEasy-1转化感受态BJ5183，得到含pAdEasy-1的BJ5183细菌。

挑取单个新鲜的BJ5183(含pAdEasy-1)菌落接种于含30μg/mL链霉素的10mL LB培养基中，37℃ 200rpm过夜振荡培养；第二天按1/1000体积接种于一新的含链霉素的LB培养基中，振荡培养，使其A₅₅₀≈0.8，培养物置冰浴上1.0h；3000rpm离心10min；用初始菌液体积的无菌预冷的WB液(10％甘油，90％蒸馏水v/v)重悬细胞；3000rpm离心30min；再次用初始体积的WB液重悬菌体，3000rpm离心30min，弃去上清，剩余1/500体积的WB液重悬菌体BJ5183，得到含腺病毒骨架载体pAdEasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183，-70℃冻存备用。

将去磷酸化的重组穿梭载体质粒pShuttle-CMV-HS35常规方法电转化含腺病毒骨架载体pAdEasy-1的感受态BJ5183。电转化后涂布带有Kan(100μg/mL)抗性的LB平板，37℃过夜培养20-24h，获得重组腺病毒质粒rAd-HS35。

5.4 重组腺病毒质粒的鉴定

5.4.1 琼脂糖凝胶电泳

从过夜培养平板上挑取较小的重组腺病毒质粒菌落接种于卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃振荡培养15h左右，采用碱裂解法提取质粒；经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，同时设定穿梭载体和骨架载体对照；可以初步判定阳性重组质粒和自身连接的穿梭质粒。

5.4.2 Pac I酶切鉴定

将初步判定阳性的重组腺病毒质粒转化DH5α感受态细胞，小量提取质粒后进行酶切鉴定。酶切总体系为20.0μL。体系如下：2.0μL 10×NE Buffer 1，0.2μL 100×BSA，5μgPlasmid DNA，0.2μL Pac I，用无菌双蒸水补至总体积20.0L。

37℃作用1.0～3.0h，然后进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳，得到两条带，一条为30kb，另一条为4.5kb，证明得到的质粒为阳性重组腺病毒质粒(图7)。表明是在复制起始点与右臂重组，将此重组腺病毒质粒命名为pAd-HS35。

6 重组腺病毒rAd-HS35的包装

6.1 重组腺病毒质粒的线性化

6.1.1 重组腺病毒质粒的纯化

用质粒纯化试剂盒纯化得到阳性重组腺病毒质粒。用分光光度计测定OD260和OD280，计算其含量和纯度。DNA含量(μg/mL)＝稀释倍数×50×OD260。

6.1.2 重组腺病毒质粒的线性化与回收

酶切体系为100.0μL。体系如下：10.0μL 10×NE Buffer 1，1.0μL 100×BSA，30μg腺病毒质粒DNA，1.0μL Pac I，用无菌双蒸水补至总体积至100.0μL。37℃作用3.0h，然后进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳，证实酶切完全后，回收DNA，方法同前。用紫外分光光度计测定其OD260和OD280，计算其含量与纯度。得到线性化的腺病毒质粒DNA。

6.2 转染

将得到的线性化腺病毒质粒DNA转染293A细胞。具体操作按TransFast^TMTransfection Reagent(Promega)的操作手册进行。转染在24孔细胞板上进行，转染后轻轻加入1.0mL37℃预热的完全生长液(或使血清浓度降到2～6％)，把细胞放入二氧化碳培养箱，37℃培养7～14d。

6.3 重组腺病毒rAd-HS35的收获与增殖

当转染的细胞出现特征病变(局部细胞变圆，成网状)或细胞状态不足以维持时，—20℃冻存收获病毒。冻融后接种长满293A细胞的6孔细胞板，37℃吸附1.0h，每孔加入2.0mL维持液(含2％血清的DMEM)，增殖病毒。

7 重组腺病毒的鉴定

7.1 间接免疫荧光试验(IFA)

在一长满单层HEK-293A细胞的96孔细胞板上接种重组腺病毒rAd-HS35(1000MOI)，重复6个孔；在37℃、5％的CO₂培养箱中培养48～72h(未出现CPE)；弃去营养液，用PBS洗涤细胞1次，然后弃去PBS；于37℃温箱中45min，使水分挥发；然后置—20℃冷冻45min；每孔加入150μL 4℃预冷的无水乙醇，置4℃固定45min；弃去乙醇，用PBS洗涤细胞1次；分别加入M和GP5的单抗，100μL/孔，每种单抗接种3个孔；在湿盒内37℃温育30min～60min；弃去抗体，用200μL/孔的PBS洗涤6次；加入1∶100稀释的FITC—羊抗鼠IgG，50μL/孔，在湿盒内37℃温育30min；弃去孔内液体，用PBS洗涤4次；于荧光显微镜下观察。同时以重组腺病毒rAd-M、rAd-GP5感染的细胞和未感染的293细胞作为对照。

用针对PRRSV HSP(图8-1)、GP3(图8-2)和GP5(图8-3)蛋白的抗体进行IFA试验，结果发现重组腺病毒感染的细胞出现明显的荧光，而右侧为感染重组腺病毒的对照组细胞则看不到荧光。证明HSP、GP3、GP5串联后的重组腺病毒可以正确的表达目的蛋白。

7.2 Western blot

7.2.1 抗原的制备

接种重组腺病毒rAd-HS35于长满单层的293细胞，至完全病变后收获病毒液，—20℃反复冻融3次；于4℃、6000rpm离心30min，除去细胞碎片；缓慢加入PEG-6000和NaCl，分别至终浓度为8％和3％，4℃缓慢搅拌过夜；8000rpm离心沉淀30min，获得病毒粗提物；加入相当于原始体积1/100～1/1000的PBS(0.1mol/L，pH7.2)，重悬沉淀，置4℃过夜；1000rpm离心10min，收集上清即为浓缩的病毒液。同时浓缩重组腺病毒rAd-HSP、rAd-GP5和野生型腺病毒wtAd作为对照。

7.2.2 SDS-PAGE与Western blot

将样品中加入5×Loading Buffer，100℃煮沸5min；将样品加入到加样孔中，进行12％的SDS-PAGE，分离蛋白。以同样方法处理的野生型腺病毒wtAd作为对照。

7.2.3 转印

将SDS-PAGE胶切到合适的大小，置转印缓冲液中摇动15～20min；剪一片大小与胶相同的NC膜，置转印缓冲液中浸泡15～20min；同时剪2片与胶大小相同的Whatman滤纸，置转印缓冲液中浸润；按以下顺序制作“三明治”：负极-Whatman滤纸-胶-NC膜-Whatman滤纸-正极，注意膜与胶之间不要产生气泡；采用半干转印法进行转印，15V转印20～30min；转印完毕，用5％的丽春红染色NC膜，以确定转印效果；用去离子水漂洗，洗脱丽春红。

7.2.4 Western blot

将NC膜置于10％的脱脂乳(PBST)中，摇动封闭过夜；用PBST洗涤4次，每次10min；加入10％的脱脂乳稀释的一抗，37℃摇动孵育2h；用PBST洗涤4次，每次10min；用10％的脱脂乳稀释SPA-HRP(1∶10000)，37℃摇动孵育2h；用PBST洗涤4次，每次10min；干燥NC膜，等量混匀化学发光底物ECL的A液和B液，将混合液直接滴加到NC膜上，孵育2～10min；用保鲜膜包好，在X-光胶片上暴光，经显影、定影后观察。

浓缩的rAd-HS35、病毒液经12％的SDS-PAGE后，用针对HSP(泳道2)、GP3(泳道3)和GP5(泳道4)蛋白的抗体进行Western blot分析，发现在相应大小处有一目的条带(HS35约125kDa)，而野生型腺病毒没有出现特异性条带(泳道1)。说明构建的重组腺病毒可以表达目的蛋白。

8 重组腺病毒的滴度

于病毒滴度测定前48h左右将HEK-293A细胞种植96孔细胞板，将重组腺病毒冻融3次，用维持液(含2％血清的DMEM)将病毒作10倍比稀释；弃去长满单层HEK-293A的96孔细胞板中的营养液，接种稀释好的病毒液，每个稀释度接种4个孔，100μL/孔；37℃、5％CO₂饱和湿度下培养5d，观察CPE，记数每个稀释度的CPE孔数，按Reed-Muench法计算病毒的TCID₅₀。

重组腺病毒10倍比稀释后接种293细胞，培养5d，观察CPE，结果如下(表1)。

表1 重组腺病毒各稀释度的CPE数

    $=\frac{83.3\%-50\%}{83.3\%-40\%}$

    $=0.77$

LogTCID₅₀＝高于50％的病毒稀释度的对数+距离比×稀释系数的对数

         ＝—8+0.77×(—1)

     ＝—8.77

重组腺病毒rAd-HS35的TCID₅₀为10^-8.77/0.1mL。

将纯化的重组腺病毒rAd-HS35在HEK293-A细胞上连续传代30次，每5代检查重组腺病毒对外源基因的转录与表达情况，同时测定其TCID₅₀。证明PRRSV GP3、GP5及HSP70蛋白表达稳定，接毒后细胞病变出现规律，种毒的毒价稳定在10^9.77TCID₅₀/1.0ml。

取用低温保存纯化的重组腺病毒rAd-HS35按10⁴TCID₅₀接种长成单层的HEK293-A细胞扩大病毒培养，当细胞病变达70-90％时收毒，经冻融一次即可获得猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒rAd-HS35疫苗。

9 动物免疫攻毒实验

选取两周龄仔猪，猪呼吸与繁殖综合征病毒抗体阴性，并经RT-PCR检测PRRSV阴性猪进行动物实验。实验分为实验组与对照组，每组五头，实验组用rAd-HS35进行免疫，间隔三周进行第二次免疫，对照组用相同剂量野生型腺病毒免疫。二免后三周用高致病性SY0608株PRRSV对实验组和对照组进行攻毒。在二免后两周检测血清ELISA抗体，及血清IFN-γ含量。攻毒后每日观察临床症状，检测体温变化及病毒血症。

结果表明，与对照组相比，实验组经免疫后产生了针对PRRSV的特异性抗体，滴度达到1∶12800，并在血液中检测到较高的IFN-γ含量。攻毒后，对照组猪临床症状明显的：表现为体温升高，精神沉郁，食欲下降；剖检可以观察到明显的肺脏的间质性肺炎，间质增宽，部分区域出现实变；组织学变化表现为肺泡萎陷，肺脏间隔增宽，淋巴细胞浸润等；而实验组只是出现轻微的体温升高，并未出现其它临床症状及病理变化，且攻毒后第七天血液中病毒含量仅为对照组的1/5。动物实验表明该腺病毒免疫后可以诱导产生有效的免疫保护。该重组腺病毒疫苗采用的是人腺病毒血清5型载体，对人、猪等动物没有致病性，容易通过安全性评价。

序列表

<110>南京农业大学

<120>猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒rAd-HS35

<130>说明书

<140>00

<141>2008-06-12

<160>8

<170>PatentIn version3.5

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>HSP70KpnI

<222>(1)..(26)

<400>1

<210>2

<211>38

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>QS HSP70XhoI

<222>(1)..(38)

<400>2

<210>3

<211>32

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>Uhsp1-11

<222>(1)..(32)

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>n is a，c，g，ort

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(9)

<223>n is a，c，g，ort

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)..(21)

<223>n is a，c，g，ort

<400>3

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>Dhsp625-634

<222>(1)..(30)

<220>

<221>misc_feature

<222>(7)..(7)

<223>n is a，c，g，ort

<220>

<221>misc_feature

<222>(13)..(13)

<223>n is a，c，g，ort

<220>

<221>misc_feature

<222>(28)..(28)

<223>n is a，c，g，ort

<400>4

<210>5

<211>29

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物SY-GP3.1

<222>(1)..(29)

<400>5

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物SY-GP3.2

<222>(1)..(24)

<400>6

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物SY-GP5.1

<222>(1)..(25)

<400>7

<210>8

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物SYGP5.2

<222>(1)..(26)

<400>8

Claims (4)

1.猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)重组腺病毒rAd-HS35，其特征在于，重组腺病毒rAd-HS35在分类上属于：腺病毒科(Adenoviridae)，哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)，人腺病毒种(Human adenovirus)，分类命名：腺病毒(重组)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期为2008年3月4日，保藏号为：CGMCCNo.2392。

2.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒rAd-HS35，是通过以下方法构建而成的：

1)PCR扩增副猪嗜血杆菌HSP70基因

设计一对针对副猪嗜血杆菌HSP70全基因序列简并引物，引物序列如下：

Uhsp1-11    5-MGNATHGGNATHAAYATGGGNAARATHATHGG-3

Dhsp625-634 5-YTTRTTNTCYTTNACYTCYTCRAAYTCNGC-3

利用上述简并引物，以副猪嗜血杆菌SH051201分离株基因组DNA为模板，通过常规PCR技术，扩增得到HSP70基因；将得到的HSP70基因克隆至pMD18-T载体，得重组质粒pMD18-T-HSP70；经基因测序，得到HSP70基因序列；

根据得到的HSP70基因序列，设计合成针对HSP70的特异性引物：

HSP70KpnI     5-TATGGTACCATGGGGAAGATCATCGG-3

QS HSP70XhoI  5-TTACTCGAGACCGCCACCGCCACCGAGATTTTTGTTGT-3

以HSP70 KpnI为上游引物，QS HSP70 XhoI为下游引物，以pMD18-T-HSP70质粒为模板进行PCR扩增，扩增出1908bp的HSP70基因；

2)PCR扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3、GP5基因

参照PRRSV SY0608株基因序列设计引物：

SY-GP3.1 5-GACCTCGAGATGGCTAATAGCTGTACATT-3

SY-GP3.2 5-ACAAAGCTTTCGCCGTGCGGCACT-3

SY-GP5.1 5-ACGAAGCTTATGTTGGGGAAGTGCT-3

SYGP5.2  5-CAGATATCCTAGAGACGACCCCATTG-3

提取PRRS病毒SY0608毒株感染后的猴肾细胞MARC-145细胞的总RNA，以反转录后的cDNA产物为模板，以SY-GP3.1和SY-GP3.2为上下游引物扩增出不含终止密码子的大小约780bp的GP3基因；以上下游引物SY-GP5.1和SYGP5.2扩增出含终止密码子的大小约620bp的GP5基因；

3)目的基因HSP70，GP3及GP5的回收与纯化

用DNA胶回收试剂盒回收目的基因片段，具体操作按TaKaRa凝胶回收试剂盒的说明书进行；

4)重组穿梭载体质粒pShuttle-CMV-GP3-GP5的构建

连接反应体积为10.0μL，体系如下：1.0μL 10×Ligase Buffer，1.0μL双酶切处理的pShuttle-CMV，4.0μL双酶切处理的GP3基因，3.5μL双酶切处理的GP5基因，0.5μL T4DNALigase，混匀后4℃连接8～10h；

用CaCl₂法制备感受态大肠杆菌DH5a，将连接产物转化感受态DH5a，获得重组穿梭载体质粒pShuttle-CMV-GP3-GP5；

5)重组穿梭载体质粒pShuttle-CMV-HS35即pSh-HS35的构建

连接反应体积为10.0μL，体系如下：1.0μL 10×Ligase Buffer，1.0μL双酶切处理的穿梭载体pShuttle-CMV-GP3-GP5，2.0μL双酶切处理的HSP70基因，100U T4 DNA Ligase，用无菌双蒸水补至总体积10.0μL，混匀后4℃连接8～10h，获得重组穿梭载体pShuttle-CMV-HS35；

用CaCl₂法制备感受态大肠杆菌DH5a，将连接产物转化感受态DH5a，获得重组穿梭载体质粒pShuttle-CMV-HS35；

6)重组穿梭载体pShuttle-CMV-HS35与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在BJ5183大肠杆菌中同源重组

重组穿梭载体质粒pShuttle-CMV-HS35线性化、去磷酸化后，常规方法电转化感受态含pAdEasy-1的BJ5183，电转化后涂布带有Kan抗性的LB平板，37℃过夜培养20-24h，获得重组腺病毒质粒rAd-HS35；

7)重组腺病毒rAd-HS35的包装

重组腺病毒质粒rAd-HS35的线性化与回收后，将得到的线性化的重组腺病毒质粒转染293A细胞，当转染的细胞出现特征病变或细胞状态不足以维持时，—20℃冻存收获病毒。

3.用权利要求1或2所述的猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒rAd-HS35制备的疫苗。

4.权利要求3所述疫苗的制备方法，其特征在于，

取用低温保存纯化的重组腺病毒rAd-HS35按10⁴TCID₅₀接种长成单层的293-A细胞扩大病毒培养，当细胞病变达70-90％时收毒，经反复冻融一次即可获得猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒rAd-HS35疫苗。

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